DE2314516C2

DE2314516C2 - Protease enthaltende Gemische und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2314516C2
Application number: DE2314516A
Authority: DE
Inventors: Sakashi Yamaguchi Ikeda; Kikuo Ito; Kazuyoshi Osaka Katamoto; Yoshio Osaka Nakao; Kiyoshi Kyoto Nara
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1972-03-25
Filing date: 1973-03-23
Publication date: 1983-10-13
Also published as: IT980688B; FR2177938B1; NL178888C; JPS4896784A; FR2177938A1; JPS5423994B2; BE797215A; CA1005770A; US3846240A; NL7304126A; NL178888B; GB1403173A; DE2314516A1

Description

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Alkaliprolcasen werden in Mischung mit Detergentien oder waschaktiven Substanzen verwendet, da sich gezeigt hat, daß die Proteasen unter alkalischen Bedingungen in Gegenwart einer waschaktiven Substanz ein ausgezeich- t,o netes Reinigungsvermögen für proteinhaltige Flecken haben. Für die Zukunft wird mit steigendem Bedarf gerechnet. Verfahren zur Herstellung von Alkaliproteasen sind bereits bekannt und werden beispielsweise in der französischen Patentschrift 2 001 575, in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 7432/1966 und in Agricultural Biological Chemistry, Vol. 31, S. 642-643 (1967), beschrieben.

In dem eingehenden Forschungsbericht der Food and Drug Administration der Vereinigten Staaten wurde die Schlußfolgerung gezogen, daß Detergentien, die Alkaliprotease enthalten, ebenso unbedenklich wie die bisher verwendeten Detergentien gebraucht werden können. Große Vorsicht ist jedoch erforderlich, um Allergiesymptome zu vermeiden, die durch Einatmen von feinem Staub des Enzyms verursacht werden, wenn die hochwirksame Protease während des Verfahrens zur Herstellung des Enzyms oder während seiner Einarbeitung in Detergentien gehandhabt wird.

Es wurde nun gefunden, daß zunächst erfindungsgemäß eine feste Masse von geeigneter Härte erhalten werden kann. Die feste Masse von geeigneter Härte ist jedoch schwierig und unangenehm zu handhaben, wenn sie, was in jedem Fall erforderlich ist, zu kleinen Teilchen zerkleinert wird. Während des Mahlens ist die Bildung zu feinen Teilchen unvermeidlich, wenn auch die Menge sehr gering sein mag, so daß immer noch die Gefahr der Bildung von feinem Staub besteht. Weitere Untersuchungen der Anmelderin mit dem Ziel, dieses Problem zu lösen, führten zu der Feststellung, daß die Bildung des feinen Staubs verhindert werden kann, wenn die pulverförmige Masse in bestimmter Weise weiter mit einem nicht-flüchtigen, bestimmten Netzmittel gemischt wird.

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen 1 und 6 dargelegten Gegenstände. Die Ansprüche 2 bis 5 nennen Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Als Ausgangsmaterialien werden die Fällungen verwendet, die Proteaseaktivitäl aufweisen und durch Entfernung der Mikrobenzellen aus dem Kulturmedium und anschließende Behandlung des erhaltenen flüssigen Teils in an sich bekannter Weise, z. B. durch Ausfällung mit einem Lösungsmittel, Abtrennung durch Konzentrierung und Aussalzen, erhalten worden sind. Bezüglich der Einzelheiten dieser bekannten Verfahren wird auf die vorstehend genannten Veröffentlichungen über die Herstellung von Alkaliproteasen verwiesen. Als nasse Fällungen gelten im Rahmen dieser Beschreibung somit die Materialien, die erhalten werden durch Entfernung der Mikrobenzellen aus dem Kulturmedium, Ausfällung einer Fraktion mit Alkaliproteaseaktivität aus der erhaltenen Lösung unter übersättigten Bedingungen nach beliebigen Methoden, die üblicherweise zur Gewinnung von Enzympulvern angewandt werden, z.B. durch Entfernung des Lösungsmittels oder durch Zusatz eines organischen Lösungsmittels oder eines anorganischen Salzes, und abschließende Abtrennung der Fraktion nach beliebigen Verfahren, die allgemein zur Abtrennung von Feststoffen angewandt werden, z.B. durch Filtration oder Zentrifugieren. Die nassen Fällungen enthalten gewöhnlich etwa 10 bis 500% Wasser, bezogen auf ihr eigenes Trockengewicht.

