DE2435642A1

DE2435642A1 - Traegermaterial

Info

Publication number: DE2435642A1
Application number: DE2435642A
Authority: DE
Inventors: Hans Dr Kuenzi
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1974-07-24
Filing date: 1974-07-24
Publication date: 1976-02-05

Description

Trägermaterial Die vorliegende Erfindung betrifft neue Polymerverbindungen der allgemeinen Formel worin n eine Zahl von etwa 25 bis etwa 2500 und R einen Rest X-CH2- darstellen, worin X Halogen oder die Hydroxygruppe bedeutet, sowie ein Verfahren zu deren Herstellung. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung der Verbinduren a er Formel I in der Herstellurg höhermolekularer Verbindungen, insbesondere von Peptiden.
Der Ausdruck "Halogen" bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung Fluor, Chlor, Brom und Jod, wobei Chlor bevorzugt ist.
Hochmolekulares Polyäthylenglykol eignet sich und wird auch seit einiger Zeit als löslicher Träger für die Synthese von Peptiden in homogener Phase verwendet. Ein Hauptnachteil der Methode besteht jedoch darin, dass das Endprodukt praktisch nur durch alkalische Hydrolyse, Ammonolyse oder Hydrazinolyse vom Träger abgespalten werden kann, wobei insbesondere die alkalische Hydrolyse zu Racemisierungen führen kann. Für die Freisetzung von Peptiden mit freiem Carboxyl-Ende sollten jedoch die sauren Abspaltungsmethoden wie z.B. HBr/Trifluoressigsäure, flüssiges HF usw. sowie insbesondere auch die hydrogenolytische Spaltung, welche eine der mildesten Methoden darstellt, anwendbar sein.
Diese Methoden versagen jedoch bei Verwendung von Polyäthylenglycol als Matrix.
Das zu lösende Problem bestand somit in dem Auffinden eines neuen, modifizierten Trägers, der den folgenden Anforderungen genügt: 1. Der Träger muss shnliche vorzügliche chemische und physikalische Eigenschaften haben wie Polyäthylenglykol (z.B. Löslichkeit in wässrigen und organischen Lösungsmitteln,.
2. Der Träger muss mit funktionellen Gruppen ausgestattet sein, die einfach und möglichst quantitativ mit dem Carboxyl-Ende der ersten Aminosaure zur Reaktion gebracht werden können.
5. Der TrGger darf nur reaktive funktionelle Gruppen aufweisen, die kinetisch gleichberechtigt sind. Bei. Polyäthylenglykol ist diese Forderung erfüllt, da nur endständige Hydroxyl-Funktionen reagieren können.
4. Die Peptide müssen so an die Matrix gebunden werden können, dass eine Abspaltung unter den verschiedensten Bedingungen ohne Nebenreaktionen möglich ist, andererseits aber während der Peptidsynthese keine Ablösung vom Träger erfolgt.
5. Der Träger muss ein derartiges Molekulargewicht aufweisen, dass die bekannten Methoden zur Trennung hoch-und niedermolekularer Komponenten angewendet werden können.
Erfindungsgemäss wurde dieses Problem nun durch die Herstellung und Verwendung der neuen Verbindungen der obigen Formel I gelöst.
Das Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der allgemeinen Formel HO-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-O-CH2-CH2-OH worin n die obige Bedeutung hat, mit einer Säure der allgemeinen Formel worin R die obige Bedeutung hat, oder mit einem funktionellen Derivat hiervon verestert.
509886/1001 Als funktionelle Derivate der Säure der Formel III können insbesondere die entsprechenden Halogenide, vorzugsweise das Chlorid, sowie ein Anhydrid genannt werden.
Die Verbindungen der obigen Formel II und III sind bekannt.
Ein bevorzugtes Ausgangsmaterial der Formel III ist die freie Säure, worin R in p-Stellung steht und X im Rest R Chlor bedeutet, d.h. die p-Chlormethyl-benzoesäure.
Bevorzugte Ausgangsverbindungen der Formel II sind diejenigen, worin n eine Zahl von 25 bis 1500, insbesondere von 25 bis 500, vorzugsweise von 35 bis 250 und besonders bevorzugt von 50 bis 150 darstellt. Als Beispiel einer ganz besonders bevorzugten Verbindung der Formel II kann Polyäthylenglycol 4000 genannt werden (d.h. eine Verbindung der Formel II, worin nN 100).
Die Veresterung einer Verbindung der Formel II mit einer Säure der Formel III oder mit einem funktionellen Derivat hiervon erfolgt in an sich bekannter Weise, zweckmässig in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten organischen Lösungsmitte und bei einer Temperatur von etwa -200C bis etwa 15d0C, vorzugsweise von etwa -20°C bis etwa 50 0C und insbesondere bei etwa Raumtemperatur. Als Lösungsmittel können genannt werden,insbesondere aprotische Lösungsmittel, z.B. cyclische Aether wie Dioxan, Tetrahydrofuran usw., halogenierte Kohlenwassersto<,e wie Methylenchlorid, Chloroform, Chlorbenzol usw., Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und dgl.
