DE2349464B2

DE2349464B2 - Enzymatisches Isomerisat einer dextrosehaltigen Lösung und enzymatisches Isomerisierungsveifahren zur Umwandlung von Dextrose in Laevulose

Info

Publication number: DE2349464B2
Application number: DE2349464A
Authority: DE
Inventors: Robert Edward Park Forest Heady; William Arthur Downers Grove Jacaway Jun.
Original assignee: Unilever Bestfoods North America
Current assignee: Unilever Bestfoods North America
Priority date: 1972-10-02
Filing date: 1973-10-02
Publication date: 1978-05-24
Also published as: DE2365722C3; MY7800032A; MY7800033A; NL169088C; AU6089973A; DE2349464A1; JPS5726758B2; NL7313551A; DE2349464C3; DE2365722A1; BE805548A; US3847741A; AR218021A1; NL169088B; AR209264A1; IT998687B; DE2365722B2; GB1447245A; NL7808628A; FR2201341B1

Description

• Die Erfindung betrifft ein enzymatisches Isomerisat einer de^trosehaltigen Lösung mit einem Laevulosegehalt von mindestens 42%, einem durch die Isomerisierung verursachten Aschegehalt von unter 1,0% und einem Psicosegehalt von nicht über 0,3%, jeweils bezogen auf die Trockensubstanz, das hergestellt worden ist durch Einwirkung einer Xyloseisomerase-Enzymzubereitung auf eine dextrosehaltige Lösung bei einer Temperatur von 50 bis 70°C und einem pH-Wert von wenigstens 7, sowie ein enzymatisches Isomerisierungsverfahren zur Umwandlung von Dextrose in Laevulose, bei dem eine Dextrose enthaltende Lösung bei einer Temperatur im Bereich von 50 bis 70° C und bei einem pH-Wert von wenigstens 7 der Einwirkung einer Xyloseisomerase-Enzymzubereitung unterworfen wird.

Die enzymatische Isomerisierung von Dextrose in Laevulose mit Hilfe von Xylose-Isomerase ist bereits bekannt, z. B. aus der DE-OS 21 08 125.

Die bekannten enzymatischen Isomerisierungsverfahren zur Umwandlung von Dextrose, meist in Form vor Stärkehydrolysaten mit Dextroseäquivalent-

(D. E.-)Werten von über 95%, in Laevulose werdet im allgemeinen chargenweise, z. B. bei einerTemperatui von etwa 70° C und einem pH von etwa 6,2 währenc einer Isorr.erisierungszeit von etwa 40 bis 60 Stunder durchgeführt, wobei der pH-Wert entweder kontinuier Hch oder abschnittsweise durch Zugabe von basischen Material, z. B. Natriumbicarbonat, aufrechterhalter wird. Die optimalen Arbeitsbedingungen hängen insbe sondere vom Typ des verwendeten Isomerase-Enzymj

ίο ab, da jede Enzym-Zubereitung ein spezielles Optimurr in bezug auf pH, Temperatur und Bedarf an Metaller sowie eine bestimmte Temperatur-Stabilität und eine bestimmte Michaelis-Konstante hat (vgl. Sato, Dem punto Gijutsu Kenkyu, 32,1965,81-88). So ist z. B. be

is Verwendung einer Enzym-Zubereitung aus einen Mikroorganismus der Gattung Streptomyces die gebildete Laevulosemenge bei 70° C größer als bei 60° C doch gehen bei pH 6,2 einige Vorteile, die bei höherer Temperaturen erzielt werden, verloren, weil das leichi saure Milieu die Laevuloseausbeute und Enzymstabilität vermindert. Wird das Enzym in Form von Mikrobenzel len eingesetzt, so werden durch die beim Mischer erzeugten Scherkräfte Zellen zerstört, Zellflüssigkeii einschließlich Enzyme geht in die Lösung über und eine stärkere Enzyminaktivierung als in inaktiven Zellen isi die Folge.

Der Einfluß der Temperatur auf die Isomeraseaktivi· tat wird z. B. von N. Tsumura und T. Satο in Agr Biol. Chem. 29, 1965, 1123-1128 und 1129-1134 beschrieben. Danach verliert eine Isomerase au! Aerobacter cloace seine Hauptaktivität bei 80° C ir Gegenwart von Magnesium- und bei 90°C in Gegen wart von Kobaltionen. In Abwesenheit von Metallionen die stabilisierend wirken, verlor das Enzym bereits nach 10 Minuten bei einer Temperatur von 70⁰C einer wesentlichen Teil seiner Aktivität. Nach den vor Yoshimura et al in Agr. Biol. Chem. 30 (10), 1966 1015-1023 beschriebenen Befunden besitzt Isomerase aus Bacillus coagulans die größte Aktivität bei einei Inkubationszeit von 2 Stunden bei 70⁰C, bzw. von 2( Stunden bei 60⁰C bis 65° C, und oberhalb diesei Temperaturen tritt Inaktivierung ein.

Kontinuierliche Verfahren zur Isomerisierung vor Dextrose in Laevulose sind ebenfalls bekannt, z. B. au; Journal of Food Science and Technology, 14 (12), 1967 539 und 540, wonach eine gereinigte Isomerase, die siel· von einem Streptomyces-Stamm ableitete, in eine: Säule an einem DEAE-Sephadex-Bett fixiert unc dadurch immobilisiert wird. Bei der Verfahrensdurch

so führung, die bei 60⁰C erfolgte, wurde eine Verminde rung der Enzymaktivität beobachtet, von der nich sicher ist, ob sie durch Enzym-Inaktivierung oder durch Auslaugen des Enzyms aus der Säule verursacht wurde Bei der von T a k a s a k i et al in Perlman »Fermente tion Advances«, Academic Press, 1969, 561 ff. beschriebenen kontinuierlichen Säulen-Isomerisierunj mit Hilfe eines Isomerase-Enzyms, das sich von einen gewöhnlichen Streptomyces-Stamm ableitete, wurde oberhalb von 70⁰C nach 10 Minuten Enzym-Inaktivie rung gefunden.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfach durchzufüh rendes Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Dextrose in Laevulose anzugeben, das kontinuier lieh durchführbar und besonders wirtschaftlich unc effektiv ist und eine wesentliche Verbesserung dei Enzymstabilität ermöglicht.

Diese Aufgabe wird bei einem enzymatischer Isomerisat bzw. bei einem enzymatischen Isomerisie

(•längsverfahren des eingangs genannten Typs dadurch gelöst, daß man nach der ersten Phase der Umsetzung die Temperatur um wenigstens 5° C erhöht, jedoch nicht über 80⁰C ansteigen läßt, und die Isomerisierung fortsetzt Die im folgenden verwendete Bezeichnung »Enzym-Zubereitung« umfaßt z. B. ganze lebende Zellen, getrocknete Zellen, Zellextrakte und gereinigte und konzentrierte Präparate, die sich von den Zellen ableiten. Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen kontinuierlichen Isomerisierungsverfahrens verwendeten Enzym-Zubereitungen liegen immer in immobilisierter Form vor. So kann z. B. die Enzym-Zubereitung in der Lösung eines Stärkehydrolysate dispergiert sein und in dieser Lösung zurückgehalten werden, indem die gewünschten Endprodukte mit Hilfe eines selektiven Membranfilters durch Ultrafiltration abgetrennt werden. Ferner kann die Enzym-Zubereitung an eine unlösliche Matrix in üblicher bekannter Weise gebunden sein, und als besonders vorteilhaft hat sich die weiter unten näher erläuterte, mit Hilfe von teilchenförmigen! basischem Magnesiumcarbonat immobilisierte Enzymzubereitung erwiesen.

Erfindungsgemäß wird die enzymatische Isomerisierung bei einer nahezu konstanten Anfangstemperatur innerhalb des Bereiches von 50 bis 70° C durchgeführt, anschließend wird die Arbeitstemperatur stufenförmig oder in einem einzigen Schritt wie angegeben erhöht. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Strom einer dextrosehaltigen Lösung während einer Anfangsphase der Isomerisierung der Wirkung einer immobilisierten Enzym-Zubereitung bei einem pH-Wert von vorzugsweise 7,5 bis 8,5 und einer Temperatur von wenigstens 5O⁰C, jedoch mindestens 1O⁰C unterhalb derjenigen Temperatur, bei der eine schnelle Inaktivierung des Enzyms erfolgt, unterworfen. Für Enzym-Zubereitungen aus Mikroorganismen der Gattung Streptomyces ist die Temperatur, oberhalb der eine schnelle Inaktivierung eintritt, gewöhnlich etwa 7O⁰C, weshalb während der Anfangsphase der Isomerisierung zweckmäßig bei etwa 60⁰C oder darunter, vorzugsweise bei 50⁰C bis 60⁰C, gearbeitet wird. Bei Temperaturen von 50⁰C bis 6O⁰C tritt zwar eine gewisse Enzym-Inaktivierung ein, die jedoch relativ gering ist im Vergleich zu derjenigen bei 7O⁰C. Wenn ein gewisser Verlust an Enzymaktivität nach dem Arbeiten im Bereich von z.B. 50⁰C bis 6O⁰C zu beobachten ist, wird die Temperatur um wenigstens etwa 5° C erhöht, was entweder stufenweise um 2 bis 3⁰C oder weniger, je nach Erfordernis, um die gewünschte Ketosemenge in dem Produkt aufrechtzuerhalten, oder in einem einzigen Schritt erfolgen kann. Vorzugsweise wird die Temperatur in der zweiten Phase des Verfahrens um mindestens etwa 10° C und vorzugsweise wird sie stufenweise in kleinen Abschnitten erhöht.

