DE2449244A1 - Vorrichtung zur fluoreszenzanalyse - Google Patents

Vorrichtung zur fluoreszenzanalyse

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DE2449244A1
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fluorescence
fluorescence analysis
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Kenji Onogi
Katsuji Rikukawa
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Description

PATENTANWÄLTE. Α. GRÜNECKEft
DIPL.-ING.
H. KINKELDEY
DR.-INQ.
W. STOCKMAIR
f\ I I Q *% j 1 DR.-INQ. ■ AlE(CAtTECH)
£ H H- Ϊ7 4 4 4 κ. SCHUMANN
. DR. RER. NAT. · DIPU.-PHVS,
P. H. JAKOB
DIPL.-INQ.
G. BEZOLD
OR. RER. NAT. ■ DIPL.-CHEM.
MÜNCHEN E. K. WEIL
OR. RER. OEC INQ.
LINDAU MÜNCHEN 22
MAXIMILIANSTRASSE 43
16. Oktober 1974 PH 8646 .
NIPPON KOGAEU'Κ. Κ.
2-3, Marunouchi 3-chome, Chiyoda-ku, Tokyo, Japan
Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse für die Messung von zwei unterschiedlichen Fluoreszenzen einer Probe.
Mit einer solchen Vorrichtung können also zwei verschiedene, fluoreszierende Substanzen in einer Probe untersucht und geraessen werden.
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TELEFON (OBO) 222352 TELEX O5-39380
— O —
weiten · Sinne ist die Fluoreszenz als Untergruppe der Lumineszenz ein Phänomen, bei dem eine Substanz ultraviolette Strahlen oder eine andere Lichtenergie mit kurzer Wellenlänge absorbiert und Licht erzeugt, das eine längere Wellenlänge als die absorbierte Wellenlänge hat. Ein Fluoreszenz-Mikroskop ist ein Instrument, das die Fluoreszenz ausnutzt, um lebende Zellen und andere Strukturen zu beobachten und zu analysieren.
Nahezu alle Substanzen sind von Natur aus im gewissen Grade fluoreszierend, wenn sie mit Lichtenergie von kurzer Wellenlänge bestrahlt werden. Es gibt jedoch bestimmte Substanzen, wie beispielsweise Proteine und Kohlehydrate, die nicht fluoreszierend sind. Solche nicht-fluoreszierenden Substanzen können zum Fluoreszieren gebracht werden, indem sie mit einer fluoreszierenden Substanz gefärbt oder versetzt werden; eine solche Substanz wird auch als " Fluorochrom " bezeichnet; als Alternative hierzu kann die sog. Fluoreszenz-Antikörpertechnik eingesetzt werden, die die Eigenschaft von Antikörpermolekülen ausnutzt, sich mit Fluorochromen zu verbinden. In einigen Fällen werden die nichtfluoreszierenden Substanzen mit zwei verschiedenen Fluorochromen versetzt; diese Technik ist auch als doppelte Färbung ( double staining ) bekannt.
Die Bestandteile der Proben, wie z.B. Zellen oder andere Strukturen, die entweder von Natur aus oder aufgrund der Zugabe von Fluorochromen fluoreszieren, können bestimmt werden, indem die Menge der fluoreszierenden Substanz gemessen wird, die in der Probe enthalten ist. Beispiels-
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weise werden bei der Fluoreszenz-Fotometrie genannten Technik die Bestandteile einer Probe durch einen.einzigen Meßvorgang bestimmt, wenn die Probe eine einzige natürliche Fluoreszenz hat oder nachdem sie mit einer einzigen fluoreszierenden Substanz oder Fluorochrom gefärbt worden ist. In den Fällen jedoch, wo die Probe zwei verschiedene natürliche Fluoreszenzen hat, oder wo die Probe mit zwei verschiedenen fluoreszierenden Substanzen oder Fluorochromen ( doppelte Färbung ) versetzt worden ist, muß eine Analysenlampe mit sehr hohem Wirkungsgrad zur Erzeugung der Erregerstrahlung verwendet werden, um die Probe so zu bestrahlen, daß die beiden Fluoreszenzen gleichzeitig auftreten; dabei wird dann das emittierende Licht gemessen, das jeder einzelnen Fluoreszenz entspricht· Diese Meßtechnik ist jedoch mit Nachteilen verbunden, da sich nur mit Schwierigkeiten vermeiden läßt, daß die Eigenschaften der Probe sich ändern, also der sog. Schwund ( fading ) auftritt. Als Ergebnis hiervon muß jeder Meßvorgang sehr rasch durchgeführt werden, so daß die Messungen äusserst schwierig sind. Um also Fehler bei den Messungen zu vermeiden, muß die Bedienungsperson äusserst geschickt sein.