Bei Verwendung einer Saure der Formel III, wird die Veresterung zweckmassig in Gegenwart eines Kupplungsmittels durchgeführt, wie etwa N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Carbonyldiimidazol und dgl.
Der Veresterungsgrad des Endproduktes (d.h. die Beladung mit Halo- oder Hydroxymethyl-benzoesnure) kann durch Elementaranalyse (Halogengehalt), Uv-Messungen max = 238 nm) und IR-Messungen (Ersterbande) bestimmt werden. Geeignete Endprodukte sind solche bei denen eine Beladung von wenigstens 85 vorliegt.
Die Löslichkeitseigenschaften der Verbindungen der Formel I sind analog denjenigen von Polyäthylenglycol, d.h.
diese Verbindungen sind sowohl in Wasser als auch in organischen Lösungsmitteln gut löslich,mit Ausnahme von aliphatischen Aethern und aliphatischen Kohlenwasserstoffen.
Die Verbindungen der Formel I sind im dünnschichtchromatographischen Vergleich in verschiedenen Systemen und bei Gelfiltration auf Sephadex G-25 und Sephadex LH-20 analog Polyäthylenglycol. Als grosser Vorteil gegenüber Polyäthylenglycol muss jedoch die starke UV-Aktivitst der erfindungsgemässen, neuen Träger hervorgehoben werden, die den Nachweis der Substanz jederzeit wesentlich erleichtert.
Wie vorhergehend erwähnt können die erfindungsgemässen Verbindungen der Formel I als Träger in der Herstellung von höhermolekularen Verbindungen, insbesondere von Peptiden, vorzugsweise von solchen mit bis zu etwa 20 Aminosauren, in homogener Phase verwendet werden.
Da der Träger bei einer Beladung an reaktiven Chlormethylgruppen von etwa 85-95 noch einen Restbestand an freien Hydroxylgruppen aufweist, die eventuell bei der stufenweisen Peptidsynthese Nebenreaktionen eingehen können, werden diese Hydroxylgruppen vor der Verknüpfung des Trägers mit der ersten Aminosäure zweckmssig acyliert. Eine bevorzugte Acylierung ist die Acetylierung z.B. mittels Essigsaureanhydrid/Triçthylamin.
Die im Nachfolgenden verwendeten Abkürzungen für die einzelnen Aminosäuren und ihre Schutzgruppen sind die in der Peptidchemie bisher gebräuchlichen und dem Fachmann allgemein bekannten [Literatur: Schröder, E. und Lübke, K.: The Peptides, Academic Press, New York & London, Bd. I (1965) und Bd. II (1966) und IUPAC-IUB-Regeln]; sie bedürfen daher hier keiner weiteren Definition.
Die Ankupplung der ersten Aminosäure an den erfindunssgemässen Träger,sowie der weitere Aufbau der gewunschten Peptidketten können nach den in der Peptidchemie bekannten Methoden durchgeführt werden. Die Vollständigkeit der einzelnen Kupplungsschritte kann z.B. dünnschichtchromatographisch mit Fluorescamin und durch Aminosäureanalyse geprüft werden. Die Abtrennung der überschüssigen niedermolekularen Kupplungskomponenten kann ebenfalls nach in der Peptidchemie bekannten Methoden erfolgen.
Die Abspaltung der Peptide vom Träger, kann nach allen in der Peptidchemie bekannten Methoden erfolgen und insbesondere ist es, wie bereits erhnt, nunmehr auch möglich diese Abspaltung nach sauren Methoden und hydrogenolytisch durchzuführen. Bei der Abspaltung der Peptide von dem Träger, werden je nach angewandter Methode, gleichzeitig die unter diesen Bedingungen abspaltbareneventuell vorhanderenSchutzgruppen entfernt.
Beispiel 1 120 g Polyäthylenglykol (MG 4000>, 51 g p-Chlormethyl benzoesäure und 63 g Dicyclohexylcarbodiimid wurden in einem Gemisch von 1200 ml CH2Cl2 und 500 ml absolutem Tetrahydrofuran gelöst und bei Raumtemperatur während 7 Tagen gerührt. Danach wurde auf ca. 1/3 eingeengt, abgekühlt und filtriert. Aus dem Filtrat erhielt man nach dem Eindampfen einen Rückstand, der in 250 ml CH2C12 gelöst wurde. Durch Zutropfen von kaltem absolutem Aether (1500 ml) wurde Polythylenlykol-bis(a-chloro-p-toluat) ausgefällt. Mehrmaliges Ausfällen aus CH2C12 mit Aether oder Gelfiltration auf Sephadex LH-20 in Methanol führte schliesslich zu reinem Produkt, das dünnschichtchromatographisch keine niedermolekulare Verunreinigung mehr aufwies (Kieselgelplatten, Fliessmittel: Aethylacetat oder Butanol/H2O/Essigsäure 4:1:1; das Produkt bleibt am Start). Ausbeute: 113.2 g (ca. 87).