Zur Bestimmung der Isomerase-Aktivität wird die aus einer Glucoselösung gebildete Ketose unter standardisierten Versuchsbedingungen spektrophotometrisch ermittelt. Die Zusammensetzung der zur Aktivitätsbestimmung verwendeten Vorratslösung wird in der folgenden Tabelle 1 wiedergegeben.

Tabelle 1

Fortsetzung

Komponenten

Menge

Komponenten

Menge

O.lmol. MgSO₄-7H₂O
0,1 mol. CoCl₂-OH₂O

1 ml
1 ml

l.Omol. Phosphatpuffer, pH 7,5 0,5 ml

Wasserfreie D-Glucose 1,44 g

Mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 7,5 ml

ίο Die zu untersuchende Enzym-Zubereitung wird zunächst mit Ultraschall oder in anderer geeigneter Weise behandelt, um das Enzym in eine für den Versuch geeignete Form zu bringen, worauf dann auf einen Gehalt von 1 bis 6 Isomerase-Einheiten pro ml verdünnt wird.

1 ml Enzym-Zubereitung wird zu 3 ml Vorratslösung zugegeben und die enzymatische Isomerisierung erfolgt, indem 30 Minuten bei 6O⁰C inkubiert wird. Nach beendeter Inkubation wird eine 1-ml-Probe entnommen und mit 9 ml 0,5 n-Perchlorsäure inaktiviert, worauf die inaktivierte Probe auf ein Gesamtvolumen von 250 ml verdünnt wird. Zur Kontrolle wird eine Glucoselösung in gleicher Weise behandelt, der anstelle von 1 ml Enzym-Zubereitung 1 ml Wasser zugesetzt wurde.

Die gebildete Ketose wird sodann durch eine Cystein-Schwefelsäure-Methode bestimmt. Die isomerase-Einheit wird definiert als diejenige Menge Enzym-Aktivität, die erforderlich ist, um 1 Mikromol Laevulose je Minute unter den angegebenen Isomerisierungsbedingungen zu erzeugen.

Die bereits bekannten' immobilisierten Enzymzubereitungen haben in der Industrie keine weite Verbreitung gefunden. So haben zwar z. B. Aktivkohle, Calciumcarbonat u.dgl. bekanntermaßen ein relativ hohes Bindevermögen für Enzyme, z. B. Xyloseisomerase, doch sind die auf diese Weise erhaltenen immobilisierten Enzymzubereitungen vergleichsweise wenig aktiv bei der Umwandlung von Dextrose in Laevulose. Ferner sind sie in der Regel instabil, und sehr kurze Halbwertszeiten sind typisch für sie.

Aus der US-PS 37 15 276 ist z. B. die Verwendung von Calciumcarbonat, Magnesiumcarbonat sowie einigen Ionenaustauscherharzen zur Steuerung des pH-Werts während längerer enzymatischer Isomerisierungsreaktionen von Dextrose in Laevulose bekannt. Dabei wird ein Xyloseisomerase-Enzym eingesetzt, das durch eine Wärmebehandlung innerhalb der Zellen gebunden ist, so daß es nicht an dem den pH-Wert regulierenden Mittel sorbiert wird. Außerdem erfolgt die pH-regulierende Wirkung von Calciumcarbonat, Magnesiumcarbonat und Ionenaustauscherharzen nur bei einer relativ langen Isomerisierung von mehr als etwa 4 Stunden. Übersteigt jedoch die Verweilzeit der Zuckerlösung etwa 4 Stunden, so erfolgt die Bildung unerwünschter Nebenprodukte, z. B. von Psikose. Da in vielen Nahrungsmitteln, in denen laevulosehaltige Sirupe eingesetzt werden, Psikosegehalte von mehr als 2 Gew.-% und oftmals 1 Gew.-%, bezogen auf Trockenbasis, nicht toleriert werden können, sind Verfahren mit längeren Verweilzeiten des aus der US-PS 37 15 276 bekannten Typs technisch uninteressant.

Erfindungsgemäß werden demgegenüber zellfreie, lösliche Xyloseisomerase-Enzymzubereitungen mit basischem Magnesiumcarbonat kontaktiert, wodurch sie gebunden oder sorbiert werden und eine hochaktive, immobilisierte Enzymzubereitung ergeben. Verwandte Stoffe wie Calciumcarbonat führen zu keiner hochaktiven und stabilen Xyloseisomerase, und andererseits

wird eine intracellulare Xyloseisomerase nicht an basischem Magnesiumcarbonat sorbiert.

Die erfindungsgemäß verwendbare immobilisierte Xyloseisomerase-Zubereitung zeichnet sich durch einen sehr hohen Enzymwirkungsgrad aus, wobei die Zuckerkontaktzeit, die zur Erzeugung eines laevulosehaltigen Sirups von mindestens etwa 45 Gew.-% Laevulose aus einer dextrosehaltigen Lösung erforderlich ist, in der Regel unter etwa 2 Stunden liegt. Infolge der geringeren Kontaktzeit zeichnen sich die erhaltenen laevulosehaltigen Sirups durch eine geringere Farbe, einen geringeren Gehalt an organischer Säure sowie einen niedrigeren Gehalt an Psikose aus, der in der Regel unter etwa 1 Gew.-% und oftmals unter etwa 0,3 Gew.-%, bezogen auf Trockenbasis, liegt Diese Vorteile sind im Hinblick auf die Investitionskosten sowie die Kommerzialisierung des Verfahrens sehr gravierend.

Zur Herstellung der erfindungsgeträß stabilisierten Xyloseisomerase-Enzymzubereitung wird vorzugsweise eine zellfreie Xyloseisomerase mit basischem Magnesiumcarbonat in Form von Einzelteilchen, das entweder ein Pulver oder ein Granulat sein kann, kontaktiert. Das Granulat wird im Hinblick auf die Fließeigenschaften bevorzugt, die dann ins Gewicht fallen, wenn ein Tiefbettkonverter eingesetzt wird. Wahlweise kann das in Form von Einzelteilchen vorliegende basische Magnesiumcarbonat zunächst in einen Konverter, der später zur Durchführung der enzymatischen Isomerisierungsreaktion eingesetzt wird, eingebracht werden, worauf eine Lösung einer zellfreien Xyloseisomerase so lange durch die Säule gepumpt wird, bis kein Enzym mehr vom basischen Magnesiumcarbonat sorbiert wird. Anschließend an die Herstellung der stabilisierten Enzymzubereitung ist der Konverter bereit für die Isomerisierungsreaktion, und eine dextrosehaltige Lösung wird durch ihn hindurchgeleitet.

Das eingesetzte Xyloseisomerase -Enzym kann hochrein oder roh sein. Die Reinigung kann in üblicher bekannter Weise erfolgen, z. B. durch fraktionierte Ausfällung mit Natriumsulfat, Ammoniumsulfat oder einem anderen Mineralsalz, durch selektive Adsorption, durch eine Differential-Wärmeinaktivierung verunreinigender Proteine bei steigenden Temperaturen und verschiedenen pH-Werten, durch isoelektrische Ausfällung, durch Ausfällung unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels und unter Einsatz von Alkoholen, durch eine DEAE-Zellulosechromatographie sowie durch eine »Sephadex«-Gelfiltration, durch elektrophoretische Trennung oder eine Ultrazentrifugentrennung.

Die verwendete Xyloseisomerase-Enzymzubereitung liegt in ihrer 'öslichen Form vor, d. h., sie ist frei von Mikrobenzellen, wobei die Freisetzung des Enzyms aus dem Zellmaterial in üblicher Weise erfolgen kann. Das Enzym in dem Rohmaterial wird sodann an dem basischen Magnesiumcarbonat sorbiert und daran gebunden. Die immobilisierte Enzymzubereitung kann danach z. B. durch Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt und mit einem Puffer gewaschen werden. Die erhaltene Enzymzubereitung kann in feuchter Form verwendet werden, oder der Kuchen kann nach bekannten, für Enzymzubereitungen üblicherweise verwendeten Trocknungsmethoden getrocknet werden, z. B. durch Zellentrocknung, Drehtrommeltrocknung oder Sprühtrocknung oder auch Gefriertrocknung. Sehr gute Ergebnisse werden dann erhalten, wenn das Enzym vor der Sorption gereinigt wird.

