DE2349464B2 - Enzymatisches Isomerisat einer dextrosehaltigen Lösung und enzymatisches Isomerisierungsveifahren zur Umwandlung von Dextrose in Laevulose - Google Patents
Enzymatisches Isomerisat einer dextrosehaltigen Lösung und enzymatisches Isomerisierungsveifahren zur Umwandlung von Dextrose in LaevuloseInfo
- Publication number
- DE2349464B2 DE2349464B2 DE2349464A DE2349464A DE2349464B2 DE 2349464 B2 DE2349464 B2 DE 2349464B2 DE 2349464 A DE2349464 A DE 2349464A DE 2349464 A DE2349464 A DE 2349464A DE 2349464 B2 DE2349464 B2 DE 2349464B2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- enzyme
- dextrose
- isomerase
- laevulose
- isomerization
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
- C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C13—SUGAR INDUSTRY
- C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
- C13K11/00—Fructose
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/813—Continuous fermentation
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/886—Streptomyces
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
• Die Erfindung betrifft ein enzymatisches Isomerisat
einer de^trosehaltigen Lösung mit einem Laevulosegehalt von mindestens 42%, einem durch die Isomerisierung
verursachten Aschegehalt von unter 1,0% und einem Psicosegehalt von nicht über 0,3%, jeweils
bezogen auf die Trockensubstanz, das hergestellt worden ist durch Einwirkung einer Xyloseisomerase-Enzymzubereitung
auf eine dextrosehaltige Lösung bei einer Temperatur von 50 bis 70°C und einem pH-Wert
von wenigstens 7, sowie ein enzymatisches Isomerisierungsverfahren zur Umwandlung von Dextrose in
Laevulose, bei dem eine Dextrose enthaltende Lösung bei einer Temperatur im Bereich von 50 bis 70° C und bei
einem pH-Wert von wenigstens 7 der Einwirkung einer Xyloseisomerase-Enzymzubereitung unterworfen wird.
Die enzymatische Isomerisierung von Dextrose in Laevulose mit Hilfe von Xylose-Isomerase ist bereits
bekannt, z. B. aus der DE-OS 21 08 125.
Die bekannten enzymatischen Isomerisierungsverfahren zur Umwandlung von Dextrose, meist in Form
vor Stärkehydrolysaten mit Dextroseäquivalent-
(D. E.-)Werten von über 95%, in Laevulose werdet im allgemeinen chargenweise, z. B. bei einerTemperatui
von etwa 70° C und einem pH von etwa 6,2 währenc einer Isorr.erisierungszeit von etwa 40 bis 60 Stunder
durchgeführt, wobei der pH-Wert entweder kontinuier Hch oder abschnittsweise durch Zugabe von basischen
Material, z. B. Natriumbicarbonat, aufrechterhalter wird. Die optimalen Arbeitsbedingungen hängen insbe
sondere vom Typ des verwendeten Isomerase-Enzymj
ίο ab, da jede Enzym-Zubereitung ein spezielles Optimurr
in bezug auf pH, Temperatur und Bedarf an Metaller sowie eine bestimmte Temperatur-Stabilität und eine
bestimmte Michaelis-Konstante hat (vgl. Sato, Dem
punto Gijutsu Kenkyu, 32,1965,81-88). So ist z. B. be
is Verwendung einer Enzym-Zubereitung aus einen
Mikroorganismus der Gattung Streptomyces die gebildete Laevulosemenge bei 70° C größer als bei 60° C
doch gehen bei pH 6,2 einige Vorteile, die bei höherer Temperaturen erzielt werden, verloren, weil das leichi
saure Milieu die Laevuloseausbeute und Enzymstabilität vermindert. Wird das Enzym in Form von Mikrobenzel
len eingesetzt, so werden durch die beim Mischer erzeugten Scherkräfte Zellen zerstört, Zellflüssigkeii
einschließlich Enzyme geht in die Lösung über und eine stärkere Enzyminaktivierung als in inaktiven Zellen isi
die Folge.
Der Einfluß der Temperatur auf die Isomeraseaktivi· tat wird z. B. von N. Tsumura und T. Satο in Agr
Biol. Chem. 29, 1965, 1123-1128 und 1129-1134
beschrieben. Danach verliert eine Isomerase au! Aerobacter cloace seine Hauptaktivität bei 80° C ir
Gegenwart von Magnesium- und bei 90°C in Gegen wart von Kobaltionen. In Abwesenheit von Metallionen
die stabilisierend wirken, verlor das Enzym bereits nach 10 Minuten bei einer Temperatur von 700C einer
wesentlichen Teil seiner Aktivität. Nach den vor Yoshimura et al in Agr. Biol. Chem. 30 (10), 1966
1015-1023 beschriebenen Befunden besitzt Isomerase aus Bacillus coagulans die größte Aktivität bei einei
Inkubationszeit von 2 Stunden bei 700C, bzw. von 2( Stunden bei 600C bis 65° C, und oberhalb diesei
Temperaturen tritt Inaktivierung ein.
Kontinuierliche Verfahren zur Isomerisierung vor Dextrose in Laevulose sind ebenfalls bekannt, z. B. au;
Journal of Food Science and Technology, 14 (12), 1967 539 und 540, wonach eine gereinigte Isomerase, die siel·
von einem Streptomyces-Stamm ableitete, in eine: Säule an einem DEAE-Sephadex-Bett fixiert unc
dadurch immobilisiert wird. Bei der Verfahrensdurch
so führung, die bei 600C erfolgte, wurde eine Verminde
rung der Enzymaktivität beobachtet, von der nich sicher ist, ob sie durch Enzym-Inaktivierung oder durch
Auslaugen des Enzyms aus der Säule verursacht wurde Bei der von T a k a s a k i et al in Perlman »Fermente
tion Advances«, Academic Press, 1969, 561 ff. beschriebenen kontinuierlichen Säulen-Isomerisierunj
mit Hilfe eines Isomerase-Enzyms, das sich von einen gewöhnlichen Streptomyces-Stamm ableitete, wurde
oberhalb von 700C nach 10 Minuten Enzym-Inaktivie
rung gefunden.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfach durchzufüh
rendes Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Dextrose in Laevulose anzugeben, das kontinuier
lieh durchführbar und besonders wirtschaftlich unc effektiv ist und eine wesentliche Verbesserung dei
Enzymstabilität ermöglicht.
Diese Aufgabe wird bei einem enzymatischer Isomerisat bzw. bei einem enzymatischen Isomerisie
(•längsverfahren des eingangs genannten Typs dadurch
gelöst, daß man nach der ersten Phase der Umsetzung die Temperatur um wenigstens 5° C erhöht, jedoch nicht
über 800C ansteigen läßt, und die Isomerisierung fortsetzt Die im folgenden verwendete Bezeichnung
»Enzym-Zubereitung« umfaßt z. B. ganze lebende Zellen, getrocknete Zellen, Zellextrakte und gereinigte
und konzentrierte Präparate, die sich von den Zellen ableiten. Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen
kontinuierlichen Isomerisierungsverfahrens verwendeten Enzym-Zubereitungen liegen immer in immobilisierter
Form vor. So kann z. B. die Enzym-Zubereitung in der Lösung eines Stärkehydrolysate dispergiert sein und
in dieser Lösung zurückgehalten werden, indem die gewünschten Endprodukte mit Hilfe eines selektiven
Membranfilters durch Ultrafiltration abgetrennt werden. Ferner kann die Enzym-Zubereitung an eine
unlösliche Matrix in üblicher bekannter Weise gebunden sein, und als besonders vorteilhaft hat sich die
weiter unten näher erläuterte, mit Hilfe von teilchenförmigen! basischem Magnesiumcarbonat immobilisierte
Enzymzubereitung erwiesen.
Erfindungsgemäß wird die enzymatische Isomerisierung bei einer nahezu konstanten Anfangstemperatur
innerhalb des Bereiches von 50 bis 70° C durchgeführt, anschließend wird die Arbeitstemperatur stufenförmig
oder in einem einzigen Schritt wie angegeben erhöht. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird ein
Strom einer dextrosehaltigen Lösung während einer Anfangsphase der Isomerisierung der Wirkung einer
immobilisierten Enzym-Zubereitung bei einem pH-Wert von vorzugsweise 7,5 bis 8,5 und einer
Temperatur von wenigstens 5O0C, jedoch mindestens 1O0C unterhalb derjenigen Temperatur, bei der eine
schnelle Inaktivierung des Enzyms erfolgt, unterworfen. Für Enzym-Zubereitungen aus Mikroorganismen der
Gattung Streptomyces ist die Temperatur, oberhalb der eine schnelle Inaktivierung eintritt, gewöhnlich etwa
7O0C, weshalb während der Anfangsphase der Isomerisierung
zweckmäßig bei etwa 600C oder darunter, vorzugsweise bei 500C bis 600C, gearbeitet wird. Bei
Temperaturen von 500C bis 6O0C tritt zwar eine
gewisse Enzym-Inaktivierung ein, die jedoch relativ gering ist im Vergleich zu derjenigen bei 7O0C. Wenn
ein gewisser Verlust an Enzymaktivität nach dem Arbeiten im Bereich von z.B. 500C bis 6O0C zu
beobachten ist, wird die Temperatur um wenigstens etwa 5° C erhöht, was entweder stufenweise um 2 bis
30C oder weniger, je nach Erfordernis, um die gewünschte Ketosemenge in dem Produkt aufrechtzuerhalten,
oder in einem einzigen Schritt erfolgen kann. Vorzugsweise wird die Temperatur in der zweiten
Phase des Verfahrens um mindestens etwa 10° C und vorzugsweise wird sie stufenweise in kleinen Abschnitten
erhöht.
Zur Bestimmung der Isomerase-Aktivität wird die aus einer Glucoselösung gebildete Ketose unter standardisierten
Versuchsbedingungen spektrophotometrisch ermittelt. Die Zusammensetzung der zur Aktivitätsbestimmung
verwendeten Vorratslösung wird in der folgenden Tabelle 1 wiedergegeben.