UV: max. = 238 nm E=78.9 (10 mgg, Feinsprit) Elementaranalyse: Gef. C = 54.68 H = 8,97% Cl = 1.61 Beladung: ca. 0.45 mM/g Löslichkeit (200C): sehr gut lösl. in: H20, Aceton, Benzol, CHCl3, CH2Cl2, Dioxan, Tetrahydrofuran, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid gut lösl. in Methanol, Aethanol, n-Propanol, Isopropanol, Aethylacetat unlösl. in: Aether, Diisopropyläther, Hexan, Petrclather Beispiel 2 20 g Polvtylen3lykol-bis(a-chloro-p-toluat) [hergestellt gemäss Beispiel 1], wurden mit einem grossen ueberschuss an Essigsäureanhydrid (3.67 ml = 50 mM) und Triäthylamin (6.95 ml = 50 mM) bei Raumtemperatur während 4 Stunden acetyliert. Als Lösungsmittel dienten 200 ml CH2Cl2. Nach dem Eindampfen zur Trockene wurde der Rückstand in 30 ml CH2C12 gelöst und durch Zutropfen von 300 m:1 kaltem absolutem Aether ausgefällt. Mehrmalige Wiederholung dieser Ausfällung führte zur vollständigen Abtrennung von Essigsäureanhydrid/Triäthylamin. Ausbeute: 19.4 g (97ß) [Die Abtrennung von Essigsnureanhydrid/Triäthylamin gelang auch mit Hilfe der Ultrafiltration durch ein Ultrafilter UM-2.].
10 g wie vorhergehend acetyliertes Polyäthylenglykol-bis(a-chloro-p-toluat) und 3.6 g Boc-ProOCs (10 mM).
wurden in 100 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und während 48 Stunden auf 600C erhitzt. Danach wurde vom ausgefallenen CsC1 abdekantiert, nachgewaschen und die klare Lösung zur Trockne eingedampft. Der getrocknete Rückstand wurde in 200 ml H20 aufgenommen und mit CHC13 extrahiert. Nach Zugabe von NaC1 zur wässrigen Phase wurde mit weiteren 5 Portionen CHC1» ausgeschüttelt. Die kombinierten CHCL3-Phasen ergaben nach dem Trocknen über Na2SO4 und Eindampfen, dünnschichtchromatographisch reines ergab folgende Beladung mit Pro: 0.33 mM/g.
Die Abtrennung von niedermolekularen Verunreinigungen wie Boc-Pro-OCs und CsCl konnte auch durch mehrmaliges Umfällen aus CH2Cl2/Aether, oder durch Gelfiltrátion auf Sephadex LH-20, oder durch Ultrafiltration mit Ultrafilter UM-2 erreicht werden.
In zum Vorhergehenden analoger Weise, wurden die folgenden Produkte hergestellt: Boc-Val-OCH2-P, Beladung: 0.37 Boc-Gly-OCH2-P, Beladung: 0.33 mM/g Boc-Arg(Tos)-OCH2-P, Beladung: 0.28 mM/g.
Beispiel 3 2 g Polyäthylenglykol-bis(a-chloro-p-toluat) (acetyliert gemäss Beispiel 2) und 1.08 g Boc-Pro-OH (5 mM) wurden in 20 ml absolutem Aethanol gelöst, mit o.63 ml Triäthylamin (4.5 mM) versetzt und während 70 Stunden am Rückfluss erhitzt. Nach dem Eindampfen des Reaktionsgemisches und Aufarbeitung in zu Beispiel 2 analoger Weise, erhielt man 1,95 g Boc-Pro-OCH2-P.
Ausbeute: 95-97%. Beladung gemäss Aminosäureanalyse: 0,25 mM/g.
Beispiel 4 Synthese von H-Leu-Ala-Gly-Val-OH 6 g Boc-Val-OCH2-P (acetyliert) wurden in 24 ml Trifluoressigsäure/CH2C12 (1:1) gelöst und während 50 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem schonenden Eindampfen wurde noch zweimal in CH2C12 aufgenommen und wieder zur Trockene eingedampft. Danach wurde der Rückstand zweimal aus CH2C12 (15 ml) mit kaltem, absolutem Aether (150 ml) gefällt. Ausbeute: 5.9 g, Beladung gemäss Aminosäureanalyse: 0.29 mM/g.
Variante: Nach der Boc-Abspaltung und dem Eindampfen wurde der Rückstand in H20 (100 ml) gelöst, entgast, das pH mit verd. NaCH auf ca. 6 gestellt und anschliessend erschöpfend mit CHC13 extrahiert.
1.05 g Boc-Gly-OH (6 mM) und o.63 g Dicyc-lohexylcarbodiimid (3 mM) in 10 ml CH2C12 wurden während 50 Minuten bei 0°C gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch direkt in eine Lösung von 4 g Val-OCH2-P in 20 ml CH2C12 filtriert. Nach Zugabe von 0.2 ml N-Methylmorpholin wurde während 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt (Umsatzkontrolle auf Kieselgelplatten im Fliessmittel Butanol/H20/Essigsäure 4:1:1; Spray: 0.1% Fluorescamin in Aceton). Nach Beendigung der Kupplungsreaktion wurde das Reaktionsgemisch zur Trockene eingedampft, der Rückstand in 10 ml CH2C12 aufgenommen und mit kaltem absolutem Aether (100 ml) gefällt.