Vor dem Immobilisieren wird die zellfreie Enzymlösung vorzugsweise auf einen pH-Wert von etwa 7,5 bis 9,5, insbesondere von etwa 8 bis 9 eingestellt. Die Immobilisierung kann bei Zimmertemperatur, z. B. etwa 25° C, durchgeführt werden, um eine Inaktivierung des Enzyms zu vermeiden. Es können jedoch auch höhere Temperaturen toleriert werden, falls die Enzymlösung mit einer dextrosehaltigen Lösung während der Immobilisierung vermischt wird. Liegt der pH-Wert der Enzymlösung, die mit dem basischen Magnesiumcarbonat kontaktiert werden soll, unter etwa 7, so tendiert das basische Magnesiumcarbonat zur Zersetzung, weshalb es zweckmäßig ist, den pH-Wert bei etwa 7,5 oder darüber zu halten.

Die Enzymlösung besitzt vorzugsweise eine Aktivität von mindestens etwa 10 Einheiten/ml (U/ml), und sie kann eine Aktivität von bis zu 3000 U/ml aufweisen. In der Regel beträgt die Isomeraseenzymaktivität etwa 50 bis 200 U/ml.

Das basische Magnesiumcarbonat besitzt ein starkes Bindevermögen für das Xyloseisomerase-Enzym und kann eine Enzymmenge binden, deren Aktivität, vor der Sorption gemessen, mehr als 150 Einheiten pro Gramm (U/g) des gebundenen Enzyms (d. h. des Komplexes aus Isomerase und basischem Magnesiumcarbonat) äquivalent ist. Die sorbierte Enzymmenge entspricht in der Regel 250 U/g, in der Praxis oftmals mehr als 500 U/g des Komplexes. Allerdings bleibt nicht die ganze ursprüngliche Enzymaktivität nach der Komplexbildung erhalten, wie z. B. das unten angegebene Beispiel 8 zeigt, obwohl das ganze proteinhaltige Enzym sorbiert wird. Mit »gebundene Isomerase« und »Bindevermögen« werden hier und im folgenden Isomeraseeinheiten, gemessen in Lösung vor der Sorption, gebunden an 1 g des Komplexes, bezogen auf Trockenbasis, bezeichnet.

Im Vergleich zu anderen bekannten Trägermitteln wurde überraschenderweise gefunden, daß die erfindungsgemäß verwendete immobilisierte Xyloseisomerase-Zubereitung eine extrem hohe »effektive Isomerase-Aktivität« besitzt, d. h. eine Isomeraseaktivität des

■ίο immobilisierten Enzyms, welche tatsächlich enzymatisch die Umwandlung von Destrose in Laevulose bedingt. Unter Verwendung bekannter Trägermittel, z. B. Aktivkohle, Calciumcarbonat, Zinkcarbonat und dergleichen hergestellte immobilisierte Enzymkomplexe besitzen in der Regel eine Wirksamkeit von weniger als 50% der Aktivität, die, bezogen auf die Isomerasemenge, die tatsächlich an den Träger gebunden oder sorbiert ist, zu erwarten wäre. Demgegenüber hat die erfindungsgemäß verwendbare immobilisierte Xyloseisomerase-Zubereitung mindestens etwa 70% und oftmals mehr als 80% der Aktivität der ursprünglichen Isomerase, die an den Träger gebunden ist.

Die erfindungsgemäß verwendbare immobilisierte Xyloseisomerase-Zubereitung zeichnet sich daher dadurch aus, daß sie eine effektive Isomeraseaktivität pro Gramm der immobilisierten Enzymzubereitung, bezogen auf Trockenbasis, von mindestens 100 (d. h. 100 U/g der wirksamen Isomeraseaktivität) und vorzugsweise von mindestens etwa 175 U/g besitzt.

Wesentlich ist ferner die lange Halbwertszeit der erfindungsgemäß verwendbaren immobilisierten und stabilisierten Enzymzubereitung, die 45% Laevulose zu erzeugen vermag bei Fließgeschwindigkeiten von mehr als 0,5 Bettvolumina/Stunde, wobei die Enzym-Halb-

b5 wertszeit bei mehr als 15 Tagen liegt.

Das verwendete basische Magnesiumcarbonatmalerial ist vorzugsweise eine körnige poröse Substanz mit jeder gewünschten Teilchengröße. Zu seiner Hersiel-

lung kann zunächst eine Magnesiumcarbonat-trihydrat-Aufschlämmung gebildet, die Aufschlämmung auf einen Feststoffgehalt von mindestens etwa 10% entwässert und die erhaltene pastenartige Masse getrocknet werden. Das erhaltene Produkt besitzt eine feste, ^r> gegenüber Zerstoßen widerstandsfähige Struktur und eine ausgeprägte Affinität für lösliche Enzyme, z. B. Xyloseisomerase.

Basisches Magnesiumcarbonat kann z. B. auch nach den in den US-PS 22 09 752, 22 09 753 und 22 09 754 beschriebenen Methoden hergestellt werden.

Einige erfindungsgemäß bevorzugt verwendbare basische Magnesiumcarbonate sind im Handel verfügbar und werden z. B. definiert als

4 MgCOi · Mg(OH)₂ · 5 H₂O ^IS

(oder 5 MgO ■ 4 CO₂ ■ 6 H₂O)

mit einem Molekulargewicht von etwa 485,74, einer absoluten Dichte von etwa 2,16, einem Feuchtigkeitsgehalt (11O⁰C) von etwa 0,5 bis 2,3%, einer Schüttdichte (lose) von 0,0560 bis 0,1280 g/ccm sowie einer Maschengröße, daß mindestens 99% (feucht) ein Sieb einer lichten Maschenweite von 0,04 mm passieren, wobei ferner eine Summenformel von

3,2 MgCOj · Mg(OH)₂ · 3,9 H₂O "

aufgestellt worden ist.

Die stabilisierte immobilisierte Xyloseisomerase-Enzymzubereitung eignet sich hervorragend zur Durchführung des erfindungsgemäßen temperaturprogrammierten Verfahrens zur kontinuierlichen Umwandlung von Dextrose in Laevulose, aufgrund der vergleichsweise geringen Kontaktzeit, die wegen der hohen Glucoseisomerase-Aktivität pro Gramm Enzymzubereitung erforderlich ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Reaktionslösung gebildet, die etwa 20 bis 70 Gew.-% Dextrose enthält, einen pH-Wert von etwa 7,5 bis 9,5 und eine Temperatur von etwa 30 bis 90⁰C aufweist. Diese Lösung wird über ein Bett aus der immobilisierten Xyloseisomerase mit einer effektiven Isomeraseaktivität von mindestens etwa 100 U/g der Enzymzubereitung geschickt. Vorzugsweise enthält die Reaktionslösung etwa 40 bis 60 Gew.-% Dextrose, und der pH-Wert der Lösung liegt zwischen etwa 8,2 und 9,2. 4^r> Besonders bevorzugt wird eine Reaktionslösung mit etwa 50 Gew.-% Dextrose und einem pH-Wert zwischen etwa 8,4 und 8,6.

In typischer Weise besitzt die immobilisierte Xyloseisomerase-Zubereilung eine effektive Isomeraseaktivi- w tat von mindestens etwa 175 U/g der immobilisierten Enzymzubereitung. Die Reaktionstemperatur liegt in besonders vorteilhafter Weise zwischen etwa 50 und 75°C, vorzugsweise bei etwa 6O⁰C.