Fortsetzung
Komponenten
Menge
Komponenten
Menge
O.lmol. MgSO4-7H2O
0,1 mol. CoCl2-OH2O
0,1 mol. CoCl2-OH2O
1 ml
1 ml
1 ml
l.Omol. Phosphatpuffer, pH 7,5 0,5 ml
Wasserfreie D-Glucose 1,44 g
Mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 7,5 ml
ίο Die zu untersuchende Enzym-Zubereitung wird
zunächst mit Ultraschall oder in anderer geeigneter Weise behandelt, um das Enzym in eine für den Versuch
geeignete Form zu bringen, worauf dann auf einen Gehalt von 1 bis 6 Isomerase-Einheiten pro ml verdünnt
wird.
1 ml Enzym-Zubereitung wird zu 3 ml Vorratslösung zugegeben und die enzymatische Isomerisierung erfolgt,
indem 30 Minuten bei 6O0C inkubiert wird. Nach beendeter Inkubation wird eine 1-ml-Probe entnommen
und mit 9 ml 0,5 n-Perchlorsäure inaktiviert, worauf die inaktivierte Probe auf ein Gesamtvolumen von 250 ml
verdünnt wird. Zur Kontrolle wird eine Glucoselösung in gleicher Weise behandelt, der anstelle von 1 ml
Enzym-Zubereitung 1 ml Wasser zugesetzt wurde.
Die gebildete Ketose wird sodann durch eine Cystein-Schwefelsäure-Methode bestimmt. Die isomerase-Einheit
wird definiert als diejenige Menge Enzym-Aktivität, die erforderlich ist, um 1 Mikromol Laevulose
je Minute unter den angegebenen Isomerisierungsbedingungen zu erzeugen.
Die bereits bekannten' immobilisierten Enzymzubereitungen haben in der Industrie keine weite Verbreitung
gefunden. So haben zwar z. B. Aktivkohle, Calciumcarbonat u.dgl. bekanntermaßen ein relativ
hohes Bindevermögen für Enzyme, z. B. Xyloseisomerase, doch sind die auf diese Weise erhaltenen
immobilisierten Enzymzubereitungen vergleichsweise wenig aktiv bei der Umwandlung von Dextrose in
Laevulose. Ferner sind sie in der Regel instabil, und sehr kurze Halbwertszeiten sind typisch für sie.
Aus der US-PS 37 15 276 ist z. B. die Verwendung von
Calciumcarbonat, Magnesiumcarbonat sowie einigen Ionenaustauscherharzen zur Steuerung des pH-Werts
während längerer enzymatischer Isomerisierungsreaktionen von Dextrose in Laevulose bekannt. Dabei wird
ein Xyloseisomerase-Enzym eingesetzt, das durch eine Wärmebehandlung innerhalb der Zellen gebunden ist,
so daß es nicht an dem den pH-Wert regulierenden Mittel sorbiert wird. Außerdem erfolgt die pH-regulierende
Wirkung von Calciumcarbonat, Magnesiumcarbonat und Ionenaustauscherharzen nur bei einer relativ
langen Isomerisierung von mehr als etwa 4 Stunden. Übersteigt jedoch die Verweilzeit der Zuckerlösung
etwa 4 Stunden, so erfolgt die Bildung unerwünschter Nebenprodukte, z. B. von Psikose. Da in vielen
Nahrungsmitteln, in denen laevulosehaltige Sirupe eingesetzt werden, Psikosegehalte von mehr als 2
Gew.-% und oftmals 1 Gew.-%, bezogen auf Trockenbasis, nicht toleriert werden können, sind Verfahren mit
längeren Verweilzeiten des aus der US-PS 37 15 276 bekannten Typs technisch uninteressant.
Erfindungsgemäß werden demgegenüber zellfreie, lösliche Xyloseisomerase-Enzymzubereitungen mit basischem
Magnesiumcarbonat kontaktiert, wodurch sie gebunden oder sorbiert werden und eine hochaktive,
immobilisierte Enzymzubereitung ergeben. Verwandte Stoffe wie Calciumcarbonat führen zu keiner hochaktiven
und stabilen Xyloseisomerase, und andererseits
wird eine intracellulare Xyloseisomerase nicht an basischem Magnesiumcarbonat sorbiert.
Die erfindungsgemäß verwendbare immobilisierte Xyloseisomerase-Zubereitung zeichnet sich durch einen
sehr hohen Enzymwirkungsgrad aus, wobei die Zuckerkontaktzeit, die zur Erzeugung eines laevulosehaltigen
Sirups von mindestens etwa 45 Gew.-% Laevulose aus einer dextrosehaltigen Lösung erforderlich ist, in der
Regel unter etwa 2 Stunden liegt. Infolge der geringeren
Kontaktzeit zeichnen sich die erhaltenen laevulosehaltigen Sirups durch eine geringere Farbe, einen geringeren
Gehalt an organischer Säure sowie einen niedrigeren Gehalt an Psikose aus, der in der Regel unter etwa 1
Gew.-% und oftmals unter etwa 0,3 Gew.-%, bezogen auf Trockenbasis, liegt Diese Vorteile sind im Hinblick
auf die Investitionskosten sowie die Kommerzialisierung des Verfahrens sehr gravierend.
Zur Herstellung der erfindungsgeträß stabilisierten Xyloseisomerase-Enzymzubereitung wird vorzugsweise
eine zellfreie Xyloseisomerase mit basischem Magnesiumcarbonat in Form von Einzelteilchen, das entweder
ein Pulver oder ein Granulat sein kann, kontaktiert. Das Granulat wird im Hinblick auf die Fließeigenschaften
bevorzugt, die dann ins Gewicht fallen, wenn ein Tiefbettkonverter eingesetzt wird. Wahlweise kann das
in Form von Einzelteilchen vorliegende basische Magnesiumcarbonat zunächst in einen Konverter, der
später zur Durchführung der enzymatischen Isomerisierungsreaktion eingesetzt wird, eingebracht werden,
worauf eine Lösung einer zellfreien Xyloseisomerase so lange durch die Säule gepumpt wird, bis kein Enzym
mehr vom basischen Magnesiumcarbonat sorbiert wird. Anschließend an die Herstellung der stabilisierten
Enzymzubereitung ist der Konverter bereit für die Isomerisierungsreaktion, und eine dextrosehaltige Lösung
wird durch ihn hindurchgeleitet.
Das eingesetzte Xyloseisomerase -Enzym kann hochrein oder roh sein. Die Reinigung kann in üblicher
bekannter Weise erfolgen, z. B. durch fraktionierte Ausfällung mit Natriumsulfat, Ammoniumsulfat oder
einem anderen Mineralsalz, durch selektive Adsorption, durch eine Differential-Wärmeinaktivierung verunreinigender
Proteine bei steigenden Temperaturen und verschiedenen pH-Werten, durch isoelektrische Ausfällung,
durch Ausfällung unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels und unter Einsatz von
Alkoholen, durch eine DEAE-Zellulosechromatographie
sowie durch eine »Sephadex«-Gelfiltration, durch elektrophoretische Trennung oder eine Ultrazentrifugentrennung.
Die verwendete Xyloseisomerase-Enzymzubereitung liegt in ihrer 'öslichen Form vor, d. h., sie ist frei von
Mikrobenzellen, wobei die Freisetzung des Enzyms aus dem Zellmaterial in üblicher Weise erfolgen kann. Das
Enzym in dem Rohmaterial wird sodann an dem basischen Magnesiumcarbonat sorbiert und daran
gebunden. Die immobilisierte Enzymzubereitung kann danach z. B. durch Filtration oder Zentrifugieren
abgetrennt und mit einem Puffer gewaschen werden. Die erhaltene Enzymzubereitung kann in feuchter Form
verwendet werden, oder der Kuchen kann nach bekannten, für Enzymzubereitungen üblicherweise
verwendeten Trocknungsmethoden getrocknet werden, z. B. durch Zellentrocknung, Drehtrommeltrocknung
oder Sprühtrocknung oder auch Gefriertrocknung. Sehr gute Ergebnisse werden dann erhalten, wenn das Enzym
vor der Sorption gereinigt wird.
Vor dem Immobilisieren wird die zellfreie Enzymlösung
vorzugsweise auf einen pH-Wert von etwa 7,5 bis 9,5, insbesondere von etwa 8 bis 9 eingestellt. Die
Immobilisierung kann bei Zimmertemperatur, z. B. etwa 25° C, durchgeführt werden, um eine Inaktivierung des
Enzyms zu vermeiden. Es können jedoch auch höhere Temperaturen toleriert werden, falls die Enzymlösung
mit einer dextrosehaltigen Lösung während der Immobilisierung vermischt wird. Liegt der pH-Wert der
Enzymlösung, die mit dem basischen Magnesiumcarbonat kontaktiert werden soll, unter etwa 7, so tendiert das
basische Magnesiumcarbonat zur Zersetzung, weshalb es zweckmäßig ist, den pH-Wert bei etwa 7,5 oder
darüber zu halten.
Die Enzymlösung besitzt vorzugsweise eine Aktivität von mindestens etwa 10 Einheiten/ml (U/ml), und sie
kann eine Aktivität von bis zu 3000 U/ml aufweisen. In der Regel beträgt die Isomeraseenzymaktivität etwa 50
bis 200 U/ml.
Das basische Magnesiumcarbonat besitzt ein starkes Bindevermögen für das Xyloseisomerase-Enzym und
kann eine Enzymmenge binden, deren Aktivität, vor der Sorption gemessen, mehr als 150 Einheiten pro Gramm
(U/g) des gebundenen Enzyms (d. h. des Komplexes aus Isomerase und basischem Magnesiumcarbonat) äquivalent
ist. Die sorbierte Enzymmenge entspricht in der Regel 250 U/g, in der Praxis oftmals mehr als 500 U/g
des Komplexes. Allerdings bleibt nicht die ganze ursprüngliche Enzymaktivität nach der Komplexbildung
erhalten, wie z. B. das unten angegebene Beispiel 8 zeigt, obwohl das ganze proteinhaltige Enzym sorbiert wird.