Damit das emittierte Licht , das den beiden gleichzeitig auftretenden Fluoreszenzen entspricht, nicht einzeln gemessen werden muß, können Analysenlampen zur Erzeugung der Erregerstrahlung verwendet werden, um die Probe getrennt zu bestrahlen, so daß die Fluoreszenzen zu unterschiedlichen Zeitpunktem. auftreten. Würde die Probe gleichzeitig durch beide Lampen bestrahlt , so wäre es schwierig, das während
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der Fluoreszenzen emittierte Licht von dem Licht zu unterscheiden, das durch die Analysenlampen erzeugt wird. Z.B. kann in einigen Fällen die Wellenlänge des Lichtes, das während einer oder während beider Fluoreszenzen emittiert wird, sehr nahe.bei der Wellenlänge des Lichtes einer der Analysenlampen liegen, so daß es schwierig ist, das Licht der Analysenlampe von dem emittierten Licht zu trennen. Dadurch würde sich das Licht von der Analysenlampe , das stärker als das emittierte Licht ist, in dem Betrachtungssystem und dem Meßsystem mischen, so daß es unmöglich ist, die Intensitäten der beiden Fluoreszenz-Strahlungen entweder zu betrachten oder zu messen.
Der Erfindung liegt deshalb u.a. die Aufgabe zugrunde, eine verbesserte Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse zu schaffen, mit der gleichzeitig zwei unterschiedliche Fluoreszenzen einer Probe gemessen werden können und bei der keiner der oben erwähnten Nachteile auftritt.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine erste Bestrahlungseinrichtung zur Bestrahlung der Probe mit Licht, das bei einer ersten Frequenz moduliert ist und eine erste Wellenlänge hat, die eine erste Fluoreszenz verursacht , durch eine zweite Bestrahlungseinrichtung zur Betrahlung der Probe mit Licht, das bei einer zweiten Frequenz, die verschieden von der ersten Frequenz ist, moduliert ist und eine zweite Wellenlänge hat, die eine zweite Fluoreszenz verursacht, und durch eine auf das während der beiden Fluoreszenzen emittierte Licht ansprechende Meßanordnung, die die Intensität der beiden Fluoreszenzen ermittelt.
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Dabei kann nach einer bevorzugten Ausführungsform die Meßanordnung aus einem fotoelektrischen Element und einem Demodulator bestehen.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die erste Bestrahlungseinrichtung einen dichroitischen Spiegel, der das modulierte Licht mit der ersten Wellenlänge, die nach einer bevorzugten Ausführungsform langer als die zweite Wellenlänge ist, auf die Probe richtet und das emittierte Licht, das den beiden Fluoreszenzen entspricht, durchläßt, so daß es die Meßanordnung erreichen kann. Weiterhin enthält die erste Bestrahlungseinrichtung eine Objektivlinse, die das Licht auf die Probe fokussiert; die Objektivlinse weist eine nicht-reflektierende Beschichtung auf, um die Reflektion des Lichtes zurück in Richtung auf die Meßanordnung zu verringern..Weiterhin kann ein Absorptionsfilter verwendet werden, um zu verhindern, daß Lichtstrahlen der Bestrahlungssysteme die Meßanordnung erreichen. Die zweite Bestrahlungseinrichtung enthält eine Dunkelfeldkondensorlinse, die das Licht mit der zweiten Wellenlänge auf die Probe richtet. Jede Bestrahlungseinrichtung enthält eine Lichtquelle, einen Zerhacker oder Chopper, der das Licht moduliert, und einen Filter, der die Lichtstrahlen mit der geeigneten Wellenlänge durchläßt. Ein zur Betrachtung der Fluoreszenz dienendes optisches System kann ein Okular und einen semitransparenten Spiegel enthalten, der das emittierte Licht während der Fluoreszenz in erste und zweite Bestandteile aufspaltet, die zu der Meßanordnung bzw« in das Okular gerichtet werden«,
