DE2312824A1

DE2312824A1 - Wasserloesliche, kovalent an polymere traeger gebundene penicillinacylase, verfahren zu ihrer herstellung, sowie ihre verwendung zur herstellung von 6-aminopenicillansaeure

Info

Publication number: DE2312824A1
Application number: DE2312824A
Authority: DE
Inventors: Fritz Dr Hueper
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1973-03-15
Filing date: 1973-03-15
Publication date: 1974-09-19
Also published as: DK145086B; FI53458B; PL91015B1; IL44405A0; BR7402021D0; FI53458C; CH611915A5; DK145086C; FR2221462B1; DD117229A5; IT1055552B; FR2221462A1; ATA209874A; AR203743A1; ZA741692B; GB1405738A; JPS49125587A; LU69630A1; IE39059B1; ES424260A1

Description

Bayer Aktiengesellschaft

Zentralbereich Patente, Marken und Lizenzen

c 4 /τ, 509 Leverkusen. Bayerwerk

1 4. MRZ. 1973

Wasserlösliche, kovalent an polymere Träger gebundene Penicillinacylase, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure

Die vorliegende Erfindung betrifft neue wasserlösliche, kovalent an polymere Träger gebundene Penicillinacylase (E. C. 3.5.1.11), Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure (6APS).

Es ist bereits bekannt geworden, daß Penicillinacylase in großtechnisch durchgeführten Prozessen zur Herstellung von 6-APS verwendet wird, welche ein Zwischenprodukt für die Herstellung der therapeutisch wertvollen halbsynthetischen Penicilline ist.

Gemäß dem Verfahren der Deutschen Patentschrift 1 111 778 zur Herstellung von 6-APS wird eine Lösung von Benzylpenicillin mit Bakterienschlamm versetzt, der das Enzym Penicillinacylase enthält. Durch die katalytische Wirkung des Enzyms wird die seitenständige Carbonamidgruppierung des Penicillins abgespalten, ohne daß der ß-Lactamring geöffnet wird.

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Dieses Verfahren hat jedoch große Nachteile. So enthält die nach diesem Verfahren hergestellte 6-APS viele Fremdstoffe, die u. a. aus dem Nährmedium, der Fermentationsbrühe und aus den Bakterien stammen. Außerdem ist die enzymatische Aktivität der Bakteriensuspension nach einmaligem Einsatz praktisch verbraucht, so daß eine Wiederverwendung nicht möglich ist.

Um diese Nachteile zu vermeiden,hat man anstelle einer Suspension von Bakterien wasserunlösliche Penicillinacylasen verwendet.

Es sind bereits verschiedene Methoden bekannt geworden, nach denen wasserunlösliche Enzyme hergestellt werden können:

1. Durch kovalente Bindung an wasserunlösliche Träger

/~ G. J. H. Melrose, Rev. Pure and Appl. Chem. 2jJ_, 83 (1971 J^?

2. Durch Einschluß in das Netzwerk eines porösen Gels

/~K. Mosbach, R. Mosbach, Acta Chem. Scand. 1966, 2£, 28o7_7.

3. Durch Mikroverkapselung

/"T.M.S. Chang, Nature 2£9, 117 (1971 )_7.

4. Durch Einschluß von Enzymen in ein Fasergefüge /"Deutsche Offenlegungsschrift 1 932 426__7.

Solche wasserunlöslichen Enzyme können als heterogene Katalysatoren nach jeder Umsetzung abgetrennt und wiederverwendet werden. Andererseits weisen sie jedoch mehrere Nachteile auf:

In den Deutschen Offenlegungsschriften 1 917 o57 und 1 9o7 beschriebene Verfahren zur Herstellung von 6-APS mit kovalent an Träger gebundener Penicillinacyläse können nämlich nicht in einen technischen Maßstab übergeführt werden. Die Gründe

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dafür liegen einmal bei den mechanischen Eigenschaften des verwendeten Trägermaterials, das zu hohem Abrieb führt, zum anderen können bei mäßigen Verfahrensausbeuten nur geringe spezifische Aktivitäten an trägergebundener Penicillinacylase erreicht werden.

Auch das nach der Deutschen Offenlegungsschrift 2 143 o62 verwendete unlösliche Eaizym hat für die technische Verwendung Nachteile. Be verwendet Penicillinacylase, die an feste, wasserunlösliche, adsorbierende Stoffe,wie z. B. Nylon, mittels eines wasserlöslichen Dialdehyds gebunden ist. Dabei kann jedoch außer einer Vernetzung der Enzymmoleküle untereinander auch eine kovalente Vernetzung mit dem Träger eintreten, wenn dieser aktive Gruppen enthält, die mit dem Dialdehyd reagieren können. Derartig hergestellte unlösliche Penicillinacylase kann infolge von Hydrolyse lösliches Protein abspalten. Die so hergestellte unlösliche Penicillinacylase kann daher nur begrenzt wiederverwendet werden.