Nach zweimaliger Wiederholung der Ausfällung konnten dünnschichtchromatographisch im Produkt Boc-Gly-Val-OCH2-P keine Verunreinigungen mehr festgestellt werden. Ausbeute:3.8 g Varianten: Das Kupplungsgemisch konnte nach dem Eindampfen,durch Gelfiltration in Methanol auf Sephadex LH-20 (5x180 cm) mit gleicher Ausbeute sauber getrennt werden.
Die Abtrennung der niedermolekularen Verunreinigungen konnte auch dadurch erfolgen, dass nach der Kupplung das Reaktionsgemisch mit Trifluoressigsaure/CH2C12 (1:l)behandelt und der resultierende Rückstand in H20 aufgenommen wurde. Nach Filtration und Einstellung des pH auf ca 6 wurde durch erschöpfende Extraktion rnit CHCl reines Gly-5 Val-OCH2-P erhalten.
In zum Vorhergehenden analoger Weise, wurde Boc-Gly-Val-OCH2-P (3.8 g) mit Trifluoressigsäure/CH2Cl2 (1:1) deblockiert und mit dem symmetrischen Anhydrid von Boc-Ala-O-T gekuppelt. Das Reaktionsgemisch wurde nach dem Eindampfen direkt während 50 Minuten mit Trifluoressigsäure/CH2Cl2 (1:1) (30 ml) behandelt. Nach mehrmaligem Eindampfen wurde der trockene Rückstand in 150 ml H20 aufgenommen, entgast und filtriert. Das pH des Filtrates wurde mit verdünnter NaOH auf ca. 6 gestellt und anschliessend, nach NaCl-Zugabe,ererschöpfend mit CHCl5 extrahiert. Die kombinierte CHC13-Phase lieferte nach dem Trocknen (Molekularsieb) und Eindampfen 5.4 g Ala-Gly-Val-OCH2-P, das in gleicher leise mit dem symetrischen Anhydrid von Z-Leu-OH gekuppelt wurde. Nach Abtrennung der niedermolekularen Verunreinigungen durch mehrmaliges Ausfällen aus CH2Cl2/Aether wurden 5.2 g Z-Leu-Ala-Gly-Val-OCH2-P erhalten. (78 berechnet auf das Ausgangsprodukt Val-OCH2-P).
Aminosäureanalyse: Val:Gly:Ala:Leu = 1.00:0.98:1.01:1.04 Beladung: 0.29 mM/g 0.5 g Z-Leu-Ala-Gly-Val-OCW,-P wurden in Methanol/EssigsGure/H20 (8:1:1)gelöst und während 40 Stunden in Gegenwart von ca. 0.1 g 5 Pd/Kohle hydriert. Nach der Filtration wurde zur Trockene eigedampft und der Rückstand in H20 aufgenommen. Durch erschöpfende Extraktion mit 6 Portionen CHCl3 wurde das Trägermaterial vom freien Peptid abgetrennt. Die Lyophilisation der wässrigen Phase lieferte 0.21 g rohes H-Leu-Ala-Gly-Val-OH, das gemäss Aminosäureanalyse folgendes Aminosäureverhältnis zeigte: Val:Gly:Ala:Leu = 1.00:0.80:0.85:0.85. Der Peptidanteil im rohen Tetrapeptid betrug 17.8X, d.h. bezogen auf die erste Aminosäure (Val) betrug die Ausbeute der Abspaltung 71.5%. Im dünnschichtchromatographischen Vergleich mit authentischem H-Leu-Ala-Gly-Val-OH verhielt sich das Produkt genau entsprechend (Rf in Butanol/H20/Essigsäure 4:1:1 = 0.36, Rf in Butanol/Essigsäure/H2O/Aethylacetat 1:1:1:1 = 0.52, Rf in Butanol/Essigsäure/H2O/Pyridin 15:3:12:10 = 0.45).
0.5 g Z-Leu-Ala-Gly-Val-OCH2-P wurden in 2 ml Anisol suspendiert und während 30 Minuten bei 0°C mit 15 ml flüssigem HF behandelt. Nach der Entfernung des HF wurde der Rückstand in H20 (ca. 50 ml) aufgenorrmen und mit Aether extrahiert. Danach wurde die wässrige Phase erschöpfend mit CHCl3 extrahiert. Lyophilisation der wässrigen Phase lieferte 0.28 g rohes Tetrapeptid, das gemss Aminosäureanalyse folgende Zusammensetzung aufwies: Val:Gly:Ala: Leu = 1.00:0.90:1.05:0.85.
Peptidanteil: 10.25, d.h. Ausbeute der Abspaltung = 54.c,.
Dünnschicht wie oben beschrieben.
0.5 g Z-Leu-Ala-Gly-Val-OCH2-P gelöst in 20 ml H20 wurden mit 0.8 ml 1N KOH versetzt und während 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. (Verfolgung der Reaktion auf DG) Danach wurde mit 0.8 ml 1N HC1 n-eutralisiert, zur Trockene eingedampft und der Rückstand in Methanol (50 ml) aufgenommen.