Mit »gebundene Isomerase« und »Bindevermögen« werden hier und im folgenden Isomeraseeinheiten,
gemessen in Lösung vor der Sorption, gebunden an 1 g des Komplexes, bezogen auf Trockenbasis, bezeichnet.
Im Vergleich zu anderen bekannten Trägermitteln wurde überraschenderweise gefunden, daß die erfindungsgemäß
verwendete immobilisierte Xyloseisomerase-Zubereitung eine extrem hohe »effektive Isomerase-Aktivität«
besitzt, d. h. eine Isomeraseaktivität des
■ίο immobilisierten Enzyms, welche tatsächlich enzymatisch
die Umwandlung von Destrose in Laevulose bedingt. Unter Verwendung bekannter Trägermittel,
z. B. Aktivkohle, Calciumcarbonat, Zinkcarbonat und dergleichen hergestellte immobilisierte Enzymkomplexe
besitzen in der Regel eine Wirksamkeit von weniger als 50% der Aktivität, die, bezogen auf die Isomerasemenge,
die tatsächlich an den Träger gebunden oder sorbiert ist, zu erwarten wäre. Demgegenüber hat die
erfindungsgemäß verwendbare immobilisierte Xyloseisomerase-Zubereitung mindestens etwa 70% und
oftmals mehr als 80% der Aktivität der ursprünglichen Isomerase, die an den Träger gebunden ist.
Die erfindungsgemäß verwendbare immobilisierte Xyloseisomerase-Zubereitung zeichnet sich daher dadurch
aus, daß sie eine effektive Isomeraseaktivität pro Gramm der immobilisierten Enzymzubereitung, bezogen
auf Trockenbasis, von mindestens 100 (d. h. 100 U/g der wirksamen Isomeraseaktivität) und vorzugsweise
von mindestens etwa 175 U/g besitzt.
Wesentlich ist ferner die lange Halbwertszeit der erfindungsgemäß verwendbaren immobilisierten und
stabilisierten Enzymzubereitung, die 45% Laevulose zu erzeugen vermag bei Fließgeschwindigkeiten von mehr
als 0,5 Bettvolumina/Stunde, wobei die Enzym-Halb-
b5 wertszeit bei mehr als 15 Tagen liegt.
Das verwendete basische Magnesiumcarbonatmalerial ist vorzugsweise eine körnige poröse Substanz mit
jeder gewünschten Teilchengröße. Zu seiner Hersiel-
lung kann zunächst eine Magnesiumcarbonat-trihydrat-Aufschlämmung gebildet, die Aufschlämmung auf einen
Feststoffgehalt von mindestens etwa 10% entwässert und die erhaltene pastenartige Masse getrocknet
werden. Das erhaltene Produkt besitzt eine feste, r>
gegenüber Zerstoßen widerstandsfähige Struktur und eine ausgeprägte Affinität für lösliche Enzyme, z. B.
Xyloseisomerase.
Basisches Magnesiumcarbonat kann z. B. auch nach den in den US-PS 22 09 752, 22 09 753 und 22 09 754
beschriebenen Methoden hergestellt werden.
Einige erfindungsgemäß bevorzugt verwendbare basische Magnesiumcarbonate sind im Handel verfügbar
und werden z. B. definiert als
4 MgCOi · Mg(OH)2 · 5 H2O IS
(oder 5 MgO ■ 4 CO2 ■ 6 H2O)
mit einem Molekulargewicht von etwa 485,74, einer absoluten Dichte von etwa 2,16, einem Feuchtigkeitsgehalt
(11O0C) von etwa 0,5 bis 2,3%, einer Schüttdichte
(lose) von 0,0560 bis 0,1280 g/ccm sowie einer Maschengröße, daß mindestens 99% (feucht) ein Sieb
einer lichten Maschenweite von 0,04 mm passieren, wobei ferner eine Summenformel von
3,2 MgCOj · Mg(OH)2 · 3,9 H2O "
aufgestellt worden ist.
Die stabilisierte immobilisierte Xyloseisomerase-Enzymzubereitung
eignet sich hervorragend zur Durchführung des erfindungsgemäßen temperaturprogrammierten
Verfahrens zur kontinuierlichen Umwandlung von Dextrose in Laevulose, aufgrund der vergleichsweise
geringen Kontaktzeit, die wegen der hohen Glucoseisomerase-Aktivität pro Gramm Enzymzubereitung
erforderlich ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Reaktionslösung gebildet, die etwa
20 bis 70 Gew.-% Dextrose enthält, einen pH-Wert von etwa 7,5 bis 9,5 und eine Temperatur von etwa 30 bis
900C aufweist. Diese Lösung wird über ein Bett aus der immobilisierten Xyloseisomerase mit einer effektiven
Isomeraseaktivität von mindestens etwa 100 U/g der Enzymzubereitung geschickt. Vorzugsweise enthält die
Reaktionslösung etwa 40 bis 60 Gew.-% Dextrose, und der pH-Wert der Lösung liegt zwischen etwa 8,2 und 9,2. 4r>
Besonders bevorzugt wird eine Reaktionslösung mit etwa 50 Gew.-% Dextrose und einem pH-Wert
zwischen etwa 8,4 und 8,6.
In typischer Weise besitzt die immobilisierte Xyloseisomerase-Zubereilung
eine effektive Isomeraseaktivi- w tat von mindestens etwa 175 U/g der immobilisierten
Enzymzubereitung. Die Reaktionstemperatur liegt in besonders vorteilhafter Weise zwischen etwa 50 und
75°C, vorzugsweise bei etwa 6O0C.
Das Xyloseisomerase-Enzym stammt vorzugsweise π
aus einem Mikroorganismus des Genus Streptomyces, insbesondere aus den Mutantenstämmen S. olivochrornogenes
ATCC Nr. 21 713, S. olivochromogenes ATCC
Nr. 21 714 und S. olivochromogenes ATCC NR. 21 715, die z. B. in der DT-OS P 22 45 402 beschrieben werden, m>
Die zur Herstellung der Reaktionslösung verwendete Dextrose kann in kristalliner Form, in erneut aufgeschmolzener
Form oder als Stärkehydrolysat, das entweder durch aufeinanderfolgende oder gleichzeitige
cnzymatische Verflüssigung und Verzuckerung einer hr>
stärkehaltigen Lösung gewonnen ist, eingesetzt werden. Als geeignete Reaktionslösungen kommen Stärkehydrolysat·
in Frage, *1ic mil einer Säure verdünnt oder
verflüssigt und in einer anschließenden Stufe enzymatisch in eine dextrosehaltige Lösung umgewandelt
wurden. Bevorzugte Stärkehydrolysate werden in dei Weise hergestellt, daß eine enzymverflüssigte stärkehal
tige Lösung mit einer Kombination von zwei Enzymen z.B. mit Glukoamylase- und 1,6-Glukosidaseenzym
umgewandelt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur enzymatischer Umwandlung von Dextrose in Laevulose ist ir
vorteilhafter Weise in Säulenreaktoren kontinuierlich durchführbar, wobei das immobilisierte Enzym in di(
Säule gepackt wird. Die Säule kann gegebenenfalls weitere Materialien enthalten, um die Fließgeschwin
digkeit der Reaktionsflüssigkeit zu verbessern, ζ. Β Glaskügelchen oder Filterhilfsstoffe. Ausgezeichnet«
Fließgeschwindigkeiten werden bei Verwendung eine; körnigen basischen Magnesiumcarbonate mit Teilchen
größen von mehr als 0,42 mm, vorzugsweise von etwi 0,84 bis 1,68 mm erzielt. Basisches Magnesiumcarbona
in derart körniger Form läßt sich in einfacher Weist dadurch erhalten, daß im Handel verfügbares pulverför
miges basisches Magnesiumcarbonat in einer geeigne ten Vorrichtung kompaktiert und anschließend vermah
len wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dei Erfindung wird mehr als eine Säule verwendet, unc
vorzugsweise werden mindestens drei Säulen einge setzt, welche in Reihe geschaltet sind. Auf diese Weisf
läßt sich eine wirksamere Ausnutzung der immobilisier ten Enzymzubereitung erzielen, z. B. können höhen
Fließgeschwindigkeiten eingehalten werden. Wird di< erste Säule der Reihe inaktiviert, so kann di<
Beschickungsflüssigkeit ohne weiteres der zweitei Säule zugeführt werden, während die erste Säule durcl
Kontaktierung mit frischem, löslichem Xyloseisomera se-Enzym regeneriert wird. Wird die zweite Säuh
inaktiviert, so kann die Beschickungsflüssigkeit zuers der dritten Säule und anschließend der regeneriertei
ersten Säule zugeführt werden, so daß eine kontinuierli ehe Verfahrensdurchführung ohne Unterbrechen mög
lieh ist. Die immobilisierte Xyloseisomerase-Enzymzu bereitung kann ferner in einem handelsübliche!
Druckblattfilter verwendet werden, das aus einem odei mehreren flachen Filterelementen (Blättern) besteht, di(
vertikal oder horizontal in einem zylindrischen Tan! befestigt sind.
Da das basische Magnesiumcarbonat, welches da: gebundene Xyloseisomerase-Enzym enthält, auf einen
alkalischen pH gehalten werden muß, um ein« Zersetzung während der enzymatischen Isomerisie
rungsreaktion zu verhindern, sollte die dextrosehaltigi Beschickungsflüssigkeit zuvor auf die angegebene!
alkalischen pH-Werte von mindestens etwa 7,5 um vorzugsweise von mehr als 8,2 eingestellt werden
Infolge der erhöhten Enzymkonzentration sowie dei beibehaltenen Aktivität des Komplexes aus Xyloseiso
merase und basischem Magnesiumcarbonat verminder sich bei kontinuierlicher Umwandlung die Zeitspanne
die zur Erzeugung eines Laevulosesirups mit 45°/i Laevulose erforderlich ist, so daß eine pH-Wertände
rung im Konverter infolge der Bildung organische! Säuren nicht festzustellen ist. Bei Verweilzciten vor
unter 2 Stunden und vorzugsweise von unter 1 Stunde und bei pH-Werten der Ausgangsbeschickungsflüssigkeil
von über 8,0 erübrig! sich daher die Steuerung de;
pH-Werts durch ein alkalisches Material, wie auch durch Beispiele gezeigt werden konnte.