Bei den bekannten Verfahren zum Einschluß von Enzymen in poröse Polymere arbeitet man unter Bedingungen, bei denen Enzyme leicht denaturiert werden. Bei der Herstellung derartiger unlöslicher Enzyme müssen demnach große Ausbeuteverluste hingenommen werden. Darüber hinaus kann freies Enzym durch die Poren in das Reaktionsmedium diffundieren. Dadurch verschlechtert sich laufend die katalytische Aktivität des unlöslichen Enzyms.

Nach dem Verfahren der Deutschen Offenlegungsschrift 1 932 werden Enzyme in ein leicht herstellbares Pasergefüge eingearbeitet. Das Enzym wird in voneinander getrennten Hohlräumen eingeschlossen, wodurch das Herausdiffundieren des Enzyms verhindert wird. Als großer Nachteil dieses Verfahrens muß jedoch angesehen werden, daß nach dem Einarbeiten des Enzyme

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in die Faser ein großer Teil der ursprünglichen vorhandenen Enzymaktivität verloren gegangen ist. lerner massen die Porengrößen der Fasern so klein gewählt werden, daß kein Enzym herausdiffundieren kann. Bei kleinen Porengrößen wird aber die Diffusion des Substrates durch das Fasergefüge zum Enzym und die Rediffusion der Reaktionsprodukte zum Reaktionsmedium stark eingeschränkt. La3 eingeschlossene Enzym wird also nicht optimal ausgenutzt. Außerdem liegt das eingeschlossene Enzym in ungebundener Form vor. Es ist nun aber bekannt geworden, daß freie Enzyme schneller denaturiert werden als kovalent an Träger gebundene £~H. D. Orth, W. Brummer, Angewandte Chemie, 84, S. 319-368 (1972)_7. Demnach sind in Polymeren eingeschlossene Enzyme gegenüber den kovalent an Träger gebundenen benachteiligt.

Es ist weiterhin bereits bekannt geworden, daß man Enzyme an wasserlösliche Träger binden kann. So werden gemäß US-Patentschrift 3 625 827 Enzyme an ein wasserlösliches Polymeres von Äthylen und Maleinsäureanhydrid gekuppelt. Dieses Verfahren ist aber nicht dazu geeignet, hochmolekulare Enzym-Derivate herzustellen, da der verwendete Träger mit zunehmendem Molekulargewicht unlöslich wird. Außerdem kann das Enzym auch mehrfach mit verschiedenen Trägermolekülen reagieren. Hierdurch treten Quervernetzungen ein, wodurch das Enzymderivat unlöslich wird.

Es wurde nun gefunden, daß die neue wasserlösliche, kovalent an polymere Träger gebundene Penicillinacylase diese Nachteile nicht aufweist und daher hervorragend für die Herstellung von 6-APS geeignet ist.

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Es wurde weiterhin gefunden, daß man wasserunlösliche Penicillinacylase erhält, wenn man Penicillinacylase !covalent an einen wasserlöslichen, polymeren Träger bindet und das dabei entstehende Enzym-Derivat entweder verkapselt oder in Polymere einschließt. Das hochmolekulare Enzymderivat kann nun nicht mehr als dem porösen Träger diffundieren.

Überraschenderweise kann die erfindungsgemäße wasserlösliche, kovalent an poröse Träger gebundene Penicillinacylase in nahezu quantitativer Ausbeute gewonnen werden, was aufgrund der enzymatisehen Aktivitäten von Ausgangs- und Endprodukten ermittelt wurde.

Gegenüber dem ungebundenen Enzym besitzen die erfindungsgemäßen Produkte den großen Vorteil der größeren Stabilität, auch bei höheren Penicillin-Konzentrationen. Sie stellen somit ein fortschrittliches Mittel für die Herstellung von 6-APS dar.

Verwendet man als wasserlösliche, polymere Träger Polysaccharide, die zuvor mit einem Halogencyanid umgesetzt wurden /"vgl. Deutsche Offenlegungeschrift 1 768 512_7» so kann der Reaktionsablauf durch das folgende Formelschema wiedergegeben werden:

-OH BrCN -OH

_v

C=NH

HgN-Protein

-0 C-NH-:

-OH

η χ

■Protein

wobei X eine NH-Gruppe oder Sauerstoff sein kann. Die erfindungsgemäß verwendbaren Polysaccharide sind bekannt. Als Beispiele seien genannt: Dextran, Stärke, Laevan sowie Carboxymethylcellulose.