Für die Zwecke der Erfindung eignen sich hydrophile organische Lösungsmittel, die mit Wasser mischbar sind und die Enzymwirkung nicht beeinträchtigen, z. B. niedere Alkohole (Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol usw.), niedere aliphatischc Ketone (z. B. Aceton und Methyläthylketon), niedere cyclische Äther (Dioxan und Tetrahydrofuran) und Gemische dieser Lösungsmittel. Wenn die nassen Fällungen mit dem hydrophilen organischen Lösungsmittel zusammengeführt werden, hat ein zu hoher Wassergehalt im wäßrigen Lösungsmittel zur Folge, daß die gewünschte Fraktion, die die Alkaliprotease enthält, schleimig wird, wodurch die anschließende Abtrennung der Fraktionen vom Lösungsmittel schwierig wird. Andererseits ist es bei einem zu niedrigen Wassergehalt unmöglich, die richtige Härte der erhalte-

nen festen Masse zu erzielen. Es wird daher das hydrophile organische Lösungsmittel in Kombination mit Wasser in einer Menge von 15 bis 30 Vol.-%, d.h. ein wäßriges hydrophiles organisches Lösungsmittel mit einem Wassergehalt von 15 bis 30 VoI.-% verwendet.

Während des Kontaktes zwischen der nassen Fällung und dem wäßrigen hydrophilen organischen Lösungsmittel tritt das Lösungsmittel an die Stelle des von vornherein in der nassen Fällung enthaltenen Lösungsmittels (nachstehend wird dieses von vornherein in der nassen Fällung enthaltene Lösungsmittel auch als »imprägnierte Mutterlauge« bezeichnet). Der einfachste Weg zu diesem Lösungsmittelaustausch besteht darin, die Fällung im Lösungsmittel zu suspendieren. Dies geschieht zweckmäßig unter leichtem Rühren. !5

Das Verhältnis des zu verwendenden Lösungsmittels zur nassen Fällung sollte so gewählt werden, daß eine genügende Lösungsmittelmenge zum vollständigen Ersatz der imprägnierten Mutterlauge vorhanden ist. Im allgemeinen wird das Lösungsmittel in ungefähr der 3-bis 20fachen Gewichtsmenge der zu behandelnden nassen Fällung verwendet.

Die Abdampfung des Lösungsmittels erfolgt unter Bedingungen, die allgemein zur Trocknung von Enzymen angewandt werden, ohne daß irgendwelche Probleme entstehen, jedoch ist es für die Großherstellung zweckmäßig, das Gemisch zur Abtrennung der suspendierten Fällung (nachstehend wird diese auch als »lösungsmittelsubstituierte nasse Fällung« bezeichnet) zu filtrieren und dann entweder unter vermindertem Druck bei Umgebungstemperatur oder in strömender Luft zu trocknen. Der Lösungsmittelgehalt der getrockneten Masse der Fällung muß unter 10%, zweckmäßig bei 0,5-2,0%, bezogen auf das Gewicht der Trockenmasse liegen, während der Wassergehalt der getrockneten Masse der Fällung unter 10%, bezogen auf das Gewicht der Trockenmasse, zu betragen hat.

Die nächste Stufe besteht aus der Zerkleinerung oder Mahlung der trockenen Masse zu einem Pulver. Zu diesem Zweck wird ein üblicher Zerkleinerer verwendet. Um die Bildung von zu feinem Pulver zu verringern, ist es zweckmäßig, eine Schneidmühle zu verwenden, die das Material hauptsächlich auf Grund ihrer Schneid wirkung zerkleinert. Die zweckmäßige Korngröße des Mahlguts hängt vom vorgesehenen Verwendungszweck ab, liegt jedoch angesichts der Tatsache, daß die Teilchengröße von zu feinen Pulvern, die den Staub bilden, gewöhnlich unter 50 μηι liegt, im allgemeinen im Bereich von etwa 50 bis 1000 μιη. Um den Zweck der Erfindung zu erreichen, ist es zweckmäßig, in dieser Stufe zu gewährleisten, daß der Anteil an Teilchen in diesem erwünschten Größenbereich im Pulver wenigstens 60% beträgt. Dies läßt sich leicht mit Hilfe üblicher Schneidmühlen erreichen.

