DE2452919C3 - Verfahren zum Herstellen von inaktivierten Impfstoffen gegen Viruskrankheiten - Google Patents

Verfahren zum Herstellen von inaktivierten Impfstoffen gegen Viruskrankheiten

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Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen, welches in der Pharmaindustrie zur Herstellung von Impfstoffen auf der Grundlage von Poliomyelitis-. Rabiesvircn. Arboviren. Myxoviren u. a. Verwendung findet.
Es sind Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen durch Ultrazcntrifugiercn bekannt.
Die Stamme A 2 England 1 66. B Rumänien 2 6ft oder der Stamm Ann Arbor 1 57 (Hier ein beliebiger anderer vom Menschen isolierter Stamm der Influcnzvtrcn vom Typ A 1. A 2 oder B werden nach der Standardmethodik in der Allantoishöhle der 10-1 Itägigen Embryonen gezüchtet. Die erhaltenen Allantoisflussigkeiten mit Titern von 5L2-2U48 Ha= maggtutinatioiiscinheiten (Einhj RHA) werden durch Zentrifugieren mit eimer niedrigen Geschwindigkeit (I j Min 1000 g) geklärt. Nachher wird die übersüß hendc Flüssigkeit 60 Minuten bei 4000 g zentrifugiert. Der gesammelte Niederschlag wird in isotonischem Phösphaiptiffcr verdünnt und das erhaltene! Könzcii^ trat im GruJicrilcn ddt Kaliümtartrat- lind Saccharo^ sccliGlitc in eint r pfäparativcii Zentrifuge dem Zcntrl·
fugieren unterzogen.
Die Fraktionen mit dem maximalen Virusgehalt haben durchschnittlich 5000 Einh. RHA/mg Eiweiß. Diese Suspension wird mit isotonischem Phosphat-" > puffer so verdünnt, daß sie von 100 bis 200 Einh. RHA71 ml enthält. Danach wird die Virussuspension durch Zugabe von Äthyläther (1:2) und 1 mg/ml »Tween-80«® inaktiviert. Das erhaltene Gemisch wird durch die Filtration durch ZeHophanmembranen
in von 0,45 μτη sterilisiert, und der Impfstoff isoliert. Es ist auch ein Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen durch Ultrazentrifugieren bekannt, welches darin besteht, daß die Allantoisflüssigkeit (pH 7,8-8,0) mit Natriumoxalat (0,16MoI) und trocke- > nem Bariumsulfat in einer Menge von 40 bis 60 g/l Allantoisflüssigkeit bei 0-3° C gemischt wird. Die Suspension wird während 90 Minuten -gerührt und über Nacht stehengelassen. Dann wird das Bariumsulfat mit dem adsorbierten Virus durch Zentrifugieren
>» im Durchflußrotor bei 7000 U/min mit einer Stromgeschwindigkeit von 50 bis 80 1/Std. abgetrennt. Die Elution erfolgt zu '/, des Ausgangsvolumens mit dem Eluenten, welcher 0,2 Gew.-% Gelatine, 0,25 Mol Zitronensäure, 1,0MoI NaCl, 0,4 Mol Tris-(trioxy-
>-. methylaminomethan) und 0,16 Mol Tween-80« mit einem pH-Wert von 7,2 enthält. Am nächsten Tag wird das Bariumsulfat durch Zentrifugieren bei Zimmertemperatur bei 800 g während 10 Minuten abgetrennt. Das erhaltene Eluat wird auf pH = 8 gebracht
jo und mit apyrogenem Wasser verdünnt. Danach wird es zentrifugiert, dann der Gelfiltration auf Sephadex G-25"1 und dann wiederum dem Zentrifugieren im Saccharosegradienten unterzogen. Man inaktiviert die erhaltenen Proben mit Formalin, unterzieht sie der
c. bakteriologischen Filtration und isoliert die Impfstoffe (DE-PS Nr. 1617774; GB-PS Nr. 1 183 506; E. B. Reiner et al.. Journal of Virology 1967, Nr. 1, Nr. 6. p. 1207-1216).
Die Nachteile der genannten Verfahren bestehen
4c. in der Kompliziertheit der Technologie, weiche zusätzliche Stufen der Reinigung und des Eindickens, darunter auch die Stufen des Eindickens mit Hilfe der Adsorption-Elution und der Reinigung mit Hilfe der Gelfiltration einschließt. Die oben beschriebene Rei-
4-, henfolge der Vorgänge führt zum Verlust an Virusmaterial von 50 bis 90r£ und schafft die Notwendigkeit, es nach der Beendigung des Reinigungs- und Eindikkensprozesscs zu sterilisieren.
