Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Polymerverbindungen der allgemeinen Formel
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worin n eine Zahl von 25 bis 2500 und R einen Rest X-CH2darstellen, worin X Halogen oder die Hydroxygruppe bedeutet, sowie die Verwendung der Verbindungen der Formel I als Trägermaterial in der Herstellung höhermolekularer Verbindungen, insbesondere von Peptiden.
Der Ausdruck Halogen bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung Fluor, Chlor, Brom und Jod, wobei Chlor bevorzugt ist.
Hochmolekulares Polyäthylenglykol eignet sich und wird auch seit einiger Zeit als löslicher Träger für die Synthese von Peptiden in homogener Phase verwendet. Ein Hauptnachteil der Methode besteht jedoch darin, dass das Endprodukt praktisch nur durch alkalische Hydrolyse, Ammonolyse oder Hydrazinolyse vom Träger abgespalten werden kann, wobei insbesondere die alkalische Hydrolyse zu Racemisierungen führen kann. Für die Freisetzung von Peptiden mit freiem Carboxyl-Ende sollten jedoch die sauren Abspaltungsmethoden wie z. B. HBr/Trifluoressigsäure, flüssiges HF usw. sowie insbesondere auch die hydrogenolytische Spaltung, welche eine der mildesten Methoden darstellt, anwendbar sein. Diese Methoden versagen jedoch bei Verwendung von Polyäthylenglycol als Matrix.
Das zu lösende Problem bestand somit in dem Auffinden eines neuen, modifizierten Trägers, der den folgenden Anforderungen genügt:
1. Der Träger muss ähnliche vorzügliche chemische und physikalische Eigenschaften haben wie Polyäthylenglykol (z. B. Löslichkeit in wässrigen und organischen Lösungsmitteln).
2. Der Träger muss mit funktionellen Gruppen ausgestattet sein, die einfach und möglichst quantitativ mit dem Carboxyl-Ende der ersten Aminosäure zur Reaktion gebracht werden können.
3. Der Träger darf nur reaktive funktionelle Gruppen aufweisen, die kinetisch gleichberechtigt sind. Bei Polyäthylenglykol ist diese Forderung erfüllt, da nur endständige Hydroxyl Funktionen reagieren können.
4. Die Peptide müssen so an die Matrix gebunden werden können, dass eine Abspaltung unter den verschiedensten Bedingungen ohne Nebenreaktionen möglich ist, anderseits aber während der Peptidsynthese keine Ablösung vom Träger erfolgt.
5. Der Träger muss ein derartiges Molekulargewicht aufweisen, dass die bekannten Methoden zur Trennung hochund niedermolekularer Komponenten angewendet werden können.
Erfindungsgemäss wurde dieses Problem nun durch die Herstellung und Verwendung der neuen Verbindungen der obigen Formel I gelöst.
Das Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der allgemeinen Formel Ho-CH,CH,-(o-CH,CH,)O-CH,-CH,OH II worin n die obige Bedeutung hat, mit einer Säure der allgemeinen Formel
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worin R die obige Bedeutung hat, oder mit einem funktionellen Derivat hiervon verestert.
Als funktionelle Derivate der Säure der Formel III können insbesondere die entsprechenden Halogenide, vorzugsweise das Chlorid, sowie ein Anhydrid genannt werden.
Die Verbindungen der obigen Formel II und III sind bekannt.
Ein bevorzugtes Ausgangsmaterial der Formel III ist die freie Säure, worin R in p-Stellung steht und X im Rest R Chlor bedeutet, d. h. die p-Chlormethyl-benzoesäure.
Bevorzugte Ausgangsverbindungen der Formel II sind diejenigen, worin n eine Zahl von 25 bis 1500, insbesondere von 25 bis 500, vorzugsweise von 35 bis 250 und besonders bevorzugt von 50 bis 150 darstellt. Als Beispiel einer ganz besonders bevorzugten Verbindung der Formel II kann Poly äthylenglycol 4000 genannt werden (d. h. eine Verbindung der Formel II, worin n = 100).
Die Veresterung einer Verbindung der Formel II mit einer Säure der Formel III oder mit einem funktionellen Derivat hiervon, erfolgt in an sich bekannter Weise, zweckmässig in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten organischen Lösungsmittel und bei einer Temperatur von -20 bis 1500 C, vorzugsweise von -20 bis 50 C, und insbesondere bei Raumtemperatur. Als Lösungsmittel können genannt werden, insbesondere aprotische Lösungsmittel, z. B. cyclische Äther wie Dioxan, Tetrahydrofuran usw., halogenierte Kohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid, Chloroform, Chlorbenzol usw., Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und dgl.
Bei Verwendung einer Säure der Formel III wird die Veresterung zweckmässig in Gegenwart eines Kupplungsmittels durchgeführt, wie etwa N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Carbonyldiimidazol u. dgl.
Der Veresterungsgrad des Endproduktes (d. h. die Beladung mit Halo- oder Hydroxymethyl-benzoesäure) kann durch Elementaranalyse (Halogengehalt), UV-Messungen (AmaX = 238 nm) und IR-Messungen (Esterbande) bestimmt werden. Geeignete Endprodukte sind solche, bei denen eine Beladung von wenigstens 85% vorliegt.
Die Löslichkeitseigenschaften der Verbindungen der Formel I sind analog denjenigen von Polyäthylenglycol, d. h.
diese Verbindungen sind sowohl in Wasser als auch in organischen Lösungsmitteln gut löslich, mit Ausnahme von aliphatischen Äthern und aliphatischen Kohlenwasserstoffen.
Die Verbindungen der Formel I sind im dünnschichtchromatographischen Vergleich in verschiedenen Systemen und bei Gelfiltration auf Sephadex G-25 und Sephadex LH-20 analog Polyäthylenglycol. Als grosser Vorteil gegenüber Polyäthylenglycol muss jedoch die starke UV-Aktivität der erfindungsgemässen, neuen Träger hervorgehoben werden, die den Nachweis der Substanz jederzeit wesentlich erleichtert.
Wie vorhergehend erwähnt, können die Verbindungen der Formel I als Träger in der Herstellung von höhermolekula ren Verbindungen, insbesondere von Peptiden, vorzugsweise von solchen mit bis zu etwa 20 Aminosäuren, in homogener Phase verwendet werden.
Da der Träger bei einer Beladung an reaktiven Chlormethylgruppen von 85-95 % noch einen Restbestand an freien Hydroxylgruppen aufweist, die eventuell bei der stufenweisen Peptidsynthese Nebenreaktionen eingehen können, werden diese Hydroxylgruppen vor der Verknüpfung des Trägers mit der ersten Aminosäure zweckmässig acyliert. Eine bevorzugte Acylierung ist die Acetylierung, z. B. mittels Essigsäurean hydrid/Triäthylamin.
Die im nachfolgenden verwendeten Abkürzungen für die einzelnen Aminosäuren und ihre Schutzgruppen sind die in der Peptidchemie bisher gebräuchlichen und dem Fachmann allgemein bekannten [Literatur: Schröder, E. und Lübke, K.: The Peptides, Academic Press, New York & London, Bd. I (1965) und Bd. II (1966) und IUPAC-IUB-Regeln]; sie bedürfen daher hier keiner weiteren Definition.
Die Ankupplung der ersten Aminosäure an den erfindungsgemäss hergestellten Träger, sowie der weitere Aufbau der gewünschten Peptidketten können nach den in der Peptidchemie bekannten Methoden durchgeführt werden. Die Vollständigkeit der einzelnen Kupplungsschritte kann z. B. dünnschichtchromatographisch mit Fluorescamin und durch Aminosäureanalyse geprüft werden. Die Abtrennung der überschüssigen niedermolekularen Kupplungskomponenten kann ebenfalls nach in der Peptidchemie bekannten Methoden erfolgen.
Die Abspaltung der Peptide vom Träger kann nach allen in der Peptidchemie bekannten Methoden erfolgen und insbesondere ist es, wie bereits erwähnt, nunmehr auch möglich, diese Abspaltung nach sauren Methoden und hydrogenolytisch durchzuführen. Bei der Abspaltung der Peptide von dem Träger werden je nach angewandter Methode, gleichzeitig die unter diesen Bedingungen abspaltbaren, eventuell vorhandenen Schutzgruppen entfernt.
Beispiel 1
120 g Polyäthylenglykol (MG 4000), 51 g p-Chlormethylbenzoesäure und 63 g Dicyclohexylcarbodiimid wurden in einem Gemisch von 1200 ml CH2Cl2 und 500 ml absolutem Tetrahydrofuran gelöst und bei Raumtemperatur während 7 Tagen gerührt. Danach wurde auf ca. 1/3 eingeengt, abgekühlt und filtriert. Aus dem Filtrat erhielt man nach dem Eindampfen einen Rückstand, der in 250 ml CH2C12 gelöst wurde. Durch Zutropfen von kaltem absolutem Äther (1500 ml) wurde Polyäthylenglykol-bis(a-chloro-p-toluat) ausgefällt.