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Die Erfindung schafft also eine Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse ," wie beispielsweise ein Fluoreszenzmikroskop, zur Messung von zwei unterschiedlichen Fluoreszenzen in . einer Probe; dabei wird die Probe durch bei einer ersten Frequenz moduliertes Licht , das eine erste Wellenlänge hat und eine erste Fluoreszenz verursacht, sowie durch Licht bestrahlt, das bei einer zweiten Frequenz , äie von der ersten Frequenz verschieden ist, moduliert wird und eine zweite Wellenlänge hat, die eine zweite Fluoreszenz verursacht. Ein fotoelektrisches Element spricht auf das von der Probe während der beiden Fluoreszenzen emittierte Licht zur Erzeugung eines elektrischen Signals an, das ein Maß für die kombinierten Intensitäten der beiden Fluoreszenzen darstellt. Aus diesem elektrischen Signal leitet ein Demodulator erste und zweite Signalbestandteile mit der ersten bzw. zweiten Frequenz und mit Amplituden ab, die ein Maß für die einzelnen Intensitäten der ersten bzw. zweiten Fluoreszenz darstellen.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die beiliegende schematische Zeichnung näher erläutert, deren einzige Figur eine bevorzugte Ausführungsform einer Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse darstellt.
In der Figur bezeichnet S 1 eine Lichtquelle, die eine Hochdruck-Quecksilberla.mpe , eine Quarz-Quecksilber-Bogenlamp©, die auch als Analysenlampe bezeichnet wird, ©der eine ähnliche Einrichtung aufweisen kann; C 1 bezeichnet einen Chopper oder Zerhacker, um das Licht ■von der Quelle S 1 bei der Frequenz f 1 zu laodulieren. Der Chopper kann irgendein© geeignetes Lichtstrahlen modulierende Einrichtung mit bekanntem Aufbau, wie beispielsweise einen mechanischen, elektromechanischen
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oder elektrooptischen Lichtmodulator aufweisen. Linsen L 1 und L I1 schaffen ein paralleles optisches System, in dem der Chopper C 1 angeordnet ist. Mit D wird eine Blende bezeichnet, die die Querschnittsfläche des durch das optische System hergestellten Lichtstrahls begrenzen soll.
F 1 bezeichnet ein Filter mit schmalem Durchlaßbereich, das im Strahlengang des modulierten Lichtstrahls angeordnet ist, so daß nur die Lichtstrahlen mit einer vorher bestimmten Wellenlänge A- 1 durchgelassen werden; diese Wellenlänge X 1 wird so ausgewählt, daß sie einen Bestandteil der zu analysierenden Probe zu einer ersten Fluoreszenzstrahlung erregt, bei der Licht mit einer längeren Wellenlänge /C i1 emittiert wird. M 1 ist ein dichroitischer Spiegel, um die Lichtstrahlen, die eine Wellenlänge haben , die gleich oder kürzer als die WeI^ lenlänge X, 1 ist, zu reflektieren., und um die Lichtstrahlen durchzulassen, die eine Wellenlänge haben, die größer als X 1 ist; dazu gehören die Lichtstrahlen, die während der beiden Fluoreszenzstrahlungen emittiert werden. L 3 ist eine Objektivlinse. Der Strahlengang 'des Erregungslichtes, das bei der Frequenz f 1 moduliert wird, und die Wellenlänge Λ_1 hat, wird durch den dichroitischen Spiegel M 1 um 9o° verändert, so daß die Lichtstrahlen das Objektiv L 3 passieren, um die Probe ( nicht dargestellt ) zu bestrahlen, die auf einem Objekttisch 0 gehaltert ist. Die hier beschriebenen Elemente bilden ein optisches System , mit dem eine einfallende Strahlung erzeugt wird.