Die chemische Inaktivierung zur Herstellung von
„, inaktivierten Impfstoffen führt zur Senkung der Imm> nogcnitat der Virusteikhen. Um diesen Effekt auszugleichen, fuhrt man mehr Virusmaterial, d. h. auch mehr F.iweißstoff ein. der unerwünschte Nebenreaktionen des Organismus hervorruft.
-,-, Außerdem ist fur die genannten Verfahren eine komplizierte apparative Ausrüstung notwendig.
Zu berücksichtigen ware noch die I)H-OS 11JSiK(W. wo vorgeschlagen wird. Impfstoffe nur durch Reinigung herzustellen, obwohl es zur Herstellu lungvuiidiesen Impfstoffen viclleitlit sugar noch günstiger ware, die VirüskUllUf zu konzentrieren. ImpfstoffCj die iitir mit der Reinigung erhalten worden sind, haben keinerlei praktische Bedeutung. Erfindungsgemäß wird nämlich ein Verfahren zum Herstellen von
bj; inaktivierten Impfstoffen vorgeschlagen unter Verwendung einer Kombination von zwei Grundverfahfcn, nämlich der Reinigung und der konzentration, die durch zwei chfömatographisciie Schritte erfolgt.
Der Reinigungsvorgang soll auf gelchromatographische Art durchgeführt werden, die Konzentration dagegen erfolgt durch Adsorptionschromatographie an Sorbenten der selben Klasse. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt also eine Kombination aus zwei Verfahren dar, die aufgrund des Standes der Technik nicht vorhersehbar waren.
Es wurde die Aufgabe gestellt, durch die Veränderung der technologischen Vorgänge die Technologie und die apparative Ausgestaltung des Verfahrens zu vereinfachen, und Impfstoffe zu erhalten, welche keine Nebenreaktionen des Organismus hervorrufen.
Die Aufgabe wurde wie aus den voranstehenden Ansprüchen ersichtlich gelöst.
Das Eindicken der Viruskultur durch Adsorption-Elution kann auf den mit Formalin bearbeiteten Erythrozyten durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird wie folgt durchgeführt. Die Suspension der Viruskultur wird durch die Gelchiomatographie gereinigt.
Dabei wird die Virussuspension in die Säule eingeführt, die mit einem porösen, die Virione nicht sorbierenden Natriumborat, Silikatglas von 50 bis 10000 A Porendurchmesser gefüllt ist.
Dieses Silikatglas erlaubt dank seines breiten Porenspektrums eine effektive Reinigung der Viruspräparate nicht nur von niedermolekularen, sondern auch von den hochmolekularen Beimischungen durchzuführen. Außerdem schafft die Gelchromatographie Bedingungen zur erfolgreichen Durchführung des darauffolgenden Eindickens des Virusstoffs. Das Eindicken des Virusstoffs wird durch \dsorption-Elution durchgeführt.
Die Adsorption-Elution wild au' der Säule durchgeführt, weiche mit einem porösen Silikatglas gefüllt ist, das es ermöglicht, die Sorptionsoberfläche in breiten Grenzen zu variieren.
Es ist auch möglich, die Adsorptions-Elution auf den mit Formalin bearbeiteten Erythrozyten durchzuführen.
Dann u ird der Impfstoff isoliert. Es ist zweckmäßig, die Impfstoffe zu isolieren, indem diese in physiologische Bedingungen übergeführt werden. Dieser Vorgang wird vorzugsweise mit Hilfe der Gclchromatographie auf der Säule durchgeführt, welche mit einem Silikatglas gefüllt ist.
Es ist möglich, die Herstellung von Impfstoffen für bestimmte Viren mit der Stufe des Eindickens des Virusmaterials zu beginnen; dam: geht die Reinigung des Viruspräparates und die Isolierung des Impfstoffes vor sich, oder es kann in einer Stufe - durch Gelchromatographie der Virussuspension - erfolgen.
Zur Hersteilung von inaktivierten Impfstoffen ist es zweckmäßig, die Inaktivierung der gereinigten und eingedickten lebenden Impfstoffe durch Behandlung mit Ultraviolettstrahlen in einer Dosis von 5000 2(H)OOO erg/cnr' oder mit 5%iger Formalinlösung durchzuführen.