Mehrmaliges Ausfällen aus CH2C12 mit Äther oder Gelfiltration auf Sephadex LH-20 in Methanol führte schliesslich zu reinem Produkt, das dünnschichtchromatographisch keine niedermolekulare Verunreinigung mehr aufwies (Kieselgelplatten, Fliessmittel: Äthylacetat oder Butanol/H2O/ Essigsäure 4:1:1; das Produkt bleibt am Start). Ausbeute: 113,2 g (ca. 87%).
UV: ,,ax. = 238 nm E=78,9 (10 mg%, Feinsprit)
Elementaranalyse:
Gef. C = 54,68% H = 8,97% Cl = 1,61%
Beladung: ca. 0,45 mM/g
Löslichkeit (20 C): sehr gut löslich in: H2O, Aceton, Benzol, CHCl3, CH2Cl2, Dioxan, Tetrahydrofuran, Dimethyl sulfoxid, Dimethylformamid gut löslich in Methanol, Äthanol, n-Propanol, Isopropanol, Äthylacetat unlöslich in Äther, Diisopropyläther, Hexan, Petroläther
Beispiel 2
20 g Polyäthylenglykol-bis (a -chloro-p-toluat) [hergestellt gemäss Beispiel 1], wurden mit einem grossen Überschuss an
Essigsäureanhydrid (3,67 ml = 50 mM) und Triäthylamin (6,95 ml = 50 mM) bei Raumtemperatur während 4 Stunden acetyliert.
Als Lösungsmittel dienten 200 ml CH2C12. Nach dem Eindampfen zur Trockne wurde der Rückstand in 30 ml CH2CI2 gelöst und durch Zutropfen von 300 ml kaltem absolutem Äther ausgefällt. Mehrmalige Wiederholung dieser Ausfällung führte zur vollständigen Abtrennung von Essigsäureanhydrid/Triäthylamin. Ausbeute: 19,4 g (97%) [Die Abtrennung von Essigsäureanhydrid/Triäthylamin gelang auch mit Hilfe der Ultrafiltration durch ein Ultrafilter UM-2].
10 g wie vorhergehend acetyliertes Polyäthylenglykol bis(.2-chloro-p-toluat) und 3,6 g Boc-ProOCs (10 mM) wurden in 100 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und während 48 Stunden auf 60 C erhitzt. Danach wurde vom ausgefallenen CsCI abdekantiert, nachgewaschen und die klare Lösung zur Trockne eingedampft. Der getrocknete Rückstand wurde in 200 ml H2O aufgenommen und mit CHCl3 extrahiert. Nach Zugabe von NaCl zur wässrigen Phase wurde mit weiteren 5 Portionen CHCl3 ausgeschüttelt. Die kombinierten CHCl3-Phasen ergaben nach dem Trocknen über Na2SO4 und Eindampfen, dünnschichtchromatographisch reines Boc
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Ausbeute: 9,5 g (92-95 %).
Die Aminosäureanalyse ergab folgende Beladung mit Pro: 0,33 mM/g.
Die Abtrennung von niedermolekularen Verunreinigungen wie Boc-Pro-OCs und Cs Cl konnte auch durch mehrmaliges Umfällen aus CH2Cl2/Äther, oder durch Gelfiltration auf Sephadex LH-20, oder durch Ultrafiltration mit Ultrafilter UM-2 erreicht werden.
In zum Vorhergehenden analoger Weise wurden die folgenden Produkte hergestellt: Boc-Val-OCHrP, Beladung: 0,37 mM/g Boc-Gly-OCH2-P, Beladung: 0,33 mM/g Boc-Arg(Tos)-OCH2-P, Beladung: 0,28 mM/g.
Beispiel 3
2 g Polyäthylenglykol-bis(a-chloro-p-toluat) (acetyliert gemäss Beispiel 2) und 1,08 g Boc-Pro-OH (5 mM) wurden in 20 ml absolutem Äthanol gelöst, mit 0,63 ml Triäthylamin (4,5 mM) versetzt und während 70 Stunden am Rückfluss erhitzt. Nach dem Eindampfen des Reaktionsgemisches und Aufarbeitung in zu Beispiel 2 analoger Weise, erhielt man 1,95 g Boc-Pro-OCH2-P.
Ausbeute: 95-97%. Beladung gemäss Aminosäureanalyse: 0,25 mM/g.
Beispiel 4 Synthese von H-Leu-Ala-Gly-Val-OH
6 g Boc-Val-OCH2-P (acetyliert) wurden in 24 ml Tri fluoressigsäure/CH2Cl2 (1 :1) gelöst und während 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem schonenden Eindampfen wurde noch zweimal in CH2C12 aufgenommen und wieder zur Trockene eingedampft. Danach wurde der Rückstand zweimal aus CH2C12 (15 ml) mit kaltem, absolutem Äther (150 ml) gefällt. Ausbeute: 5,9 g, Beladung gemäss Aminosäureanalyse: 0,29 mM/g.
Variante: Nach der Boc-Abspaltung und dem Eindampfen wurde der Rückstand in H20 (100 ml) gelöst, entgast, das pH mit verd. NaOH auf ca. 6 gestellt und anschliessend erschöpfend mit CHCl3 extrahiert.
1,05 g Boc-Gly-OH (6 mM) und 0,63 g Dicyclohexylcarbodiimid (3 mM) in 10 ml CH2CI2 wurden während 30 Minuten bei 0 C gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch direkt in eine Lösung von 4 g Val-OCH2-P in 20 ml CH2Cl2 filtriert. Nach Zugabe von 0,2 ml N-Methylmorpholin wurde während 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt (Umsatzkontrolle auf Kieselgelplatten im Fliessmittel Butanol/H2O/Essigsäure 4:1:1; Spray: 0,1% Fluorescamin in Aceton). Nach Beendigung der Kupplungsreaktion wurde das Reaktionsgemisch zur Trockene eingedampft, der Rückstand in 10 ml CH2Cl2 aufgenommen und mit kaltem absolutem Äther (100 ml) gefällt.
Nach zweimaliger Wiederholung der Ausfällung konnten dünnschichtchromatographisch im Produkt Boc-Gly-Val-OCH2-P keine Verunreinigungen mehr festgestellt werden. Ausbeute: 3,8 g.
Varianten: Das Kupplungsgemisch konnte nach dem Eindampfen durch Gelfiltration in Methanol auf Sephadex LH-20 (5 x 180 cm) mit gleicher Ausbeute sauber getrennt werden.
Die Abtrennung der niedermolekularen Verunreinigungen konnte auch dadurch erfolgen, dass nach der Kupplung das Reaktionsgemisch mit Trifluoressigsäure/CH2Cl2 (1 :1) behandelt und der resultierende Rückstand in H2O aufgenommen wurde. Nach Filtration und Einstellung des pH auf ca. 6 wurde durch erschöpfende Extraktion mit CHCl3 reines Gly Val-OCH2-P erhalten.
In zum Vorhergehenden analoger Weise wurde Boc Gly-Val-OCH2-P (3,8 g) mit Trifluoressigsäure/CH2Cl2 (1:1) deblockiert und mit dem symmetrischen Anhydrid von Boc-Ala-OH gekuppelt. Das Reaktionsgemisch wurde nach dem Eindampfen direkt während 30 Minuten mit Trifluoressigsäure/CH2Cl2 (1:1) (30 ml) behandelt. Nach mehrmaligem Eindampfen wurde der trockene Rückstand in 150 ml H2O aufgenommen, entgast und filtriert. Das pH des Filtrates wurde mit verdünnter NaOH auf ca. 6 gestellt und anschliessend, nach NaCl-Zugabe, erschöpfend mit CHCl3 extrahiert.
Die kombinierte CHCl3-Phase lieferte nach dem Trocknen (Molekularsieb) und Eindampfen 3,4 g Ala-Gly-Val-O CH2-P, das in gleicher Weise mit dem symmetrischen Anhydrid von Z-Leu-OH gekuppelt wurde. Nach Abtrennung der niedermolekularen Verunreinigungen durch mehrmaliges Ausfällen aus CH2Cl2/Äther wurden 3,2 g Z-Leu-Ala-Gly-Val-OCH2-P erhalten (78 % berechnet auf das Ausgangsprodukt Val-OCH2 P).
Aminosäureanalyse: Val : Gly : Ala : Leu = 1,00:0,98:1,01: 1,04
Beladung: 0,29 mM/g.