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S 2 ist eine Lichtquelle, die der Lichtquelle S 1 in dem optischen System zur Erzeugung einer Einfallstrahlung ähnelt. Linsen L 2 und L 21 ähneln den Linsen L 1 und L I1 und schaffen ein paralleles optisches System. C 2 bezeichnet einen Chopper oder Zerhacker, der in dem parallelen optischen System angeordnet ist. Der Chopper C 2 moduliert das Licht von der Quelle S 2 bei einer Frequenz f 2 , die sich von der Modulationsfrequenz f 1 unterscheidet, die durch den Chopper C 1 in dem optischen System zur Erzeugung der Einfallstrahlung erzeugt wird. F 2 ist ein Filter mit schmalem Durchlaßbereich, das in dem Strahlengang des durch den ChopperC 2 modulierten Lichtes angeordnet ist und nur die Lichtstrahlen durchläßt, die eine vorher bestimmte Wellenlänge /L 2 haben; diese Wellenlänge /[_, 2 ist so ausgewählt, daß ein Bestandteil der Probe zu einer zweiten Fluoreszenzstrahlung erregt wird, so daß Licht mit einer längeren Wellenlänge /L emittiert wird, die sich nach einer bevorzugten Ausführungsform von der Wellenlänge· A. 1' unterscheidet. Aus einem noch zu erläuternden Grund ist die durch das Filter F 2 gelagerte Wellenlänge A. 2 kürzer als die durch das Filter F 1 gelieferte Wellenlänge Ά 1· Ein Spiegel ist mit M 2 und ein Dunkelfeldkondensor mit L k bezeichnet.Der Strahlengang dieses Erregungslichtes, das bei der Frequenz f 2 moduliert wird und eine Wellenlänge ^ 2 hat, wird durch den Spiegel M 2 um 9o verändert, so daß die Lichtstrahlen den Dunkelfeldkondensor passieren, um die Probe auf dem Objekttisch 0 zu bestrahlen. Die hier beschriebenen Elemente bilden ein optisches System, das zur Erzeugung einer Durchlichtstrahlung dient.
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Ein halbdurchscheinender oder semitransparenter Spiegel M 3 ist in dem Strahlengang des Lichtes angeordnet, das während der beiden Fluoreszenzstrahlungen ( das heißt, das Licht mit den Wellenlängen A- I1 und A_ 21 ) emittiert wird, wobei dieses Licht den dichroitischen Spiegel M 1 passiert; der Spiegel M 3 spaltet dann dieses emittierte Licht in zwei Komponenten oder Bestandteile auf· Ein zur Messung dienendes optisches System, das ein fotoelektrisches Element PM und eine Frequenztrennschaltung R aufweist, spricht auf einen der Bestandteile an, um die jeweiligen einzelnen Intensitäten der beiden Fluoreszenzstrahlungen auf im folgenden zu beschreibende Weise festzustellen. Ein zur Betrachtung dienendes optisches System weist ein Prisma P, das den Strahlengang verändert, und ein Okular L 5 auf; dieses System, das einen Teil eines Fluoreszenz-Mikroskops bilden kaivn, empfängt den anderen Bestandteil, so daß die Fluoreszenzen betrachtet werden können. F 3 ist ein Absorptions-Filter, das alle Lichtstrahlen bis auf die mit den Wellenlängen λ-l' und
Λ_ 2' ausfiltert und abtrennt. Wäre der Dunkelfeldkondensor L k eine Kondensorlinse mit einer einfachen Durchlässigkeit-Kennlinie, so würde die Intensität des zur Erregung dienenden Lichtes mit der Wellenlänge Λ. 2 so groß werden, daß es durch den dichroitischen Spiegel M 1 nicht vollständig abgetrennt ( d.h., reflektiert ) werden könnte». In einem solchen Fall ist deshalb das Absorptionsfilter F 3 erforderlich, um die Lichtstrahlen mit der Wellenlänge /L 2 zu absorbieren, die den Spiegel M 1 passieren. Weiterhin wird das Filter F 3 benötigt, um Lichtstrahlen mit der Wellenlänge λ i zu absorbieren, die zurück in Richtung auf den Spiegel M 1 reflektiert werden ( beispielsweise an der Oberfläche
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der Objektivlinse L 3 ) und die nicht vollständig durch den Spiegel M- 1 abgetrennt werden.