Neben den angegebenen Vorzügen ist einer dei
wichtigsten erfindungsgemäß erzielbaren Vorteile die Herabsetzung der Kosten pro Einheit produzierter
Laevulose. Im Vergleich zur chargenweisen Isomerisierung wird z.B. erfindungsgemäß mit der gleichen
Enzymmenge bis zu dreimal mehr Verfahrensprodukt > gewonnen. Hinzu kommt die wesentlich kürzere
Isomerisierungszeit. so daß die Zucker, die zur Umsetzung gelangen, der erhöhten Temperatur weniger
lang ausgesetzt sind, weshalb ein geringerer thermischer Abbau eintritt. Das Endprodukt enthält
daher weniger färbende Bestandteile, so daß die Farbe des Produktes verbessert und die Raffinationskosten
geringer sind. Auch werden weniger organische Säuren gebildet, und die Zusammensetzung der Kohlenhydrate
im Endprodukt ist hochgradig sowie erwünscht. Wegen ι >
der kürzeren Reaktionszeiten sind ferner auch kleinere Anlagen für die Verfahrensdurchführung erforderlich.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, wobei sich aus den Beispielen 5 bis 8 die
grundsätzlichen Vorteile einer mit basischem Magnesiumcarbonat immobilisierten Enzymzubereitung ergeben,
die bei der Verwendung derselben zur Durchführung des in den übrigen Beispielen beschriebenen
erfindungsgemäßen Verfahrens voll zu Tage treten.
Kontinuierliche Isomerisierung unter Verwendung
eines fixierten Bettes von Mikrobenzellen
eines fixierten Bettes von Mikrobenzellen
Einstufige Temperatureinstellung
25
JO
Um die Erfindung zu erläutern, wurde eine mit Mantel versehene Säule verwendet. Der Mantel war mit einer
Heißwasserquelle verbunden, um die Temperatur der Säule während der Isomerisierung zu kontrollieren. j5
Ein Stamm eines Mikroorganismus der Gattung Streptomyces, der als guter Isomerase-Erzeuger erkannt war, wurde unter submersen aeroben Bedingungen in einem xylosehaltigen Medium kultiviert, um
intrazellular Isomerase zu erzeugen.
Nach der Fermentation wurde Magnesiumhydroxid im Verhältnis von 2 Gew.-Teilen Magnesiumhydroxid je
Gew.-Teil Zellmasse der Kulturbrühe zugesetzt. Die so erhaltene Anschlämmung wurde filtriert, und der
Filterkuchen wurde in einem offenen Gefäß bei Raumtemperatur getrocknet. Die Aktivität der so
erhaltenen trockenen Enzym-Zubereitung betrug 330 Einheiten je Gramm.
Die trockene Enzym-Zubereitung wurde in einer 50%igen Dextroselösung (GewVVol.) dispergiert. Die
Anschlämmung wurde dann in die mit Mantel versehene Säule übergeführt, und beim Einführen in die Säule
wurden gleichzeitig kleine Glaskugeln mit einem Durchmesser von etwa 3 mm hinzugefügt. Die
Glaskugeln dienten als Träger und verhinderten gleichzeitig ein Absetzen der Enzym-Zubereitung und
Verstopfen der Säule. In dieser Weise wurden etwa 750 Einheiten des Enzyms in die Säule eingeführt.
Ein Dextrosesirup mit einer Konzentration von 50% (Gew./Vol.) wurde durch Zugabe von Magnesiumhydro- bo
xid auf ein pH im Bereich von 7,0 bis 7,5 eingestellt. Der Sirup wurde mit Stickstoff beladen und dann in den
oberen Teil der Säule unter Stickstoff-Atmosphäre eingeführt.
Das isomerisierte Produkt wurde in gleichen Mengen
von 15 ml in Versuchsgläsern gesammelt. Die Versuchsgläser enthielten jedes etwa 5 ml einer
0,5-n-Perchlorsäure, um jede lösliche Isomerase, die mit der Lösung hätte austreten können, zu inaktivieren.
Während einer Anfangsphase wurde die Temperatui der Säule bei etwa 6O0C gehalten. Die Durchflußmenge
der Dextroselösung durch die Säule wurde in wesentlichen konstant gehalten, und der Ketosegehal
des Ausflusses betrug 40 bis 50%, bezogen au Trockensubstanz.
In dieser Weise wurde die Isomerisierung 9 Tage lang
durchgeführt, bevor ein wesentlicher Abfall hinsichtlich der Enzym-Aktivität in Erscheinung trat, was sich ir
einer Abnahme des im Ausfluß beobachteten Ketose wertes zeigte. Während der Anfangsphase des Versuch;
hatte der durchschnittliche Ketosegehalt des Ausflusse! bei 38,7% gelegen.
Bei Beendigung dieser Phase des Versuchs wurde die Temperatur der Säule in einer Stufe (von derr
Ausgangswert in Höhe von 6O0C) auf 700C erhöht. Die
Isomerisierung wurde dann fortgesetzt bei der erhöhter Temperatur während einer zusätzlichen Zeit von 2'
Stunden. Der Ketosegehalt des ausfließenden Produk tes während der zweiten Phase des Versuchs betrug in
Durchschnitt etwa 49%. Die Ergebnisse sind in dei folgenden Tabelle zusammengestellt worden (Tabelle 2)
Bei Wiederholung der Isomerisierung mit einei Enzym-Zubereitung, die aus einem Gemisch vor
Diatomeenerde und Mikrobenzellen bestand, wurder nahezu die gleichen Resultate erhalten.
Kontinuierliche Isomerisierung,
einstufige Temperatureinstellung
Zeit | Tem | Durchlauf | Auslauf des etwa | 42% | pro Lite | 951 |
pera | [lurch das Bett | Laevulose in der | Trok- | Mikrobenzellenbett | 951 | |
tur | kensubstanz enthaltender | 951 | 951 | |||
Produktes in 0,016 kg | 951 | 951 | ||||
Trockensubstanz | 951 | 936 | ||||
Tage | "C 1 | M. je Stunde | 951 | 876 | ||
1 | 60 | ,27 | 936 | 823 | ||
2 | 60 | ,27 | 876 | 771 | ||
3 | 60 | ,27 | 823 | 1235 | ||
4 | 60 | ,27 | 771 | 1235 | ||
5 | 60 | ,25 | 734 | |||
6 | 60 | ,17 | 681 | |||
7 | 60 | ,10 | Beispiel 2 | |||
8 | 60 | ,03 | ||||
9 | 70 | ,65 | ||||
10 | 70 | 1,65 | ||||
Kontinuierliche Isomerisierung unter Verwendung
eines fixierten Bettes von Mikrobenzellen
Intrazellulare Isomerase wurde durch Wachsen einer Streptomyces-Kultur unter submersen aeroben Bedingungen in einem xylosehaltigen Nährmedium gewonnen.
Nach Beendigung der Fermentation wurde Diatomeenerde-Filterhilfsmittcl der fermentierten Flüssigkeit
im Verhältnis von 2 Teilen Filterhilfsmittel zu 1 Teil Mikroorganismen-Zellen, bezogen auf das trockene
Gewicht der Zellen, zugesetzt. Das Gemisch aus Zellen und Diatomeenerde wurde durch Filtration abgetrennt,
gewaschen und getrocknet, um es als Enzym-Zubereitung zu verwenden.
Diese Enzym-Zubereitung wurde in Dextroselösung suspendiert und in eine mit Mantel versehene Säule
eingeführt. Der untere Auslaß der Säule war an eine Vakuumquelle angeschlossen, um ein kompaktes Bett zu
erhalten. Nach dem Füllen enthielt die Säule 0,35 kg (Trockensubstanz) Enzym-Zubereitung (d. h. Gemisch
aus Zellen und Filterhilfsmittel) pro Liter des Säulenvolumens.
Durch den Mantel der Säule wurde Wasser von 600C
gegeben. Es wurde eine Lösung mit einem Gehalt von 500 g Trockensubstanz je Liter eines Stärkehydrolysats
mit 95% D.E. und 92% Dextrose in der Trockensubstanz mit Magnesiumhydroxid auf pH 7,8 eingestellt und
kontinuierlich in die Säule eingeführt, wobei zur Kontrolle der Ausflußmenge Druck angewendet wurde.
Die Durchflußmenge wurde so eingestellt, daß im Ausfluß aus der Säule ein Gehalt von 42% Laevulose
(bezogen auf Trockensubstanz) aufrechterhalten wurde.
Nach einer Versuchsdauer von 6 Tagen wurde das Ausflußvolumen auf 66% des Anfangswertes reduziert,
um den Gehalt an 42% Laevulose (in der Trockensubstanz) aufrechtzuerhalten. Danach wurde die Temperatur
periodisch erhöht, wie aus Tabelle 3 hervorgeht, damit die Ausflußmenge bei einem Gehalt von 42%
Laevulose nicht weniger als 66% der anfänglichen Ausflußmenge betrug. Wie aus der Tabelle 3 zu ersehen
ist, war die Gesamtausflußmenge, die in einer Zeit von 14 Tagen durch Erhöhen der Temperatur erhalten
wurde, um 41 % größer als die Gesamtausflußmenge, die erhalten worden wäre, wenn die Temperatur auf 600C
konstant gehalten worden wäre.