0,5 g Z-Leu-Ala-Gly-Val-OCH2-P wurden in Methanol/ Essigsäure/H2O (8:1:1) gelöst und während 40 Stunden in Gegenwart von ca. 0,1 g 5 % Pd/Kohle hydriert. Nach der Filtration wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand in H2O aufgenommen. Durch erschöpfende Extraktion mit 6 Portionen CHCl3 wurde das Trägermaterial vom freien Peptid abgetrennt. Die Lyophilisation der wässrigen Phase lieferte 0,21 g rohes H-Leu-Ala-Gly-Val-OH, das gemäss Aminosäureanalyse folgendes Aminosäureverhältnis zeigte: Val: Gly: Ala : Leu = 1,00:0,80:0,85:0,83. Der Peptidanteil im rohen Tetrapeptid betrug 17,8%, d. h. bezogen auf die erste Aminosäure (Val) betrug die Ausbeute der Abspaltung 71,5 %.
Im dünnschichtchromatographischen Vergleich mit authentischem H-Leu-Ala-Gly-Val-OH verhielt sich das Produkt genau entsprechend (Rf in Butanol/H2O/Essigsäure 4:1:1 = 0,36, Rf in Butanol/Essigsäure/H2O/Äthylacetat 1:1:1:1 = (7,52, Rf in Butanol/Essigsäure/H2O/Pyridin 15:3:12:10 = 0,45).
0,5 g Z-Leu-Ala-Gly-Val-OCH2-P wurden in 2 ml Anisol suspendiert und während 30 Minuten bei 0 C mit 15 ml flüssigem HF behandelt. Nach der Entfernung des HF wurde der Rückstand in H2O (ca. 50 ml) aufgenommen und mit Äther extrahiert. Danach wurde die wässrige Phase erschöpfend mit CHCl3 extrahiert. Lyophilisation der wässrigen Phase lieferte 0,28 g rohes Tetrapeptid, das gemäss Aminosäureanalyse folgende Zusammensetzung aufwies: Val: Gly: Ala: Leu = 1,00:0,90:1,05:0,85. Peptidanteil: 10,25 %, d. h. Ausbeute der Abspaltung = 54,9 %. Dünnschicht wie oben beschrieben.
0,5 g Z-Leu-Ala-Gly-Val-OCH2-P gelöst in 20 ml H2O wurden mit 0,8 ml 1N KOH versetzt und während 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. (Verfolgung der Reaktion auf DC) Danach wurde mit 0,8 ml 1N HCl neutralisiert, zur Trockene eingedampft und der Rückstand in Methanol (50 ml) aufgenommen. Hydrierung in Gegenwart von 5 % Pd/Kohle über Nacht lieferte rohes Tetrapeptid, das wie vorhergehend beschrieben, vom Trägermaterial abgetrennt wurde.
Ausbeute: 0,18 g. Aminosäureanalyse: Val: Gly: Ala: Leu = 1,00:1,02:0,88:0,84. Peptidanteil: 13,5 %, d. h. Ausbeute der Abspaltung = 46,3 %. Dünnschicht wie oben beschrieben.
0,5 g Z-Leu-Ala-Gly-Val-OCH2-P wurden in 20 ml absoluter Trifluoressigsäure gelöst, worauf bei Raumtemperatur während 90 Minuten HBr in die Lösung eingeleitet wurde.
Nach dem Eindampfen des Reaktionsgemisches wurde der Rückstand in CH2C12 aufgenommen. Mehrmaliges Eindampfen aus CH2C12 entfernte weitgehend HBr/Trifluoressigsäure und führte zu einem Rückstand der in H20 aufgenommen wurde. Durch CHCl3-Extraktion wurde das Trägermaterial abgetrennt und durch Lyophilisation der wässrigen Phase wurden 0,12 g rohes Tetrapeptid gewonnen. Aminosäureanalyse: Val:Gly:Ala:Leu = 1,00:1,03:1,10:1,05. Peptidanteil: 7,5%, d. h. Ausbeute der Abspaltung = 16%. Dünnschicht wie oben beschrieben.
Beispiel 5 Ammonolyse von H-Pro-OCH2-P
Zu 1,2 g H-Pro-OCH2-P (acetyliert, 0,33 mM/g) in 12 ml absolutem Methanol wurden bei -10" C 50 ml 10n NH3/ Methanol gegeben. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wurde zur Trockene eingedampft, der Rückstand in H2O aufgenommen und mit 6 Portionen CHCl3 extrahiert. Die wässrige Phase lieferte nach Lyophilisation praktisch reines Prolinamid in einer Ausbeute von über 90 %, wie durch dünnschichtchromatographischen Vergleich mit authentischem Prolinamid gezeigt werden konnte.
Beispiel 6 Synthese von Bradykinin
19,5 g Boc-Arg(Tos)-OCH2-P (acetyliert) wurden während 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Trifluoressigsäure/ CH2Cl2 1:1(200 ml) behandelt. Nach dem Eindampfen wurde zweimal aus CH2C12 (25 ml)/Äther (250 ml) gefällt, das resultierende Produkt in 250 ml H2O gelöst und unter NaCl-Zugabe mit CHCl3 erschöpfend extrahiert. Die kombinierte CHCl3-Phase lieferte nach dem Trocknen und Eindampfen 18,1 g deblockiertes Produkt. Beladung gemäss Aminosäureanalyse: 0,20 mM/g.
2,66 g Boc-Phe-OH (10 mM) und 1,05 g Dicyclohexylcarbodiimid (5 mM) wurden in 20 ml CH2C12 bei 0 C während 1 Stunde gerührt. Danach wurde dieses Reaktionsgemisch direkt in eine Lösung von 10 g Arg(Tos)-OCH2-P in 50 ml CH2C12 filtriert. Nach Zugabe von 0,44 ml N-Methylmorpholin wurde diese Lösung während 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Eindampfen wurden die niedermolekularen Verunreinigungen in zu Beispiel 4 analoger Weise abtetrennt und dünnschichtchromatographisch reines Boc-Phe-Arg(Tos)-OCH2-P erhalten. Ausbeute: 10,3 g.
Aminosäureanalyse: Arg:Phe = 1,00:1,02, Beladung: 0,22 mM/g.
In zum Vorhergehenden analoger Weise wurde Boc-Phe Arg(Tos)-OCH2-P deblockiert und mit dem symmetrischen Anhydrid von Boc-Pro-OH gekuppelt. Die Aufarbeitung erfolgte wie vorhergehend beschrieben. Ausbeute an Boc Pro-Phe-Arg(Tos)-OCH2-P: 9,8 g. Aminosäureanalyse: Arg:Phe-Pro = 1,00:1,02:0,99, Beladung: 0,21 mM/g.
Nach der nächsten Kupplung mit dem symmetrischen Anhydrid von Boc-Ser(Bzl)-OH wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand in H2O aufgenommen. Durch Extraktion mit einem Gemisch aus Äther/Äthylacetat (4:1) konnten die niedermolekularen Verunreinigungen entfernt werden. Die wässrige Phase wurde darauf, unter Zusatz von NaCl, mit CHCl3 erschöpfend extrahiert. Die kombinierte CHCl3-Phase lieferte nach dem Trocknen (Molekularsieb) und Eindampfen 9,4 g reines Boc-Ser(Bzl)-Pro-Phe-Arg(Tos)-OCH2-P. Aminosäureanalyse: Arg:Phe:Pro:Ser = 1,00:1,00:1,01:1,00.
Beladung: 0,21 mM/g.
In zum Vorhergehenden analoger Weise wurden hierauf Boc-Phe-OH und dann Boc-Gly-OH angekuppelt, und man erhielt Boc-Gly-Phe-Ser(Bzl)-Pro-Phe-Arg(Tos)-OCH2-P.
Aminosäureanalyse: Arg: Phe: Pro: Ser: Gly = 1,00:2,06: 1,00:0,93:1,08. Beladung: 0,20 mM/g.
In zum Vorhergehenden analoger Weise wurden hierauf zwei Prolinderivate angekuppelt und man erhielt Boc-Pro Pro-Gly-Phe-Ser(Bzl)-Pro-Phe-Arg(Tos)-OCHrP. Aminosäureanalyse: Phe:Pro:Ser:Gly = 2,00:2,82:0,92:1,01 (Arg nicht bestimmt), Beladung: 0,19 mM/g.
Die letzte Kupplung wurde nach Abspaltung der Boc Schutzgruppen mit dem symmetrischen Anhydrid von Boc Arg(Tos)-OH in CH2Cl2/Dimethylformamid (2:1) über Nacht durchgeführt. Nach dem Eindampfen wurde der Rückstand in Methanol aufgenommen und die niedermolekularen Verunreinigungen durch Gelfiltration auf Sephadex LH-20 (180 x 5 cm) abgetrennt. Es wurde dünnschichtchromatographisch reines Boc-Arg(Tos)-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser(Bzl) Pro-Phe-Arg(Tos)-OCH2-P erhalten. Aminosäureanalyse: Arg:Phe:Pro:Ser:Gly = 2,00:2,02:3,01:0,94:1,01. Beladung: 0,19 mM/g.
Durch Behandlung des Boc-geschützten Nonapeptides mit 100 ml Trifluoressigsäure/CH2Cl2 (1:1) und anschliessende zweimalige Fällung aus CH2Cl3/Äther wurde Arg(Tos) Pro-Pro-Gly-Phe-Ser(Bzl)-Pro-Phe-Arg(Tos)-OCH2-P erhalten.