Das Xyloseisomerase-Enzym stammt vorzugsweise π aus einem Mikroorganismus des Genus Streptomyces, insbesondere aus den Mutantenstämmen S. olivochrornogenes ATCC Nr. 21 713, S. olivochromogenes ATCC Nr. 21 714 und S. olivochromogenes ATCC NR. 21 715, die z. B. in der DT-OS P 22 45 402 beschrieben werden, m>

Die zur Herstellung der Reaktionslösung verwendete Dextrose kann in kristalliner Form, in erneut aufgeschmolzener Form oder als Stärkehydrolysat, das entweder durch aufeinanderfolgende oder gleichzeitige cnzymatische Verflüssigung und Verzuckerung einer h^r> stärkehaltigen Lösung gewonnen ist, eingesetzt werden. Als geeignete Reaktionslösungen kommen Stärkehydrolysat· in Frage, *1ic mil einer Säure verdünnt oder verflüssigt und in einer anschließenden Stufe enzymatisch in eine dextrosehaltige Lösung umgewandelt wurden. Bevorzugte Stärkehydrolysate werden in dei Weise hergestellt, daß eine enzymverflüssigte stärkehal tige Lösung mit einer Kombination von zwei Enzymen z.B. mit Glukoamylase- und 1,6-Glukosidaseenzym umgewandelt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur enzymatischer Umwandlung von Dextrose in Laevulose ist ir vorteilhafter Weise in Säulenreaktoren kontinuierlich durchführbar, wobei das immobilisierte Enzym in di( Säule gepackt wird. Die Säule kann gegebenenfalls weitere Materialien enthalten, um die Fließgeschwin digkeit der Reaktionsflüssigkeit zu verbessern, ζ. Β Glaskügelchen oder Filterhilfsstoffe. Ausgezeichnet« Fließgeschwindigkeiten werden bei Verwendung eine; körnigen basischen Magnesiumcarbonate mit Teilchen größen von mehr als 0,42 mm, vorzugsweise von etwi 0,84 bis 1,68 mm erzielt. Basisches Magnesiumcarbona in derart körniger Form läßt sich in einfacher Weist dadurch erhalten, daß im Handel verfügbares pulverför miges basisches Magnesiumcarbonat in einer geeigne ten Vorrichtung kompaktiert und anschließend vermah len wird.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dei Erfindung wird mehr als eine Säule verwendet, unc vorzugsweise werden mindestens drei Säulen einge setzt, welche in Reihe geschaltet sind. Auf diese Weisf läßt sich eine wirksamere Ausnutzung der immobilisier ten Enzymzubereitung erzielen, z. B. können höhen Fließgeschwindigkeiten eingehalten werden. Wird di< erste Säule der Reihe inaktiviert, so kann di< Beschickungsflüssigkeit ohne weiteres der zweitei Säule zugeführt werden, während die erste Säule durcl Kontaktierung mit frischem, löslichem Xyloseisomera se-Enzym regeneriert wird. Wird die zweite Säuh inaktiviert, so kann die Beschickungsflüssigkeit zuers der dritten Säule und anschließend der regeneriertei ersten Säule zugeführt werden, so daß eine kontinuierli ehe Verfahrensdurchführung ohne Unterbrechen mög lieh ist. Die immobilisierte Xyloseisomerase-Enzymzu bereitung kann ferner in einem handelsübliche! Druckblattfilter verwendet werden, das aus einem odei mehreren flachen Filterelementen (Blättern) besteht, di( vertikal oder horizontal in einem zylindrischen Tan! befestigt sind.

Da das basische Magnesiumcarbonat, welches da: gebundene Xyloseisomerase-Enzym enthält, auf einen alkalischen pH gehalten werden muß, um ein« Zersetzung während der enzymatischen Isomerisie rungsreaktion zu verhindern, sollte die dextrosehaltigi Beschickungsflüssigkeit zuvor auf die angegebene! alkalischen pH-Werte von mindestens etwa 7,5 um vorzugsweise von mehr als 8,2 eingestellt werden Infolge der erhöhten Enzymkonzentration sowie dei beibehaltenen Aktivität des Komplexes aus Xyloseiso merase und basischem Magnesiumcarbonat verminder sich bei kontinuierlicher Umwandlung die Zeitspanne die zur Erzeugung eines Laevulosesirups mit 45°/i Laevulose erforderlich ist, so daß eine pH-Wertände rung im Konverter infolge der Bildung organische! Säuren nicht festzustellen ist. Bei Verweilzciten vor unter 2 Stunden und vorzugsweise von unter 1 Stunde und bei pH-Werten der Ausgangsbeschickungsflüssigkeil von über 8,0 erübrig! sich daher die Steuerung de; pH-Werts durch ein alkalisches Material, wie auch durch Beispiele gezeigt werden konnte.

Neben den angegebenen Vorzügen ist einer dei

wichtigsten erfindungsgemäß erzielbaren Vorteile die Herabsetzung der Kosten pro Einheit produzierter Laevulose. Im Vergleich zur chargenweisen Isomerisierung wird z.B. erfindungsgemäß mit der gleichen Enzymmenge bis zu dreimal mehr Verfahrensprodukt > gewonnen. Hinzu kommt die wesentlich kürzere Isomerisierungszeit. so daß die Zucker, die zur Umsetzung gelangen, der erhöhten Temperatur weniger lang ausgesetzt sind, weshalb ein geringerer thermischer Abbau eintritt. Das Endprodukt enthält daher weniger färbende Bestandteile, so daß die Farbe des Produktes verbessert und die Raffinationskosten geringer sind. Auch werden weniger organische Säuren gebildet, und die Zusammensetzung der Kohlenhydrate im Endprodukt ist hochgradig sowie erwünscht. Wegen ι > der kürzeren Reaktionszeiten sind ferner auch kleinere Anlagen für die Verfahrensdurchführung erforderlich.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, wobei sich aus den Beispielen 5 bis 8 die grundsätzlichen Vorteile einer mit basischem Magnesiumcarbonat immobilisierten Enzymzubereitung ergeben, die bei der Verwendung derselben zur Durchführung des in den übrigen Beispielen beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens voll zu Tage treten.

Beispiel 1

Kontinuierliche Isomerisierung unter Verwendung
eines fixierten Bettes von Mikrobenzellen

Einstufige Temperatureinstellung

25

JO

Um die Erfindung zu erläutern, wurde eine mit Mantel versehene Säule verwendet. Der Mantel war mit einer Heißwasserquelle verbunden, um die Temperatur der Säule während der Isomerisierung zu kontrollieren. j5

Ein Stamm eines Mikroorganismus der Gattung Streptomyces, der als guter Isomerase-Erzeuger erkannt war, wurde unter submersen aeroben Bedingungen in einem xylosehaltigen Medium kultiviert, um intrazellular Isomerase zu erzeugen.

Nach der Fermentation wurde Magnesiumhydroxid im Verhältnis von 2 Gew.-Teilen Magnesiumhydroxid je Gew.-Teil Zellmasse der Kulturbrühe zugesetzt. Die so erhaltene Anschlämmung wurde filtriert, und der Filterkuchen wurde in einem offenen Gefäß bei Raumtemperatur getrocknet. Die Aktivität der so erhaltenen trockenen Enzym-Zubereitung betrug 330 Einheiten je Gramm.

Die trockene Enzym-Zubereitung wurde in einer 50%igen Dextroselösung (GewVVol.) dispergiert. Die Anschlämmung wurde dann in die mit Mantel versehene Säule übergeführt, und beim Einführen in die Säule wurden gleichzeitig kleine Glaskugeln mit einem Durchmesser von etwa 3 mm hinzugefügt. Die Glaskugeln dienten als Träger und verhinderten gleichzeitig ein Absetzen der Enzym-Zubereitung und Verstopfen der Säule. In dieser Weise wurden etwa 750 Einheiten des Enzyms in die Säule eingeführt.

Ein Dextrosesirup mit einer Konzentration von 50% (Gew./Vol.) wurde durch Zugabe von Magnesiumhydro- bo xid auf ein pH im Bereich von 7,0 bis 7,5 eingestellt. Der Sirup wurde mit Stickstoff beladen und dann in den oberen Teil der Säule unter Stickstoff-Atmosphäre eingeführt.

Das isomerisierte Produkt wurde in gleichen Mengen von 15 ml in Versuchsgläsern gesammelt. Die Versuchsgläser enthielten jedes etwa 5 ml einer 0,5-n-Perchlorsäure, um jede lösliche Isomerase, die mit der Lösung hätte austreten können, zu inaktivieren.

Während einer Anfangsphase wurde die Temperatui der Säule bei etwa 6O⁰C gehalten. Die Durchflußmenge der Dextroselösung durch die Säule wurde in wesentlichen konstant gehalten, und der Ketosegehal des Ausflusses betrug 40 bis 50%, bezogen au Trockensubstanz.

In dieser Weise wurde die Isomerisierung 9 Tage lang durchgeführt, bevor ein wesentlicher Abfall hinsichtlich der Enzym-Aktivität in Erscheinung trat, was sich ir einer Abnahme des im Ausfluß beobachteten Ketose wertes zeigte. Während der Anfangsphase des Versuch; hatte der durchschnittliche Ketosegehalt des Ausflusse! bei 38,7% gelegen.

