DE2335334B2

DE2335334B2 - Verfahren zur gewinnung von hochgereinigten phosphatiden aus tierischen organen

Info

Publication number: DE2335334B2
Application number: DE19732335334
Authority: DE
Inventors: Werner Dipl.-Ing. Wien Wolff
Original assignee: Etapharm ehem. pharm. Laboratorium GmbH,. Wien
Priority date: 1972-07-31
Filing date: 1973-07-11
Publication date: 1976-09-09
Also published as: FR2194413A1; AT315359B; DE2335334A1; FR2194413B1; GB1388094A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von hochgereinigten Phosphatide:! aus tierischen Organen. Phosphatide bzw. Phosphatidgemische kornmen in tierischen Organen stets mit Begleitsubstanzen vergesellschaftet vor, die für eine spätere Verwendung störend oder ungeeignet sind und deshalb abgetrennt werden müssen. Als Beispiele für solche Begleitsubstanzen seien erwähnt: Peptide, Aminosäuren, öo Sterine, Sterincster, Mono-, Di- und Triglyceride, freie Fettsäuren und Zucker.

Verfahren zur Phosphatidgevvinnung und ihrer Reinigung sind schon mehrfach beschrieben worden. So gibt die DL-PS 62 400 die Lehre, pflanzenphsophatidhaltiges Material mit Alkohol und Chloroform zu extrahieren und nach Filtration vom Unlöslichen das mnnesmittel im Vakuum abzuziehen. Ein solches Darsiellupgsverfahren führt zu Phosphatidgemischen, deren Reinheitsgrad noch sehr zu wünschen übrig läßt. Würde beispielsweise ein phosphatidhaltiges Material aas tierischen Organen auf diese Weise behandelt werden, wären die Phosphatide noch u. a. mit Zucker und Aminosäuren verunreinigt.

Auch die Mabnahmen, die die DT-AS 12 41559 sowie die GB-PS S 96 903 zur Herstellung eines arachidonsäurereichen Phosphatides unter Anwendung von vier Vcrfahrenssiufen vorschlagen, sind ungenügend, falls sehr reine Phosphatide gewünscht werden. Nach diesem bekannten Verfahren muß erst in zwei Verfahrensstufen durch aufeinanderfolgendes Entwässern eines tierischen Organs mit Alkohol und durch Extraktion sämtlicher Lipoide mit Petroläther ein Gesamtlipoidextrakt hergestellt werden, der dann mit aliphatischen Ketonen extrahiert, dabei aber nur unvollständig von Neutralfette!! und Giyeeriden befreit wird und schließlich durch Extraktion mit einem aliphatischen Ester oder einem Alkohol-Chlorkohlenwasserstoff-Gemisch und Abscheidung des Phosphatidsiemisches aus dieser Extraktionslösung durch Kühlen aufgearbeitet wird. Diese beiden Behandlungsvorgänge des zuvor gewonnenen Gesamtlipoidextraktes reichen aber nicht aus, um Phosphatide zu erhalten, weiche sovvohl frei ion wasserlöslichen, nicht phosphatidischen Begleiisiofien sind, als auch keine Neutralfette und Glyceride enthalten. Dies trifft auch die mehrstufige Arbeitsweise gemäß der DT-PS 6 35 325 zur Gewinnung von Lipoiden aus Geweben des Zentralnervensystems /.u, wobei in drei aufeinanderfolgenden Stufen mitteis bestimmter Lösungsmittel zunächst die Gesamtlipuide gewonnen werden, die dann von Cholesterin und wasserlöslichen Verunreinigungen im Wege einer speziellen P;handlung mit Aceton befreit werden müssen: die native Zusammensetzung bleibt dabei nicht erhalten und auch eine für ein Rcinprodukt notwendige weitgehende Abtrennung der phosphorfreien Lipoide \on den Phosphatide)! findet nicht statt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, aus dem Gesamiiipoidextraki tierischer Organe ein sehr reines Phosphatidgemisch zu gewinnen, um daraus eine injizierbare, stabile wäßrige Dispersion herstellen zu können. Darüber hinaus soll die native Zusammensetzung der Phosphatide weitestgehend erhalten bleiben.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht im Prinzip darauf, einen Gesamtlipoidextrakt durch eine bestimmte Lösungsmittelbehandlung von den Proteinen vollständig *.u befreien und aus diesem vergereinigten Gesamtlipoidextrakt entweder zuerst die wasserlöslichen Verunreinigungen durch einen speziellen Waschvorgang zu entfernen und dann zur Gewinnung des hochreinen Phosphatidgemisches die anderen, phosphin freien Lipoide durch einen Adsorptionsvorgang abzutrenneii, oder -iber zuerst die Adsorption und dann den Waschvorgang vorzunehmen.

Zur Erläuterung der angestrebten besonders hohen Reinheit sei angeführt, daß das zu gewinnende Phosphatidgemisch eiweißfrei und frei von Peptiden sein :imß und darüber hinaus weitestgehend befreit von Aminosäuren, Sterinen, Sterinestern, Mono-, Di- und Friglyceriden, fieien Fettsäuren und Zuckern sein soll. Bei der naiiven Zusammensetzung der Phosphatide darf keine Änderung in der für die einzelnen Organe spezifischen Zusammensetzung der Einzelkomponenten eintreten. Das bedeutet beispielsweise, daß der Aldehydgehalt als Mat für den Gehalt an Plasma-

logenen (Accialphosphatide) erhalten bleiben muß und daß am Feitsäuremuster der Phosphatide keine Veränderung wie Epoxidbildung oder Hydroperoxidbildung auftreten darf. Ferner darf das Verfahren zur Reindarstellung von Phosphatiden nicht zu einer merklichen Erhöhung des Gehaltes an Lysoverbindungen führen, d. h., hydrolytische Spaltungen müssen vermieden werden. Daraus folgt ferner, daß der Phosphatid-Rohextrakt nur mit neutralen Salzlösungen schonend behandelt werden darf, wobei noch die Einschränkung gemacht werden muß, daß Calcium- und Kaliumionen bei den Reinigungsoperationen nicht zugegen sein dürfen, weil diese Ionen vor den Phosphatiden salzartig bzw. auch adsorptiv gebunden werden und dann eine spätere pharmazeutische Verwendung nachteilig beeinflussen können.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das vorliegende Problem der Herstellung hochgereinigter Phosphatide tierischen Ursprungs mit weitestgehend eewahrter nativer Zusammensetzung dadurch gelöst, daß

a) ein lösungsmittelfreier Gesamtlipoidextrakt in alkoholhaltigen Lösungsmitteln, z. B. Gemischen \on Methanol und Chloroform oder von Äthanol und Benzol, aufgenommen und bei Temperaturen bis etwa 40 C eingedampft wird, wobei die Aufnahme des Extraktes und das Eindampfen mehrmals vorgenommen werden, wonach der getrocknete Extrakt in Petroläthcr in Gegenwart eines inerten Gases bei Gefrierschranktemperaturen einige Zeit .-.ichen gelassen und \on den ungelösten Proteinen abgetrennt wird, danach vorzugsweise die Abtrennung der Proteine durch Eindampfen der Pctrolätherlösung und Behandeln mittels alkoholhaltiger Lösungsmittel, z. B. Chloroform-Methanol, vervollständigt wird, wonach

b) der von Proteinen und Lösungsmitteln befreite Extrakt in einem polaren bzw. schwach polaren, im Falle der Phosphatide die Bildung mizellarer Strukturen verhindernden, mit Wasser nicht oder nur wenig mischbaren Lösungsmittel aufgenommen und mit neutralen wäßrigen Natriumsalzlösungen in Abwesenheit von Calcium- und Kaliumioncn und anschließend mit Wasser gewaschen wird, und

c) der von Lösungsmitteln und Wasser befreite Extrakt in einem unpolaren, im Falle der Phosphatide die Bildung von Mizellen ermöglichenden Lösungsmittel mit Siedepunkt unter 100° C gelöst, über Kieselgel od. dgl. nitriert und vom Lösungsmittel befreit wird,

mit der Maßgabe, daß der Verfahrensschritt gemäß c) auch vor dem Verfahrensschritt gemäß b) durchgeführt werden kann.

Der als Ausgangsmaterial dienende Gesamtlipoidextrakt wird aus tierischen Organen, beispielsweise aus Hirn- und Nervengewebe, Netzhaut, Herzen, Testes, Eigelb od. dgl., durch Extraktion mittels organischer Lösungsmittel, wie z. B. Methanol-Chloroform oder Äthanol-Diäthyläther, gewonnen. Bei Durchführung des dreistufigen Reinigungsverfahrens gemäß der Erfindung ist es wichtig, daß die Lipoproteide des Gesamtlipoidextraktes zunächst in Lipoide und Proteine aufgespalten und die Proteine daraus entfernt werden.