Im folgenden soll die Wirkungsweise der oben beschriebenen Vorrichtung erläutert werden. Die bei^den zu messenden Bestandteile der zu untersuchenden Probe müssen in Abhängigkeit von den zur Erregung dienenden Lichtstrahlen mit zwei unterschiedlichen Wellenlängen, die oben als Wellenlängen /L. 1 bzw. /^ 2 bezeichnet wurden, fluoreszierend sein. Fluoreszieren die beiden Bestandteile nicht von Natur aus, so kann entweder einer oder können beide mit geeigneten fluoreszierenden Substanzen oder Fluorochromen versetzt , also gewissermaßen dotiert werden, um die notwendige Fluoreszenz-Strahlung zu erzeugen. Die Probe wird dann auf dem Objekttisch O zur Messung der beiden Fluoreszenzstrahlungen angeordnet. Vor der Messung der Probe wird eine Testplatte, die in geeigneter Weise behandelt ist, um zwei unterschiedliche Fluoreszenz-Strahlungen zu liefern, zur Durchführung einer Messung oder Bestimmung auf den Objekttisch gelegt. Die Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse kann geeicht werden, indem die Werte, die durch die Fluoreszenz - Messung ( wie es im folgenden beschrieben wird ) erhalten werden, mit den bekannten Werten der Probe verglichen werden.
Die divergierenden Lichtstrahlen von der Quelle S 1 werden durch die Linse L 1 parallel gemacht und durch den Chopper C 1 bei einer ausgewählten Frequenz f 1 moduliert, wobei die modulierten Lichtstrahlen durch das Objektiv L 1' konzentriert ( d.h., zur Konvergenz gebracht ) werden, d as; auch die Lichtstrahlen in Richtung auf den dichroitischen Spiegel M 1 richtet. Das Filter F 1 läßt nur die Lichtstrahlen mit
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der Wellenlänge L· l durch, trennt also alle anderen Lichtstrahlen ab, so daß ein Erregerlicht entsteht, das durch die Objektivlinse L 3 auf die Probe gerichtet -wird. Ein geringer Prozentsatz dieses Lichtes wird durch die Oberfläche der Objektivlinse und durch die bearbeiteten, insbesondere geglätteten und polierten Oberflächen des Tisches 0 zurück in Richtung auf den dichroitischen Spiegel M 1 reflektiert. Dieses reflektierte Licht wird praktisch vollständig durch den dichroitischen Spiegel M 1 zurück in Richtung auf die Lichtquelle S 1 reflektiert. Der geringe Prozentsatz des Lichtes, der den dichroitischen Spiegel passiert, wird durch das Filter F 3 absorbiert. Trifft das zur Erregung dienende Licht auf die Probe auf, so gibt die fluoreszierende Substanz oder das Fluorochrom, das auf die Wellenlänge A- 1 anspricht, eine Fluoreszenz-Strahlung ab, wobei Licht mit der Wellenlänge A-ι· emittiert wird. Das emittierte Licht passiert den dichroitischen Spiegel M 1 und das Filter F 3 und trifft auf den semitransparenten Spiegel M 3 auf. Der Bestandteil des Lichtes, der an dem Spiegel reflektiert wird, wird auf das fotoelektrische Element PM gerichtet, während der Bestandteil des Lichtes, der den Spiegel passiert, durch das Prisma P in das Okular L 5 gerichtet wird. Berücksichtigt man, daß die Eigenschaften der Probe sich verändern, die Probe sich insbesondere verfärbt oder verblasst ( fading ), so sollte während der Messung die Bestrahlung der gesamten Probe durch das Erregerlicht vermieden werden. Deshalb wird das Bestrahlungsfeld des Lichtes mittels der Blende D auf einen kleinen Fleck begrenzt.