Kontinuierliche Isomerisierung unter Verwendung eines fixierten Bettes,
Temperaturerhöhung in kleinen Stufen
Temperaturerhöhung in kleinen Stufen
Zeit Tempe- Auslauf des etwa 42% Laevulose in der ratur Trockensubstanz enthaltenden Produktes
in 0,016 kg Trockensubstanz pro Liter Tage "C Mikrobenzellenbett
60
60
60
60
60
60
62
62
62
64
64
66
68
70
60
60
60
60
60
62
62
62
64
64
66
68
70
787 787 787 787 622 516 418 343 286 233 187 158 127 106
787 787 787 787 622 516 590 516 516 509 509 473 674 622
insgesamt 6144
8695
Kulturmedium durchgeführt, um Isomerase zu produzieren.
Durch Hinzufügen von Diatomeenerde zur Kulturbrühe und Filtrieren wurden die Zellen abgetrennt.
j Ein Teil des feuchten Filterkuchens wurde als Enzym-Zubereitung zur Durchführung einer chargenweisen
Isomerisierung von einem Maisstärkehydrolysat mit einem D.E.-Wert von 95% verwendet. Die
Verweilzeit in einem mit Rührwerk ausgerüsteten
ι» Reaktionsbehälter betrug 50 Stunden bei pH 6,25.
Ein anderer Teil der gleichen Enzym-Zubereitung wurde als Enzymquelle für ein fixiertes Bett verwendet,
um eine kontinuierliche Isomerisierung durchzuführen. Die Verweilzeit in der Säule betrug bei pH 8 1 bis 2
Stunden.
Die chargenweise Isomerisierung wurde bei 700C
durchgeführt, die kontinuierliche Isomerisierung in einer Anfangsphase, bis im wesentlichen eine Inaktivierung
des Enzyms beobachtet wurde, bei 6O0C. Dann wurde die Säulentemperatur auf 700C erhöht. Die
Ergebnisse sind in der Tabelle 4 zusammengestellt.
Chargenweise und Säulen-Isomerisierung eines
Hydrolysats mit einem D.E.-Wert von 95 %
Hydrolysats mit einem D.E.-Wert von 95 %
Chargenweise, Zugeführtes Isomerisat Differenz
50 Stil., pH 6,25 Material
Asche, % Tr. | 1,0 | 1,8 | 0,8 |
Organische Säu | 0,05 | 0,08 | 0,03 |
ren, % Tr. | |||
Farbe | 4 | 200 | 196 |
Kontinuierlich, Zugeführtes Isomerisat Differenz
1-2 Std. pH 8 Material
Asche, % Tr. | 0,5 |
Organische Säu | 0,03 |
ren, % Tr. | |
Farbe | 4 |
0,6
0,04
0,04
0,1
0,01
0,01
Chargenweise Isomerisierung im Vergleich
zur kontinuierlichen Isomerisierung mit immobilisierten Enzymen im fixierten Bett
Es wurde eine Fermentation mit einem Mikroorganismus der Gattung Streptomyces in einem xylosehaltigen
Die chargenweise Isomerisierung wurde bei pH 6,25 durchgeführt, weil bei pH-Werten über 7,0 während der
langen Reaktionsdauer, die beim chargenweisen Arbeiten erforderlich ist, die Zusammensetzung des Endproduktes
dazu neigte, unerwünscht zu werden. Es wurden Bedingungen für den Vergleich gewählt, von denen
angenommen werden kann, daß sie für jeden Verfahrenstyp das Optimum darstellten. Das Ergebnis der
Vergleichsversuche spricht eindeutig für das kontinuierliche Verfahren, dessen Wirtschaftlichkeit darauf
beruht, daß es wirksamer ist und eine wesentlich geringere Menge an Enzym-Aktivität pro Einheit
gebildete Laevulose erfordert.
Beispiel 4
Stabilisierte Enzyme
Stabilisierte Enzyme
Dieses und die folgenden Beispiele zeigen die b5 verbesserte thermische Aktivität der erfindungsgemäß
verwendbaren stabilisierten Isomerase, deren Einsatz zur Durchführung des temperaturprogrammierten Verfahrens
nach der Erfindung die Herstellung von
hochlaevulosehaltigen Sirupen ohne übermäßigen Enzymverlust ermöglicht.
Die verwendete stabilisierte Isomerase war ein aus den Zellen gewonnenes Enzym von sehr hoher Reinheit,
das in Lösung gebracht und über ein Bett von teilchenförmigen! basischem Magnesiumcarbonat geleitet
und daran wirksam absorbiert worden war.
Die Vorteile des Arbeitens bei höheren Temperaturen, das zu höheren Laevulosegehalten führt, weil die
umgesetzte Menge und der im Gleichgewicht befindliche Laevulosegehalt ansteigt, ergeben sich aus der
folgenden Tabelle, in der die bei einigen erhöhten Temperaturen im Gleichgewicht befindlichen Laevulosegehalte
zusammengestellt sind (Tabelle 5).
Im Gleichgewicht befindlicher Laevulosegehalt
in Abhängigkeit von der Temperatur
in Abhängigkeit von der Temperatur
Isomerisierungstemperaturen
Laevulosegehalt, % Tr.,
bezogen auf Ausgangsmenge Dextrose
bezogen auf Ausgangsmenge Dextrose
51,2
52,6
54,0
52,6
54,0
Die mit dem stabilisierten Enzym gefüllte Säule, durch die ein Strom einer Dextroselösung bei pH 8 geschickt
wurde, wurde bei 600C und darüber vergleichsweise lange betrieben, wobei das Enzym eine lange Lebensdauer
hatte, während der Laevulosegehalt im Ausfluß mindestens 50% des gesamten vorhandenen Zuckers,
bezogen auf Trockensubstanz, betrug. Das Verfahrensprodukt hatte eine besonders gute, d. h. geringe Farbe,
einen niedrigen Gehalt an organischen Säuren und einen niedrigen Gehalt an unerwünschten Kohlenhy- au
draten. Das hohe Arbeits-pH förderte die Enzymstabilität trotz der hohen Arbeitstemperaturen, die ihrerseits
eine sehr kurze Verweilzeit in der Säule bedingten. Demzufolge ließen sich auch die erforderlichen
Investitionen und Anlagekosten verringern.
Weitere Versuche zeigten, daß sich das erfindungsgemäße Verfahren auch mit Enzym-Zubereitungen anderen
Typs erfolgreich durchführen läßt, wobei im allgemeinen die Verwendung intakter Zellen bevorzugt
wird. Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung wurden getrocknete Zellen in ein feines Pulver
übergeführt. Es wurde durch Auflösen einer kleinen Menge eines oberflächenaktiven Mittels in einer l.Omol.
Glycinlösung eine Pufferlösung hergestellt, die durch Zugabe einer kleinen Menge Natriumhydroxid auf pH
8,0 eingestellt wurde. Durch Zugabe von 200 g der trockenen, fein gepulverten Zellen zu 1000 ml
Pufferlösung wurde eine Aufschlämmung hergestellt, die filtriert wurde. Es wurden 793 ml Filtrat mit einer
Aktivität von 17,5 Einheiten je ml erhalten.
Ein Teil dieser Enzymlösung wurde sodann an einem porösen Glasträger mit großer Oberfläche und reaktionsfähigen
Silangruppcn fixiert, wie es in der US-PS
35 56 945 beschrieben wird. Eine weitere Menge der
Lösung wurde an aktivierter granulierter Kohle μ
absorbiert. Beide Enzym-Zubereitungen wurden zur Durchführung des crfindungsgcmäßcn kontinuierlichen
Isomerisierung!!- Verfiihrcns erfolgreich verwendet.
Kontinuierliche er..*.} malische Umwandlung von
Dextrose in Laevulose unter Verwendung von
immobilisierter Xyloseisomerase
Ein körniges basisches Magnesiumcarbonat mit einer Teilchengröße zwischen 1,65 bis 0,844 mm wird in einer
Menge von 55,8 g in eine Säule gegeben, die ein Volumen von 73,3 ml aufweist. Ein im wesentlichen
reines, lösliches und zellfreies Xyloseisomerase-Enzym,
das auf S. olivochromogenes ATCC Nr. 21 713 in einer 0,01 m MgSCvLösung zurückgeht und eine Aktivität
von 50 U/ml besitzt, wird mit dem körnigen basischen Magnesiumcarbonat kontaktiert, um die Säule mit 5
Millionen Einheiten/0,03 m* des Enzyms zu beladen. Das
immobilisierte Xyloseisomerase-Enzym weist eine effektive Aktivität von mehr als 100 U/g pro Gramm des
immobilisierten Enzyms auf.
Eine wäßrige Dextrose-Beschickungsflüssigkeit wird dann der Säule mit 27° Baume (50% Trockensubstanz)
zugeführt. Die Beschickungsflüssigkeit enthält MgCl2 (0,005 m bezüglich MgCl2). Der pH-Wert der Beschikkung
wird auf 8,4 bis 8,8 mit 4 n-NaOH bei 580C
eingestellt.
Die Säule, welche die immobilisierte Enzymzubereitung enthält, wird auf einer Temperatur von 58°C
gehalten. Die Verweilzeit in der Säule beträgt weniger als 1 Stunde. Das Ausgangsbettvolumen pro Stunde für
die Herstellung von 45% Laevulose, bezogen auf
in Trockenbasis (BVH45 Laevulose) beträgt ungefähr 1.
Der abfließende Sirup enthält ungefähr 45 Gewichts-% Laevulose, bezogen auf Trockenbasis, und
weniger als ungefähr 0,3 Gewichts-% Psikose, bezogen auf Trockenbasis. Nachfolgend wird eine Analyse des
pH-Wertes des Beschickungssirups sowie des abfließenden Sirups nach einer längeren kontinuierlichen
Umwandlung angegeben:
Betriebsstunden Beschickungssirup Ablauf
pH bei 25 C pH bei 25
8,60
8,60
Der vorstehend beschriebene Versuch wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Xyloseisomerase an
einen Aluminiumoxydträger gebunden wird. Die gleiche
5(i Dextrose-Beschickungsflüssigkeit, die zuvor auf einem
pH von 8,3 bis 8,4 mit 4 n-NaOH eingestellt worden ist, wird durch die Säule gepumpt, die auf einer Temperatur
von 58°C gehalten wird, und zwar mit einer solchen Geschwindigkeit, daß 45 Gewichts-% Laevulose,
bezogen auf Trockenbasis, in dem Ablauf erhalten werden. Die Vcrwcilzcit beträgt weniger als 1 Stunde.