Bei Beendigung dieser Phase des Versuchs wurde die Temperatur der Säule in einer Stufe (von derr Ausgangswert in Höhe von 6O⁰C) auf 70⁰C erhöht. Die Isomerisierung wurde dann fortgesetzt bei der erhöhter Temperatur während einer zusätzlichen Zeit von 2' Stunden. Der Ketosegehalt des ausfließenden Produk tes während der zweiten Phase des Versuchs betrug in Durchschnitt etwa 49%. Die Ergebnisse sind in dei folgenden Tabelle zusammengestellt worden (Tabelle 2)

Bei Wiederholung der Isomerisierung mit einei Enzym-Zubereitung, die aus einem Gemisch vor Diatomeenerde und Mikrobenzellen bestand, wurder nahezu die gleichen Resultate erhalten.

Tabelle 2

Kontinuierliche Isomerisierung,

einstufige Temperatureinstellung

Zeit	Tem	Durchlauf	Auslauf des etwa	42%	pro Lite	951
	pera	[lurch das Bett	Laevulose in der	Trok-	Mikrobenzellenbett	951
	tur		kensubstanz enthaltender	951	951
			Produktes in 0,016 kg	951	951
			Trockensubstanz	951	936
Tage	"C 1	M. je Stunde	951	876
1	60	,27	936	823
2	60	,27	876	771
3	60	,27	823	1235
4	60	,27	771	1235
5	60	,25	734
6	60	,17	681
7	60	,10	Beispiel 2
8	60	,03
9	70	,65
10	70	1,65

Kontinuierliche Isomerisierung unter Verwendung eines fixierten Bettes von Mikrobenzellen

Temperatureinstellung in kleinen Stufen

Intrazellulare Isomerase wurde durch Wachsen einer Streptomyces-Kultur unter submersen aeroben Bedingungen in einem xylosehaltigen Nährmedium gewonnen.

Nach Beendigung der Fermentation wurde Diatomeenerde-Filterhilfsmittcl der fermentierten Flüssigkeit im Verhältnis von 2 Teilen Filterhilfsmittel zu 1 Teil Mikroorganismen-Zellen, bezogen auf das trockene Gewicht der Zellen, zugesetzt. Das Gemisch aus Zellen und Diatomeenerde wurde durch Filtration abgetrennt,

gewaschen und getrocknet, um es als Enzym-Zubereitung zu verwenden.

Diese Enzym-Zubereitung wurde in Dextroselösung suspendiert und in eine mit Mantel versehene Säule eingeführt. Der untere Auslaß der Säule war an eine Vakuumquelle angeschlossen, um ein kompaktes Bett zu erhalten. Nach dem Füllen enthielt die Säule 0,35 kg (Trockensubstanz) Enzym-Zubereitung (d. h. Gemisch aus Zellen und Filterhilfsmittel) pro Liter des Säulenvolumens.

Durch den Mantel der Säule wurde Wasser von 60⁰C gegeben. Es wurde eine Lösung mit einem Gehalt von 500 g Trockensubstanz je Liter eines Stärkehydrolysats mit 95% D.E. und 92% Dextrose in der Trockensubstanz mit Magnesiumhydroxid auf pH 7,8 eingestellt und kontinuierlich in die Säule eingeführt, wobei zur Kontrolle der Ausflußmenge Druck angewendet wurde. Die Durchflußmenge wurde so eingestellt, daß im Ausfluß aus der Säule ein Gehalt von 42% Laevulose (bezogen auf Trockensubstanz) aufrechterhalten wurde.

Nach einer Versuchsdauer von 6 Tagen wurde das Ausflußvolumen auf 66% des Anfangswertes reduziert, um den Gehalt an 42% Laevulose (in der Trockensubstanz) aufrechtzuerhalten. Danach wurde die Temperatur periodisch erhöht, wie aus Tabelle 3 hervorgeht, damit die Ausflußmenge bei einem Gehalt von 42% Laevulose nicht weniger als 66% der anfänglichen Ausflußmenge betrug. Wie aus der Tabelle 3 zu ersehen ist, war die Gesamtausflußmenge, die in einer Zeit von 14 Tagen durch Erhöhen der Temperatur erhalten wurde, um 41 % größer als die Gesamtausflußmenge, die erhalten worden wäre, wenn die Temperatur auf 60⁰C konstant gehalten worden wäre.

Tabelle 3

Kontinuierliche Isomerisierung unter Verwendung eines fixierten Bettes,
Temperaturerhöhung in kleinen Stufen

Zeit Tempe- Auslauf des etwa 42% Laevulose in der ratur Trockensubstanz enthaltenden Produktes

in 0,016 kg Trockensubstanz pro Liter Tage "C Mikrobenzellenbett

60
60
60
60
60
60
62
62
62
64
64
66
68
70

787 787 787 787 622 516 418 343 286 233 187 158 127 106

787 787 787 787 622 516 590 516 516 509 509 473 674 622

insgesamt 6144

8695

Kulturmedium durchgeführt, um Isomerase zu produzieren. Durch Hinzufügen von Diatomeenerde zur Kulturbrühe und Filtrieren wurden die Zellen abgetrennt.

j Ein Teil des feuchten Filterkuchens wurde als Enzym-Zubereitung zur Durchführung einer chargenweisen Isomerisierung von einem Maisstärkehydrolysat mit einem D.E.-Wert von 95% verwendet. Die Verweilzeit in einem mit Rührwerk ausgerüsteten

ι» Reaktionsbehälter betrug 50 Stunden bei pH 6,25.

Ein anderer Teil der gleichen Enzym-Zubereitung wurde als Enzymquelle für ein fixiertes Bett verwendet, um eine kontinuierliche Isomerisierung durchzuführen. Die Verweilzeit in der Säule betrug bei pH 8 1 bis 2 Stunden.

Die chargenweise Isomerisierung wurde bei 70⁰C durchgeführt, die kontinuierliche Isomerisierung in einer Anfangsphase, bis im wesentlichen eine Inaktivierung des Enzyms beobachtet wurde, bei 6O⁰C. Dann wurde die Säulentemperatur auf 70⁰C erhöht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 zusammengestellt.

Tabelle 4

Chargenweise und Säulen-Isomerisierung eines
Hydrolysats mit einem D.E.-Wert von 95 %

Chargenweise, Zugeführtes Isomerisat Differenz

50 Stil., pH 6,25 Material

Asche, % Tr.	1,0	1,8	0,8
Organische Säu	0,05	0,08	0,03
ren, % Tr.
Farbe	4	200	196

Kontinuierlich, Zugeführtes Isomerisat Differenz

1-2 Std. pH 8 Material

Asche, % Tr.	0,5
Organische Säu	0,03
ren, % Tr.
Farbe	4

0,6
0,04

0,1
0,01

Beispiel 3

Chargenweise Isomerisierung im Vergleich

zur kontinuierlichen Isomerisierung mit immobilisierten Enzymen im fixierten Bett

Es wurde eine Fermentation mit einem Mikroorganismus der Gattung Streptomyces in einem xylosehaltigen Die chargenweise Isomerisierung wurde bei pH 6,25 durchgeführt, weil bei pH-Werten über 7,0 während der langen Reaktionsdauer, die beim chargenweisen Arbeiten erforderlich ist, die Zusammensetzung des Endproduktes dazu neigte, unerwünscht zu werden. Es wurden Bedingungen für den Vergleich gewählt, von denen angenommen werden kann, daß sie für jeden Verfahrenstyp das Optimum darstellten. Das Ergebnis der Vergleichsversuche spricht eindeutig für das kontinuierliche Verfahren, dessen Wirtschaftlichkeit darauf beruht, daß es wirksamer ist und eine wesentlich geringere Menge an Enzym-Aktivität pro Einheit gebildete Laevulose erfordert.

Beispiel 4
Stabilisierte Enzyme

Dieses und die folgenden Beispiele zeigen die _b5 verbesserte thermische Aktivität der erfindungsgemäß verwendbaren stabilisierten Isomerase, deren Einsatz zur Durchführung des temperaturprogrammierten Verfahrens nach der Erfindung die Herstellung von

hochlaevulosehaltigen Sirupen ohne übermäßigen Enzymverlust ermöglicht.

Die verwendete stabilisierte Isomerase war ein aus den Zellen gewonnenes Enzym von sehr hoher Reinheit, das in Lösung gebracht und über ein Bett von teilchenförmigen! basischem Magnesiumcarbonat geleitet und daran wirksam absorbiert worden war.

Die Vorteile des Arbeitens bei höheren Temperaturen, das zu höheren Laevulosegehalten führt, weil die umgesetzte Menge und der im Gleichgewicht befindliche Laevulosegehalt ansteigt, ergeben sich aus der folgenden Tabelle, in der die bei einigen erhöhten Temperaturen im Gleichgewicht befindlichen Laevulosegehalte zusammengestellt sind (Tabelle 5).