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In ähnlicher Weise werden die divergierenden Lichtstrahlen von der Quelle S 2 in dem zur Erzeugung des Durchlichtes dienenden optischen System durch die Linse L 2 parallel gemacht, durch den Chopper C 2 bei der Frequenz f 2 moduliert, wonach sie durch die Linse L 21 konzentriert und auf den Spiegel M 2 gerichtet werden. Das Filter F 2 läßt nur die Lichtstrahlen mit der Wellenlänge Λ- 2 durch, trennt also alle anderen Lichtstrahlen ab, so daß eine Erregerstrahlung erzeugt wird, die durch den Dunkelfeldkondensor L k auf die Probe gerichtet wird und dann relativ zu der Objektivlinse L 3, wie in der Figur dargestellt.ist, nach außen austritt. Trifft diese Erregerstrahlung auf die Probe auf, so gibt die fluoreszierende Substanz oder das Fluorochrom, das auf Licht mit der Wellenlänge /L- 2 anspricht, eine Fluoreszenz-Strahlung ab, wobei Licht mit der Wellenlänge /V 2· emittiert wird, das in das zur Messung und Betrachtung dienende optische System auf die gleiche Weise eintritt} wie es oben in Bezug auf das emittierte Licht mit der Wellenlänge /t, 1' beschrieben wurde. Alle Lichtstrahlen, die den dichroitischen Spiegel M 1 passieren, werden mit Ausnahme des Lichtes mit der Wellenlänge X, 1! und /L 2·, wie beispielsweise die Erregerstrahlung, die an der Objektivlinse L 3 reflektiert, oder an dem Kondensor L kt gestreut wird, durch das Absorptionsfilter F 3 abgefangen, so daß nur die Lichtstrahlen den semitranspa- reaten Spiegel M 3 erreichen, die während der Fluoreszenz-Strahlung von der Probe emittiert werden.
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Wird die Erregerstrahlung in dem nach unten gerichteten oder Auflicht-Strahlungssystem so ausgewählt, daß sie eine Wellenlänge /t^i hat, die kürzer als die Wellenlänge /L-, 2 der Erregerstrahlung in dem nach oben gerichteten oder Durchlaß-Strahlungssystem ist, so daß die Wellenlänge ^ 2 der nach oben gerichteten Erregerstrahlung näher als die Wellenlänge Xl bei den Wellenlängen X. 1' und /C 21 des emittierten Lichtes liegt, so würde ein einfaches Filter nicht ausreichen, um die nach oben gerichtete Erregerstrahlung von dem emittierten Licht zu trennen. Dies beruht darauf, daß die Intensität der nach oben gerichteten. Erregerstrah-, lung sehr viel größer wäre als die Intensität des emittierten Lichtes. Wird- jedoch die Erregerstrahlung mit der längeren Wellenlänge nach unten, gerichtet, um die Probe zu bestrahlen, so wird nur ein geringer Prozentsatz dieser Erregerstrahlung an der Oberfläche der Objektivlinse L 3 zurück in Richtung auf die optischen Systeme zur Betrachtung und Messung reflektiert. Weiterhin ist es möglich, die Stärke der Reflektion zu verringern, indem eine das Auftreten von Reflektionen verhindernde Beschichtung auf die Oberfläche der Linse aufgebracht wird. Daraus ergibt sich also in Bezug auf die optischen Systeme zur Betrachtung und Messung, daß die nach unten gerichtete Erregerstrahlung wesentlich mehr gedämpft bzw. geschwächt werden kann als die nach oben gerichtete Erregerstrahlung. Deshalb sollte in dem Falle, daß einer der Erre- · gerstrahlen eine Wellenlänge hat, die nahe bei der Wellenlänge des während der Fluoreszenz emittierten Lichtes liegt, diese Erregerstrahlung in dem optischen System für die nach unten gerichtete oder Auflicht-Strahlung verwendet werden, während die Erregerstrahlung mit
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der kürzeren Fellenlänge in dem optischen System für die nach oben gerichtete oder Durchlichtstrahlung verwendet werden sollte.
Das fotoelektrische Element PM spricht auf das während der beiden Fluoreszenzen (d.h., das Licht mit den Wellenlängen /L 1' und /C 21 ) emittierte Licht zur'Erzeugung eines elektrischen Signals mit einer Amplitude an, die der Summe der Intensitäten des während der beiden Fluoreszenzen emittierten Lichtes entspricht. Da jedoch die Erregerstrahlung für das Auflicht und für das Durchlicht bei den Frequenzen f 1 bzw. f2 moduliert wird, wird das während der jeweiligen Fluoreszenzen emittierte Licht ebenfalls bei diesen Frequenzen moduliert. Deshalb kann die Frequenztrennschaltung R, de einen Demodulator aufweisen kann, erste und zweite Signalbestandteile mit Frequenzen fl bzw.f2 abtrennen, die die jeweiligen einzelnen Intensitäten der beiden Fluoreszenzen darstellen· Diese gemessenen Werte werden dann mit den Werten verglichen, die mittels der Testplatte ermittelt wurden, um die korrigierten Werte zu erhalten.