Nachfolgend wird eine Analyse des pH des Beschikkungssirups sowie des ablaufenden Sirups nach einer
längeren kontinuierlichen Umwandlung angegeben:
M)
Bctricbsstuntlcn Hcsihickunpssirup Ablauf
pll bei 25 ( pll bei 25 C
8,3
8,15
HA
8,4
8,25
8,3
Bei dem Betrieb einer Sau!::, in welcher die Verweilzeit ungefähr 4 Stunden überschreiten kann, ist
es besonders vorzuziehen ein alkalisches Material, wie beispielsweise eine Natriumhydroxyd- oder Mg(OH)2-Lösung
oder eine Kombination aus diesen beiden Lösungen in die Säule in verschiedenen Höhen
einzuführen. Eine geeignete Methode zur Durchführung dieser Maßnahme besteht darin, Einlasse für die
alkalischen Lösungen an einer oder mehreren Stellen längs der Säule vorzusehen, so daß der pH-Wert der
Reaktionslösung auf wenigstens ungefähr 7,5 gehalten wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der pH-Wert der enzymatischen Isomerase-Reaktionslösung
durch die Verwendung von einem oder mehreren Einlassen für die alkalische Lösung längs der
Säule programmiert werden. Bei der Durchführung einer derartigen Methode kann der Anfangs-pH-Wert
der Beschickungsflüssigkeit ungefähr 7,5 oder darüber betragen und vorzugsweise zwischen ungefähr 7,5 und
ungefähr 8,2 liegen. Durch Einführen von alkalischen Materialien, wie beispielsweise Natriumhydroxyd oder
Mg(OH)2 oder Kombinationen aus diesen zwei Materialien, in die Reaktionslösung über Einlasse längs der
Säule kann der pH-Wert der Reaktionslösung in bequemer Weise bis auf einen Wert von bis zu ungefähr
9,5 gebracht werden. Vorzugsweise wird der pH-Wert um einen Wert von wenigstens ungefähr 0,1 durch die
Zufuhr von Vorratsflüssigkeit zu dem Ablauf erhöht, wobei jedoch günstigere Ergebnisse bezüglich der
Stabilität des basischen Magnesiumträgers sowie der Qualität der Isomerase erzielt werden, wenn der
pH-Wert um einen Wert von wenigstens ungefähr 0,2 gesteigert wird.
Kontinuierliche enzymatische Umwandlung von
Dextrose in Laevulose unter Verwendung von
immobilisierter Xyloseisomerase
Eine von einem Glasmantel umgebene Säule mit einer Länge von 104 cm wird als Konverter verwendet. Der
Durchmesser des Enzymbettes beträgt 26 mm. Wasser wird in den Konverter an dem tieferen Ende in einer
Menge von ungefähr 2 Bettvolumina pro Stunde eingepumpt. Trockenes basisches Magnesiumcarbonat,
das durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 1,15 mm gesiebt worden ist und auf einem Sieb mit einer
lichten Maschenweite von 0,60 mm gesammelt worden ist, wird dann oben in die Konvertersäule eingefüllt. Die
Teilchen des basischen Magnesiumcarbonats setzen sich unten an dem Konverter ab, während das feine Material
des basischen Magnesiumcarbonats aus dem Oberteil der Säule durch aufsteigendes Wasser ausgewaschen
wird.
Nachdem das Bett aus basischen Magnesiumcarbonat-Teilchen
hergestellt worden ist, wird eine lösliche Xyloseisomerase-Enzymlösung, die auf einen Mikroorganismus
des Genus Streptomyces zurückgeht (1 1 mit einer Enzymaktivität von 100 U/ml) durch das Bett bei
Zimmertemperatur gepumpt. Bezogen auf den Unterschied der Enzymaktivität der Lösung vor sowie nach
einem zweimaligen Durchlaufenlassen durch das Bett wird festgestellt, daß 79 000 Einheiten des Isomeraseenzyms
in dem Bett aus basischem Magnesiumcarbonat gebunden sind, wobei ein Komplex aus Xyloseisomerase
und basischem Magnesiumcarbonat gebildet wird, der eine effektive Aktivität von mehr als 175 U/g besitzt.
Eine enzymatische Isomerisierung einer Dextroselösung unter Bildung eines Laevulose enthaltenden Sirups
wird in der Weise durchgeführt, daß durch die Säule eine Lösung geschickt wird, die 600 g pro Liter Dextrose
enthält, und zwar bei einem Anfangs-pH von ungefäht 8,3 sowie einer Anfangsfließgeschwindigkeit von ungefähr
1,5 Bettvolumina pro Stunde (ungefähr 800 ml pro Stunde). Aliquotproben werden periodisch für Analysezwecke
abgezogen. Während der ersten 6 Stunden des
ίο Betriebs enthält das ablaufende Produkt zwischen 45,S
und 48,7 Gewichts-% Ketose. Die Fließgeschwindigkeil zur Herstellung eines Ketoseproduktes in einer Menge
von 45 Gewichts-%, bezogen auf Trockenbasis, beträgt ungefähr 1 Bettvolumen pro Stunde oder darüber. Die
is Menge der gebildeten Psikose beträgt weniger als 1
Gewichts-%, bezogen auf Trockenbasis.
Unter Berücksichtigung der bei der Durchführung des vorstehend geschilderten Experiments erhaltenen Ergebnisse
ist ersichtlich, daß der Komplex aus Xyloseisomerase
und basischem Magnesiumcarbonat sehr aktiv ist. Das Experiment zeigt ferner, daß das gebundene
Enzym aktiv und sehr stabil ist. Da die Qualität eines Produktes aus einem kontinuierlich arbeitenden Konverter
mit einer Produktionsgeschwindigkeit von 0,5 Bettvolumina pro Stunde (BVH) zufriedenstellend ist,
kann die Produktionszeit dieses Konverters 22 Tage betragen, wobei die Halbwertszeit des Konverters
zwischen 16 und 18 Tagen liegt. Bei einer durchschnittlichen
Produktionsgeschwindigkeit von 1,3 BVH bei 45% Laevulose während einer Zeitspanne von 17 Tagen
beträgt das Gesamtprodukt, bezogen auf Trockenbasis, 171 849 g oder 0,46 Enzymeinheiten pro Gramm des
Produktes. Daraus geht deutlich der durch die Erfindung erzielbare technische Fortschritt hervor, der insbesondere
auf Einsparungen an dem Enzym zurückzuführen ist, das zur Herstellung des gewünschten Laevuloseproduktes
erforderlich ist.
Ein im Handel erhältliches basisches Magnesiumcarbonat-Pulver
wird kompaktiert und auf eine Teilchengröße zwischen ungefähr 0,42 und 0,60 mm vermählen.
31,7 g dieses granulierten basischen Magnesiumcarbonat-Trägers werden in eine mit Wasser gefüllte Säule
gegeben, die von einem Mantel umgeben ist. Das Bett besitzt ein Volumen von 53 ml. Wasser wird durch die
Säule an ihrem unteren Ende eingepumpt, so daß die gröberen Teilchen des körnigen basischen Magnesiumcarbonats
sich unten in dem Konverter absetzen, während das feine Material aus dem Oberteil der Säule
durch das aufsteigende Wasser ausgewaschen wird.
In einem anderen Behälter wird eine Lösung hergestellt, die 95% D.E.-Stärkehydrolysat mit einem
Feststoffgehalt von 50% sowie lösliches Enzym enthält Das Xyloseisomerase-Enzym geht auf Streptomyces
zurück und besitzt eine Isomeraseaktivität von 50 U/ml Die Lösung wird auf 189 mi eingestellt. Magnesiumchlorid
(MgCb) wird der Lösung zur Einstellung eines Gehaltes von 0,005 m bezüglich MgCl2 zugesetzt. Der
W) pH wird unter Verwendung von 4 n-Natriumhydroxyd
auf 8,4 eingestellt.
Die Kombinationslösung (Stärkehydrolysat und lösliches Enzym) wird in die Kolonne eingepumpt, welche
das körnige basische Magnesiumcarbonat enthält und 2'/2mal durch die Säule laufengelassen, so daß der
Träger mit 5 Millionen Einheiten pro 0,03 m3 des Enzyms bei einer Temperatur von 6O0C beladen wird.
Nachdem die Lösung, die das iösiiche Enzym und das
BO9 621/232
Stärkehydrolysat enthält, durch die Säule laufengelassen
worden ist, ist die Säule anschließend aktiviert und fertig für eine Verwendung zur kontinuierlichen Umwandlung
einer Dextroselösung in einen Laevulose enthaltenden Sirup. Der Komplex aus Xylc-.eisomerase und körnigem
basischen Magnesiumcarbonat besitzt eine effektive Isomeraseaktivität von mehr als 175 U/g des Komplexes.
Ein Laevulose enthaltender Sirup wird kontinuierlich in der Säule in der Weise hergestellt, daß eine Lösung, ι ο
die ein Stärkehydrolysat mit einem Dextroseäquivalent von ungefähr 95 enthält und einen Feststoffgehalt von
ungefähr 50%, bezogen auf Trockenbasis, aufweist, eingepumpt wird. Das in die Säule eingepumpte
Stärkehydrolysat wird zuerst mit MgCb zur Einstellung ι *,
eines MgC^-Gehaltes von 0,005 m behandelt, worauf der pH-Wert der Lösung auf 8,4 unter Verwendung von
4 n-NaOH eingestellt wird. Die Isomerisierung wird kontinuierlich bei einer Temperatur von 60° C bei einem
Laevulose-BVH42-Wert von 1,6 durchgeführt.