Hydrierung in Gegenwart von 5 Pd/Kohle über Nacht lieferte rohes Tetrapeptid, das wie vorhergehend beschrieben, vom Trägermaterial abgetrennt wurde. Ausbeute: 0.18 g. Aminosäureanalyse: Val:Gly:Ala:Leu = 1.00:1;02:0.88:0.84. Peptidanteil: 15.5%, d.h. Ausbeute der Abspaltung = 46.3ß.
Dünnschicht wie oben beschrieben.
0.5 g Z-Leu-Ala-Gly-Val-OCH2-P wurden in 20 ml absoluter Trifluoressigsäure gelöst, worauf bei Raumtemperatur während 90 Minuten HBr in die Lösung eingeleitet wurde. Nach dem Eindampfen des Reaktionsgemisches wurde der Rückstand in CH2C 12 aufgenommen. Mehrmaliges Eindampfen aus CH2C12 entfernte weitgehend HBr/Trifluoressigsaure und führte zu einem Rückstand der in H20 aufgenommen wurde.
Durch CHC13-Extraktion wurde das Trägermaterial abgetrennt und durch Lyophilisation der wässrigen Phase wurden 0.12 g rohes Tetrapeptid gewonnen. Aminosäureanalyse: Val:Gly:Ala-Leu = 1.00:1.05:1.10:1.05. Peptidanteil: 7.5X, d.h. Ausbeute der Abspaltung = 16%. Dünnschicht wie oben beschrieben.
Beispiel 5 Ammonolyse von H-Pro-OCH2-P Zu 1.2 g H-Pro-OCH2-P (acetyliert, 0.33 mM/g) in 12 ml absolutem Methanol wurden bei -10°C 50 ml 10N NH-/Methane 5 gegeben. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wurde zur Trockene eigedampft, der Rückstand in H20 aufgenommen und mit 6 Portionen CHCl3 extrahiert. Die wässrige Phase lieferte nach Lyophilisation praktisch reines Prolinamid in einer Ausbeute von über 90%, wie durch dünnschichtchromatographische Vergleich mit authentischem Prolinamid gezeigt werden konnte.
Beispiel 6 Synthese von Bradykinin 19.5 g Boc-Arg(Tos)-OCH2-P (acetyliert) wurden während 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Trifluoressigsäure/CH2Cl2 1:1 (200 ml) behandelt. Nach dem Eindampfen wurde zweimal aus CH2Cl2 (25 ml)/Aether (250 ml) gefällt, das resultierende Produkt in 250 ml H20 gelöst und unter NaCl-Zugabe mit CHCl3 erschöpfend extrahiert. Die kombinierte CHC13-Phase lieferte nach dem Trocknen und Einda!npfen 18.1 g deblockiertes Produkt. Beladung gemäss Aminosäureanalyse: 0.20 mM/g.
2.66 g Boc-Phe-0H (10 mM) und 1.05 g Dicyclohexylcarbodiimid (5 mM) wurden in 23 ml CH2C12 bei 0^C während 1 Stunde gerührt. Danach wurde dieses Reaktionsgemisch direkt in eine Lösung von 10 g Arg(Tos)-OCH2-P in 50 ml CH2C12 filtriert. Nach Zugabe von 0.44 ml N-Methylmorpholin wurde diese Lösung während 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach der; Eindampfen wurden die niedermolekularen Verunreinigurgen in zu Beispiel 4 analoger Weise abgetrennt und dünnschichtchromatographisch reines Boc-Phe-Arg(Tos)-OCH2-P erhalten. Ausbeute: 10.3 g. Aminosäureanalyse: arg: Phe = 1.00:1.02, Beladung : 0.22 miT/g.
In zum Vorhergehenden analoger Weise wurde Boc-Phe-Arg(Tos)-OCH2-P deblockiet un mit dem symetrischen Anhydrid von Boc-Pro-OH gekuppelt. Die Aufarbeitung erfolgte wie vorhergehend beschrieben. Ausbeute an Boc-Pro-Phe-Arg(Tos)-OCH2-P: 9.8 g. Aminosäureanalyse: Arg:Phe-Pro = 1.00:1.02:0.99 Beladung: 0.21 mM/g.
Nach der nächsten Kupplung mit dem symmetrischen Anhydrid von Boc-Ser(Bzl)-OH wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand in H20 aufgenommen. Durch Extraktion mit einem Gemisch aus Aether/Aethylacetat(4:1)konnten die niedermolekularen Verunreinigungen entfernt werden. Die wässrige Phase wurde darauf, unter Zusatz von NaCl, mit CHC1» erschöpfend extrahiert. Die kombinierte CHCl-Phase lieferte nach dem Trocknen (Molekularsieb) und Eindampfen 9.4 g reines Boc-Ser(Bzl)-Pro-Phe-Arg(Tos)-OCH2-P. Aminosäureanalyse: Arg:Phe*Pro:Ser = 1.00:1.00:1.01:1.00.
Beladung: 0.21 mnl/g.