Das Mahlgut wird anschließend mit einem nichtflüchtigen Netzmittel gemischt. Der Ausdruck »nichtflüchtig« bedeutet hier, daß das Netzmittel bei einer Temperatur von etwa 15° bis 45° C und Normaldruck nicht oder kaum verdunstet. Beliebige nicht-flüchtige Netzmittel dieser Art können verwendet werden, so lange sie die Enzymaktivität nicht beeinträchtigen, und für die Verwendung als Komponente von Waschmitteln sollten sie außerdem die Voraussetzungen für eine Komponente von Waschmitteln erfüllen. Bevorzugt werden im allgemeinen Netzmittel, die unter den Umgebungsbedingungen flüssig oder ölig sind. Geeignet sind beispielsweise Polyäthylenglykol (insbesondere mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 200 bis 600), flüssiges Paraffin, Glycerin, Vaseline und Polyoxyäthylenalkylphenyläther (insbesondere solche mit eine mittleren Molekulargewicht von etwa 450 bis 900). Der Anteil des nichtflüchtigen Netzmittels, bezogen auf das Gewicht des Mahlguts, d.h. des Pulvers, beträgt 0.1 bis 10%, am besten 1 bis 5 %.

Das Verfahren gemäß der Erfindung und die Gewinnung des Ausgangsmaterials werden nachstehend an Hand von Beispielen zur Herstellung des Ausgangsm-üerials, Versuchen und Ausführungsbeispielen näher erläutert. Der Wassergehalt des Lösungsmittels ist darin in Vol.-%, bezogen auf das gesamte wäßrige Lösungsmittel, angegeben. Die Prozentsätze für die Bestandteile der Kulturmedien sind auf Basis von Gewicht/Volumen, d. h. in g/dl genannt. Die übrigen Prozentsätze beziehen sich auf das Gewicht, falls nicht anders angegeben.

Die in der Beschreibung dieser Versuche und in diesen Beispielen angegebenen Aikaliproteaseaktivitälen wurden wie folgt bestimmt: 1,0 ml der zu testenden Enzymlösung und 0,5 ml einer Glycinbutterlösung von pH 10,5 wurden mit 0,5 ml einer Lösung, die 20 ms Hammerstein-Casein enthielt, gemischt. Das Gemisch wurde 20 Minuten bei 37°C stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 3,0 ml einer 5%igen wäßrigen Trichloressigsäurelösung abgebrochen. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 37°C stehen gelassen, wobei das nicht umgesetzte Casein ausgefällt wurde. Die Fällung wurde abfiltriert, wobei die durch die Enzymwirkung im Überstand freigesetzte Tyrosinmenge gemessen wurde. Die Einheit der Enzymaktivitäi wird definiert als die Menge, die 1 7 Tyrosin unte, sauren Bedingungen bildet, und die Aktivität, die 1 mg der Enzymproben zeigt, ist als »Pu/mg« angegeben.

Die Messung der Staubmenge, die ein Maßstab für die Neigung zur Staubentwicklung ist, wurde vorgenommen, indem der von 500 g der jeweiligen Probe entwickelte Staub mit Hilfe eines elektrostatischen Luftprobenehmers gemessen wurde, der von M. H. Hendricks und Mitarbeitern (Journal of American Oil Chemists Society, 47 (1970) 207 ff.) vorgeschlagen wurde.

Beispiel 1

In einem 2000-1-Tank wurden 10001 eines (auf pH 6,0 eingestellten) flüssigen Nährmediums gegeben, das 13 % η-Paraffine (C,₀ bis C₁₃), 7,0 % von Nucleinsäure befreite Hefe (von der Anmelderin hergestellte Nährhefe), 0,05 % Magnesiumsulfat, 0,01 % Calciumchlorid, 0,05 % Eisen(II)-sulfat, 0,8% primäres Kaliuniphosphat, 0,2% sekundäres Kaliumphosphat, 0,5 % Polysorbat 60, 0,5 % Sojabohnenöl und 1,0% Calciumcarbonat (gefällt) enthielt. Das Medium wurde mit Penicillium lilacinum (I FO 5350) geimpft. Das geimpfte Nährmedium wurde unter Zuführung von 12001 Luft/M inute 136 Stunden bei 26° C unter Rühren mit 280 UpM bebrütet. Die durch Zentrifugieren des Kulturmediums erhaltene überstehende Lösung zeigte eine Alkaliproteaseaktivität von 10200Pu/ml.