Uli. .ifiiuluiicspemäße Verfahren ist im Vergleich zu den bekannten durch eine einfache Technologie und apparative Gestaltung ausgezeichnet,
DiC Verwendung voii mechanisch festen Silikätgläsern, welche ihre Eigenschaften während der Sterilisation nicht verändern, nicht aufquellen, ermöglicht es, das Verfahren bei hohen Geschwindigkeiten zu verwirklichen. Die" SÜikatglasef stellen keine Substrate dar, auf welchen das Wachstum von Bakterien möglich ist, lassen sich leicht regenerieren Und können
mehrmals verwendet werden. Diese Gläser gewährleisten, indem sie breite Möglichkeiten der Porenauswahl besitzen, einen hohen Effektivitätsgrad des ge|- chromatographischen Prozesses. Andererseits sichert die Sorptionskapazität dieser Stoffe einen hohen Eindickungsgrad der Virussuspension.
Die Kombination der gelchromatographischen Reinigung und des Sorptjonsejndickens von Vir :n auf diesen Stoffen gestattet, hochwirksame Impfstoffe herzustellen, welche keine Nebenreaktionen des Organismus hervorrufen.
Bei der Herstellung von inaktivierten Impfstoffen erlaubt es die Behandlung mit UV-Strahlen das Viriismaterial ohne Störung von immunogenen Viruseigenschaften zu inaktivieren.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung werden folgende Beispiele der Durchführung des Verfahrens angeführt.
Beispiel 1
Die Allantoiskultur des Influenza virus (Stamm A 2/Hongkong/68) in einer Menge von 840 ml und mit einem Titer von 320 Einh. RHA wird durch eine Säule von 3,0 cm Durchmesser und 32 cm Höhe, die mit Natrium-Borosilikatglas (Körnchenausmaß 0,1-0,3 mm, Porendurchmesser 500 A, Porosität 1-0,6 crrr/g) gefüllt ist, mit einer Geschwindigkeit von 0,3-0,6 cm/min durchgelassen. Die Entfernung von Beimengungen und die Viruselution werden stufenweise mit Trispuffern durchgeführt, die mit apyrogenem Wasser (0,005-0,05 Mol, pH-Wert 8,2-8,6 NaCI-Konzentration beträgt 0,-0,5 Mol, und Ionenstärke 0,1-1,0) vorbereitet sind, 50-100% Virus sind in 30 ml Eluat mit einem Titer von 10000 Einh. RHA enthalten.
Die Reinigung, Isolierung und Überführung der Impfstoffe zu physiologischen Bedingungen werden auf einer Säule von 3 cm Durchmesser und 50 cm Höhe durchgeführt, die mit dem grobporigen Kieselsäuregel gefüllt ist (Körnchengrößf: 0,16-0.15 mm. Porendurchmesser 450 Ä, Porosität 1,3 cm' g).
Das Virusmaterial wird mit dem Phosphatpuffer von 0.02 Mol, pH-Wert = 7.4-"\5 mit einer NaCI-Knnzentration von 0,85% und bei einer Geschwindigkeit von 0,5 cm min eluiert.
Es werden gegen 100 ml Impfstoff erhalten, welcher mindestens 50% Ausgangsvirus enthält.
Vergleichende Charakteristiken des Ausgangsmaterials und des erhaltenen Virusimpfstoffes
Ausgangs- Erhaltener material Impfstoff
Neuraminidasenaktivität in 0,17 0,69
Einheiten der optischen 8.5 9.3
Dichte bei einer Wellen
länge von 549 nm 5.5 0.04
Infektionsaktivität
Eiweißstoff nach Lowry
(mg, ml)
Die Inaktivierung des Virus iri dem Impfstoff wird durch UV-Bestrahlung durchgeführt. Die Dicke der Schicht vort 0,1 cm bis 0,5 cm, Lichtintensität 380-400 erg/mm* * s Während 5 Minuten
Die Immunögenität für Mäuse würde durch eine einmalige intrapcritoncale Einführung von 0,3 ml ab^ getötetem Impfstoff untersucht, der durchschnittliche Titer der Antihämaglutinine beträgt 13223. Die Im-
24
munogenität für Menschen wurde nach subkutaner Einführung an 20 Volontären zu je 0,5 ml Impfstoff mit einem nadellosen Injektor eingeschätzt. Das Antikörperanwachsen stieg im Durchschnitt auf das 17,2fache beim Fehlen von ausgeprägter Reaktogenität.