1 g Arg(Tos)-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser(Bzl)-Pro-Phe-Arg (Tos)-OCH2-P, suspendiert in 3 ml Anisol, wurde während 45 Minuten mit 20 ml flüssigem HF bei Raumtemperatur behandelt. Nach dem Abziehen des HF wurde der Rückstand in H2O/Äther aufgenommen und das pH mit verdünnter NH3 Lösung auf ca. 5 gestellt. Nach mehrmaliger Extraktion mit Äther wurde die wässrige Phase mit 5 Portionen CHCl3 unter NaC1-Zusatz ausgeschüttelt. Zur Abtrennung der anorganischen Salze wurde die H2O-Phase mit 5 Portionen Phenol (je ca. 50 ml) extrahiert und die kombinierte Phenol-Phase darauf zwischen Äther (1 Liter) und H20 (5 Portionen von je ca. 100 ml) verteilt.
Nach dem schonenden Eindampfen der wässrigen Phase erhielt man einen Rückstand von 0,75 g, der durch Gelfiltration in 0,2m Essigsäure auf Sephadex G-10 (3 x 95 cm) von restlichem Trägermaterial und Salzen befreit wurde. Anschliessende Ionenaustauschchromatographie auf Amberlite CG-50 (1,1 x 10 cm) mit einem Gradienten von verdünnter Essigsäure (H2Oeca. 10n Essigsäure) lieferte reines Bradykininacetat. Nach Lyophilisation aus H2O wurden 50 mg Produkt erhalten (20,2 % Totalausbeute berechnet auf die erste Aminosäure). Aminosäureanalyse: Arg:Phe: Pro:Ser:Gly = 2,00:2,01:2,96:0,96: 1,02. Peptidanteil: 82,2 %.
C50H73o11N15 .2C2H402 3H2O (1234,40)
Ber. C 51,87 H 7,01 N 16,80%
Gef. C 51,61 H 6,94 N 16,82% [a]D25 = -86,9 C (c = 0,5, 1n Essigsäure)
Im dünnschichtchromatographischen Vergleich auf Kieselgel und Cellulose-Platten in den verschiedensten Systemen verhielt sich die Substanz entsprechend wie authentisches Bradykinin. Nach enzymatischem Abbau mit Chymotrypsin erhielt man von beiden Substanzen identische Bruchstücke.
1 g Arg(Tos)-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser(Bzl)-Pro-Phe-Arg (Tos)-OCH2-P in einem Gemisch von Methanol/Essigsäure/ H2O 8:1:1(50 ml) wurde in Gegenwart von 0,2 g 10% Pd/BaSO4 während 48 Stunden hydriert. Danach wurde filtriert, gut nachgewaschen und zur Trockene eingedampft. Der resultierende Rückstand wurde direkt in 3 ml Anisol suspendiert und bei Raumtemperatur während 45 Minuten mit 20 ml HF behandelt. Nach dem Abziehen des HF wurde in H2O aufgenommen, das pH auf ca. 5 gestellt und mit Äther extrahiert. Die wässrige Phase wurde darauf schonend eingedampft und der Rückstand durch Gelfiltration in 0,2m Essigsäure auf Sephadex G-10 (3 x 95 cm) gereinigt. Die anschliessende Ionenaustauschchromatographie auf Amberlite CG-50, - ausgeführt wie oben beschrieben -, lieferte reines Bradykininacetat.
Nach Lyophilisation aus H2O wurden 101 mg Produkt erhalten (40,5 % Totalausbeute berechnet auf die erste Aminosäure). Im dünnschichtchromatographischen Vergleich mit dem vorher beschriebenen Präparat erwies sich das Produkt als absolut identisch.
Beispiel 7 Synthese von LH-RH.
10 g Polyäthylenglykol-bis[cs-chloro-p-toluat] (acetyliert) und 3,2 g Boc-Gly-OCs wurden in 100 ml abs. Dimethylformamid gelöst und während 72 Stunden auf 60" C erhitzt. Nach der Abtrennung vom ausgefallenen CsCI wurde das Filtrat zur Trockene eingedampft und der Rückstand in H2O (200 ml) aufgenommen und mit CHCI3 extrahiert. Die kombinierte CHCl3-Phase ergab nach dem Trocknen (Na2SO4) und Eindampfen dünnschichtchromatographisch reines Boc-Gly OCH2-P. Ausbeute: 9,9 g. Beladung gemäss Aminosäureanalyse: 0,30 mM/g.
8 g des obigen Produktes wurden während 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Trifluoressigsäure/CH2Cl2 1:1 (100 ml) behandelt. Nach dem Eindampfen wurde der Rückstand wieder in CH2Cl2 aufgenommen und wiederum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde nunmehr in H20 (200 ml) aufgenommen und das pH der Lösung mit verd. NaOH auf 5-6 gestellt. Nach dem Entgasen der Lösung wurde unter NaC1-Zugabe erschöpfend mit CHC13 extrahiert. Nach dem Trocknen und Eindampfen erhielt man 8 g deblockiertes Produkt.
2,15 g Boc-Pro-OH (10 mM) und 1,05 g DCC (5 mM) wurden in 10 ml CH2CI2 bei 0 C während 1 Stunde gerührt.
Danach wurde dieses Reaktionsgemisch direkt in eine Lösung von 8 g Gly-OCH2-P in 50 ml CH2C12 filtriert. Nach Zugabe von 0,44 ml N-Methylmorpholin wurde das Kupplungsgemisch während 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschliessend zur Trockene eingedampft. Zur Abtrennung der niedermolekularen Verunreinigungen wurde der Rückstand in Methanol gelöst und über eine Säule (5 x 180 cm) von Sephadex LH-20 gelfiltriert, worauf 8,0 g dünnschichtchromatographisch reines Boc-Pro-Gly-OCH2-P erhalten wurden.
Die Deblockierung von Boc-Pro-Gly-OCH2-P wurde entsprechend wie oben beschrieben durchgeführt. In analoger Weise wie für Boc-Pro-OH beschrieben, wurde darauf mit dem symmetrischen Anhydrid von Boc-Arg(Tos)-OH (4,3 g Boc-Arg(Tos)OH + 1,05 g DCC) in Anwesenheit von 0,44 ml N-Methylmorpholin gekuppelt (Lösungsmittel: Di methylformamid/CH2Cl2 1: 1) und anschliessend mit Hilfe von Sephadex LH-20 gereinigt. Ausbeute: 7,8 g. Aminosäureanalyse: Gly:Pro:Arg = 1,00:0,89:0,87. Beladung: 0,26 mM/g.
Nach entsprechender Wiederholung des obigen Synthese zyklus mit Boc-Leu-OH (Ausbeute: 7,7 g), Boc-Gly-OH (Ausbeute: 7,7 g) und Boc-Tyr(Bzl)-OH erhielt man 8 g B oc-Tyr(Bzl)-Gly-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-OCH2-P.
Aminosäureanalyse: Gly: Pro: Arg: Leu : Tyr = 2,00:0,87: 0,87:0,93:0,84. Beladung: 0,24 mM/g.
Der weitere Umsatz mit Boc-Ser(Bzl)-OH (Ausbeute: 8,1 g), Boc-Trp-OH (Ausbeute: 8,3 g) und Boc-(Nim-Dnp)- His-OH führte zu 8,4 g Boc-(Ni=-Dnp)-His-Trp-Ser(Bzl)-Tyr- (Bzl)-Gly-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-OCHz-P, das nach Deblockierung während 20 Stunden mit 3,76 g pGlu-OPhCl5 in DMF (80 ml) zur Reaktion gebracht wurde (Zugabe von 0,44 ml N-Methylmorpholin). Nach der Reinigung über Sephadex LH-20 erhielt man 8,9 g pGlu-His(Dnp)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr (Bzl)-Gly-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-OCH2-P. Aminosäure analyse: Gly:Pro :Arg: Leu :Tyr:Ser:Glu=2,00:0,84:1,01: 1,02:1,00:1,04:0,83 (His und Trp nicht bestimmt). Beladung: 0,24 mM/g.
7,8 g pGlu-His(Dnp)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Gly-Leu Arg(Tos)-Pro-Gly-OCH2-P wurden in der Kälte (-20"C) mit 100 ml 10n NH3/abs. Methanol versetzt und anschliessend während 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Eindampfen wurde der Rückstand über Sephadex LH-20 (5 x 180 cm) gereinigt (Abtrennung des polymeren Materials vom Peptid). Ausbeute an rohem pGlu-His-Trp-Ser(Bzl) Tyr(Bzl)-Gly-Leu-Arg-(Tos)-Pro-Gly-NH2:1,8 g.