Beispiel 5 Tabelle 5

Im Gleichgewicht befindlicher Laevulosegehalt
in Abhängigkeit von der Temperatur

Isomerisierungstemperaturen

Laevulosegehalt, % Tr.,
bezogen auf Ausgangsmenge Dextrose

51,2
52,6
54,0

Die mit dem stabilisierten Enzym gefüllte Säule, durch die ein Strom einer Dextroselösung bei pH 8 geschickt wurde, wurde bei 60⁰C und darüber vergleichsweise lange betrieben, wobei das Enzym eine lange Lebensdauer hatte, während der Laevulosegehalt im Ausfluß mindestens 50% des gesamten vorhandenen Zuckers, bezogen auf Trockensubstanz, betrug. Das Verfahrensprodukt hatte eine besonders gute, d. h. geringe Farbe, einen niedrigen Gehalt an organischen Säuren und einen niedrigen Gehalt an unerwünschten Kohlenhy- au draten. Das hohe Arbeits-pH förderte die Enzymstabilität trotz der hohen Arbeitstemperaturen, die ihrerseits eine sehr kurze Verweilzeit in der Säule bedingten. Demzufolge ließen sich auch die erforderlichen Investitionen und Anlagekosten verringern.

Weitere Versuche zeigten, daß sich das erfindungsgemäße Verfahren auch mit Enzym-Zubereitungen anderen Typs erfolgreich durchführen läßt, wobei im allgemeinen die Verwendung intakter Zellen bevorzugt wird. Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung wurden getrocknete Zellen in ein feines Pulver übergeführt. Es wurde durch Auflösen einer kleinen Menge eines oberflächenaktiven Mittels in einer l.Omol. Glycinlösung eine Pufferlösung hergestellt, die durch Zugabe einer kleinen Menge Natriumhydroxid auf pH 8,0 eingestellt wurde. Durch Zugabe von 200 g der trockenen, fein gepulverten Zellen zu 1000 ml Pufferlösung wurde eine Aufschlämmung hergestellt, die filtriert wurde. Es wurden 793 ml Filtrat mit einer Aktivität von 17,5 Einheiten je ml erhalten.

Ein Teil dieser Enzymlösung wurde sodann an einem porösen Glasträger mit großer Oberfläche und reaktionsfähigen Silangruppcn fixiert, wie es in der US-PS

35 56 945 beschrieben wird. Eine weitere Menge der

Lösung wurde an aktivierter granulierter Kohle μ absorbiert. Beide Enzym-Zubereitungen wurden zur Durchführung des crfindungsgcmäßcn kontinuierlichen Isomerisierung!!- Verfiihrcns erfolgreich verwendet.

Kontinuierliche er..*.} malische Umwandlung von

Dextrose in Laevulose unter Verwendung von

immobilisierter Xyloseisomerase

Ein körniges basisches Magnesiumcarbonat mit einer Teilchengröße zwischen 1,65 bis 0,844 mm wird in einer Menge von 55,8 g in eine Säule gegeben, die ein Volumen von 73,3 ml aufweist. Ein im wesentlichen reines, lösliches und zellfreies Xyloseisomerase-Enzym, das auf S. olivochromogenes ATCC Nr. 21 713 in einer 0,01 m MgSCvLösung zurückgeht und eine Aktivität von 50 U/ml besitzt, wird mit dem körnigen basischen Magnesiumcarbonat kontaktiert, um die Säule mit 5 Millionen Einheiten/0,03 m* des Enzyms zu beladen. Das immobilisierte Xyloseisomerase-Enzym weist eine effektive Aktivität von mehr als 100 U/g pro Gramm des immobilisierten Enzyms auf.

Eine wäßrige Dextrose-Beschickungsflüssigkeit wird dann der Säule mit 27° Baume (50% Trockensubstanz) zugeführt. Die Beschickungsflüssigkeit enthält MgCl₂ (0,005 m bezüglich MgCl₂). Der pH-Wert der Beschikkung wird auf 8,4 bis 8,8 mit 4 n-NaOH bei 58⁰C eingestellt.

Die Säule, welche die immobilisierte Enzymzubereitung enthält, wird auf einer Temperatur von 58°C gehalten. Die Verweilzeit in der Säule beträgt weniger als 1 Stunde. Das Ausgangsbettvolumen pro Stunde für die Herstellung von 45% Laevulose, bezogen auf

in Trockenbasis (BVH45 Laevulose) beträgt ungefähr 1.

Der abfließende Sirup enthält ungefähr 45 Gewichts-% Laevulose, bezogen auf Trockenbasis, und weniger als ungefähr 0,3 Gewichts-% Psikose, bezogen auf Trockenbasis. Nachfolgend wird eine Analyse des pH-Wertes des Beschickungssirups sowie des abfließenden Sirups nach einer längeren kontinuierlichen Umwandlung angegeben:

Betriebsstunden Beschickungssirup Ablauf

pH bei 25 C pH bei 25

8,60

Der vorstehend beschriebene Versuch wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Xyloseisomerase an einen Aluminiumoxydträger gebunden wird. Die gleiche

5(i Dextrose-Beschickungsflüssigkeit, die zuvor auf einem pH von 8,3 bis 8,4 mit 4 n-NaOH eingestellt worden ist, wird durch die Säule gepumpt, die auf einer Temperatur von 58°C gehalten wird, und zwar mit einer solchen Geschwindigkeit, daß 45 Gewichts-% Laevulose, bezogen auf Trockenbasis, in dem Ablauf erhalten werden. Die Vcrwcilzcit beträgt weniger als 1 Stunde. Nachfolgend wird eine Analyse des pH des Beschikkungssirups sowie des ablaufenden Sirups nach einer längeren kontinuierlichen Umwandlung angegeben:

M)

Bctricbsstuntlcn Hcsihickunpssirup Ablauf

pll bei 25 ( pll bei 25 C

8,3

8,15

HA

8,4

8,25

8,3

Bei dem Betrieb einer Sau!::, in welcher die Verweilzeit ungefähr 4 Stunden überschreiten kann, ist es besonders vorzuziehen ein alkalisches Material, wie beispielsweise eine Natriumhydroxyd- oder Mg(OH)2-Lösung oder eine Kombination aus diesen beiden Lösungen in die Säule in verschiedenen Höhen einzuführen. Eine geeignete Methode zur Durchführung dieser Maßnahme besteht darin, Einlasse für die alkalischen Lösungen an einer oder mehreren Stellen längs der Säule vorzusehen, so daß der pH-Wert der Reaktionslösung auf wenigstens ungefähr 7,5 gehalten wird.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der pH-Wert der enzymatischen Isomerase-Reaktionslösung durch die Verwendung von einem oder mehreren Einlassen für die alkalische Lösung längs der Säule programmiert werden. Bei der Durchführung einer derartigen Methode kann der Anfangs-pH-Wert der Beschickungsflüssigkeit ungefähr 7,5 oder darüber betragen und vorzugsweise zwischen ungefähr 7,5 und ungefähr 8,2 liegen. Durch Einführen von alkalischen Materialien, wie beispielsweise Natriumhydroxyd oder Mg(OH)2 oder Kombinationen aus diesen zwei Materialien, in die Reaktionslösung über Einlasse längs der Säule kann der pH-Wert der Reaktionslösung in bequemer Weise bis auf einen Wert von bis zu ungefähr 9,5 gebracht werden. Vorzugsweise wird der pH-Wert um einen Wert von wenigstens ungefähr 0,1 durch die Zufuhr von Vorratsflüssigkeit zu dem Ablauf erhöht, wobei jedoch günstigere Ergebnisse bezüglich der Stabilität des basischen Magnesiumträgers sowie der Qualität der Isomerase erzielt werden, wenn der pH-Wert um einen Wert von wenigstens ungefähr 0,2 gesteigert wird.

Beispiel 6

Kontinuierliche enzymatische Umwandlung von

Dextrose in Laevulose unter Verwendung von

immobilisierter Xyloseisomerase

Eine von einem Glasmantel umgebene Säule mit einer Länge von 104 cm wird als Konverter verwendet. Der Durchmesser des Enzymbettes beträgt 26 mm. Wasser wird in den Konverter an dem tieferen Ende in einer Menge von ungefähr 2 Bettvolumina pro Stunde eingepumpt. Trockenes basisches Magnesiumcarbonat, das durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 1,15 mm gesiebt worden ist und auf einem Sieb mit einer lichten Maschenweite von 0,60 mm gesammelt worden ist, wird dann oben in die Konvertersäule eingefüllt. Die Teilchen des basischen Magnesiumcarbonats setzen sich unten an dem Konverter ab, während das feine Material des basischen Magnesiumcarbonats aus dem Oberteil der Säule durch aufsteigendes Wasser ausgewaschen wird.