Das" durch den semitransparenten Spiegel M 3 in das optische Betrachtungssystem gelangende Licht wird durch das Prisma P in Richtung auf das Okular L 5 gerichtet, so daß die Probe und die Fluoreszenzen betrachtet werden können.
In der dargestellten Aus führung s form wird der Chopper C des optischen Systems für das Auflicht in dem parallelen optischen System angeordnet. Als Alternative hierzu kann sich jedoch der Chopper an irgendeiner gewünschten Stelle v zwischen der Lichtquelle S 1 und dem semitransparenten
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Spiegel M 1 befinden. In ähnlicher Weise kann in dem optischen System für das Durchlicht der Chopper an irgendeiner Stelle zwischen der Lichtquelle S 2 und dem Spiegel M 2 angeordnet werden. Weiterhin müssen sich die Filter F 1 und F .2 nicht in den dargestellten Positionen befinden, sondern können in irgendwelchen anderen, geeigneten Lagen angeordnet werden.
Der Vorteil der Verwendung des Dunkelfeldkondensors L 4 in dem optischen System für das Durchlicht liegt darin, daß auf diese Weise vermieden wird, daß die Erregerstrahlung in diesem System nach der Bestrahlung der Probe im wesentlichen Umfang in die optischen Systeme zur Betrachtung und Messung eindringt. Bei der Verwendung dieses Dunlcelfeldkondensors tritt jedoch ein Nachteil in Bezug auf die Änderung der Eigenschaften auf, weil in dem System keine Seh feldblende Vorgesehen ist. Muß der Schwund bzw. die Veränderung der Eigenschaften berücksichtigt werden , so kann die Messung durchgeführt werden, indem der Dunkelfeldkondensor durch einen einfachen Kondensor , der mit Durchlicht arbeitet,und eine Blende ersetzt wird, ΐη einem solchen Fall würde jedoch die Erregerstrahlung in dem optischen System für das Durchlicht selbst dann direkt in die Systeme zur Betrachtung und Messung eingeführt werden, wenn der dichroitische Spiegel M 1 einen so hohen Wirkungsgrad hätte, daß nahezu die gesamte Erregerstrahlung in dichtung auf die Lichtquelle S 1 reflektiert würde. Aus diesem Grund ist das Absorptionsfilter F 3» das die gesamte Erregerstrahlung absorbieren kann, die den dichroitischen Spiegel passiert, zwischen dem dichroitischen Spiegel und dem semintransparenten Spiegel M 3 vorgesehen.
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Bei einer Vorrichtung zur Flüoreszenzanalyse , die einen Aufbau gemäß der Erfindung hat, werden also die Auflicht-Erregerstrahlung und die Durchlicht-Erregerstrahlung vorteilhafterweise dazu verwendet, gleichzeitig die Messung von zwei unterschiedlichen Fluoreszenzen in einer Probe, wie beispielsweise einer zweifach versetzten Probe, durchzuführen, ohne daß dabei Schwund oder Veränderung der Eigenschaften auftritt.
Weiterhin können die Durchlässigkeit bzw. Transmission oder das Durchlassungsvermögen, das Reflektionsvermögen bzw. der Reflexionsgrad und andere Keimzahlen der Probe gleichzeitiggemessen werden, indem nur der Dunkelfeldkondensor durch einen einfachen, mit Durchlicht arbeitenden Kondensor ersetzt wird.
Die Vorteile und verbesserten Ergebnisse der Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse nach der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der obigen Beschreibung einer bevorzugtten Ausführungsform der Erfindung. Dabei können verschiedene Abänderungen und Modifikationen vorgenommen werden, ohne daß dadurch der Gedanke und der Umfang der Erfindung verlassen werden, wie er durch die nun folgenden Ansprüche definiert ist.