Zur Entfernung der Schutzgruppen wurden obige 1,8 g in 60 ml Methanol/Essigsäure/H2O (8:1: 1) gelöst und in Anwesenheit von 10%Pd/BaSO4 während 15 Stunden hydriert.
Nach Filtration und Eindampfen zur Trockene wurde der Rückstand während 45 Minuten bei 0 C in Anwesenheit von 5 ml Anisol mit 40 ml flüssigem HF behandelt. Nach dem Abziehen des HF wurde der Rückstand in H2O/Äthylacetat aufgenommen und das pH mit verdünnter NH3-Lösung auf ca. 5 gestellt. Nach mehrmaliger Extraktion mit Äthylacetat wurde die wässrige Phase lyophilisiert und der anfallende Rückstand über Amberlite CG-50 (1.6 x 21 cm) chromatographiert (H2O, dann Gradient verdünnter Essigsäure: H205n Essigsäure). Es wurden 1,2 g rohes Produkt erhalten, das durch Gelfiltration über Sephadex G-25 (5 x 80 cm) in 0,2m Essigsäure weiter gereinigt wurde (Hauptfraktion: 0,8 g).
Die anschliessende Verteilungschromatographie auf Sephadex G-25 (5 x 80 cm) im System n-Butanol/Benzol/0,2m Ammoniumacetat, pH 5,5, 100:4:100, lieferte schliesslich nach mehrmaliger Lyophilisation aus verdünnter Essigsäure bzw.
H2O reines Produkt als Acetat. Ausbeute: 450 mg (Totalausbeute berechnet auf die erste Aminosäure: 16,5 %). Aminosäureanalyse: Glu: His: Trp: Ser: Tyr: Gly: Leu: Arg: Pro = 1,00:0,99:0,98:0,88: 1,01:2,00:0,98:1,01: 1,02. Peptid- anteil: 80,4% C55H75O13N17 2C2H402 5H2O [1392,49]
Ber. C 50,89 H 6,73 N 17,10 H2O 6,47%
Gef. C 51,11 H 6,83 N 17,39 H2O 6,62% [uln'5 = -50,6 + 20 C [c = 1,1% Essigsäure]
Im dünnschichtchromatographischen Vergleich auf Kieselgel und Cellulose-Platten in den verschiedensten Systemen war die Substanz homogen und verhielt sich genau entsprechend wie authentisches Produkt, das nach klassischen Methoden hergestellt worden war.
Der enzymatische Abbau mit Chymotrypsin lieferte von beiden Substanzen identische Bruchstücke.
PATENTANSPRUCH 1
Verfahren zur Herstellung von Polymerverbindungen der allgemeinen Formel
EMI5.1
worin n eine Zahl von 25 bis 2500 und
R einen Rest X-CH2- darstellen, worin
X Halogen oder die Hydroxygruppe bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der allgemeinen Formel Ho-CH3-CH2-(oH3-CH2)11-0-CH2H3-0H II worin n die obige Bedeutung hat, mit einer Säure der allgemeinen Formel
EMI5.2
worin R die obige Bedeutung hat, oder mit einem funktionellen Derivat hiervon verestert.
UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsmaterial eine Verbindung der Formel III verwendet, worin R in p-Stellung steht.
2. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsmaterial eine Verbindung der Formel III verwendet, worin X im Rest R ein Chloratom darstellt.
3. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsmaterial eine Verbindung der Formel II verwendet, worin n eine Zahl von 25 bis 1500, insbesondere von 25 bis 500, vorzugsweise von 35 bis 250 und besonders bevorzugt von 50 bis 150 darstellt.
4. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Veresterung einer Verbindung der Formel II mit einer Säure der Formel III in Gegenwart eines Kupplungsmittels, insbesondere Dicyclohexylcarbodiimid, durchführt.
PATENTANSPRUCH II
Verwendung von nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch I hergestellten Verbindungen der allgemeinen Formel
**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.
The present invention relates to a process for the preparation of new polymer compounds of the general formula
EMI1.1
in which n is a number from 25 to 2500 and R is a radical X-CH2, in which X is halogen or the hydroxyl group, and the use of the compounds of the formula I as carrier material in the preparation of higher molecular weight compounds, in particular peptides.
In the context of the present invention, the term halogen means fluorine, chlorine, bromine and iodine, chlorine being preferred.
High molecular weight polyethylene glycol is suitable and has been used for some time as a soluble carrier for the synthesis of peptides in a homogeneous phase. A main disadvantage of the method, however, is that the end product can practically only be split off from the carrier by alkaline hydrolysis, ammonolysis or hydrazinolysis, and alkaline hydrolysis in particular can lead to racemizations. For the release of peptides with a free carboxyl end, however, the acidic cleavage methods such. B. HBr / trifluoroacetic acid, liquid HF, etc., and in particular hydrogenolytic cleavage, which is one of the mildest methods, can be used. However, these methods fail when polyethylene glycol is used as the matrix.
The problem to be solved was to find a new, modified carrier that would meet the following requirements:
1. The carrier must have excellent chemical and physical properties similar to those of polyethylene glycol (e.g. solubility in aqueous and organic solvents).
2. The carrier must be equipped with functional groups that can be reacted simply and as quantitatively as possible with the carboxyl end of the first amino acid.
3. The carrier may only have reactive functional groups that are kinetically equal. In the case of polyethylene glycol, this requirement is met, since only terminal hydroxyl functions can react.
4. The peptides must be able to be bound to the matrix in such a way that cleavage is possible under the most varied of conditions without side reactions, but on the other hand no detachment from the carrier occurs during the peptide synthesis.
5. The carrier must have such a molecular weight that the known methods for separating high and low molecular weight components can be used.
According to the invention, this problem has now been solved by the preparation and use of the new compounds of the above formula I.
The process for preparing the compounds of the formula I is characterized in that a compound of the general formula Ho-CH, CH, - (o-CH, CH,) O-CH, -CH, OH II in which n has the above meaning , with an acid of the general formula
EMI1.2
wherein R has the above meaning, or esterified with a functional derivative thereof.
The corresponding halides, preferably the chloride, and an anhydride can in particular be mentioned as functional derivatives of the acid of the formula III.
The compounds of the above formula II and III are known.
A preferred starting material of the formula III is the free acid, in which R is in the p-position and X in the radical R is chlorine, d. H. p-chloromethyl-benzoic acid.
Preferred starting compounds of the formula II are those in which n is a number from 25 to 1500, in particular from 25 to 500, preferably from 35 to 250 and particularly preferably from 50 to 150. As an example of a particularly preferred compound of formula II, there may be mentioned polyethylene glycol 4000 (i.e. a compound of formula II in which n = 100).
The esterification of a compound of the formula II with an acid of the formula III or with a functional derivative thereof is carried out in a manner known per se, expediently in an organic solvent which is inert under the reaction conditions and at a temperature of -20 to 1500 C, preferably of - 20 to 50 C, and especially at room temperature. Solvents that can be mentioned are, in particular, aprotic solvents, e.g. B. cyclic ethers such as dioxane, tetrahydrofuran, etc., halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, chlorobenzene, etc., dimethylformamide, dimethyl sulfoxide and the like.
When using an acid of the formula III, the esterification is advantageously carried out in the presence of a coupling agent such as N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), carbonyldiimidazole and the like. like
The degree of esterification of the end product (i.e. the loading with halo- or hydroxymethyl-benzoic acid) can be determined by elemental analysis (halogen content), UV measurements (AmaX = 238 nm) and IR measurements (ester band). Suitable end products are those with a loading of at least 85%.
The solubility properties of the compounds of formula I are analogous to those of polyethylene glycol, i. H.
these compounds are readily soluble in both water and organic solvents, with the exception of aliphatic ethers and aliphatic hydrocarbons.
The compounds of the formula I are analogous to polyethylene glycol in a comparison by thin-layer chromatography in different systems and in the case of gel filtration on Sephadex G-25 and Sephadex LH-20. As a major advantage over polyethylene glycol, however, the strong UV activity of the novel carriers according to the invention must be emphasized, which makes the detection of the substance much easier at all times.
As mentioned above, the compounds of the formula I can be used as carriers in the production of high molecular weight compounds, in particular peptides, preferably those with up to about 20 amino acids, in a homogeneous phase.
Since the carrier still has a residual amount of free hydroxyl groups with a loading of reactive chloromethyl groups of 85-95%, which may enter into side reactions during the stepwise peptide synthesis, these hydroxyl groups are expediently acylated before the carrier is linked to the first amino acid. A preferred acylation is acetylation, e.g. B. by means of Acetic anhydride / triethylamine.
The abbreviations used in the following for the individual amino acids and their protective groups are those customary in peptide chemistry and generally known to the person skilled in the art [literature: Schröder, E. and Lübke, K .: The Peptides, Academic Press, New York & London, Vol. I (1965) and Vol. II (1966) and IUPAC-IUB rules]; they therefore do not require any further definition here.