In der ersten Reinigungsstufe a) können als alkoholhaltige Lösungsmittel Gemische aus niedermolekularen Alkoholen und unpolaren oder schwach polaren organischen Lösungsmitteln, deren Siedepunkte 100 C nicht überschreiten, gegebenenfalls mit einem geringen Wassergehalt, verwendet werden. Bei der mehrmaligen Behandlung mit den alkoholhaltigen Lösungsmitteln wird bevorzugt zunächst ein Gemisch aus Methanol, Chloroform und Wasser, dann ein Gemisch aus Äthanol und Benzol und schließlich ein Gemisch aus

ίο Methanol und Chloroform angewendet.

In der zweiten Reinigungsstufe b) können zum Aufnehmen des von den Proteinen und danach durch Eindampfen im Vakuum von dem Lösungsmittel befreiten Extraktes, der außer den Lipoiden noch die wasserlöslichen Begleitstoffe enthält, als polare bzw. schwach polare Lösungsmittel vorteilhaft Essigsäureäthylester, Diäthyläther oder Chloroform bzw. diese enthaltende Gemische verwendet werden. Zum Waschen mit Natriumsalzlösungen werden verschieden konzentrierte, z. B. gesättigte wäßrige Natriumchloridlösungen verwendet. Die so gereinigte Lösung wird vom Wasser befreit und im Vakuum bis zur Lösungsmittelfreiheit eingedampft.

Bei der Hersteilung der Lösung in der dritten Reinigungsstufe c) können als unpolare Lösungsmittel vorteilhaft Pentan, Hexan, Heptan sowie Gemische dieser Kohlenwasserstoffe, einschließlich Petroläther, Anwendung finden.
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Phosphatidgemisch zeichnet sich durch große Reinheit aus und ist daher zur Herstellung von wäßrigen injizierbaren stabilen Dispersionen gut geeignet. Weiterhin bleibt die native Zusammensetzung des Phosphatidgemisches weitgehend erhalten und seine Verwendung für pharmazeutische Präparate ist sehr vorteilhaft.

Die erfindungsgemäß erhaltenen hochgereinigten, organspezifischen Phosphatide eignen sich durch ihre organotrope Wirkung zur Behandlung von Erkran-

Ί° kungen innerer Organe. Beispielsweise können Netzhautphosphatide mit Erfolg bei der Behandlung von Makulopathien, Metamorphopsien und juvenilen Formen von Retinitis pigmentosa eingesetzt werden.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

a) 9,2 g Gesamtlipoidextrakt aus Kälberherzen wurden mit 500 ml einer Mischung von Chloroform, Methanol und Wasser im Verhältnis 16:8:1 versetzt. Die nach Extraktion erhaltene Lösung wurde abgesaugt und im Vakuum bei 40° C eingedampft. Dieser Vorgang wurde mit 500 ml der gleichen Lösungsmittelmischung wiederholt. Nach abermaligem Absaugen und Eindampfen wurde der Rückstand in 50 ml Benzol gelöst und mit 50 ml Äthanol versetzt, abgesaugt und wieder im Vakuum bei 4O⁰C eingedampft. Auch dieser Schritt wurde mit den gleichen Lösungsmittelmengen wiederholt. Der Eindampfrückstand wurde dann 18 h im Vakuumexsikkator über Silikagel getrocknet. Danach wurde mit 500 ml Petroläther (Siedebereich 40 bis 6O⁰C) versetzt und die Luft im Kolben mit N₂ verdrängt. Diese Lösung wurde nun 24 h in der Tiefkühltruhe bei —20°C stehen gelassen.

Anschließend wurde die Lösung bei -2O⁰C 30 min bei 4000 Touren zentrifugiert. Die klare Lösung wurde abgegossen und im Vakuum bei 4O⁰C zur Trockene eingedampft. Der Eindampfrückstand wurde in 50 ml

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Chloroform gelöst und mit dem gleichen Volumen Beispiel 2
Methanol versetzt. Nach listünd'P.cm Stehen in der

Tiefkühltruhe bei -20 C wurde der cebildete flockige 5 g eines aus Schweinenetzhäuten gewonnene GeNiederschlag durch 10 min Zentrifugen bei samtlipoidextraktes wurden, wie im Beispiel 1, nach 3000 Touren abgetrennt. Die klare überstehende Lö- 5 der unter a) beschriebenen Verfahrensweise vorgereisung wurde im Vakuum bei 40 C eingedampft. Aus- nigt. Das so vorgereinigte Produkt wurde dann zuerst beute: 8,8 g. " nach der unter c) und dann nach der unter b) beschrie-

b) Der \on Proteinen und alkoholhaltigem Lösungs- benen Verfahrensweise weitergereinigt. Ausbeute: mittel befreite Extrakt (8.Sg) wurde in 100 ml Äther 2.8 g. Das Produkt war frei von Proteinen, Peptiden. gelöst und dreimal mit je 100 ml gesättigter Kochsalz- io Aminosäuren, Kohlehydraten und phosphorfreien lösung ausgeschüttelt. Anschließend wurde die Äther- Lipoiden. Der Phosphorgehalt betrug 3,67",,.
phase einmal mit 100 ml Wasser ausgeschüttelt. „ _1C1 3