In zum Vorhergehenden analoger Weise, wurden hierauf Boc-Phe-OH und dann Boc-Gly-OH angekuppelt und man erhielt Boc-Gly-Phe-Ser(Bzl)-Pro-Phe-Arg(Tos)-OCH2-P. Aminosäureanalyse: Arg: Phe:Pro:Ser:Gly = 1.00:2.06:1.00:0.93:1.08.
Beladung: 0.20 m.uj/g.
In zum Vorhergehenden analoger Weise, wurden hierauf zwei Prolinderivate angekuppelt und man erhielt Boc-Pmo-Boc-Gly-Phe-Ser(Bzl)-Pro-Phe-Arg(Tos)-OCH2-P. Aminosäureanalyse: Phe:Pro:Ser:Gly = 2.00:2.82:0.92:1.01 (Arg nicht bestimmt), Beladung: 0.19 mM/g.
Die letzte Kupplung wurde nach Abspaltung der Boc-Schutzgruppen mit dem symmetrischen Anhydrid von in CH2Cl2/Dimethylformamid (2:1) über Nacht durchgeführt.
Nach dem Eindampfen wurde der Rückstand in Methanol aufgenommen und die niedermolekularen Verunreini--ungen durch Gelfiltration auf Sephadex LH-20 (180x5 cm) abgetrennt.
Es wurde dünnschichtchromatographisch reines Boc-Arg(Tos)-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser(Bzl)-Pro-Phe-Arg(Tos)-OCH2-P erhalten.
Aminosäureanalyse: Arg:Phe:Pro:Ser:Gly = 2.00:2.02:3.01:0.94: 1.01. Beladung: 0.19 mM/g.
Durch Behandlung des Boc-geschützten Nonapeptides mit 100 ml Trifluoressigsaure/CH2C12 (1:1)und anschliessende zweimalige Fällung aus CH2Cl2/Aether wurde Arg(Tös)-Pro-Pro Gly-Phe-Ser(Bzl)-Pro-Phe-Arg(Tos)-OCH2 -P erhalten.
1 g Arg(Tos)-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser(Bzl)-Pro-Phe-Arg(Tos) OCH2-P, suspendiert in 5 ml Anisol, wurde während 45 Minuten mit 20 ml flüssigem HF bei Raumtemperatur behandelt. Nach dem Abziehen des HF wurde der Rückstand in H2O/Aether aufgenommen und das pH mit verdünnter NH3-Lösung auf ca.
5 gestellt. Nach mehrmaliger Extraktion mit Aether wurde die wässrige Phase mit 5 Portionen CHC1 unter NaCl-Zusatz 5 ausgeschüttelt. Zur Abtrennung der anorganischen Salze wurde die H20-Phase mit 5 Portionen Phenol (je ca. 50 ml) extrahiert und die kombinierte Phenol-Phase darauf zwischen Aether (1 Liter) und H2O (5. Portionen von je ca. 100 ml) verteilt.
Nach dem schonenden Eindampfen der wässrigen Phase erhielt man einen Rückstand von 0.75 g, der durch Gelfiltration in 0.2 M Essigsäure auf Sephadex G-10 (3x95 cm) von restlichem Trägermaterial und Salzen befreit wurde. Anschliessende Ionenaus auschchror-atographie auf Amberlite CG-50 (1.1x10 cm mit einem Gradienten von verdünnter Essigsäure (H2O#ca. 10N Essigsäure) lieferte reines Bradykininacetat. Nach Lyophilisation aus H2O wurden 50 mg Produkt erhalten (20.2% Totalausbeute berechnet auf die erste Aminosäure). Aminosäureanalyse: Arg:Phe:Pro:Ser:Gly = 2.00:2.01:2.96:0.96:1.02: Peptidanteil: 82.2.
C50H73O11N15#2C2H4O2#3H2O Ber. C = 51.87% H = 7.01% N = 16.80% (1234.40) Gef. C = 51.61% H = 6.94 N = 16.82W-[a]D5 = -86.9° (c = 0.5, 1N Essigsäure) Im dünnschichtchromatographischen Vergleich auf Kieselgel und Cellulose-Platten in den verschiedensten Systemen,verhielt sich die Substanz entsprechend wie authentisches Bradykinin. Nach enzymatischem Abbau mit Chymotrypsin erhielt man von beiden Substanzen identische Bruchstücke.
1 g Arg(Tos)-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser(Bzl)-Pro-Phe-Arg(Tos)-OCH2-P in einem Gemisch von Methanol/Essigsäure/H20 8:1:1 (50 ml) wurde in Gegenwart von 0.2 g 10 Pd/BaS04 während 48 Stunden hydriert. Danach wurde filtriert, gut nachgewaschen und zur Trockene eingedampft. Der resultierende Rückstand wurde direkt in 3 ml Anisol suspendiert und bei Raumtemperatur während 45 Minuten mit 20 ml HF behandelt.