The coupling of the first amino acid to the carrier produced according to the invention and the further construction of the desired peptide chains can be carried out by the methods known in peptide chemistry. The completeness of the individual coupling steps can, for. B. be checked by thin layer chromatography with fluorescamine and by amino acid analysis. The excess low molecular weight coupling components can also be removed by methods known in peptide chemistry.
The cleavage of the peptides from the carrier can take place by all methods known in peptide chemistry and in particular, as already mentioned, it is now also possible to carry out this cleavage by acidic methods and hydrogenolytically. When the peptides are split off from the carrier, any protective groups that can be split off under these conditions are removed at the same time, depending on the method used.
example 1
120 g of polyethylene glycol (MW 4000), 51 g of p-chloromethylbenzoic acid and 63 g of dicyclohexylcarbodiimide were dissolved in a mixture of 1200 ml of CH2Cl2 and 500 ml of absolute tetrahydrofuran and stirred at room temperature for 7 days. It was then concentrated to about 1/3, cooled and filtered. After evaporation, the filtrate gave a residue which was dissolved in 250 ml of CH2C12. Polyethylene glycol bis (α-chloro-p-toluate) was precipitated by adding dropwise cold absolute ether (1500 ml).
Repeated precipitation from CH2C12 with ether or gel filtration on Sephadex LH-20 in methanol finally led to a pure product which, according to thin layer chromatography, no longer showed any low molecular weight contamination (silica gel plates, flow agent: ethyl acetate or butanol / H2O / acetic acid 4: 1: 1; the product remains on Begin). Yield: 113.2 g (approx. 87%).
UV: ,, ax. = 238 nm E = 78.9 (10 mg%, fine spirit)
Elemental analysis:
Found C = 54.68% H = 8.97% Cl = 1.61%
Loading: approx. 0.45 mM / g
Solubility (20 C): very soluble in: H2O, acetone, benzene, CHCl3, CH2Cl2, dioxane, tetrahydrofuran, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide easily soluble in methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, ethyl acetate insoluble in ether, diisopropyl ether, hexane , Petroleum ether
Example 2
20 g of polyethylene glycol bis (a -chloro-p-toluate) [prepared according to Example 1] were used with a large excess of
Acetic anhydride (3.67 ml = 50 mM) and triethylamine (6.95 ml = 50 mM) are acetylated at room temperature for 4 hours.
200 ml of CH2C12 served as solvent. After evaporation to dryness, the residue was dissolved in 30 ml of CH2Cl2 and precipitated by adding dropwise 300 ml of cold absolute ether. Repeating this precipitation several times led to the complete separation of acetic anhydride / triethylamine. Yield: 19.4 g (97%) [The separation of acetic anhydride / triethylamine was also possible with the aid of ultrafiltration through a UM-2 ultrafilter].
10 g of polyethylene glycol bis (.2-chloro-p-toluate) acetylated as above and 3.6 g of Boc-ProOCs (10 mM) were dissolved in 100 ml of absolute dimethylformamide and heated to 60 ° C. for 48 hours. The precipitated CsCl was then decanted off, washed and the clear solution was evaporated to dryness. The dried residue was taken up in 200 ml of H2O and extracted with CHCl3. After adding NaCl to the aqueous phase, it was shaken out with a further 5 portions of CHCl3. The combined CHCl3 phases gave after drying over Na2SO4 and evaporation, pure Boc by thin layer chromatography
EMI2.1
EMI2.2
Yield: 9.5 g (92-95%).
The amino acid analysis showed the following loading with Pro: 0.33 mM / g.
The separation of low molecular weight impurities such as Boc-Pro-OCs and Cs Cl could also be achieved by repeated reprecipitation from CH2Cl2 / ether, or by gel filtration on Sephadex LH-20, or by ultrafiltration with ultrafilter UM-2.
In a manner analogous to the above, the following products were prepared: Boc-Val-OCHrP, loading: 0.37 mM / g Boc-Gly-OCH2-P, loading: 0.33 mM / g Boc-Arg (Tos) -OCH2- P, loading: 0.28 mM / g.
Example 3
2 g of polyethylene glycol bis (a-chloro-p-toluate) (acetylated according to Example 2) and 1.08 g of Boc-Pro-OH (5 mM) were dissolved in 20 ml of absolute ethanol, with 0.63 ml of triethylamine (4 , 5 mM) and refluxed for 70 hours. After evaporating the reaction mixture and working up in a manner analogous to Example 2, 1.95 g of Boc-Pro-OCH2-P were obtained.
Yield: 95-97%. Loading according to amino acid analysis: 0.25 mM / g.
Example 4 Synthesis of H-Leu-Ala-Gly-Val-OH
6 g of Boc-Val-OCH2-P (acetylated) were dissolved in 24 ml of trifluoroacetic acid / CH2Cl2 (1: 1) and stirred for 30 minutes at room temperature. After the gentle evaporation, the mixture was taken up twice in CH2C12 and again evaporated to dryness. The residue was then precipitated twice from CH2C12 (15 ml) with cold, absolute ether (150 ml). Yield: 5.9 g, loading according to amino acid analysis: 0.29 mM / g.
Variant: After the Boc cleavage and evaporation, the residue was dissolved in H20 (100 ml), degassed, the pH was adjusted to about 6 with dilute NaOH and then exhaustively extracted with CHCl3.
1.05 g of Boc-Gly-OH (6 mM) and 0.63 g of dicyclohexylcarbodiimide (3 mM) in 10 ml of CH 2 Cl 2 were stirred at 0 ° C. for 30 minutes. The reaction mixture was then filtered directly into a solution of 4 g of Val-OCH2-P in 20 ml of CH2Cl2. After adding 0.2 ml of N-methylmorpholine, the mixture was stirred for 2 hours at room temperature (conversion control on silica gel plates in the flow agent butanol / H2O / acetic acid 4: 1: 1; spray: 0.1% fluorescamine in acetone). After the coupling reaction had ended, the reaction mixture was evaporated to dryness, the residue was taken up in 10 ml of CH2Cl2 and precipitated with cold absolute ether (100 ml).
After the precipitation had been repeated twice, thin-layer chromatography could no longer detect any impurities in the product Boc-Gly-Val-OCH2-P. Yield: 3.8 g.
Variants: After evaporation, the coupling mixture could be separated cleanly with the same yield by gel filtration in methanol on Sephadex LH-20 (5 × 180 cm).
The low molecular weight impurities could also be separated off by treating the reaction mixture with trifluoroacetic acid / CH2Cl2 (1: 1) after the coupling and taking up the resulting residue in H2O. After filtration and adjustment of the pH to approx. 6, pure Gly Val-OCH2-P was obtained by exhaustive extraction with CHCl3.
In a manner analogous to the above, Boc Gly-Val-OCH2-P (3.8 g) was deblocked with trifluoroacetic acid / CH2Cl2 (1: 1) and coupled with the symmetrical anhydride of Boc-Ala-OH. After evaporation, the reaction mixture was treated directly with trifluoroacetic acid / CH2Cl2 (1: 1) (30 ml) for 30 minutes. After evaporation several times, the dry residue was taken up in 150 ml of H2O, degassed and filtered. The pH of the filtrate was adjusted to about 6 with dilute NaOH and then, after the addition of NaCl, extracted exhaustively with CHCl3.
After drying (molecular sieve) and evaporation, the combined CHCl3 phase yielded 3.4 g of Ala-Gly-Val-O CH2-P, which was coupled in the same way with the symmetrical anhydride of Z-Leu-OH. After the low molecular weight impurities had been separated off by repeated precipitation from CH2Cl2 / ether, 3.2 g of Z-Leu-Ala-Gly-Val-OCH2-P were obtained (78% calculated on the starting product Val-OCH2 P).
Amino acid analysis: Val: Gly: Ala: Leu = 1.00: 0.98: 1.01: 1.04
Loading: 0.29 mM / g.
0.5 g of Z-Leu-Ala-Gly-Val-OCH2-P were dissolved in methanol / acetic acid / H2O (8: 1: 1) and for 40 hours in the presence of approx. 0.1 g of 5% Pd / carbon hydrogenated. After filtration, it was evaporated to dryness and the residue was taken up in H2O. The carrier material was separated from the free peptide by exhaustive extraction with 6 portions of CHCl3. Lyophilization of the aqueous phase yielded 0.21 g of crude H-Leu-Ala-Gly-Val-OH, which, according to amino acid analysis, showed the following amino acid ratio: Val: Gly: Ala: Leu = 1.00: 0.80: 0.85: 0.83. The peptide content in the crude tetrapeptide was 17.8%; H. based on the first amino acid (Val), the cleavage yield was 71.5%.
In a thin-layer chromatographic comparison with authentic H-Leu-Ala-Gly-Val-OH, the product behaved exactly accordingly (Rf in butanol / H2O / acetic acid 4: 1: 1 = 0.36, Rf in butanol / acetic acid / H2O / ethyl acetate 1 : 1: 1: 1 = (7.52, Rf in butanol / acetic acid / H2O / pyridine 15: 3: 12: 10 = 0.45).