Etwaige Emulsionsbildung wurde durch vorsichtige

Zugabe von wenigen Tropfen Äthanol beseitigt. Die 10 g eines aus Schwcineleber gewonnenen Gesamt-

Ätherphase wurde über Na₂SO₁ getrocknet und bei 15 lipoidextraktes wurden wie im Beispiel 1 nach der dort

40 C im Vakuum eingedampft. Ausbeute: 6,1 g. Das unter a) beschriebenen Verfahrensweise vorgercinigt.

Produkt war frei von Aminosäuren. Peptiden und Danach wurde das vorgercinigle Produkt wie unter hl

Kohlehydraten. beschrieben v\eitergereiniut, wobei statt Äther eine

c) 6 g des vorgereinigten Extraktes wurden in 14 g Mischung aus Methanol und Chloroform \erwendet Hexan gelöst und durch eine mit 12g Kiesclgel der 20 wurde.

Firma Merck. Darmstadt, gefüllte Chromatographicr- Das so gereinigte Produkt wurde dann nach der

säule nitriert. Nachdem die Lösung durch die Säule unter c/ beschriebenen Arbeitsweise von phosphor-

durchgelaufen war. wurde die Säule mit 36 ml Hexan freien Lipoiden befreit, wobei Petroläthcr (Siede-

nachcluicrt. Das gesamte Hexan-Lluat wurde bei bereich 40 bis 60 C) anstelle von Hexan verwende:

40 C im Vakuum eingedampft. Ausbeute: 4.1 g. Das 25 wurde. Die Ausbeute betrug 4.8 g. Das Produkt war

Produkt war frei von Glyceriden. Stcrincn und deren frei von Proteinen. Peptiden, Aminosäuren. Kohle-

I stern, freien fettsäuren und sonstigen phosphor- hydraten und phosphorfreien Lipoiden. Der Pho-.phor-

freien Lipoiden. Der Phosphorgehalt betrug 3.87",,. gehalt betrug 3.68",.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung hochgereinigter Phosphatide tierischen Ursprungs mit weitestgehend gewahrter nativer Zusammensetzung, ausgehend von mit organischen Lösungsmitteln erhaltenen Organextrakten, dadurch gekennzeichnet, daß

IO

a) ein lösungsmiuelfreier Gesamtlipoidextrakt in alkoholhaltigen Lösungsmitteln, z. B. Gemischen von Methanol und Chloroform oder von Äthanol und Benzol, aufgenommen und bei Temperaturen his etwa 40^r C eingedampft wird, wobei die Aufnahme des Extraktes und das Eindampfen mehrmals vorgenommen werden, wonach der getrocknete Extrakt in Pctroläthcr in Gegenwart eines inerten Gases bei Gcfricrbchrankicmpei'iiiureri einige Zeit stehen gelassen und von den ungelösten Proteinen abgetrennt wirJ, danach vorzugsweise die Abtrennung der Proteine durch Eindampfen der Petrolätherlösuiig und Behandeln mittels alkoholhaltiger Lösungsmittel vervollständigt wird, wonach

b) der ν on Proteinen und Lösungsmitteln befreite Extrakt in einem polaren bzw. schwach polaren, im Falle der Phosphatide die Bildung mizcllarer Strukturen verhindernden, mit Wasser nicht oder nur wenig mischbaren Lösungsmitteln aufgenommen und mit neutralen wäßrigen Natriumsalzlösungen in Abwesenheit von Calcium- und Kaliumionen und anschließend mit Wasser gewaschen wird, und

c) der von Lösungsmitteln und Wasser befreite Extrakt in einem unpolaren, im Falle der Phosphatide die Bildung von Mizellen ermöglichenden Lösungsmittel mit Siedepunkt unter 100c gelöst, über Kiesclgel filtriert und vom Lösungsmittel befreit wird,

mit der Maßgabe, daß der Yerfahrensschriu gemäß c) auch vor dem Verfahrensschritt gemäß b) durchgeführt werden kann.

2. Injizierbare wäßrige Dispersionen für pharmazeutische Präparate, gekennzeichnet durch einen Gehalt an nach Anspruch 1 hergestellten Phosphatiden.

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