Nachdem das Bett aus basischen Magnesiumcarbonat-Teilchen hergestellt worden ist, wird eine lösliche Xyloseisomerase-Enzymlösung, die auf einen Mikroorganismus des Genus Streptomyces zurückgeht (1 1 mit einer Enzymaktivität von 100 U/ml) durch das Bett bei Zimmertemperatur gepumpt. Bezogen auf den Unterschied der Enzymaktivität der Lösung vor sowie nach einem zweimaligen Durchlaufenlassen durch das Bett wird festgestellt, daß 79 000 Einheiten des Isomeraseenzyms in dem Bett aus basischem Magnesiumcarbonat gebunden sind, wobei ein Komplex aus Xyloseisomerase und basischem Magnesiumcarbonat gebildet wird, der eine effektive Aktivität von mehr als 175 U/g besitzt.

Eine enzymatische Isomerisierung einer Dextroselösung unter Bildung eines Laevulose enthaltenden Sirups wird in der Weise durchgeführt, daß durch die Säule eine Lösung geschickt wird, die 600 g pro Liter Dextrose enthält, und zwar bei einem Anfangs-pH von ungefäht 8,3 sowie einer Anfangsfließgeschwindigkeit von ungefähr 1,5 Bettvolumina pro Stunde (ungefähr 800 ml pro Stunde). Aliquotproben werden periodisch für Analysezwecke abgezogen. Während der ersten 6 Stunden des

ίο Betriebs enthält das ablaufende Produkt zwischen 45,S und 48,7 Gewichts-% Ketose. Die Fließgeschwindigkeil zur Herstellung eines Ketoseproduktes in einer Menge von 45 Gewichts-%, bezogen auf Trockenbasis, beträgt ungefähr 1 Bettvolumen pro Stunde oder darüber. Die

is Menge der gebildeten Psikose beträgt weniger als 1 Gewichts-%, bezogen auf Trockenbasis.

Unter Berücksichtigung der bei der Durchführung des vorstehend geschilderten Experiments erhaltenen Ergebnisse ist ersichtlich, daß der Komplex aus Xyloseisomerase und basischem Magnesiumcarbonat sehr aktiv ist. Das Experiment zeigt ferner, daß das gebundene Enzym aktiv und sehr stabil ist. Da die Qualität eines Produktes aus einem kontinuierlich arbeitenden Konverter mit einer Produktionsgeschwindigkeit von 0,5 Bettvolumina pro Stunde (BVH) zufriedenstellend ist, kann die Produktionszeit dieses Konverters 22 Tage betragen, wobei die Halbwertszeit des Konverters zwischen 16 und 18 Tagen liegt. Bei einer durchschnittlichen Produktionsgeschwindigkeit von 1,3 BVH bei 45% Laevulose während einer Zeitspanne von 17 Tagen beträgt das Gesamtprodukt, bezogen auf Trockenbasis, 171 849 g oder 0,46 Enzymeinheiten pro Gramm des Produktes. Daraus geht deutlich der durch die Erfindung erzielbare technische Fortschritt hervor, der insbesondere auf Einsparungen an dem Enzym zurückzuführen ist, das zur Herstellung des gewünschten Laevuloseproduktes erforderlich ist.

Beispiel 7

Ein im Handel erhältliches basisches Magnesiumcarbonat-Pulver wird kompaktiert und auf eine Teilchengröße zwischen ungefähr 0,42 und 0,60 mm vermählen. 31,7 g dieses granulierten basischen Magnesiumcarbonat-Trägers werden in eine mit Wasser gefüllte Säule gegeben, die von einem Mantel umgeben ist. Das Bett besitzt ein Volumen von 53 ml. Wasser wird durch die Säule an ihrem unteren Ende eingepumpt, so daß die gröberen Teilchen des körnigen basischen Magnesiumcarbonats sich unten in dem Konverter absetzen, während das feine Material aus dem Oberteil der Säule durch das aufsteigende Wasser ausgewaschen wird.

In einem anderen Behälter wird eine Lösung hergestellt, die 95% D.E.-Stärkehydrolysat mit einem Feststoffgehalt von 50% sowie lösliches Enzym enthält Das Xyloseisomerase-Enzym geht auf Streptomyces zurück und besitzt eine Isomeraseaktivität von 50 U/ml Die Lösung wird auf 189 mi eingestellt. Magnesiumchlorid (MgCb) wird der Lösung zur Einstellung eines Gehaltes von 0,005 m bezüglich MgCl₂ zugesetzt. Der

W) pH wird unter Verwendung von 4 n-Natriumhydroxyd auf 8,4 eingestellt.

Die Kombinationslösung (Stärkehydrolysat und lösliches Enzym) wird in die Kolonne eingepumpt, welche das körnige basische Magnesiumcarbonat enthält und 2'/2mal durch die Säule laufengelassen, so daß der Träger mit 5 Millionen Einheiten pro 0,03 m³ des Enzyms bei einer Temperatur von 6O⁰C beladen wird. Nachdem die Lösung, die das iösiiche Enzym und das

BO9 621/232

Stärkehydrolysat enthält, durch die Säule laufengelassen worden ist, ist die Säule anschließend aktiviert und fertig für eine Verwendung zur kontinuierlichen Umwandlung einer Dextroselösung in einen Laevulose enthaltenden Sirup. Der Komplex aus Xylc-.eisomerase und körnigem basischen Magnesiumcarbonat besitzt eine effektive Isomeraseaktivität von mehr als 175 U/g des Komplexes.

Ein Laevulose enthaltender Sirup wird kontinuierlich in der Säule in der Weise hergestellt, daß eine Lösung, ι ο die ein Stärkehydrolysat mit einem Dextroseäquivalent von ungefähr 95 enthält und einen Feststoffgehalt von ungefähr 50%, bezogen auf Trockenbasis, aufweist, eingepumpt wird. Das in die Säule eingepumpte Stärkehydrolysat wird zuerst mit MgCb zur Einstellung ι *, eines MgC^-Gehaltes von 0,005 m behandelt, worauf der pH-Wert der Lösung auf 8,4 unter Verwendung von 4 n-NaOH eingestellt wird. Die Isomerisierung wird kontinuierlich bei einer Temperatur von 60° C bei einem Laevulose-BVH42-Wert von 1,6 durchgeführt.

Nach 69 Stunden vermag die immobilisierte Xyloseisomerase in der Säule immer noch Dextrose in Laevulose umzuwandeln, wobei ein Produkt erhalten wird, das einen Ketosegehalt von 40,1%, bezogen auf Trockenbasis, und einen Psikosegehalt von 0,15 Gewichts-%, bezogen auf Trockenbasis, aufweist, wobei ein eingestelltes Bettvolumen pro Stunde erzielt wird, das 1,8 BVH42 äquivalent ist.

Dieses Experiment zeigt deutlich die Stabilität sowie die Enzymwirkung der erfindungsgemäßen immobili- jo sierten Xyloseisomerase.

Beispiel 8
Vergleichsbeispiel

Erdalkalicarbonate werden im Vergleich auf ihr Bindevermögen (»gebundene Isomerase«) sowie die

J5 effektive Isomeraseaktivität (»beibehaltene Isomeraseaktivität«) mit in Form von Einzelteilchen vorliegendem basischen Magnesiumcarbonat verglichen. In jedem Falle wird der getestete Träger mit einer gereinigten, zellfreien Xyloseisomerase-Lösung kontaktiert, die 2500 bis 2600 U/ml Glukoseisomerase-Aktivität enthält. Die Xyloseisomerase geht auf einen Mikroorganismus des Genus Streptomyces (Stamm S. olivochromogenes, ATCCNr.21 713)zurück.

Jeder der Träger wird in einem 150-mI-Becher mit 30 ml einer Lösung aufgeschlämmt, die aus

0,01 m MgSO₄ · 7H₂O

besteht. Die Aufschlämmung wird auf einen pH von 8 bis 9 unter Verwendung von 0,1 n-KOH eingestellt. Die gereinigte Xyloseisomerase-Lösung wird dann einer jeden Trägeraufschlämmung zugesetzt, um eine Gesamtisomerase-Zugabe von ungefähr 2600 Einheiten Glukoseisomerase-Aktivität zu erzielen. Eine weitere Menge einer 0,01 m MgSO₄-Lösung wird einer jeden Aufschlämmung aus Träger und Enzym zugesetzt, um ein Gesamtvolumen von 50 ml einzustellen. Der pH-Wert der Lösung wird (falls erforderlich) auf 8 bis 9 eingestellt. Die Becher werden bedeckt und bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 30 Minuten gerührt, um eine maximale Sorption des Enzyms an die entsprechenden Träger zu bewirken. Die Aufschlämmungen werden filtriert, worauf die Träger mit dem sorbierten Enzym mit 100 ml der 0,01 m MgSO₄-Lösung gewaschen werden. Die Filtrate sowie die Waschlösungen werden vereinigt und auf ihre Isomeraseaktivität gegenüber der zugesetzten ursprünglichen Isomeraseaktivität unter Verwendung eines handelsüblichen Analysators untersucht

Das Bindevermögen oder die »gebundene Isomerase« der jeweiligen Träger wird unter Anwendung der folgenden Formel berechnet:

Gebundene Isomerase (BI)

in Einheiten pro g (U/g),

bezogen auf das Trockengewicht (d. b.)