Nach dem Abziehen des HF wurde in H20 aufgenommen, das pH auf ca. 5 gestellt und mit Aether extrahiert. Die wässrige Phase wurde darauf schonend eingedampft und der Rückstand durch Gelfiltration in 0.2M Essigsäure auf Sephadex G-10 (3x95 cm) gereinigt. Die anschliessende lonenaustauschchromatographie auf Amberlite CG-50, -ausgeführt wie oben beschrieben-, lieferte reines Bradykininacetat. Nach Lyophilisation aus H2 0 wurden 101 mg Produkt erhalten (40.5 Totalausbeute berechnet auf die erste Aminosäure). I-.
dünnschichtchromatographischen Vergleich mit dem vorher beschriebenen Präparat erwies sich das Produkt als absolut identisch.
Beispiel 7 Synthese von LH-RH.
10 g Polyäthylenglykol-bis[α-chloro-p-toluat] (acetylier und 3,2 g Boc-Gly-OCs wurden in 100 ml abs. Dimethylformamid gelöst und während 72 Stunden auf 600C erhitzt. Nach der Abtrennung vom ausgefallenen CsCl wurde das Filtrat zur Trockene eingedampft und der Rückstand in H20 (200 ml) aufgenommen und mit CHCl3 extrahiert. Die kombinierte CHCl3-Phase ergab nach dem Trocknen (Na2S04)' und Eindampfen dünnschichtchromatographisch reines Boc-Gly-OCH2-P.
Ausbeute: 9,9 g Beladung gemäss Aminosäureanalyse: 0,30 mM/g 8 g des obigen Produktes wurden während 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Trifluoressigsäure/CH2Cl2 1:1 (100 ml) behandelt.
Nach dem Eindampfen wurde der Rückstand wieder in CH2C12 aufgenommen und wiederum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde nunmehr in H20 ( N 200 ml) aufgenommen und das pH der Lösung mit verd. NaOH auf 5-6 gestellt. Nach dem Entgasen der Lösung wurde unter NaCl-Zugabe erschöpfend mt CHC1 extrahiert. Nach dem Trocknen und Eindampfen erhielt man 5 8 g deblockiertes Produkt.
2,15 g Boc-Pro-OH (10 mM) und 1,05 g DCC ( 5 mM) wurden in 10 ml CH2C12 bei OOC während 1 Stunde gerührt. Danach wurde dieses Reaktionsgemisch direkt in eine Lösung von 8 g Gly-OCH2-P in 50 ml CH2C12 filtriert. Nach Zugabe von 0,44 ml N-Nethyltrorpholin wurde das Kupplungsgemisch während 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschliessend zur Trockene eingedapft. Zur Abtrennung der niedermolekularen Verunreinigungen wurde der Rückstand in ethanol gelöst und über eine Säule (5x180 cm von Sephadex LH-20 gelfiltriert, worauf 8,0 g dünnschichtchromatographisch reines Boc-Pro-Gly-OCH2-P erhalten wurden.
Die Deblockierung von Boc-Pro-Gly-OCH,-P wurde entsprechend wie oben beschrieben durchgeführt. In analoger Weise wie für Boc-Pro-OH beschrieben wurde darauf mit dem symmetrischen Anhydrid von Boc-Arg(Tos)-OH (4,3 g Boc-Arg(Tos) OH + 1,05 g DCC) in Anwesenheit von 0,44 ml N-Methylmorpholin gekuppelt (Lösungsmittel: i)imethylformamid/CH2Cl2 1:1) und anschliessend mit Hilfe von Sephadex LH-20 gereinigt. Ausbeute: 7,8 g, Aminosäureanalyse: Gly:Pro:Arg = 1.00:0.89:0.87 Beladung: 0.26 mM/g.
Nach entsprechender Wiederholung des obigen Synthesecyklus mit Boc-Leu-OH (Ausbeute: 7,7 g), Boc-Gly-OH (Ausbeute: 7,7 g) und Boc-Tyr(Bzl)-OH erhielt man 8 g Boc-Tyr(Bzl)-Gly-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-OCH2-P.
Aminosäureanalyse: Gly:Pro:Arg:Leu:Tyr = 2.00:0.87:0.87:0.93:0.8-.
Beladung: 0.24 mN/g.
Der weitere Umsatz mit Boc-Ser(Bzl)-OH (Ausbeute: 8,1 g), Boc-Trp-OH (Ausbeute: 8,3 g) und Boc-(Nim-Dnp)-His-OH führte zu 8,4 g Boc-(Nim-Dnp)-His-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Gly-Leu-Arg (Tos)-Pro-Gly-OCH2-P das nach Deblockierung, während 20 Stunden mit 3,76 g pGlu-OPhC15 in Dt.F (80 ml) zur Reaktion gebracht wurde (Zugabe von 0,44 ml N-Methylmorpholin). Nach der Reinigung über Sephadex LH-20 erhielt man 8,9 g pGlu-His(Dnp)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Gly-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-OCH2-P.
Aminosäureanalyse: Gly:Pro:Arg:Leu:Tyr:Ser:Glu = 2.00:0.84: 1.01:1.02:1.00:1.04:0.8) (His und Trp nicht bestimmt) Beladung: 0.24 m.g.