100 ml des Kulturmediums wurden zentrifugiert, wobei ein Überstand erhalten wurde, der dann auf 5 1 eingeengt wurde. Dem Konzentrat wurde Aceton bis zu einer Acetonkonzentration von 35% zugesetzt, worauf eine Fällung abgeschieden wurde, die abgetrennt wurde. Weiteres Aceton wurde bis zu einer Konzentration von 65 % zugesetzt. Die hierbei gebildete Fällung wurde abfiltriert. Es wurden 2,1 kg nasse Fällung erhalten, die 1,6 kg eines 65% Aceton enthaltenden Gemisches von Aceton und Wasser als Mutterlauge enthielt.

Beispiel 2

Ein Nährmedium der in Beispiel 1 genannten Zusammensetzung wurde mit Fusarium oxysporum (IFO 4471) geimpft. Das Nährmedium wurde in der gleichen Weise bebrütet, wobei ein Kulturmedium erhalten wurde, das eine Alkaliproleaseaktiviläl von 4S00 Pu ml zeigte. 500 ml des Kulturmediums wurden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei 17.5 kg nasse Fällung erhalten wurden, die 12.5 kg eines 65% Aceton enthaltenden Gemisches von Wasser und Action als Mutterlauge enthielt.

Beispiel 3

In 101 wäßrigem Aceton mit einem Wassergehalt von 25% (bei 15°C) wurden 2.1 kg der auf die in Beispiel 1

Tabelle 1

beschriebene Weise erhaltenen Fällung suspendiert Dir Fällung wurde 30 Minuten saciite gerührt, um die imprägnierte Mutterlauge der nassen Fällung gegen das Lösungsmittel auszutauschen, und dann mit einer Filterpresse filtriert. Die erhaltene Fällung, die 1.9 kg wog. wurde auf einer Schale ausgebreitet und bei 4O⁰C unter vermindertem Druck getrocknet. Nach einer Trockenzeit von 16 Stunden wurden 58Og einer trockenen Masse nut einer Proteaseaktivität von 1200 Puma erhalten. Diese Masse wurde in einer Schneidmühle gemahlen, wobei ein Pulver verhalten wurde, das die in Tabelle 1 genannte Teilchengrößenverleihing aufwies.

Zum Vergleich wurde die in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellte nasse Fällung mit wasserfreiem Aceton vollständig dehydratisiert und dann getrocknet und in der gleichen Weise gemahlen. Das erhaltene Pulver, das 610g wog. zeigte eine Proteaseaklivilät von 1100 Pu mti und einen Wassersehalt von 1.38 %.

Teilchen	Hehundlunc mit wäßrigem Aceton	Behandlung	mit wasserfreiem	Aceton
größe	mit 25 % Wussergehalt
in μ	vor dem Mühlen nach dem Mahlen	vor dem M;	ihlen nach dem	Mahlen

über500	98%	14%	92%	0%,
500-300	1%	35 %	3%	0%,
300 100	1%	31 %	2%	8%,
100 50	0%	10%	1%	9%,
unter 50	0%,	10%,	2%	83 %

Wie die Werte in Tabelle 1 deutlich zeigen, zeigt die mit Aceton mit einem Wassergehalt von 25% behandelte Probe während des Mahlens eine geringere Staubbildung auf Grund der Erstarrung zum Kuchen während des Trocknens. Der durch vollständige Dehydratisierung mit wasserfreiem Aceton und anschließende Trocknung erhaltene Kuchen sah wie ein großer Klumpen aus, war jedoch sehr brüchig und bildete während des Mahlens eine große Staubmenge.

Beispiel 4

Die auf die in Beispiel 3 durch Behandlung mit Aceton mit einem Wassergehalt von 25 % und durch Behandlung

Tabelle 2

mit wasserfreiem Aceton erhaltenen Pulver wurden getrennt mit wasserfreiem Natriumsulfat einer Teilchengrößenverteilung zwischen 50 und 500 μηι in einer solchen Menge verdünnt, daß die Enzymaktivität 1000 Pu, mg betrug. Je 500g des Gemisches wurden in eine Lackiertrommel gegeben. Eine bestimmte Menge an Polyäthylenglykol (mittleres Molekulargewicht 400) oder tlüssigem Paraffin wurde gleichmäßig mit einer Spritzpistole über das Pulver gesprüht, wobei die pulverförmigen Alkaliprotease enthaltenden Sioffgemische erhalten wurden, deren Staubentwicklung gemessen wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 2 genannt.