- Patentansprüche -
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Claims (10)

  1. Paten t a η s ρ r ü c h e
    l.\ Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse für die Messung von zwei unterschiedlichen Fluoreszenzen einer Probe, gekennzeichnet durch eine erste Bestrahlungseinrichtung zur Bestrahlung der Probe mit Licht, das bei einer ersten Frequenz ( f 1 ) moduliert ist und eine erste Wellenlänge (Λ1) hat, die eine erste Fluoreszenz verursacht, durch eine zweite Bestrahlungseinrichtung zur Bestrahlung der Probe mit Licht, das bei einer zweiten Frequenz ( f 2 ), die verschieden von der ersten Frequenz ( f 1 ) ist, moduliert ist und eine zweite Wellenlänge (^, 2 ) hat, die eine zweite Fluoreszenz verursacht, und durch eine auf das während der beiden Fluoreszeiizen emittierte Licht ansprechende Meßanordnung ( PM, R), die die Intensität der beiden Fluoreszenzen ermittelt.
  2. 2. Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßanordnung ein fotoelektrisches Element C PM ) zur Erzeugung eines elektrischen Signals ,. das ein Maß für das während der beiden Fluoreszenzen ami"Aierte Licht ist, und eina Einrichtung (R) aufweist, die auf das elektrische Signal anspricht und daraus' erste Und zweite Signalbestandteil® mit der ersten Frequenz Cf I)' bzw. der zweiten ( f 2 ) ableitet und die einseinen Intensitäten der ersten bzw. aweit©» Fluoreszenz darstellt. .
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  3. 3- Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Bestrahlungseinrichtung einen dichroitischen Spiegel (Ml) enthält, der die Lichtstrahlen mit der ersten Wellenlänge ( /$_ 1 ) auf die Probe richtet und die während der beiden Fluoreszenzen emittierten Lichtstrahlen passieren und die Meßanordnung ( PM, R ) erreichen läßt.
  4. 4. Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse nach einem der Ansprüche 1 bis 3« dadurch gekennzeichnet, daß die erste Wellenlänge ( /C i ) länger als die zweite Wellenlänge ( X 2 ) ist.
  5. 5. Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Bestrahlungseinrichtung eine Objektivlinse ( L 3 ) enthält, die das Licht mit der ersten Wellenlänge (/Cl ) auf die Probe richtet, wobei die Objektivlinse ( L 3 ) zur Verringerung der Reflexion des Lichtes mit der ersten Wellenlänge (Λ.1 ) eine die Reflexionen verhindernde Beschichtung hat.
  6. 6. Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse nach einem der Ansprüche 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß ein Filter ( F 3 ) vorgesehen . ist» das verhindert., daß Licht mit der ersten und der zweiten Wellenlänge (Xl, A^ 2 ) die Meßanordnung ( PM, R ) erreicht.
  7. 7· Vorrichtung- zur Fluoreszenzanalyse nach einem der Ansprüche 1 bis δ, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite . Bestrahlungste±2tr±ehtung eine Kondensorlinse enthält , die das Licht mit der zweiten -Wellenlänge ( /L 2 ) auf die Probe richtet«,
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  8. 8. Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß die Kondensorlinse einen Dunkelfeldkondensor ( L 4 ) aufireist.
  9. 9· Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse nach einem der' Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß jede Bestrahlungseinrichtung eine Lichtquelle ( S 1* S 2 ), eine Anordnung ( C 1, C 2 ) zur Modulierung des Lichtes bei der ersten bzw. zweiten Frequenz (f1, f 2 ), und ein Filter ( F 1, F 2 ) aufweist, das nur Licht mit der ersten bzw. zweiten Wellenlänge ( X 1, /L 2 ) durchläßt.
  10. 10. Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse nach einem der Ansprüche 1 bis 9i weiterhin gekennzeichnet durch ein Okular ( L 5 ) und durch eine Anordnung zur Aufspaltung des während der beiden Fluoreszenzen emittierten Lichtes in einen ersten und einen zweiten Bestandteil, wobei die einzelnen Bestandteile zu der Meßanordnung ( PM, R ) bzw. zu dem Okular ( L 5 ) gerichtet werden.
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