7,8 g pGlu-His(Dnp)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Gly-Leu Arg(Tos)-Pro-Gly-0CH2 -P wurden in der Kälte (-20°C) mit 100 ml 10 N NH3/abs. Methanol versetzt und anschliessend während 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Eindampfen wurde der Rückstand über Sephadex LH-20 (5 x 180 cm gereinigt (Abtrennung des polymeren Materials vom Peptid).
Ausbeute an rohem pGlu-His-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Gly-Leu-Arg-(Tos)-Pro-Gly-NH2 : 1,8 g.
Zur Entfernung der Schutzgruppen wurden obige 1,8 g in 60 ml Methanol/Essigsäure/H2O (8:1:1) gelöst und in Anwesenheit von 10 Pd/BaSO4 während 15 Stunden hydriert.
Nach Filtration und Eindampf en zur Trockene wurde der Rückstand während 45 Minuten bei OOC in Anwesenheit von 5 ml Anisol mit 40 ml flüssigem HF behandelt. Nach dem Abziehen des HF wurde der Rückstand in H2O/Aethylacetat aufgenommen und das pH mit verdünnter NH3-Lösung auf ca. 5 gestellt. Nach mehrmaliger Extraktion mit Aethylacetat wurde die wässrige Phase lyophilisiert und der anfallende Rückstand über Amberlite CG-50 (1.6x21 cm) chromatographiert (H20, dann Gradient verdünnter Essigsäure: H2O#5N Essigsäure). Es wurden 1,2 g rohes Produkt erhalten, das durch Gelfiltration über Sephadex G-25 (5 x 80 cm) in 0.2 M Essigsäure weiter gereinigt wurde (Hauptfraktion: ö,8 g). Die anschliessende Verteilungschromatographie auf Sephadex. G-25 (5 x 80 cm) im System n-Butanol/Benzol/0.2 M Ammoniumacetat, pH 5.5, 100:4:100, lieferte schliesslich nach mehrmaliger Lyophilisation aus verdünnter Essigsäure bzw. H20 reines Produkt als Acetat.
Ausbeute: 450 mg (Totalausbeute berechnet auf die erste Aminosäure: 16.5%). Aminosäureanalyse: Glu:His:Trp:Ser:Tyr: Gly:Leu:Arg:Pro = 1.00:0.99:0.98:0.88:1.01:2.00:0.98:1.01:1.02.
Peptidanteil: 80,4 % C55H75O13N17#2C2H4O2 # 5H2O Ber.: C=50.89% H = 6.73% N = 17.10% H2O = 6.47% [1392.49] Gef.: C=51.11% H = 6.83% N = 17.39% H2O = 6.62% [α]D25 = -50.6° # 2° [c = 1,1% Essigsäure] Im dünnschichtchromatographischen Vergleich auf Kieselge und Cellulose-Platten in den verschiedensten Systemen war die Substanz homogen und verhielt sich genau entsprechend wie authentisches Produkt, das nach klassischen Methoden hergestellt worden war. Der enzymatische Abbau mit Chymotrypsin lieferte von beiden Substanzen identische Bruchstücke.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur fierstellung von Polymerverbindungen der allgemeinen Formel worin n eine Zahl von etwa 25 bis etwa 2500 und R einen Rest X-CH2- darstellen, worin X Halogen oder die Hydroxygruppe bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der allgemeinen Formel HO-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]n-O-CH2-CH2-OH II worin n die obige Bedeutung hat, mit einer Säure der allgemeinen Formel worin R die obige Bedeutung hat, oder mit einem funktionellen Derivat hiervon,verestert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch geXennzeich-ev dass man als Ausgangsmaterial eine Verbindung der Formel III verwendet, worin R in p-Stellung steht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsmaterial eine Verbindung der Formel III verwendet, worin X im Rest R ein Chloratom darstellt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsmaterial eine Verbindung der Formel II verwendet, worin n eine Zahl von 25 bis 1500, insbesondere von 25 bis 500, vorzugsweise von 55 bis 250 und besonders bevorzugt von 50 bis 150 darstellt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Veresterung einer Verbindung der Formel II mit einer Säure der Formel III in Gegenwart eines Kupplungsmittels, insbesondere Dicyclohexylcarbodiimid durchgeführt.

6. Polymerverbindungen der allgemeinen Formel worin n eine Zahl von et 25 bis etwa 2500 und R einen Rest X -OH2- darstellen, worin X Halogen oder die Hydroxygruppe bedeutet.

7. Polymerverbindungen gemäss Anspruch 6, worin R in p-Stellung steht.

8. Polymerverbindungen gemäss Anspruch 6 oder 7, worin X im Rest R ein Chloratom darstellt.

9. Polymerverbindungen gemäss Anspruch 6, 7 oder 8, worin n eine Zahl von 25 bis 1500, insbesondere von 25 bis 500, vorzugsweise von 35 bis 250 und besonders bevorzugt von 50 bis 150 darstellt.

10. Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel worin n eine Zahl von etwa 25 bis etwa 2500 und R einen Rest X-CH2- darstellen, worin X Halogen oder die Hydroxygruppe bedeutet, als Trägermaterial für Peptidsynthesen in homogener Phase.