0.5 g of Z-Leu-Ala-Gly-Val-OCH2-P were suspended in 2 ml of anisole and treated with 15 ml of liquid HF for 30 minutes at 0 ° C. After the HF had been removed, the residue was taken up in H2O (approx. 50 ml) and extracted with ether. The aqueous phase was then extracted exhaustively with CHCl3. Lyophilization of the aqueous phase yielded 0.28 g of crude tetrapeptide which, according to amino acid analysis, had the following composition: Val: Gly: Ala: Leu = 1.00: 0.90: 1.05: 0.85. Peptide content: 10.25%, i.e. H. Cleavage yield = 54.9%. Thin film as described above.
0.5 g of Z-Leu-Ala-Gly-Val-OCH2-P dissolved in 20 ml of H2O were treated with 0.8 ml of 1N KOH and stirred for 6 hours at room temperature. (Monitoring of the reaction on TLC) It was then neutralized with 0.8 ml of 1N HCl, evaporated to dryness and the residue taken up in methanol (50 ml). Hydrogenation in the presence of 5% Pd / charcoal overnight yielded crude tetrapeptide, which was separated from the support material as described above.
Yield: 0.18 g. Amino acid analysis: Val: Gly: Ala: Leu = 1.00: 1.02: 0.88: 0.84. Peptide content: 13.5%, i.e. H. Cleavage yield = 46.3%. Thin film as described above.
0.5 g of Z-Leu-Ala-Gly-Val-OCH2-P were dissolved in 20 ml of absolute trifluoroacetic acid, whereupon HBr was passed into the solution at room temperature for 90 minutes.
After the reaction mixture had been evaporated, the residue was taken up in CH2C12. Repeated evaporation from CH2C12 largely removed HBr / trifluoroacetic acid and led to a residue which was taken up in H20. The carrier material was separated off by CHCl3 extraction and 0.12 g of crude tetrapeptide was obtained by lyophilization of the aqueous phase. Amino acid analysis: Val: Gly: Ala: Leu = 1.00: 1.03: 1.10: 1.05. Peptide content: 7.5%, i.e. H. Cleavage yield = 16%. Thin film as described above.
Example 5 Ammonolysis of H-Pro-OCH2-P
50 ml of 10N NH3 / methanol were added at -10 "C. to 1.2 g of H-Pro-OCH2-P (acetylated, 0.33 mM / g) in 12 ml of absolute methanol. After 24 hours at room temperature, the mixture was evaporated to dryness , the residue taken up in H2O and extracted with 6 portions of CHCl3. After lyophilization, the aqueous phase gave practically pure prolinamide in a yield of over 90%, as could be shown by thin-layer chromatographic comparison with authentic prolinamide.
Example 6 Synthesis of Bradykinin
19.5 g of Boc-Arg (Tos) -OCH2-P (acetylated) were treated with trifluoroacetic acid / CH2Cl2 1: 1 (200 ml) for 30 minutes at room temperature. After evaporation, it was precipitated twice from CH2C12 (25 ml) / ether (250 ml), the resulting product was dissolved in 250 ml of H2O and exhaustively extracted with CHCl3 while adding NaCl. After drying and evaporation, the combined CHCl3 phase yielded 18.1 g of deblocked product. Loading according to amino acid analysis: 0.20 mM / g.
2.66 g of Boc-Phe-OH (10 mM) and 1.05 g of dicyclohexylcarbodiimide (5 mM) were stirred in 20 ml of CH2Cl2 at 0 ° C. for 1 hour. This reaction mixture was then filtered directly into a solution of 10 g of Arg (Tos) -OCH2-P in 50 ml of CH2C12. After adding 0.44 ml of N-methylmorpholine, this solution was stirred for 4 hours at room temperature. After evaporation, the low molecular weight impurities were separated off in a manner analogous to Example 4 and pure Boc-Phe-Arg (Tos) -OCH2-P was obtained by thin-layer chromatography. Yield: 10.3 g.
Amino acid analysis: Arg: Phe = 1.00: 1.02, loading: 0.22 mM / g.
In a manner analogous to the preceding, Boc-Phe Arg (Tos) -OCH2-P was deblocked and coupled with the symmetrical anhydride of Boc-Pro-OH. Work-up was carried out as described above. Yield of Boc Pro-Phe-Arg (Tos) -OCH2-P: 9.8 g. Amino acid analysis: Arg: Phe-Pro = 1.00: 1.02: 0.99, loading: 0.21 mM / g.
After the next coupling with the symmetrical anhydride of Boc-Ser (Bzl) -OH, the mixture was evaporated to dryness and the residue was taken up in H2O. The low molecular weight impurities could be removed by extraction with a mixture of ether / ethyl acetate (4: 1). The aqueous phase was then exhaustively extracted with CHCl3 with the addition of NaCl. After drying (molecular sieve) and evaporation, the combined CHCl3 phase yielded 9.4 g of pure Boc-Ser (Bzl) -Pro-Phe-Arg (Tos) -OCH2-P. Amino Acid Analysis: Arg: Phe: Pro: Ser = 1.00: 1.00: 1.01: 1.00.
Loading: 0.21 mM / g.
In a manner analogous to the preceding, Boc-Phe-OH and then Boc-Gly-OH were then coupled, and Boc-Gly-Phe-Ser (Bzl) -Pro-Phe-Arg (Tos) -OCH2-P was obtained.
Amino acid analysis: Arg: Phe: Pro: Ser: Gly = 1.00: 2.06: 1.00: 0.93: 1.08. Loading: 0.20 mM / g.
Two proline derivatives were then coupled in a manner analogous to the above and Boc-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser (Bzl) -Pro-Phe-Arg (Tos) -OCHrP was obtained. Amino acid analysis: Phe: Pro: Ser: Gly = 2.00: 2.82: 0.92: 1.01 (Arg not determined), loading: 0.19 mM / g.
The last coupling was carried out overnight after splitting off the Boc protective groups with the symmetrical anhydride of Boc Arg (Tos) -OH in CH2Cl2 / dimethylformamide (2: 1). After evaporation, the residue was taken up in methanol and the low molecular weight impurities were separated off by gel filtration on Sephadex LH-20 (180 × 5 cm). Pure Boc-Arg (Tos) -Pro-Pro-Gly-Phe-Ser (Bzl) Pro-Phe-Arg (Tos) -OCH2-P was obtained by thin-layer chromatography. Amino Acid Analysis: Arg: Phe: Pro: Ser: Gly = 2.00: 2.02: 3.01: 0.94: 1.01. Loading: 0.19 mM / g.
By treating the Boc-protected nonapeptide with 100 ml of trifluoroacetic acid / CH2Cl2 (1: 1) and subsequent two-fold precipitation from CH2Cl3 / ether, Arg (Tos) Pro-Pro-Gly-Phe-Ser (Bzl) -Pro-Phe-Arg ( Tos) -OCH2-P.
1 g of Arg (Tos) -Pro-Pro-Gly-Phe-Ser (Bzl) -Pro-Phe-Arg (Tos) -OCH2-P, suspended in 3 ml of anisole, was mixed with 20 ml of liquid HF at room temperature for 45 minutes treated. After the HF had been stripped off, the residue was taken up in H2O / ether and the pH was adjusted to approx. 5 with dilute NH3 solution. After extracting several times with ether, the aqueous phase was extracted by shaking with 5 portions of CHCl3 with the addition of NaCl. To separate the inorganic salts, the H2O phase was extracted with 5 portions of phenol (approx. 50 ml each) and the combined phenol phase was then distributed between ether (1 liter) and H2O (5 portions of approx. 100 ml each).
After careful evaporation of the aqueous phase, a residue of 0.75 g was obtained, which was freed from residual carrier material and salts by gel filtration in 0.2 M acetic acid on Sephadex G-10 (3 × 95 cm). Subsequent ion exchange chromatography on Amberlite CG-50 (1.1 × 10 cm) with a gradient of dilute acetic acid (H2O approx. 10N acetic acid) yielded pure bradykinin acetate. After lyophilization from H2O, 50 mg of product were obtained (20.2% total yield calculated on the first amino acid). Amino acid analysis: Arg: Phe: Pro: Ser: Gly = 2.00: 2.01: 2.96: 0.96: 1.02. Peptide content: 82.2%.
C50H73o11N15 .2C2H402 3H2O (1234.40)
Ber. C 51.87 H 7.01 N 16.80%
Found C 51.61 H 6.94 N 16.82% [a] D25 = -86.9 C (c = 0.5, 1n acetic acid)
In a thin-layer chromatographic comparison on silica gel and cellulose plates in a wide variety of systems, the substance behaved accordingly like authentic bradykinin. After enzymatic degradation with chymotrypsin, identical fragments were obtained from both substances.
1 g Arg (Tos) -Pro-Pro-Gly-Phe-Ser (Bzl) -Pro-Phe-Arg (Tos) -OCH2-P in a mixture of methanol / acetic acid / H2O 8: 1: 1 (50 ml) was hydrogenated in the presence of 0.2 g of 10% Pd / BaSO4 for 48 hours. It was then filtered, washed thoroughly and evaporated to dryness. The resulting residue was directly suspended in 3 ml of anisole and treated with 20 ml of HF at room temperature for 45 minutes. After the HF had been stripped off, it was taken up in H2O, the pH was adjusted to about 5 and extracted with ether. The aqueous phase was then gently evaporated and the residue was purified by gel filtration in 0.2m acetic acid on Sephadex G-10 (3 × 95 cm). The subsequent ion exchange chromatography on Amberlite CG-50, carried out as described above, yielded pure bradykinin acetate.
After lyophilization from H2O, 101 mg of product were obtained (40.5% total yield calculated on the first amino acid). In a thin-layer chromatographic comparison with the preparation described above, the product was found to be absolutely identical.
Example 7 Synthesis of LH-RH.
10 g of polyethylene glycol bis [cs-chloro-p-toluate] (acetylated) and 3.2 g of Boc-Gly-OCs were dissolved in 100 ml of abs. Dissolved dimethylformamide and heated to 60 ° C. for 72 hours. After the precipitated CsCl had been separated off, the filtrate was evaporated to dryness and the residue was taken up in H 2 O (200 ml) and extracted with CHCl 3. After drying, the combined CHCl 3 phase gave (Na 2 SO 4 ) and evaporation, pure Boc-Gly OCH2-P according to thin-layer chromatography. Yield: 9.9 g. Loading according to amino acid analysis: 0.30 mM / g.
8 g of the above product were treated with trifluoroacetic acid / CH2Cl2 1: 1 (100 ml) for 30 minutes at room temperature. After evaporation, the residue was taken up again in CH2Cl2 and again evaporated to dryness. The residue was then taken up in H20 (200 ml) and the pH of the solution was adjusted to 5-6 with dilute NaOH. After degassing the solution, it was extracted exhaustively with CHC13 while adding NaCl. After drying and evaporation, 8 g of deblocked product were obtained.
2.15 g of Boc-Pro-OH (10 mM) and 1.05 g of DCC (5 mM) were stirred in 10 ml of CH2Cl2 at 0 ° C. for 1 hour.
This reaction mixture was then filtered directly into a solution of 8 g of Gly-OCH2-P in 50 ml of CH2C12. After adding 0.44 ml of N-methylmorpholine, the coupling mixture was stirred for 3 hours at room temperature and then evaporated to dryness. To separate off the low molecular weight impurities, the residue was dissolved in methanol and gel-filtered through a column (5 × 180 cm) of Sephadex LH-20, whereupon 8.0 g of Boc-Pro-Gly-OCH2-P pure by thin layer chromatography were obtained.
The deblocking of Boc-Pro-Gly-OCH2-P was carried out as described above. In a manner analogous to that described for Boc-Pro-OH, the symmetrical anhydride of Boc-Arg (Tos) -OH (4.3 g Boc-Arg (Tos) OH + 1.05 g DCC) in the presence of 0 , 44 ml of N-methylmorpholine coupled (solvent: dimethylformamide / CH2Cl2 1: 1) and then purified with the aid of Sephadex LH-20. Yield: 7.8 g. Amino acid analysis: Gly: Pro: Arg = 1.00: 0.89: 0.87. Loading: 0.26 mM / g.
After corresponding repetition of the above synthesis cycle with Boc-Leu-OH (yield: 7.7 g), Boc-Gly-OH (yield: 7.7 g) and Boc-Tyr (Bzl) -OH, 8 g of B oc were obtained -Tyr (Bzl) -Gly-Leu-Arg (Tos) -Pro-Gly-OCH2-P.
Amino acid analysis: Gly: Pro: Arg: Leu: Tyr = 2.00: 0.87: 0.87: 0.93: 0.84. Loading: 0.24 mM / g.
Further conversion with Boc-Ser (Bzl) -OH (yield: 8.1 g), Boc-Trp-OH (yield: 8.3 g) and Boc- (Nim-Dnp) - His-OH led to 8, 4 g of Boc- (Ni = -Dnp) -His-Trp-Ser (Bzl) -Tyr- (Bzl) -Gly-Leu-Arg (Tos) -Pro-Gly-OCHz-P, which after deblocking for 20 hours with 3.76 g of pGlu-OPhCl5 in DMF (80 ml) was reacted (addition of 0.44 ml of N-methylmorpholine). After purification on Sephadex LH-20, 8.9 g of pGlu-His (Dnp) -Trp-Ser (Bzl) -Tyr (Bzl) -Gly-Leu-Arg (Tos) -Pro-Gly-OCH2-P were obtained. Amino acid analysis: Gly: Pro: Arg: Leu: Tyr: Ser: Glu = 2.00: 0.84: 1.01: 1.02: 1.00: 1.04: 0.83 (His and Trp not determined ). Loading: 0.24 mM / g.
7.8 g of pGlu-His (Dnp) -Trp-Ser (Bzl) -Tyr (Bzl) -Gly-Leu Arg (Tos) -Pro-Gly-OCH2-P were in the cold (-20 "C) with 100 ml of 10N NH3 / absolute methanol were added and the mixture was then stirred for 48 hours at room temperature.After evaporation, the residue was purified on Sephadex LH-20 (5 × 180 cm) (separation of the polymeric material from the peptide) Yield of crude pGlu-His -Trp-Ser (Bzl) Tyr (Bzl) -Gly-Leu-Arg- (Tos) -Pro-Gly-NH2: 1.8 g.
To remove the protective groups, the above 1.8 g were dissolved in 60 ml of methanol / acetic acid / H2O (8: 1: 1) and hydrogenated in the presence of 10% Pd / BaSO4 for 15 hours.
After filtration and evaporation to dryness, the residue was treated with 40 ml of liquid HF for 45 minutes at 0 C in the presence of 5 ml of anisole. After the HF had been stripped off, the residue was taken up in H2O / ethyl acetate and the pH was adjusted to approx. 5 with dilute NH3 solution. After repeated extraction with ethyl acetate, the aqueous phase was lyophilized and the residue obtained was chromatographed over Amberlite CG-50 (1.6 x 21 cm) (H2O, then gradient of dilute acetic acid: H2O5N acetic acid). 1.2 g of crude product were obtained, which was further purified by gel filtration through Sephadex G-25 (5 × 80 cm) in 0.2 M acetic acid (main fraction: 0.8 g).
The subsequent partition chromatography on Sephadex G-25 (5 x 80 cm) in the system n-butanol / benzene / 0.2m ammonium acetate, pH 5.5, 100: 4: 100, finally yielded after repeated lyophilization from dilute acetic acid or
H2O pure product as acetate. Yield: 450 mg (total yield calculated on the first amino acid: 16.5%). Amino acid analysis: Glu: His: Trp: Ser: Tyr: Gly: Leu: Arg: Pro = 1.00: 0.99: 0.98: 0.88: 1.01: 2.00: 0.98: 1, 01: 1.02. Peptide content: 80.4% C55H75O13N17 2C2H402 5H2O [1392.49]
Ber. C 50.89 H 6.73 N 17.10 H2O 6.47%
Found C 51.11 H 6.83 N 17.39 H2O 6.62% [uln'5 = -50.6 + 20 C [c = 1.1% acetic acid]
In a thin-layer chromatographic comparison on silica gel and cellulose plates in a wide variety of systems, the substance was homogeneous and behaved exactly like an authentic product that had been manufactured using traditional methods.
The enzymatic degradation with chymotrypsin yielded identical fragments of both substances.
PATENT CLAIM 1
Process for the preparation of polymer compounds of the general formula
EMI5.1
where n is a number from 25 to 2500 and
R represents a radical X-CH2-, in which
X denotes halogen or the hydroxy group, characterized in that a compound of the general formula Ho-CH3-CH2- (oH3-CH2) 11-0-CH2H3-0H II in which n has the above meaning, with an acid of the general formula
EMI5.2
wherein R has the above meaning, or esterified with a functional derivative thereof.
SUBCLAIMS
1. The method according to claim I, characterized in that the starting material used is a compound of the formula III in which R is in the p-position.
2. The method according to claim I or dependent claim 1, characterized in that the starting material used is a compound of the formula III in which X in the radical R is a chlorine atom.
3. The method according to claim I or dependent claim 1, characterized in that the starting material used is a compound of the formula II in which n is a number from 25 to 1500, in particular from 25 to 500, preferably from 35 to 250 and particularly preferably from 50 to 150 represents.
4. The method according to claim I or dependent claim 1, characterized in that the esterification of a compound of the formula II with an acid of the formula III in the presence of a coupling agent, in particular dicyclohexylcarbodiimide, is carried out.
PATENT CLAIM II
Use of compounds of the general formula prepared by the process according to claim I
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