Beispiel 2
Die Allantoiskultur des Influenzavirus (Stamm A 2, Viktoria 36/72/H3N2) mit einem Titer von 640 Einh. RHA wird der Gelchromatographie auf einer Säule von 3 cm Durchmesser und 50 cm Höhe unterzogen, die mit Natrium-Borosilikatglas (Körnchengröße 0,1-0,3 mm, Porendurchmesser 1800 A, Porosität 1,6 cm3/g) gefüllt ist. Das Virusmaterial wird mit Trispuffer bei pH- = 7,5undNaCl-Konzentrationvon 0,85 Gew.-% mit einer Geschwindigkeit von 0,5 cm/ min eluiert.
Die weiteren Vorgänge Adsorption-Elution und Isolierung werden durchgeführt, wie es im Beispiel 1 beschrieben ist.
Im Ergebnis erhält man gegen 200 ml Impfstoff, welcher gegen 50% Ausgangsvirus enthält.
Vergleichende Charakteristiken:
Ausgangs- Erhaltener material Impfstoff Die Inaktivierung wird ebenso wie im Beispiel 1 durchgeführt.
Die Immunogenität wurde analog dem Beispiel 1 in den Versuchen an Mäusen untersucht. Der durchschnittliche Antihämaglutininentiter beträgt 1:275.
Beispiel 3
Die Allantoiskultur des Influenzavirus (der sowjetische Stamm 69) mit dem Titer von 512 Einh. RHA wird mit Hilfe der Adsorption-Elution auf formaiisierten Erythrozyten eingedickt. Danach wird die Gelchromatographie auf einer Säule von 3 cm Durchmesser und 50 cm Höhe, die mit Kieselsäuregel gefüllt ist (Körnchengröße 0,16-0,25 mm, Porendurchmesser450 A und Porosität 1,3 cmVg), bei pH- = 7,5 und NaCI-Konzentration von 0,85 Gew.-% durchgeführt.
Man erhält gegen 100 ml Impfstoff, welcher mindestens 50% Ausgangsvirus enthält.
Vergleichende Charakteristi'.,n:
Ausgangs- Fiuat Erhaltener material Impfstoff
Hämaglutinintiter
Eiweißstoff nach
Lowry (mg/ml)
512
4196 1024
0,7 0,1
Neuraminidasenaktivität 0,03 0,4
Hämaglutinintiter 320 1280
Eiweißstoff (mg/ml) 2,4 0,03
Die Immunogenität wurde analog dem Beispiel 1 in den Versuchen an Mäusen untersucht.
Der durchschnittliche Antihämoglutininentiter in beträgt 1:300.

Claims (2)

sz y iy b) Patentansprüche:
1. Verfahren zum Herstellen von inaktivierten Impfstoffen gegen Viruskrankheiten durch Reinigung von Virussuspensionen an Adsorbentien, dadurch gekennzeichnet, daß man eine in üblicher Weise erhaltene Virussuspension
a) mittels Säulengelchromatographie unter Verwendung eines die Viren nicht sorbierenden porösen Natriumboratsilikatglases mit einem Porendurchmesser von 450, 500, ISOO A Porosität von 0,3 bis 2,5 cnrVg und einer Korngröße von 0,1-0,3 mm reinigt,
die Viren daraus durch Waschen mit Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 7,2-10,0 und einer Ionenkonzentration von 0,1-1,0 zu einem Eluat vereinigt,
c) das virushaltige Eluat an großporigem Kieselsäuregel mit einem Porendurchmesser von 300-2000 A, einer Porosität von 1,3 cnvVg und einer Korngröße von 0,1-0,3 mm adsorbiert, die Viren durch Waschen mit einem Puffer mit einem pH-Wert von 8,2-8,6 und einer Ionenkonzentration von 0,1-1,0 Mol/l in ein Eluat überführt,
daraus das Virusmaterial mit einem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0-7,8 mm der Ionenkonzentration von 0,1-1,0 mit einer Na-Cl-Konzentration von 0,14-0,154 MoI/I in eine physiologische verträgliche Lösung überführt und
e) die Viren darin durch Behandlung mit UV-Strahlen in einer Dosis von 5000 bis 2I)OO(K) erg.cnr oder mit 5%iger Formalinlösung inaktiviert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß den Verfahrensstufen a) und b) die Verfahrensstufen c) und d) oder andere übliche Konzentrierverfahren vorangestellt werden.
d)
DE2452919A 1973-11-16 1974-11-07 Verfahren zum Herstellen von inaktivierten Impfstoffen gegen Viruskrankheiten Expired DE2452919C3 (de)

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