Nach 69 Stunden vermag die immobilisierte Xyloseisomerase
in der Säule immer noch Dextrose in Laevulose umzuwandeln, wobei ein Produkt erhalten
wird, das einen Ketosegehalt von 40,1%, bezogen auf Trockenbasis, und einen Psikosegehalt von 0,15
Gewichts-%, bezogen auf Trockenbasis, aufweist, wobei ein eingestelltes Bettvolumen pro Stunde erzielt wird,
das 1,8 BVH42 äquivalent ist.
Dieses Experiment zeigt deutlich die Stabilität sowie die Enzymwirkung der erfindungsgemäßen immobili- jo
sierten Xyloseisomerase.
Beispiel 8
Vergleichsbeispiel
Vergleichsbeispiel
Erdalkalicarbonate werden im Vergleich auf ihr Bindevermögen (»gebundene Isomerase«) sowie die
J5 effektive Isomeraseaktivität (»beibehaltene Isomeraseaktivität«)
mit in Form von Einzelteilchen vorliegendem basischen Magnesiumcarbonat verglichen. In jedem
Falle wird der getestete Träger mit einer gereinigten, zellfreien Xyloseisomerase-Lösung kontaktiert, die
2500 bis 2600 U/ml Glukoseisomerase-Aktivität enthält. Die Xyloseisomerase geht auf einen Mikroorganismus
des Genus Streptomyces (Stamm S. olivochromogenes, ATCCNr.21 713)zurück.
Jeder der Träger wird in einem 150-mI-Becher mit 30
ml einer Lösung aufgeschlämmt, die aus
0,01 m MgSO4 · 7H2O
besteht. Die Aufschlämmung wird auf einen pH von 8 bis 9 unter Verwendung von 0,1 n-KOH eingestellt. Die
gereinigte Xyloseisomerase-Lösung wird dann einer jeden Trägeraufschlämmung zugesetzt, um eine Gesamtisomerase-Zugabe
von ungefähr 2600 Einheiten Glukoseisomerase-Aktivität zu erzielen. Eine weitere
Menge einer 0,01 m MgSO4-Lösung wird einer jeden
Aufschlämmung aus Träger und Enzym zugesetzt, um ein Gesamtvolumen von 50 ml einzustellen. Der
pH-Wert der Lösung wird (falls erforderlich) auf 8 bis 9 eingestellt. Die Becher werden bedeckt und bei
Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 30 Minuten gerührt, um eine maximale Sorption des
Enzyms an die entsprechenden Träger zu bewirken. Die Aufschlämmungen werden filtriert, worauf die Träger
mit dem sorbierten Enzym mit 100 ml der 0,01 m MgSO4-Lösung gewaschen werden. Die Filtrate sowie
die Waschlösungen werden vereinigt und auf ihre Isomeraseaktivität gegenüber der zugesetzten ursprünglichen
Isomeraseaktivität unter Verwendung eines handelsüblichen Analysators untersucht
Das Bindevermögen oder die »gebundene Isomerase« der jeweiligen Träger wird unter Anwendung der
folgenden Formel berechnet:
Gebundene Isomerase (BI)
in Einheiten pro g (U/g),
bezogen auf das Trockengewicht (d. b.)
Alle vorliegenden Einheiten —
Alle Einheiten in dem Filtrat und in den Waschlösungen
g Träger, d. b.
g Träger, d. b.
Die »effektive Isomeraseaktivität« (auch als »zurückbehaltene Isomeraseaktivität« bezeichnet) einer jeden
Erdalkali-Carbonatträgerprobe wird unter Einhaltung der folgenden Methode bestimmt:
Eine wäßrige Lösung, die 80 g Dextrose (d. b.) und 13,3 mg Mg(OH)2 pro 100 ml enthält, wird hergestellt.
Die Lösung wird während wenigstens 1 Stunde (vorzugsweise über Nacht) zur Gleichgewichtseinstellung
gerührt. Der pH wird auf 8,5 bei Zimmertemperatür mit 3 n-KOH eingestellt. 193,9 g Substrat (ungefähr
150 ml) werden in einen Becher aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 1 1 zugesetzt, der mit
einem Uhrglas mit einem Loch in der Mitte bedeckt ist, wobei das Uhrglas ein weiteres Loch in der Nähe seines
Randes aufweist. Die Probe wird in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 60°C gestellt und während einer
Zeitspanne von 15 Minuten gerührt, wobei ein pH-Wert
von 8,0 unter Verwendung von 3 n-KOH aufrechterhalten wird. Das Substrat wird mit Stickstoff mit mäßiger h5
Geschwindigkeit gespült, wobei ein Gasverteilungsrohr verwendet wird, das durch das Loch am Außenumfang
des Uhrglases eingeführt wird. Eine zuvor abgewogene Menge eines Komplexes aus Xyloseisomerase und
basischem Magnesiumcarbonat, der 1000 bis 3000 Einheiten an gebundener Isomerase enthält, wird unter
Verwendung von 50 ml Wasser mit einer Temperatur von 60° C zugesetzt, wobei das Wasser dazu verwendet
wird um das Material in den Becher aus rostfreiem Stahl zu überführen. Auf diese Weise erhält man eine
Reaktionsmischung, die 60 g Dextrose und 10 mg Mg(OH)2 pro 100 ml enthält und einen Isomerasegehalt
von 8,3 bis 25,0 Einheiten pro Gramm Dextrose aufweist. Die Reaktionsmischung wird auf einen pH von
8,0 eingestellt und während einer Zeitspanne von 2 Stunden, die exakt nach der Enzymzugabe gemessen
werden, digeriert. Das Material wird sofort durch Vakuum durch ein Filterpapier filtriert, worauf der pH
eines 500-ml-Anteils des Filtrats auf ungefähr 2,5 unter
Verwendung von 1,0 n-Perchlorsäure eingestellt wird. Der Trockensubstanzgehalt der inaktivierten Probe
wird durch Brechungsindexmessung bestimmt. Die Laevulosekonzentration wird durch spektrophotometrische
oder polarimetrische Methoden ermittelt. Aus der Menge der erzeugten Laevulose wird die effektive
Isomerase-Aktivität (»beibehaltene Isomeraseaktivität«) unter Anwendung der folgenden Gleichung
bestimmt:
wobei
Effektive Aktivität, U/g, d. b. Träger
- C * 2M6 X l0g
V = Reaktionsvolumen, ml
C = Träger, g, d. b. und
L = erzeugte Laevulose, % d. b.
Einzelheiten sowie die Ergebnisse der einzelnen Tests sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:
Träger
Substrat
Konzentration
g, d.s.
100 m!
Konzentration
g, d.s.
100 m!
Lösungsmittel Bindevermögen
(»gebundene Isomeraseaktivität«)
(»gebundene Isomeraseaktivität«)
(U/g, d.b.) Effektive
Isomeraseaktivität
Isomeraseaktivität
(U/g, d.b.)
% der ursprünglichen Aktivität
ZnCO3 | 60 | MgSO4 | 515 |
CaCO3 | 60 | MgSO4 | 368 |
BaCO3 | 60 | MgSO4 | 38 |
Basisches | 60 | MgSO4 | 412 |
MgCO3 1) | |||
') Basisches | Magnesiumcarbonat der | Formel 4MgCO3- | Mg(OH)2 -5 H2O. |
252
54
75
54
75
294
48,9 14,7
71,4
Wie aus den vorstehenden Werten ersichtlich ist, ist das Bindevermägen (auch als »gebundene Isomerase«
bezeichnet) der Erdalkalicarbonate schwer vorherseh- jo bar. Das gleiche gilt für die effektive Isomeraseaktivität.
Es ist besonders bemerkenswert, daß BaCO3 ein extrem geringes Vermögen besitzt. Isomerase zu binden.
Während ZnCO3- und CaCO3-Komplexe mit Isomerase
eine vernünftige »gebundene Isomeraseaktivität« zeigen, besitzen die Komplexe der beiden Verbindungen
eine relativ niedrige »effektive Isomeraseaktivität« oder die Fähigkeit, Dextrose zu Laevulose zu isomerisieren,
und zwar im Vergleich zu dem Komplex aus Xyloseisomerase und basischem Magnesiumcarbonat
gemäß vorliegender Erfindung.
Ohne sich an eine Theorie binden zu wollen, kann man annehmen, daß die relativ niedrige »effektive
Isomeraseaktivität« bei diesen Salzen (ZnCO3 und CaCO3) deshalb auftritt, da die Isomerase so fest 4>
gebunden wird, daß ihre Konformation verändert und/oder die Isomerase nicht dem Substrat zugänglich
ist aufgrund der Art, in welcher die Isomerase an das Salz gebunden ist. In jedem Falle ist es unerwartet, daß
basisches Magnesiumcarbonat ein relativ hohes Bindevermögen zusätzlich zu einer hohen »effektiven
Isomeraseaktivität« besitzt. Die Kombination dieser zwei Merkmale bietet eine Reihe von wichtigen
Vorteilen im Hinblick auf die Stabilität sowie die längere Halbwertszeit des immobilisierten Enzyms
sowie des größeren Enzymwirkungsgrades. Die Enzymwirkungsgrade liegen normalerweise zwischen 0,30 und
ungefähr 0,70. So zeigt beispielsweise eine Tiefbettsäule mit einer Enzymbeladung von 474 000 Einheiten an
isomerisiertem Enzym 0,03 m3 (Ausmaß der Enzymaktivität
in dem Bett [Einheiten/g] geteilt durch das Bettvolumen [kg/0,03 m3]) sowie mit einem Enzymwirkungsgrad
von 0,6 eine Anfangssäulen-Produktionsgeschwindigkeit von 3,6 BVH mit 45% Ketose (BVH45),
wobei BVH die Zuführungsgeschwindigkeit geteilt durch das Bettvolumen ist.