	1% 7% 3% 10%	Staubmenge bei mit wäßrigem Aceton mit 25 % Wasser gehalt behandelten Proben	Slaubmenge bei mit wasserfreiem Aceton behandelten Proben
Polyäthylenglykol (aufgesprühte Menge)	1% 2% 3% 10%	0.10 mg 0 0 0	40 mg 6.5 mg 3,8 mg 0,5 mg
Flüssiges Paraffin (aufgesprühte Menge)	0.15 mg 0.05 mg 0 0	58 mg 18 m« 6,3 mg 0.7 mc

Wie die Werte in Tabelle 2 deutlich zeigen, wurde bei 05 pcm Paraffin vollständig unterdrückt, während bei den

den durch Behandlung mit Aceton mit 25% Wasserge- durch Dehydratisierung mit wasserfreiem Aceton erhul-

halt erhaltenen getrockneten Proben die Staubbildung tenen getrockneten Proben die Staubbildung selbst bei

durch Aufsprühen von 3 % Polyäthylenglykol oder flüssi- Aufsprühen von 10% der oben genannten Netzmittel

nicht unterdrückt wurde. Zwar konnte die Staubbildung durch Aufsprühen einer viel größeren Menge unterdrückt werden, jedoch erwies sich das erhaltene Produkt als klebrig und schleimig, d.h. es hatte nicht mehr die Beschaffenheil eines Pulvers.

Beispiel 5

500 I des auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise erhaltenen Kulturmediums wurden zentrifugiert. Der Überstand wurde auf 25 1 eingeengt. Zum Konzentrat wurde Aceton bis zu einer Acetonkonzenlration von 35 Vol.-% gegeben. Die hierbei gebildete Fallung wurde abgetrennt. Zur Lösung wurde weiteres Aceton bis zu einer Acetonkonzentration \on 65 YoI.-% gegeben. Die hierbei gebildete Fällung wurde abllliriert. Fs wurden 10.5 kg Fällung, die Alkaliprotease enthielt, erhalten. Die Fällung wurde in 3001 Wasser gelost. Zur Losung wurden 80kg eines pulverlörmigen Metruicr\lsäure-Divin\lbenzol-C'opolvmerisats (H'-T\p) (im Handel beispielsweise unter der Handelsbezeichnung »Amberlite CG-SO«) gegeben, wobei die Protease am Harz adsorbier! wurde. Nach Filtration wurde das Harz nut 25001 Wasser gewaschen und dann mit 3501 einer 10 ""!.igen wäßrigen Natriumacetatlösung eluierl. wobei 3501 Fluat erhalten wurden. Das Eluat wurde mit 210kg Ammoniumsulfat ausgesalzt, wobei 2.(S kg Fällung erhalten wurden. Die Fällung wurde erneut in 101 Wasser gelöst. Die Lösung wurde durch eine Säule geleitet, die 1001 Perlen des lonenaustauscherharzes »Sephadex G-25« (mil F.pichlorhvdrin überbrücktes Dextran) enthielt, um die darin enthaltenen Mineralsalze abzutrennen. Der entsalzte Ablauf wurde anschließend durch eine Säule von 501 perllörmigem earboxymelhylieriem Dextran (»CM-Sephadex (.'-50«) geleilet, wobei die Protease am Harz adsorbiert wurde. Die adsorbierte Protease wurde mit 401 einer 0.15-molaren Natriumchloridlösung in 0.02-molarer Acelatpufferlösung vom pH 5.0eluierl. De: Ablauf wurde mit 24 kg Ammoniumsulfal ausgesalzt, wobei 2.1 kg nasse Fällung erhalten wurde, die 0.X kg to 55 "»ige wäßrige Ammoniumsulfatlösung als imprägnierte Mutterlauge enthielt, jedoch eine sehr hohe Reinheil hatte und im wesentlichen aus Alkaliprolease bestand. Die Füllung wurde in 251 wäßrigem Methanol mit einem Wassergehalt von 30% suspendiert. Die Suspension wurde 30 Minuten leicht gerührt und zur Abtrennung der nassen Fällung vom überstand zentrifugiert. Die nasse Fällung, die 1,N kg wog. wurde auf einer Schale ausgebreitet und unter vermindertem Druck bei 50⁰C getrocknet. Nach einer Trockenzeit von 12 Stunden hatten die erhaltenen Kuchen, die 600g wogen, eine Proteaseaktivität von 4000 Pu/mg und einen Wassergehalt von 1,30%. Die Kuchen wurden in der Schneidmühle gemahlen. Das Pulver, das 11,3% Teilchen unter 50μιη und X8.7% Teilchen zwischen 50 und 500 μΐη enthielt, wurde zur Herstellung der Produkte mit den in Tabelle 3 genannten Netzmitteln gemischt. In der Tabelle sind ferner die gemessenen Staubmengen genannt.

Zum Vergleich wurde auch die Staubmenge von Proben gemessen, die in der gleichen Weise, jedoch unter Verwendung von wasserfreiem Methanol an Stelle von wäßrigem Methanol hergestellt wurden.

Tabelle 3

	1%	Staubmenge von mit	Staubmenge von mit
	2%	wäßrigem Methanol	wasserfreiem Methanol
	3%	mit 30% Wasser	behandelten Proben
	1%	behandelten Proben
Polyäthylenglykol. mittleres	2%	0,2 mg	350 mg
Molekulargewicht 400	3%	0,18mg	10mg
(aufgesprühte Menge)	0	7 mg
Flüssiges Paraffin	0,15mg	320 mg
(aufgesprühte Menge)	0,10mg	12 mg
	0	5 mg

Beispiel 6

Etwa 20.5 kg der auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise erhaltenen nassen Fällung wurde in zwei gleiche Teile geteilt. Eine Hälfte von 10.25 kg wurde in 251 wäßrigem Dioxan mit einem Wassergehalt von 25% suspendiert, um das Lösungsmittel auszutauschen, und dann abgetrennt, wöbe; 10.1 kg lösungsmittel-substituierte nasse Fällung erhalten w urde. Diese Fällung wurde unter -vermindertem Druck bei 45"C getrocknet, wobei 3.7kg trockener Kuchen erhalten wurde. Der Kuchen wurde auf die in Beispiel 5 beschriebene Weise gemahlen. Das Pulver wurde mit Polyäthylenglykol (mittleres Molekulargewicht 400 bzw. 600·) oder flüssigem Paraffin oder Polyoxyäthyiennonvlpheny läther (durchschnittliche Zahl der wiederkehrenden Polyoxyäthyleneinheiten in) 8 und 10) in einer Menge von je 3%. bezogen auf das Gewicht des Pulvers, gemischt, wobei pulverförmige Alkaliprotease enthaltende Stoffgemische erhalten wurden. Die andere Hälfte von 10,25 kg wurde zum Austausch des Lösungsmittels in 25 1 wäßrigem Äthanol mit einem Wassergehalt von 15 % suspendiert, worauf die lösungsmitiel-substituierte nasse Fällung, die 9,9 kg wog, abgetrennt wurde. Die Fällung wurde unter vermindertem Druck bei 45° C getrocknet, wobei 3,6 kg trockener Kuchen erhalten wurde, der eine Alkaliproteaseaktivität von 1190 Pu/mg und einen Wassergehalt von 1,48 % hatte. Der Kuchen wurde auf die in Beispiel 5 beschriebene Weise gemahlen. Das Pulver wurde mit verschiedenen Netzmitteln in einer Menge von jeweils 3 %, bezogen auf das Gewicht des Pulvers, gemischt, um die Alkaliprotease enthaltenden Stoff gemische herzustellen. Die an die¹-sen Stoffgemischen gemessenen Staubmengen sind nachstehend in Tabelle 4 genannt.

ίο

Tabelle 4

	3%	Behandlung mil	Behandlung mil
		wäßrigem Dioxan	wäßrigem Äthanol
	3%	mil 25%	mit 15%
	3%	Wassergehalt	Wassergehall
Polyäthylenglykol
(Molekulargewicht 400)	3%	unter 0,2 mg	0
Polyäthylenglykol
(Molekulargewicht 600)	3%	unter 0,2 mg	0
Flüssiges Paraffin	0	0
Polyoxyäthylennonvlpheny lather
(H = 8)	0	0
Polyoxyäthylennonylphenyläther
(H=IO)	0	0

Beispiel 7

17,5 kg der gemäß Beispiel 2 hergestellten nassen Fällung wurden in 1001 wäßrigem Aceton mit 25 % Wassergehalt suspendiert. Die Suspension wurde 30 Minuten leicht gerührt. Die nasse Fällung wurde mit dem Lösungsmittel gewaschen, um den Lösungsmittelaustausch zu vollenden, und dann mit einer Filterpresse filtriert, wobei 14,0 kg lösungsmittel-substituierte Naßfällung erhalten wurde. Die Fällung wurde unter vermindertem Druck bei 55°C getrocknet, wobei 4 kg trockener Kuchen mit einer Alkaliproteaseaktivität von 480 Pu/mg und einem Wassergehall von 1,53% erhalten wurden. Der Kuchen wurde in einer Schneidmühle zu einem PuI-

Tabelle 5

ver gemahlen (12% Teilchen unter 50 μm, 88 % Teilchen zwischen 50 und 500 μιη). Das Pulver wurde mit PoIyäthylenglykol (Molekulargewicht 400) bzw. nüssigem Paraffin bzw. Polyoxyäthylennonyläther(/i= 10) in einer Menge von je 1 %, 2% bzw. 3%, bezogen auf das Pulver, gemischt, wobei die pulverförmigen Alkaliprotease enthaltenden Stoffgemische erhalten wurden.

Zum Vergleich wurden Proben in der gleichen Weise hergestellt, wobei jedoch wasserfreies Aceton zur vollständigen Dehydratisierung an Stelle von wäßrigem Aceton verwendet wurde.

Die Ergebnisse der Messungen der Staubmengen der verschiedenen Produkte sind nachstehend in Tabelle 5 genannt.

Staubmenge nach	Staubmenge nach
Behandlung mit	Dehydratisierung mil
Aceton mit 25%	wasserfreiem Aceton
Wassergehalt

Polyäthylenglykol

Flüssiges Paraffin

Polyoxyäthylennonylphenyläther

1% 2% 3%	0,15 mg 0 0	430 mg 12 mg 8 mg
1% 2% 3%	0,25 mg 0,10mg 0	380 mg 15mg 10mg
1% 2% 3%	0,20 mg 0,10 mg 0	530 mg 23 mg 9 mg

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von staubfreien, pulverformigen SlofTgemischen. die eine Protease enthallen, aus Protease einhaltenden nassen Fällungen, die durch Zusatz eines Lösungsmittels aus dem durch Entfernung der Mikrobenzellen aus dem Kulturmedium erhaltenen flüssigen Teil hergestellt worden sind, dadurch gekennzeichnet,daß man die nasse Fällung mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel mit einem Wassergehalt von 15 bis 30% zusammenführt, die erhaltene lösungsmittel-substituierte nasse Fällung auf einen Lösungsmittelgehalt in der Gesamtfällung unter 10% trocknet, wobei der Wassergehalt der getrockneten Masse der Fällung unter 10%. bezogen auf das Gewicht der Trockenmasse, zu betragen hat, die getrocknete Masse der Fällung zu einem Pulver mahlt und das Pulver mit einem bei einer Temperatur von 15 bis 45° C und Normaldruck nicht oder kaum verdunstenden Netzmittel in einer Menge von 0,1 bis 10%, bezogen auf das Gewicht des Pulvers, mischt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel in einer solchen Menge eingesetzt wird, daß die zu mahlende trockene Masse 0,5 bis 2.0% Lösungsmittel enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als hydrophile organische Lösungsmittel Methanol, Äthanol, Propanol, Isopro- jo panol. Aceton, Methylethylketon, Dioxan. Tetrahydrofuran oder Gemische dieser Lösungsmittel eingesetzt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die getrocknete Masse der Fällung so gemahlen wird, daß der Anteil an Teilchen einer Größe zwischen 50 und ΙΟΟΟμίη im Pulver wenigstens 60 % beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Netzmittel ein Polyäthylenkol mit einem mittleren Molekulargewicht von 400 bis 600 eingesetzt wird.

6. Staubfreie, pulverförinige Stoffgemische, erhältlich mit den Maßnahmen eines der Ansprüche 1 bis 5.

7. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6. dadurch gekennzeichnet, daß als Netzmittel ein Polyäthylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 400 bis 600 verwendet wird.

8. Staubfreie pulverförinige Stoffgemische, d.g., da.3 sie nach den Verfahren nach den Ansprüchen 1-7 erhalten worden sind.