Alle vorliegenden Einheiten —

Alle Einheiten in dem Filtrat und in den Waschlösungen
g Träger, d. b.

Die »effektive Isomeraseaktivität« (auch als »zurückbehaltene Isomeraseaktivität« bezeichnet) einer jeden Erdalkali-Carbonatträgerprobe wird unter Einhaltung der folgenden Methode bestimmt:

Eine wäßrige Lösung, die 80 g Dextrose (d. b.) und 13,3 mg Mg(OH)₂ pro 100 ml enthält, wird hergestellt. Die Lösung wird während wenigstens 1 Stunde (vorzugsweise über Nacht) zur Gleichgewichtseinstellung gerührt. Der pH wird auf 8,5 bei Zimmertemperatür mit 3 n-KOH eingestellt. 193,9 g Substrat (ungefähr 150 ml) werden in einen Becher aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 1 1 zugesetzt, der mit einem Uhrglas mit einem Loch in der Mitte bedeckt ist, wobei das Uhrglas ein weiteres Loch in der Nähe seines Randes aufweist. Die Probe wird in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 60°C gestellt und während einer Zeitspanne von 15 Minuten gerührt, wobei ein pH-Wert von 8,0 unter Verwendung von 3 n-KOH aufrechterhalten wird. Das Substrat wird mit Stickstoff mit mäßiger h5 Geschwindigkeit gespült, wobei ein Gasverteilungsrohr verwendet wird, das durch das Loch am Außenumfang des Uhrglases eingeführt wird. Eine zuvor abgewogene Menge eines Komplexes aus Xyloseisomerase und basischem Magnesiumcarbonat, der 1000 bis 3000 Einheiten an gebundener Isomerase enthält, wird unter Verwendung von 50 ml Wasser mit einer Temperatur von 60° C zugesetzt, wobei das Wasser dazu verwendet wird um das Material in den Becher aus rostfreiem Stahl zu überführen. Auf diese Weise erhält man eine Reaktionsmischung, die 60 g Dextrose und 10 mg Mg(OH)₂ pro 100 ml enthält und einen Isomerasegehalt von 8,3 bis 25,0 Einheiten pro Gramm Dextrose aufweist. Die Reaktionsmischung wird auf einen pH von 8,0 eingestellt und während einer Zeitspanne von 2 Stunden, die exakt nach der Enzymzugabe gemessen werden, digeriert. Das Material wird sofort durch Vakuum durch ein Filterpapier filtriert, worauf der pH eines 500-ml-Anteils des Filtrats auf ungefähr 2,5 unter Verwendung von 1,0 n-Perchlorsäure eingestellt wird. Der Trockensubstanzgehalt der inaktivierten Probe wird durch Brechungsindexmessung bestimmt. Die Laevulosekonzentration wird durch spektrophotometrische oder polarimetrische Methoden ermittelt. Aus der Menge der erzeugten Laevulose wird die effektive

Isomerase-Aktivität (»beibehaltene Isomeraseaktivität«) unter Anwendung der folgenden Gleichung bestimmt:

wobei

Effektive Aktivität, U/g, d. b. Träger

- C * ^{2M6 X l0g}

Tabelle 6

V = Reaktionsvolumen, ml

C = Träger, g, d. b. und

L = erzeugte Laevulose, % d. b.

Einzelheiten sowie die Ergebnisse der einzelnen Tests sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:

Träger

Substrat
Konzentration
g, d.s.
100 m!

Lösungsmittel Bindevermögen
(»gebundene Isomeraseaktivität«)

(U/g, d.b.) Effektive
Isomeraseaktivität

(U/g, d.b.)

% der ursprünglichen Aktivität

ZnCO₃	60	MgSO₄	515
CaCO₃	60	MgSO₄	368
BaCO₃	60	MgSO₄	38
Basisches	60	MgSO₄	412
MgCO₃ ¹)
') Basisches	Magnesiumcarbonat der	Formel 4MgCO₃-	Mg(OH)₂ -5 H₂O.

252
54
75

294

48,9 14,7

71,4

Wie aus den vorstehenden Werten ersichtlich ist, ist das Bindevermägen (auch als »gebundene Isomerase« bezeichnet) der Erdalkalicarbonate schwer vorherseh- jo bar. Das gleiche gilt für die effektive Isomeraseaktivität. Es ist besonders bemerkenswert, daß BaCO₃ ein extrem geringes Vermögen besitzt. Isomerase zu binden. Während ZnCO₃- und CaCO₃-Komplexe mit Isomerase eine vernünftige »gebundene Isomeraseaktivität« zeigen, besitzen die Komplexe der beiden Verbindungen eine relativ niedrige »effektive Isomeraseaktivität« oder die Fähigkeit, Dextrose zu Laevulose zu isomerisieren, und zwar im Vergleich zu dem Komplex aus Xyloseisomerase und basischem Magnesiumcarbonat gemäß vorliegender Erfindung.

Ohne sich an eine Theorie binden zu wollen, kann man annehmen, daß die relativ niedrige »effektive Isomeraseaktivität« bei diesen Salzen (ZnCO₃ und CaCO₃) deshalb auftritt, da die Isomerase so fest 4> gebunden wird, daß ihre Konformation verändert und/oder die Isomerase nicht dem Substrat zugänglich ist aufgrund der Art, in welcher die Isomerase an das Salz gebunden ist. In jedem Falle ist es unerwartet, daß basisches Magnesiumcarbonat ein relativ hohes Bindevermögen zusätzlich zu einer hohen »effektiven Isomeraseaktivität« besitzt. Die Kombination dieser zwei Merkmale bietet eine Reihe von wichtigen Vorteilen im Hinblick auf die Stabilität sowie die längere Halbwertszeit des immobilisierten Enzyms sowie des größeren Enzymwirkungsgrades. Die Enzymwirkungsgrade liegen normalerweise zwischen 0,30 und ungefähr 0,70. So zeigt beispielsweise eine Tiefbettsäule mit einer Enzymbeladung von 474 000 Einheiten an isomerisiertem Enzym 0,03 m³ (Ausmaß der Enzymaktivität in dem Bett [Einheiten/g] geteilt durch das Bettvolumen [kg/0,03 m³]) sowie mit einem Enzymwirkungsgrad von 0,6 eine Anfangssäulen-Produktionsgeschwindigkeit von 3,6 BVH mit 45% Ketose (BVH₄₅), wobei BVH die Zuführungsgeschwindigkeit geteilt durch das Bettvolumen ist.

Claims

Patentansprüche:

1. Enzymatisches Isome isat einer dextrosehaltigen Lösung mit einem Laevulosegehalt von mindestens 42%, einem durch die Isomerisierung verursachten Aschegehalt von unter 1,0% und einem Psicosegehalt von nicht über 0,3%, jeweils bezogen auf Trockensubstanz, hergestellt durch Einwirkung einer Xyloseisomerase-Enzymzubereitung auf eine dextrosehaltige Lösung bei einer Temperatur von 50 bis 70° C und einem pH-Wert von wenigstens 7, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der ersten Phase der Umsetzung die Temperatur um wenigstens 5⁰C erhöht, jedoch nicht über 80° C ansteigen läßt, und die Isomerisierung fortsetzt

2. Enzymatisches Isomerisierungsverfahren zur Umwandlung von Dextrose in Laevulose, wobei eine Dextrose enthaltende Lösung bei einer Temperatur im Bereich von 50° C bis 70° C und bei einem pH-Wert von wenigstens 7 der Einwirkung einer Xylose-Isomerase-Enzymzubereitung unterworfen wird, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der ersten Phase der Umsetzung die Temperatur um wenigstens 5° C erhöht, jedoch nicht über 80° C steigen läßt und die Isomerisierung fortsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man bei kontinuierlicher Isomerisierung eine immobilisierte Enzymzubereitung verwendet

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Enzymzubereitung von einem Organismus der Gattung Streptomyces ableitet.

5. Verfahren nach Anspruch 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Xylose-Isomerase-Zubereitung aus intakten Zellen von Mikroorganismen besteht.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Enzymzubereitung verwendet, die an teilchenförmiges basisches Magnesiumcarbonat adsorbiert ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das stabilisierte Enzym in einer Säule angeordnet ist.