Claims (7)
1. Enzymatisches Isome isat einer dextrosehaltigen Lösung mit einem Laevulosegehalt von
mindestens 42%, einem durch die Isomerisierung verursachten Aschegehalt von unter 1,0% und einem
Psicosegehalt von nicht über 0,3%, jeweils bezogen auf Trockensubstanz, hergestellt durch Einwirkung
einer Xyloseisomerase-Enzymzubereitung auf eine dextrosehaltige Lösung bei einer Temperatur von 50
bis 70° C und einem pH-Wert von wenigstens 7, dadurch gekennzeichnet, daß man nach
der ersten Phase der Umsetzung die Temperatur um wenigstens 50C erhöht, jedoch nicht über 80° C
ansteigen läßt, und die Isomerisierung fortsetzt
2. Enzymatisches Isomerisierungsverfahren zur Umwandlung von Dextrose in Laevulose, wobei eine
Dextrose enthaltende Lösung bei einer Temperatur im Bereich von 50° C bis 70° C und bei einem
pH-Wert von wenigstens 7 der Einwirkung einer Xylose-Isomerase-Enzymzubereitung unterworfen
wird, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der ersten Phase der Umsetzung die Temperatur um
wenigstens 5° C erhöht, jedoch nicht über 80° C steigen läßt und die Isomerisierung fortsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man bei kontinuierlicher Isomerisierung
eine immobilisierte Enzymzubereitung verwendet
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Enzymzubereitung von einem
Organismus der Gattung Streptomyces ableitet.
5. Verfahren nach Anspruch 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Xylose-Isomerase-Zubereitung
aus intakten Zellen von Mikroorganismen besteht.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine
Enzymzubereitung verwendet, die an teilchenförmiges basisches Magnesiumcarbonat adsorbiert ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das stabilisierte Enzym in einer Säule
angeordnet ist.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US00294397A US3847741A (en) | 1972-10-02 | 1972-10-02 | Temperature-programmed process for the production of levulose-bearing syrups |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2349464A1 DE2349464A1 (de) | 1974-04-18 |
DE2349464B2 true DE2349464B2 (de) | 1978-05-24 |
DE2349464C3 DE2349464C3 (de) | 1979-01-18 |
Family
ID=23133236
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2365722A Expired DE2365722C3 (de) | 1972-10-02 | 1973-10-02 | Stabilisierte und immobilisierte Xylose-Isomerase-Enzymzubereitung, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Umwandlung von Dextrose in Laevulose |
DE2349464A Expired DE2349464C3 (de) | 1972-10-02 | 1973-10-02 | Enzymatisches Isomerisat einer dextrosehaltigen Lösung und enzymatisches Isomerisierungsverfahren zur Umwandlung von Dextrose in Laevulose |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2365722A Expired DE2365722C3 (de) | 1972-10-02 | 1973-10-02 | Stabilisierte und immobilisierte Xylose-Isomerase-Enzymzubereitung, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Umwandlung von Dextrose in Laevulose |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US3847741A (de) |
JP (1) | JPS5726758B2 (de) |
AR (2) | AR209264A1 (de) |
BE (1) | BE805548A (de) |
DE (2) | DE2365722C3 (de) |
FR (1) | FR2201341B1 (de) |
GB (2) | GB1447246A (de) |
IT (1) | IT998687B (de) |
MY (2) | MY7800033A (de) |
NL (2) | NL169088C (de) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1455993A (en) * | 1973-01-12 | 1976-11-17 | Novo Industri As | Glucose isomerase |
US3956065A (en) * | 1973-02-02 | 1976-05-11 | Cpc International Inc. | Inert, non-porous granules for flow control in a plug flow reactor |
SE401037B (sv) * | 1974-06-07 | 1978-04-17 | Lkb Produkter Ab | Sett att genom metning av temperaturforendringar bestemma koncentrationen av ett emne som under paverkan av ett enzym avger eller upptar verme, samt apparat for settets utforande |
US3974036A (en) * | 1974-09-03 | 1976-08-10 | Miles Laboratories, Inc. | Process for conditioning bacterial cells containing glucose isomerase activity |
US4310628A (en) * | 1976-02-26 | 1982-01-12 | A. E. Staley Manufacturing Company | Fructose production |
US4410627A (en) * | 1982-06-30 | 1983-10-18 | Nabisco Brands, Inc. | Glucose isomerase process |
JP6977231B2 (ja) | 2015-07-13 | 2021-12-08 | マラ リニューアブルズ コーポレーション | C5有機炭素の微生物による代謝の増強 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3788945A (en) * | 1970-11-09 | 1974-01-29 | Standard Brands Inc | Process for isomerizing glucose to fructose |
US3784409A (en) * | 1971-06-01 | 1974-01-08 | Standard Brands Inc | Process for purifying glucose syrups containing fructose |
-
1972
- 1972-10-02 US US00294397A patent/US3847741A/en not_active Expired - Lifetime
-
1973
- 1973-10-01 FR FR7335034A patent/FR2201341B1/fr not_active Expired
- 1973-10-02 AR AR250329A patent/AR209264A1/es active
- 1973-10-02 GB GB4680375A patent/GB1447246A/en not_active Expired
- 1973-10-02 IT IT29646/73A patent/IT998687B/it active
- 1973-10-02 NL NLAANVRAGE7313551,A patent/NL169088C/xx not_active IP Right Cessation
- 1973-10-02 GB GB4608173A patent/GB1447245A/en not_active Expired
- 1973-10-02 DE DE2365722A patent/DE2365722C3/de not_active Expired
- 1973-10-02 BE BE2053110A patent/BE805548A/xx unknown
- 1973-10-02 DE DE2349464A patent/DE2349464C3/de not_active Expired
- 1973-10-02 JP JP11024573A patent/JPS5726758B2/ja not_active Expired
-
1977
- 1977-01-07 AR AR266125A patent/AR218021A1/es active
-
1978
- 1978-08-21 NL NL7808628A patent/NL7808628A/xx not_active Application Discontinuation
- 1978-12-30 MY MY33/78A patent/MY7800033A/xx unknown
- 1978-12-30 MY MY32/78A patent/MY7800032A/xx unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE2365722C3 (de) | 1980-07-17 |
MY7800032A (en) | 1978-12-31 |
MY7800033A (en) | 1978-12-31 |
NL169088C (nl) | 1982-06-01 |
AU6089973A (en) | 1975-04-10 |
DE2349464A1 (de) | 1974-04-18 |
JPS5726758B2 (de) | 1982-06-07 |
NL7313551A (de) | 1974-04-04 |
DE2349464C3 (de) | 1979-01-18 |
DE2365722A1 (de) | 1976-02-26 |
BE805548A (fr) | 1974-04-02 |
US3847741A (en) | 1974-11-12 |
AR218021A1 (es) | 1980-05-15 |
NL169088B (nl) | 1982-01-04 |
AR209264A1 (es) | 1977-04-15 |
IT998687B (it) | 1976-02-20 |
DE2365722B2 (de) | 1979-10-31 |
GB1447245A (en) | 1976-08-25 |
NL7808628A (nl) | 1978-12-29 |
FR2201341B1 (de) | 1977-09-09 |
GB1447246A (en) | 1976-08-25 |
JPS4992243A (de) | 1974-09-03 |
FR2201341A1 (de) | 1974-04-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE3853921T2 (de) | Verfahren zur produktion von ethanol, glycerin und bernsteinsäure. | |
DE3133123C2 (de) | Unbeweglich gemachte &alpha;-Glukosyltransferase, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie Verwendung zur Herstellung von Palatinose | |
DE68909488T2 (de) | Vernetzte Glukose-Isomerase. | |
DE69010999T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Xylose. | |
DE2232645C3 (de) | Verfahren zur Durchführung einer enzymkatalysierten Umwandlung eines Substrats | |
DE2712007C2 (de) | ||
DE2349464C3 (de) | Enzymatisches Isomerisat einer dextrosehaltigen Lösung und enzymatisches Isomerisierungsverfahren zur Umwandlung von Dextrose in Laevulose | |
DE69631689T2 (de) | Kristalline 1-kestose und verfahren zu ihrer herstellung | |
US3847740A (en) | Process for the production of levulose-bearing syrups | |
DE2166121C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von Verzuckerungsprodukten von Stärke | |
DE3438960A1 (de) | Verfahren zum isomerisieren von glucose zu fructose | |
DE2713861A1 (de) | Verfahren zur immobilisierung von glukoseisomerase | |
CH659827A5 (de) | Verfahren zur isolierung von l-aminosaeuren. | |
DE3323617A1 (de) | Verfahren zum isomerisieren von glucose in fructose | |
DE1567323B2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Fructose durch enzymatische Umwandlung von Glucose | |
DE2443895C3 (de) | Immobilisierte Dextroseisomerase-Zubereitung, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihrer Verwendung für die Isomerisierung von Dextrose | |
DE69315902T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Mannitol | |
EP0277934B1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Zuckersirupen durch enzymatische Direktverzuckerung von stärkereichen Rohstoffen, insbesondere frischen oder getrockneten Cassavawurzeln | |
DE2329457C2 (de) | Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glucose zu Fructose | |
DE2752499A1 (de) | Verfahren zur enzymatischen umwandlung eines penicillins in 6-aminopenicillansaeure | |
DE2539015C3 (de) | Verfahren zur Behandlung von Bakterienzellen, die Glucoseisomerase-Aktivität besitzen, zur anschließenden Anwendung zur Herstellung eines Fructose-haltigen Produkts | |
DE2832577A1 (de) | Enzymatische mittel fuer die isomerisierung von glucose zu laevulose | |
DE2707876C2 (de) | ||
DE2138059B2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Glucose-Isomerase und deren Verwendung | |
DE2539015B2 (de) | Verfahren zur behandlung von bakterienzellen, die glucoseisomerase-aktivitaet besitzen, zur anschliessenden anwendung zur herstellung eines fructose-haltigen produkts |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |