DE2433212B2

DE2433212B2 - Verfahren und vorrichtung zur messung der konzentration von substraten von enzymreaktionen sowie enzymelektrode

Info

Publication number: DE2433212B2
Application number: DE19742433212
Authority: DE
Inventors: Philippe Münchenstein Racine (Schweiz); Higelin, Jean-Claude, Hegenheim; Engelhardt, Roland, Mülhausen; (Frankreich); Mindt, Wolfgang, Dr., 8520 Erlangen
Priority date: 1973-08-06
Filing date: 1974-07-10
Publication date: 1977-05-18
Also published as: US4005002A; NL7408519A; BE818486A; DD115755A5; SE7409942L; DE2433212A1; CH585907A5; AU465211B2; JPS5046190A; DK414874A; GB1480762A; IL45216A0; JPS544878B2; CA1003044A; FR2240451B1; IT1015528B; FR2240451A1; AU7155574A; SE411960B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Konzentration von Substraten von Enzymreaktionen, die im intermediären Metabolismus auftreten, insbesondere der Konzentration von Lactat und Glucose in

flüssigen biologischen Proben, bei welchem Verfahren die Konzentration des Substrats durch Ermitteln des Maximalwertes eines durch Oxidation eines Akzeptors an einem elektrischen Sensor entstehenden Stromes mit einer Meßvorrichtung gemessen wird, die sich im wesentlichen aus einer Meßzelle zur Aufnahme der flüssigen Probe, einer mit dieser Probe in Kontakt befindlichen, den elektrochemischen Sensor, eine Enzymschicht und eine die Enzymschicht abdeckende semipermeable Membrane enthaltenden Enzymelektrode und einer mit der flüssigen Probe in Kontakt befindlichen Bezugselektrode zusammensetzt, wobei eine Regelung der Temperatur der Enzymreaktion vorgenommen und eine Gleichspannung zwischen der Enzymelektrode und der Bezugselektrode angelegt wird.

Die Erfindung betrifft weiter eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens, die eine als Kammer ausgebildete Meßzelle zur Aufnahme einer flüssigen Probe, eine einen elektrochemischen Sensor, eine Enzymschicht und eine die Enzymschicht abdeckende semipermeable Membrane enthaltenden Enzymelektrode, eine Bezugselektrode und eine elektrische Nachweiseinrichtung zur Messung des durch der. elektrochemischen Sensor fließenden maximalen Stromes enthält.

Schließlich betrifft die Erfindung eine Enzymelektrode, insbesondere für eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, welche einen elektrochemischen Sensor, eine mit diesem in Kontakt befindliche, ein Enzym enthaltende Schicht und eine diese Schicht abdeckende semipermeable Membrane enthält.

Die Messung der Konzentration von Substraten der eingangs genannten Art hat durch die Ergebnisse der medizinischen Forschung an Bedeutung gewonnen. Es hat sich z.B. erwiesen, daß eine Erhöhung der Lactatkonzentration im Blut einem Sauerstoffmangel im zellularen Bereich entspricht Diese Erkenntnis ist z. B. für die Behandlung von Patienten im Schockzustand außerordentlich wichtig, denn es hat sich gezeigt, daß in solchen Fällen die Lactatkonzentration im Blut einen maßgebenden Parameter für die Beurteilung und Verfolgung des Zustandes eines Patienten darstellt.

In einer Vielzahl von Anwendungen wie jenen, in denen eine schnelle Diagnose sehr wichtig ist, ist ein Verfahren (bzw. eine Vorrichtung) für die Messung der Konzentration von Substraten in flüssigen biologischen Proben erst von Nutzen, wenn dieses (bzw. diese) die schnelle Durchführung von zuverlässigen Messungen ermöglicht Zudem ist besonders für den Analysenlabor- und/oder den Spitalbetrieb eine Meßvorrichtung erforderlich, die eine zweckmäßige Automatisierung der Meßvorgänge ermöglicht, deren Behandlung und Wartung einfach ist und die mit sehr kleinen Probenmengen auskommt.

Eine bekannte Vorrichtung der eingangs beschriebenen Gattung (US-PS 36 23 960) enthält außer der Enzymelektrode eine zweite Elektrode, die soweit wie möglich den gleichen Aufbau wie die Enzymelektrode aufweist, aber ohne die Enzymschicht ausgebildet ist.

Für jede Messung wird der Testlösung eine als Akzeptor bezeichnete Substanz hinzugefügt. Die Messung geht in der Weise vor sich, daß die Enzymelektrode, die zweite Elektrode und eine Kathode in die so vorbereitete Testlösung getaucht werden, eine niedrige Gleichspannung zwischen der Kathode und den anderen zwei Elektroden angelegt wirrt und die Differenz der Ströme, die durch die

Enzymelektrode und die zweite Elektrode fließen, gemessen wird Die zweite Elektrode soll die unerwünschte Wirkung des Grundstromes, der durch die Enzymelektrode fließt, auf die Genauigkeit der Messung kompensieren. Der Grundsirom entsteht z. B, bei der Messung der Glucosekonzentration im Blut weil das als Akzeptor verwendete Chinon nicht nur durch die Oxidation des reduzierten Enzyms, sondern auch durch die Oxidation von verschiedenen Plasmakomponenten reduziert wird

Der für die Messung nützliche Strom fließt durch die Enzymelektrode und entsteht auf folgende Weise: Das Substrat (S) und der Akzeptor (Aox) diffundieren durch die semipermeable Membrane der Enzymelektrode und gelangen in deren Enzymschicht Das Substrat geht eine enzymatische Reaktion ein. Das aus dieser Reaktion resultierende reduzierte Enzym (Ered) oxidiert dann in Anwesenheit des Akzeptors (Aox) Der dadurch reduzierte Akzeptor (Ared) oxidiert an dem elektrochemischen Sensor der Enzymelektrode wieder. Ein derartiger gekoppelter Prozeß läßt sich durch folgende 3ruttoreaktionsgleichungen beschreiben:

E+S ^ES — Ered+P Ered+Aox —► E+Ared Ared — A + ne

Pstellt darin ein Reaktionsprodukt dar. Die Oxidation des reduzierten Akzeptors ergibt einen Strom, der durch den elektrochemischen Sensor der Enzymelektrode fließt und in eindeutigem Verhältnis zu der Konzentration des Substrats in der Testlösung steht.

Nach den bekannten Verfahren werden je nach Substrat folgende Enzyme und Akzeptoren verwendet:

Substrat

Enzym

Akzeptor

Glucose	Glucose-Oxydase	Chinon
Lactat	Cytochrom h>2	Kalium-
		heuacyano
		ferrat(III)

Die Temperatur des Behälters, der die Testlösung enthält, wird während der Messung geregelt. Dies ist für die Meßgenauigkeit wichtig, da die enzymatischen Reaktionen temperaturabhängig sind.

Die hier geschilderte Vorrichtung weist für den praktischen Betrieb folgende Unzulänglichkeiten auf:

Die Vorbereitung der Vorrichtung ist zeitraubend, da keine Automatisierung der Messungen vorgesehen ist so und allein die Temperaturregelung der Restlösung viel Zeit beansprucht

Die Vorrichtung kann nicht von Hilfspersonal bedient oder gewartet werden.

Es wird eine große Menge an Testlösung benötigt, da üs die kleinsten Abmessungen des Behälters für die Testlösung durch die Einrichtung für die Temperaturregelung der Testlösung gegeben sind. Die Menge der Testlösung pro Messung kann somit nicht reduziert werden.

n.·. Die Kompensation des Grundstromes mit einer zweiten Elektrode hat sich nicht als genügend genau erwiesen, da es schwierig ist, zwei identische Elektroden zubauen.

Die Ablesung des durch den elektrochemischen h Sensors fließenden Stromes erfolgt visuell an einem Meßgerät, was die ständige Aufmerksamkeit einer Bedienungsperson erfordert.

Die bekannte Vorrichtung ist somit für die Durchfüh-

rung von Routinemessungen in einem Analysenlabor oder im Krankenhausbetrieb ungeeignet.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bzw. eine Vorrichtung zu seiner Durchführung zu schaffen, welches bzw. welche die Bestimmung der Konzentration von Substraten in flüssigen biologischen Proben mit geringem Arbeits- und Zeitaufwand ermöglicht und nur kleine Testlösungsmengen pro Messung benötigt

Weiter liegt eine Aufgabe der Erfindung darin, eine Enzymelektrode anzugeben, die in einer Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens verwendet werden kann.

Der ein Verfahren betreffende Teil der Erfindungsaufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs beschriebenen Gattung erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß eine lokale Temperaturregelung der Enzymschicht durchgeführt wird, die Meßzelle vor dem Füllen mit der flüssigen Probe mit einer den Akzeptor enthaltenden Pufferlösung so lange gefüllt gehalten wird, bis eine genügende Menge des Akzeptors durch die semipermeable Membrane der Enzymelektrode in die Enzymschicht gelangt ist, wonach die Pufferlösung aus der Meßzelle abgesaugt und die Meßzelle mit der flüssigen Probe gefüllt wird.

Dadurch, daß die Temperatur der Enzymschicht in der Enzymelektrode lokal geregelt wird, kann die erforderliche Zeit für die Bereitstellung der Meßvorrichtung wesentlich verkürzt werden. Die für die Meßgenauigkeit erforderliche Regelung der Temperatur der Enzymschicht ist nämlich auf ein sehr kleines Volumen innerhalb der Enzymelektrode beschränkt. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht somit die unverzügliche Durchführung von Messungen in Notfall-Stationen. Durch die Zufuhr des Akzeptors zu der Enzymschicht vor dem Füllen der Meßzelle mit der flüssigen Probe wird einerseits die Vorbereitung der Proben vereinfacht, da im Gegensatz zu dem bekannten Verfahren die flüssigen Proben weder mit einem Akzeptor noch mit einer Pufferlösung gemischt werden müssen, wodurch auch die Automatisierung der Messungen erleichtert wird Andererseits kann der Akzeptor keine unerwünschte Änderung der Probe verursachen, da die Probe und der Akzeptor in der Meßzelle nicht miteinander in Berührung kommen. Bei dem bekannten Meßverfahren geschieht dies, so daß das Chinon (Akzeptor) die Auflösung der roten Blutkörper der Blutprobe verursacht (Hämolyse). Das durch diese Hämolyse befreite Hämoglobin lagert sich auf die Membrane der Enzymelektrode ab und ändert ihre Permeabilität derart, daß die Membrane bei dem bekannten Verfahren in kurzer Zeit unbrauchbar wird.

Wenn das erfindungsgemäße Verfahren derart durchgeführt wird, daß der Maximalwert des an dem elektrischen Sensor entstehenden Stromes selbsttätig gemessen wird, kann es weitgehend automatisiert, d. h, zeit- und arbeitssparend durchgeführt werden.

Vorteilhafte Durchführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den Unteransprüchen 2 bis 4 gekennzeichnet

Der die Vorrichtung betreffende Teil der Erfindungsaufgabe wird mit einer Vorrichtung der eingangs beschriebenen Gattung erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß Mittel innerhalb der Enzymelektrode zur lokalen Temperaturregelung der Enzymschicht und eine hydraulische Einrichtung, mit der die Meßzelle abwechselnd mit einer einen Akzeptor enthaltenden Pufferlösune oder mit einer flüssigen Probe gefüllt wird.

vorgesehen sind, daß die Meßzelle rohrförmig ist und sich zwischen den Kontaktflächen der Elektroden erstreckt, und daß die Nachweiseinrichtung eine elektronische Diskriminatorschaltung zur schnellen

> Ermittlung des Maximalwertes des gemessenen Stromes enthält.

Vorteilhafte Ausführungsformen der Vorrichtung sind in den Unteransprüchen 6 bis 12 gekennzeichnet.
Eine Enzymelektrode der eingangs beschriebenen

:.-, Gattung zeichnet sich erfindungsgemäß durch einen mit dem elektrochemischen Sensor thermisch gekoppelten Temperaturfühler und ein mit dem elektrochemischen Sensor thermisch gekoppeltes, von einer externen Temperaturregeleinheit gesteuertes Peltier-Element

ι, zur Temperaturregelung des elektrochemischen Sensors und der mit diesem in Kontakt befindlichen, ein Enzym enthaltenden Schicht aus.

Die wesentlichen, mit der Erfindung erzielten Vorteile seien nochmals zusammenfassend dargestellt:

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die erforderliche Temperaturregelung schneller und mit höchstem Wirkungsgrad durchzuführen, indem das temperaturgeregelte Flüssigkeitsvolumen auf das Volumen der das Enzym enthaltenden Schicht reduziert wird. Es

n ermöglicht weiter, daß der Akzeptor nicht zu jeder Testlösung hinzugefügt werden muß, was eine Reduktion des Arbeitsaufwandes bedeutet Wenn der Maximalwert des durch den elektrochemischen Sensor fließenden Stromes selbsttätig in einer elektronischen

\o Schaltung ermittelt wird, kann der Zeitaufwand pro Messung ganz erheblich verkürzt werden.

Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden folgende Vorteile erzielt: Durch die Automatisierung aller Meßvorgänge, mit Ausnahme der Einführung der

is Testlösung in die Meßzelle, und die Verwendung eines Fensterdiskriminators, können die Messungen bedeutend schneller (bis ca. 20 Messungen je Stunde) als mit den bekannten Vorrichtungen durchgeführt werden. Bedienung und Wartung der Vorrichtung sind einfach, so daß beides von Hilfspersonal vorgenommen werden kann. Da die Meßzelle sehr kleine Abmessungen hat, können die Messungen mit entsprechend kleinen Mengen an Testlösung (ca. 100 μΐ) durchgeführt werden. Es ist außerdem anzunehmen, daß das Vorhandensein einer solchen Vorrichtung die Verbreitung der Messung verschiedener Substrate von Enzymreaktionen für Diagnosezwecke fördern wird. So kann z. B. die Überwachung der Lactatkonzentration im Blut von Neugeborenen in Intervallen von einigen Minuter durchgeführt werden, was mit den bisher bekannter Verfahren und Vorrichtungen nicht möglich war.

Die erfindungsgemäße Enzymelektrode bietet haupt sächlich zwei Vorteile: Einerseits kann die Temperatur regelung der das Enzym enthaltenden Schicht sehi schnell und mit hohem Wirkungsgrad durchgeführ werden, denn der thermische Widerstand zwischen den Peltier-Element und der das Enzym enthaltende Schicht ist sehr klein. Andererseits konnten, da da: Peltier-Element und der Thermistor in der Enzymelek trode eingebaut wurden, die Abmessungen der Meßzel Ie in der Meßvorrichtung und dadurch die benötigt Menge der Testlösung pro Messung auf ein Minimun von ca. 100 μΐ reduziert werden.

Die Erfindung wird im folgenden anhand schemati scher Zeichnungen eines Ausführungsbeispiels mi weiteren Einzelheiten erläutert Es zeigt

F i g. 1 ein schematisches Blockdiagramm eine selbsttätig gesteuerten Vorrichtung zur Bestimmun

der Konzentration eines Substrats in einer Testlösung,

F i g. 2 eine perspektivische Ansicht einer bevorzugten Ausführung der Vorrichtung,

F i g. 3 einen Querschnitt einer thermisch geregelten Enzymelektrode,

F i g. 4 einen Teil des in F i g. 3 gezeigten Querschnitts, F i g. 5 eine typische Aufzeichnung des Stromverlaufs bei der Messung der Lactatkonzentration in verdünnten Lösungen von heparinisierten menschlichen Blutproben.

Wie in den F i g. 1 und 2 gezeigt, enthält die erfindungsgemäße Vorrichtung eine Meßzellenanordnung 1, welche aus einer thermisch geregelten Enzymelektrode 2, einer Bezugselektrode 3 und einer zur Aufnahme der Testlösung bestimmten, als rohrförmige Kammer von sehr kleinen Abmessungen ausgebildeten, zwischen die Kontaktflächen 4,5 der Elektroden gelegten Meßzelle 6 besteht Die Meßzellenanordnung 1 weist die in F i g. 1 schematisch dargestellten Kanäle 7,

8 auf, welche die Meßzelle 6 einerseits über eine Leitung

9 mit einem Verteiler 10, der mit der Meßzellenanordnung 1 mechanisch gekoppelt ist, und andererseits über eine Leitung 11 mit einem Behälter 12 zum Empfang der aus der Meßzelle 6 abgesaugten Abfassungen verbindet Die Meßzellenanordnung 1 und der Verteiler

10 sind teilweise aus durchsichtigem Material angefertigt. In den Verteiler 10 münden zwei Zuleitungen 13,14. Zuleitung 13 verbindet den Verteiler mit einem Behälter 15, der eine einen Akzeptor enthaltende Pufferlösung enthält und durch eine öffnung 15' stets nach außen geöffnet ist Zuleitung 14 ermöglicht die Verbindung des Verteilers mit einer Spritze 16, mit der eine Testlösung in die Meßzelle 6 eingeführt wird. Verteiler 10 ist durch einen Elektromagnet 17 steuerbar, um die Verbindung der Zuleitung 13 oder der Zuleitung 14 mit der Leitung 3 herzustellen. Der Behälter 12 ist nach außen geschlossen und nur über Leitungen 18,19 mit einer Vakuumpumpe 20 bzw. mit einem Luftventil 21 verbunden. Die Vakuumpumpe 20 ermöglicht die Bildung eines Vakuums im Behälter 12, welches je nach Einstellung des Verteilers 10 den Fluß der Pufferlösung vom Behälter 15 in die Meßzelle 6 oder das Absaugen der Abfallösungen von der Meßzelle 6 in den Behälter 12 verursachen kann. Das Luftventil 21 dient zur Beseitigung des durch die Vakuumpumpe 20 im Behälter 12 erzeugten Vakuums und damit zur Unterbrechung des durch Druckunterschied verursachten Flusses. Sowohl die Vakuumpumpe 20 ais auch das Luftventil 21 sind elektrisch steuerbar.

Fig.3 zeigt im Detail den Aufbau der in der Meßzellenanordnung 1 untergebrachten, thermisch geregelten Enzymelektrode 2. Ein als Halter dienender zylindrischer Kunststoffblock 22 weist eine zylindrische Vertiefung auf, die von einem ringförmigen Vorsprung umgeben ist In der Vertiefung ist ein elektrochemischer Sensor 23 aus Platin oder Gold untergebracht Dieser weist auch eine zylindrische Vertiefung von ca. 0,2 mm Tiefe auf. Der Rand des Vorsprungs und die äußerste ringförmige Oberfläche des elektrochemischen Sensors 23 befinden sich auf derselben Ebene. Eine semipermeable Membrane 24 aus regenerierter Cellulose wird durch einen außerhalb des Vorsprungs angeordneten Haltering 25 befestigt In dem Raum zwischen der Oberfläche der zylindrischen Vertiefung des elektrochemischen Sensors '.Q und der Membrane 24 befindet sich eine ein Enzym enthaltende Schicht 26. Der elektrochemische Sensor 23 ist von einem zylindrischen Ansatz eines scheibenförmigen Aluminiumteils 27 umgeben, der die thermische Kopplung zwischen dem elektrochemischen Sensor 23 und einem auf dem Aluminiumteil montierten Peltier-Element 28 ermöglicht. Der Aluminiumteil ist mittels einer Oxydschicht 29 von allen anderen Teilen elektrisch isoliert Zur Abkühlung des Peltier-Elements 28 ist auf diesem eine Kühlrippe 30 montiert.

Wie in F i g. 1 gezeigt, wird das Peltier-Element 28 von einer Temperaturregeleinheit 31 gesteuert, um die Temperatur des elektrochemischen Sensors 23 auf

ίο einem vorgegebenen Wert zwischen 10 und 20⁰C konstant zu halten. Durch die Temperaturregelung des elektrochemischen Sensors 23 wird eigentlich die Temperaturregelung der das Enzym enthaltenden Schicht 26 bezweckt da, wie bereits erwähnt die

■ 5 enzymatische Reaktion, die in dieser Schicht stattfindet temperaturabhängig ist Die Temperaturregelung der Schicht 26 kann mit der oben beschriebenen Anordnung am schnellsten und mit dem höchsten Wirkungsgrad erfolgen, da der thermische Widerstand zwischen dem Peltier-Element 28 und der Schicht 26 sehr klein ist Ein in einer Bohrung des elektrochemischen Sensors 23 untergebrachter und mit diesem thermisch gekoppelter Thermistor 34 ist mit der Temperaturregeleinheit 31 verbunden, um dieser die Bildung eines Signals zu ermöglichen, das den Ist-Wert der Temperatur des elektrochemischen Sensors 23 darstellt

Wie in F i g. 3 gezeigt dient eine Epoxydfüllung 37 zur Befestigung des Thermistors 34 in der Bohrung des elektrochemischen Sensors 23. Die Temperaturregeleinheit 31 ist über Leitungen 32,33 mit dem Peltier-Element 28 und über Leitungen 35,36 mit dem Thermistor 34 verbunden. Der elektrochemische Sensor 23 ist über eine Leitung 38 mit einer Gleichspannungsquelle 40 verbunden. Alle elektrischen Verbindungen werden über Anschlußklemmen 39 nach außen geführt

Je nach Substrat werden in der Enzymelektrode folgende Enzyme verwendet

Substrat

Enzyme

Glucose
Lactat

Glucose-Oxydase
Cytochrom t>2

Die Kriterien für die Wahl der Enzym- und Membraneigenschaften werden zunächst für die Messung der Lactatkonzentration erläutert Für ihre Verwendung in einer Klinik oder einem Analysenlabor muß die Enzymelektrode folgende Bedingungen erfüllen. Erstens muß bei Anwesenheit einer genügenden Menge des Akzeptors in der Enzym enthaltenden Schicht 26 der durch den elektrochemischen Sensor 23 fließende Dauerstrom proportional zur Lactatkonzentration in der Testlösung bis zu einer Konzentration von ca. 15 mM/1 sein. Zweitens muß trotz der unvermeidlichen Verminderung der Aktivität des Enzyms mit zunehmender Verwendungszeit die nach Eichung der Enzymelektrode auftretende zeitliche Abweichung des Dauerstromes möglichst gering sein. Drittens muß die Ansprechzeit der Enzymelektrode möglichst kurz sein (< 2 Min.). Um diese drei Bedingungen zu erfüllen, wäre es am besten, Membranen mit niedriger Permeabilität und kurzen Induktionszeiten (ein Maß für die Zeit, die eine Membrane benötigt um eine stationäre Diffusion des Substrats durch die Membrane zu ermöglichen) zu verwenden. Kommerziell erhältliche Zellophanmembranen weisen zwar eine kurze Induktionszeit für Lactat auf, ihre hohe Permeabilität erfordert jedoch die Verwendung von Enzymlösungen mit sehr hoher

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Aktivität. Mit den aktivsten Cytochrom-brLösungen, die zur Zeit erhältlich sind (ca. 2000 U/ml bei 25°C), ist es möglich, nach Eichung der Enzymelektrode eine sehr kleine zeitliche Abweichung der Meßwerte über einige Tage zu erreichen. Eine wirtschaftlich günstige Ausführung der Enzymelektrode muß über mehrere Wochen ohne Unterhalt verwendbar sein. Dies kann durch Verwendung von Membranen niedriger Permeabilität oder durch Verdünnung der Testlösung erreicht werden. Da zur Zeit keine zuverlässigen Membranen niedriger Permeabilität vorhanden sind, wurde die zweite Möglichkeit gewählt Es wurde festgestellt, daß ein Verdünnungsverhältnis von 1:10, das den Meßbereich auf 0 bis 1,5 mM/l reduziert, am zweckmäßigsten ist. Verdünnungsverhültnisse zwischen 1 :5 und 1 :20 sind jedoch auch anwendbar. In der oben beschriebenen Enzymelektrode wurden Zellophanmembranen PUDO-193 von Du Pont und Cytochrom-b2-Lösungen mit einer Aktivität von ca. 2000 U/ml verwendet Eine so präparierte Enzymelektrode kann mindestens während eines Monats für die Messung der Lactatkonzentration in verdünnten flüssigen biologischen Proben in einem Bereich von 0 bis 1,5 mM/l eingesetzt werden. Die Ansprechzeit dieser Enzymelektrode liegt zwischen 50 und 120 SeIc, wenn die Temperatur des elektrochemischen Sensors konstant bei 18°C gehalten wird.

Mit zunehmender Verwendungszeit nimmt die Aktivität des Enzyms ab. Dadurch nimmt die Intensität des durch die enzymatische Reaktion resultierenden Stromes ab, und die Ansprechzeit der Enzymelektrode nimmt zu. Das Ende der Lebensdauer des Enzyms ist durch den Zeitpunkt gegeben, zu dem der Dauerstrom nicht mehr proportional zur Lactatkonzentration ist oder wenn die Ansprechzeit der Enzymelektrode zu lang wird (über 2 Min.).

Der Unterhalt der Enzymelektrode ist einfach. Bei Ablauf der Lebensdauer des Enzyms werden das alte Enzym und die Membrane entfernt, die Kontaktoberfläche des elektrochemischen Sensors sorgfältig gereinigt, eine neue Enzymlösung wird auf dieser aufgetragen und eine neue Membrane montiert. Diese Unterhaltsmaßnahmen können von einer geübten Person in ca. 5 Minuten durchgeführt weiden. Die Enzymelektrode kann daraufhin wieder für mindestens einen Monat ohne Unterhalt verwendet werden.

Die in den F i g. 1 und 2 gezeigte Bezugselektrode 3 ist z. B. eine Silberchloridelektrode. Die Lebensdauer des in der Enzymeiektrode verwendeten Enzyms wird durch die Wirkung der von der Silberchloridelektrode abgegebenen Ionen verkürzt. Um das Enzym gegen diese Ionen zu schützen, wird die Bezugselektrode zweckmäßig mit einer nicht gezeigten Glasfritte oder einer Membrane versehen, die den Ionenfluß aus der Bezugselektrode hindern.

Wie in der F i g. 1 gezeigt, ist der elektrochemische ss Sensor der Enzymelektrode 2 über Leitung 38, die Gleichspannungsquelle 40, einen Stromverstärker 41 und eine Leitung 42 mit der Bezugselektrode 3 verbunden. Zur Messung eines durch diese Schleife fließenden Stromes ist ein Strommeßgerät 43 mit digitaler Anzeige an einen Ausgang des Stromverstärkers 41 angeschlossen. Ein mit dem Strommeßgerät parallelgeschalteter Fensterdiskriminator 44 dient bei jeder Substratkonzentrationsmessung zur schnellen Ermittlung des Maximalwertes des von dem Strommeßgerät 43 gemessenen Stromes. Im Fensterdiskriminator 44 werden bei zunehmendem Strom jeweils zwei nacheinander abgetastete Meßwerte verglichen. Wenn ihre Differenz kleiner als ein vorgegebener Bezugswert ist, gibt der Fensterdiskriminator 44 Signale ab, mit denen die digitale Anzeige des Strommeßgerätes 43 zur Anzeige des ermittelten Sättigungswertes blockiert und eine Anzeigelampe 45 zur Information der Bedienungsperson bev/irkt wird. Bei geeigneter Eichung der gesamten Nachweiseinrichtung mittels Potentiometer 46, 47 ist es danach möglich, die Konzentration von Substraten in einer Testlösung direkt von der in mM/l geeichten digitalen Anzeige des Strommeßgerätes 43 abzulesen. Ein weiterer Ausgang 48 des Stromverstärkers 4t gibt ein Signal für Registrierzwecke ab.

Wie in der F i g. 1 gezeigt, ist eine Steuereinheit 49 vorgesehen, die eine sequentielle elektrische Steuerung des Verteilers 10, der Vakuumpumpe 20, des Luftventils 21 und des Fensterdiskriminators 44 ermöglicht Zwei Drucktasten 50, 51 sind für die Bedienung der Vorrichtung vorgesehen. Mit der Drucktaste 50 wird ein Reinigungsvorgang gestartet durch den die Meßzelle 6 mit der Pufferlösung aus dem Behälter 15 gefüllt wird. Mit der Drucktaste 51 hingegen wird ein Absaugvorgang eingeleitet durch den die Meßzelle 6 und sämtliche Leitungen zwischen dem Spritzeneingang der Leitung 14 und dem Ausgang der Leitung 11 völlig in den Behälter 12 entleert werden. Am Ende dieses Vorganges wird durch eine von der Steuereinheit 49 gesteuerte Anzeigelampe 52 die Bereitschaft der Vorrichtung zum Empfang einer Testlösung angezeigt

In der oben beschriebenen Vorrichtung wird Kaliumhexacyanoferrat(III) sowohl für die Lactat- als auch für die Glucosekonzentrationsmessung als Akzeptor verwendet Je nach Substrat werden Pufferlösungen mit folgenden Akzeptorkonzentrationen verwendet

Substrat

Akzeptorkonzentration·)
(mM/l)

Lactat
Glucose

1-2
10

*) Wenn das Verdünnungsverhältnis der Testlösung ca. 1:10

Als Pufferlösung wird eine isotonische Phosphatlösung mit pH = 7,2 verwendet. Der Behälter 15 muß täglich mit frischer Pufferlösung gefüllt werden. Diese Unterhaltsmaßnahme läßt sich durch eine zweckmäßige Anordnung der Behälter in der Vorrichtung leicht durchführea

Da vor jeder Messung eine genügende Menge des Akzeptors der das Enzym enthaltenden Schicht zugefügt wird, braucht die Testlösung keinen Akzeptor zu enthalten. Wenn verdünnte biologische Flüssigkeiten als Testlösung verwendet werden, läßt sich die Verdünnung der flüssigen biologischen Proben mit im Handel erhältlichen Einrichtungen genau und schnell durchführea Im Zusammenhang mit der Vorbereitung der Testlösungen ist es wichtig zu beachten, daß bei dei Messung der Lactatkonzentration im Blut, die Erythrozyten in der Blutprobe in der Zeit zwischen dei Entnahme der Blutprobe und der Einführung dei Testlösung in die Meßzelle eine Erhöhung dei Lactatkonzentration verursachea Infolgedessen ist e< für die Genauigkeit der Messung erforderlich, dies« Zwischenzeit auf ein Minimum zu beschränken.

Die Eichung der Vorrichtung wird auf folgende Weist durchgeführt. Nachdem eine neue Enzymelektrode ir der Meßzellenanordnung 1 untergebracht worden ist wird die Meßzelle 6 mit der Pufferlösung gefüllt Nacr

einer Wartezeit von 10 bis 15 Minuten, in der der Grundstrom seinen Dauerwert erreicht hat, wird die Nullpunkteinstellung mit dem Potentiometer 46 vorgenommen. Die Pufferlösung wird dann aus der Meßzelle 6 abgesaugt und durch Testlösungen mit bekannter Lactatkonzentration ersetzt. Die Stromverstärkung wird jeweils mit dem Potentiometer 47 so eingestellt, daß die bekannte Lactatkonzeniration direkt von der digitalen Anzeige des Strommeßgerätes 43 abgelesen werden kann. Da der durch den elektrochemischen Sensor 23 fließende Strom eine gute Reproduzierbarkeit und eine sehr kleine zeitliche Abweichung aufweist, braucht man die Eichung der Vorrichtung nur in Intervallen von einigen Stunden zu prüfen. In der Tat ist es oft möglich, eine Enzymelektrode über mehrere Tage zu verwenden, ohne eine neue Einstellung der Eichung vornehmen zu müssen. Nach jeder Eichung oder Messung wird die Testlösung aus der Meßzelle 6 abgelassen und durch die Pufferlösung ersetzt.

Der in der Pufferlösung enthaltene Akzeptor diffundiert darauf durch die semipermeable Membrane 24 der Enzymelektrode 2 und gelangt in die das Enzym enthaltende Schicht Inzwischen sinkt der durch den elektrochemischen Sensor 23 fließende Strom in 2 bis 3 Minuten auf den Dauerwert des Grundstromes und eine neue Testlösung kann in die Meßzelle 6 eingeführt werden. Um eine optimale Genauigkeit zu erreichen, ist es nötig, ungefähr die gleiche Menge der Testlösung für die Eichung und die Messung zu verwenden.

Vor jeder Messung ist also die Meßzelle 6 bereits mit Pufferlösung gefüllt, die das Enzym enthaltende Schicht hat dadurch eine genügende Menge des Akzeptors erhalten und durch den elektrochemischen Sensor 23 fließt ein für die Messung unwichtiger Grundstrom.

Die Durchführung einer Messung mit der oben beschriebenen Vorrichtung erfolgt auf folgende Weise. Nach Betätigung der Drucktaste 51 durch eine Bedienungsperson steuert die Steuereinheit 49 den Verteiler 10, die Vakuumpumpe 20 und das Luftventil 21. Der Verteiler 10 wird mit dem Elektromagnet 17 gesteuert, um die Leitungen 9 und 13 zu verbinden. Das Luftventil 21 wird geschlossen und die Vakuumpumpe 20 in Betrieb gesetzt Die Vakuumpumpe 20 bildet ein Vakuum im Behälter 12, wodurch die Pufferlösung aus der Meßzelle 6 in den Behälter 12 abgesaugt wird. Nach einer bestimmten Zeit nach der die Meßzelle 6 und die mit dieser verbundenen Leitungen völlig entleert sind, wird die Vakuumpumpe 20 außer Betrieb gesetzt, das Luftventil 21 geöffnet der Fensterdiskriminator 44 in Betrieb gesetzt und die Bereitschaft der Vorrichtung zum Empfang einer Testlösung mit der Anzeigelampe 52 angekündigt Dann wird die Testlösung mit Hilfe einer Spritze 16 durch Leitung 14, Verteiler 10 und Leitungen 9 und 7 in die Meßzelle 6 eingeführt. Darauf nimmt der durch den elektrochemischen Sensor 23 fließende Strom zuerst schnell zu, erreicht nach 50 bis 120 Sek. einen Maximalwert und nimmt zuletzt langsam ab, da die Konzentration des Akzeptors in der Enzym enthaltenden Schicht durch Diffusion des Akzeptors in die Meßzelle 6 kleiner wird. Die anfängliche Stromzunahme kann mit Hilfe der digitalen Anzeige des Strommeßgerätes 43 beobachtet werden. Die relative Stromzunahme wird dabei im Fensterdiskriminator 44 mit einem vorgegebenen Bezugswert verglichen. Der Maximalwert des Stromes ist erreicht, wenn die relative Stromzunahme kleiner als der vorgegebene Bezugswert ist. Sobald der Maximalwert des Stromes ermittelt worden ist, gibt der Fensterdiskriminator 44 ein Signal zur Blockierung der digitalen Anzeige des Strommeßgerätes 43 ab, damit die Substratkonzentration aus dieser Anzeige abgelesen werden kann. Urn die Bedienungsperson auf den angezeigten Konzentrationswert aufmerksam zu machen, schaltet der Fensterdiskriminator 44 gleichzeitig die Anzeigelampe 45. Nachdem die Bedienungsperson den angezeigten Substratkonzentrationswert abgelesen hat betätigt sie die Drucktaste 50, worauf die Steuereinheit 49 den Verteiler 10, die Vakuumpumpe 20 und das Luftventil 21 steuert und den Fensterdiskriminator 44 außer Betrieb setzt, wodurch die Blockierung der digitalen Anzeige aufgehoben wird. Die Leitungen 9 und 13 werden durch den Verteiler 10 verbunden, das Luftventil 21 wird geschlossen und die Vakuumpumpe 20 in Betrieb gesetzt. Das von der Vakuumpumpe 20 im Behälter 15 hergestellte Vakuum verursacht dieses Mal das Absaugen der Testlösung aus der Meßzelle 6 in den Behälter 12 und den Fluß der Pufferlösung vom Behälter 15 in die Meßzelle 6. Nach einer bestimmten Zeit nämlich nachdem die Meßzelle 6 und die mit dieser verbundenen Leitungen mit Pufferlösung gefüllt sind, wird die Pumpe 20 außer Betrieb gesetzt und das Luftventil 21 geöffnet. Nach 2 bis 3 Minuten ist der durch den elektrochemischen Sensor 23 fließende Strom wieder auf den Dauerwert des Grundstromes gesunken, und eine neue Messung kann begonnen werden.

Wie in dem Stromverlauf der F i g. 5 gezeigt, sind die Eichkurven 55 und 56, die vor bzw. nach einer Reihe von Messungen aufgezeichnet wurden, praktisch gleich obwohl im Zeitpunkt des Versuches die Enzymelektro de 2 bereits 28 Tage in Betrieb war. Diese Meßergebnis se zeigen die ausgezeichnete zeitliche Stabilität unt Reproduzierbarkeit der Messungen, die mit de erfindungsgemäßen Enzymelektrode 2 durchgeführ werden können.

Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Messung der Konzentration von Substraten von Enzymreaktionen, die im intermediären Metabolismus auftreten, insbesondere der Konzentration von Lactat und Glucose in flüssigen biologischen Proben, bei welchem Verfahren die Konzentration des Substrats durch Ermitteln des Maximalwertes eines durch Oxidation eines Akzeptors an einem elektrischen Sensor entstehenden Stromes mit einer Meßvorrichtung gemessen wird, die sich im wesentlichen aus einer Meßzelle zur Aufnahme der flüssigen Probe, einer mit dieser Probe in Kontakt befindlichen, den elektrochemisehen Sensor, eine Enzymschicht und eine die Enzymschicht abdeckende semipermeable Membrane enthaltenden Enzymelektrode und einer mit der flüssigen Probe in Kontakt befindlichen Bezugselektrode zusammensetzt, wobei eine Regelung der Temperatur der Enzymreaktion vorgenommen und eine Gleichspannung zwischen der Enzymelektrode und der Bezugselektrode angelegt wird, dadurch gekennzeichnet, daß eine lokale Temperaturregelung der Enzymschicht durchgeführt wird, die Meßzelle vor dem Füllen mit der flüssigen Probe mit einer den Akzeptor enthaltenden Pufferlösung so lange gefüllt gehalten wird, bis eine genügende Menge des Akzeptors durch die semipermeable Membrane der Enzymelektrode in die Enzymschicht gelangt ist, wonach die Pufferlösung aus der Meßzelle abgesaugt und die Meßzelle mit der flüssigen Probe gefüllt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für die Messung der Konzentration von Glucose in flüssigen biologischen Proben Kaliumhexacyanoferratl[III) als Akzeptor verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Testlösungen verdünnte flüssige biologische Proben sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Verdünnungsverhältnis zwischen 1 :5und 1 :20 liegt.

5. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, die eine als Kammer ausgebildete Meßzelle zur Aufnahme einer flüssigen Probe, eine einen elektrochemischen Sensor, eine Enzymschicht und eine die Enzymschicht abdeckende semipermeable Membrane enthaltenden Enzymelektrode, eine Bezugselektrode und eine elektrische Nachweiseinrichtung zur Messung des durch den elektrochemischen Sensor fließenden maximalen Stromes enthält, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel (28, 34, 31) innerhalb der Enzynnelektrode (2) zur lokalen Temperaturregelung der Enzymschicht (26) und eine hydraulische Einrichtung, mit der die Meßzelle (6) abwechselnd mit einer einen Akzeptor enthaltenden Pufferlösung oder mit einer flüssigen Probe gefüllt wird, vorgesehen sind, daß die Meßzelle (6) rohrförmig ist und sich zwischen den Kontaktflächen (4,5) der Elektroden (2,3) erstreckt und daß die Nachweiseinrichtung eine elektronische Diskriminatorschaltung (44) zur schnellen Ermittlung des Maximalwertes des gemessenen Stromes enthält.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die thermisch geregelte Enzymelektrode i2) einen mit dem elektrochemischen Sensor (23)

thermisch gekoppelten Temperaturfühler (34) und ein mit ■ dem _v elektrochemischen Sensor (23) thermisch gekoppeltes, von einer Temperaturregeleinheit (31) gesteuertes Peltier-Element (28) zur Temperaturregelung des elektrochemischen Sensors (23) und der mit diesem in Kontakt befindlichen, ein Enzym enthaltenden Schicht (26) enthält

7. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die in der Meßzelle (6) untergebrachte Bezugselektrode (3) Bauteile enthält, die den Ionenfluß von der Bezugselektrode (3) zur Enzymelektrode (2) hindern.

8. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die hydraulische Einrichtung einen ersten Behälter {15) für die Aufbewahrung einer einen Akzeptor enthaltenden Pufferlösungen, einen mit dem ersten Behälter (15) und der Meßzelle (6) verbundenen Verteiler (10), einen zweiten Behälter (12) zum Empfang der aus der Meßzelle (6) abgesaugten Abfassungen, eine mit dem zweiten Behälter (12) verbundene Vakuumpumpe (20) zur Herstellung eines Vakuums im zweiten Behälter (12) und ein mit dem zweiten Behälter (i2) verbundenes Luftventil (21) zur Beseitigung des durch die Vakuumpumpe (20) hergestellten Vakuums im zweiten Behälter (12) enthält

9. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Diskriminatorschaltung (44) ein Fensterdiskriminator ist, der mit einer Anzeigeeinrichtung (45) zur Anzeige des Zeitpunktes der Ermittlung des Maximalwertes des durch die Enzymelektrode (2) fließenden Stromes verbunden ist

10. Vorrichtung nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch eine automatische Steuereinheit (49) zur sequentiellen Steuerung der hydraulischen Einrichtung.

11. Vorrichtung nach den Ansprüchen 5 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die automatische Steuereinheit (49) die elektrische Nachweiseinrichtung steuert.

12. Vorrichtung nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch eine von der automatischen Steuereinheit (49) gesteuerte Anzeigeeinrichtung (52) zur Anzeige der Bereitschaft der Vorrichtung zum Empfang w 11er Testlösung.

13. Enzymelektrode, insbesondere für eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, welche einen elektrochemischen Sensor, eine mit diesem in Kontakt befindliche, ein Enzym enthaltende Schicht und eine diese Schicht abdekkende semipermeable Membrane enthält, gekennzeichnet durch einen mit dem elektrochemischen Sensor (23) thermisch gekoppelten Temperaturfühler (34) und ein mit dem elektrochemischen Sensor (23) thermisch gekoppeltes, von einer externen Temperaturregeleinheit (31) gesteuertes Peltier-Element (28) zur Temperaturregelung des elektrochemischen Sensors (23) und der mit diesem in Kontakt befindlichen, ein Enzym enthaltenden Schicht (26).