Als Verdünnungs- bzw. Lösungsmittel wird Wasser verwendet. Le A 14 92o - 5 -

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Als Halogencyan kommen Jod-, Chlor- und Bromcyan in Frage.

Die Reaktionstemperatüren liegen zwischen 0 und 5o°C, die Umsetzung kann bei Normaldruck, aber auch bei erhöhtem Druck durchgeführt werden.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens hält man das Reaktionamedium durch Zugabe von beispielsweise Natronlauge im Bereich von pH 8 - 13, vorzugsweise bei pH 11,o. Die Um setzung des Halogencyans mit dem Polysaccharid ist nach 1o - 2o Minuten beendet. Die Lösung darf kein freies Halogen- cyan mehr enthalten, wenn in der nächsten Stufe das Polymer- Derivat mit Penicillinacylase umgesetzt wird. Die Umsetzung muß so bald wie möglich erfolgen, da das reaktionsfähige Derivat des Polymeren leicht infolge von Hydrolyse inaktiviert wird. Vor der Umsetzung mit Penicillinacylase wird der pH- Wert der Lösung mit dem Polymer-Derivat auf 8,5 gestellt. Nach Zugabe der Penicillinacylase rührt man bei 0 - 5o°C, vorzugsweise 5 - 1o°C. Der Gehalt an nicht umgesetztem Enzym läßt sich bestimmen, wenn man Dextran mit einem Molekular gewicht von 500.000 verwendet. Das hochmolekulare Enzym-Derivat kann beispielsweise durch Ultrafiltration vom nativen Enzym mit Membranen abgetrennt werden,, die für Moleküle mit einem Molekulargewicht von mehr als I00.000 undurchlässig sind.

Das Verhältnis von Polysaccharid, Ha^ogencyan und Penicillinacylase kann in weiten Grenzen variiert werden. Mit Sicherheit wird eine vollständige Umsetzung des Enzyms erzielt, wenn pro Gewichtsteil Enzymprotein mindestens 5 Gewichtsteile PoI^- saccharld verwendet werden.

Ee hat sich außerdem gezeigt, daß das Mengenverhältnis von Halogencyan und Poly saccharid die Haltbarkeit des Enzym-Derivates außerordentlich beeinflußt. So wird die native Penicillinacylase in wässriger Lösung bei pH 7,8 und 45°C inner-

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halb von 24 Stunden bis zu 95 Ί» !«aktiviert (siehe Fig. 1, Kurve a). Unter gleichen Bedingungen verliert trägergebundene, wasserlösliche Penicillinacylase, die beispielsweise an Dextran vom Molekulargewicht 5oo.ooo gekuppelt wurde, in 24 Stunden nur 47 i» an Aktivität, wenn pro Gramm Dextran 17 mg Bromcyan eingesetzt werden (siehe Fig. 1, Kurve b). Werden aber pro Gramm Dextran 8o mg Bromcyan verwendet, so vermindert sich die Enzymaktivität in 24 Stunden nur um 5 ^ (siehe Fig. 1, Kurve c). Dabei überrascht es, daß bei gleicher Kupplungsausbeute durch Erhöhung des Halogencyan-Anteils die Stabilität der wasserlöslichen, trägergebundenen Penicillinacylase außerordentlich gesteigert werden kann. Möglicherweise entstehen durch Erhöhung der Menge an Halogencyan zwischen Trägermolekttl und Enzymmolekiil mehr k oval ent e Bindungen. Dadurch könnte die Tertiärstruktur des Enzyms um so mehr stabilisiert werden, wie kovalente Bindungen zwischen Träger und Enzym entstanden sind. Der Einsatz an Halogeneyan ist aber begrenzt, da infolge von Quervernetzungen schwerlösliche und/ oder unlösliche Enzymderivate entstehen können. So ist es nicht empfehlenswert, bei Verwendung von Dextran mit einem Molekulargewicht von ungefähr 5oo.ooo pro Gramm mehr als 15o mg Bromcyan einzusetzen.

Wird aber Dextran mit einem kleineren Molekulargewicht, z. B. von 2O.OOO verwendet, so kann man ohne weiteres pro Gram Dextran mehr als 3oo mg Bromcyan reagieren lassen. Jedoch wird bei Verwendung von Trägern mit kleineren Molekulargewichten die Stabilität des Enzyms vermindert. In Fig. 2 ist der zeitliche Verlauf der Restaktivitäten von Penicillinacylase-Dextranderivaten nach Vorinkubation bei 45⁰C und pH 7.8 angegeben.

Es bedeuten: Kurve a: Ungebundene Penicillinacylase.

Kurve b: Kovalent an Dextran mit einem ungefähren Molekulargewicht von 2o.ooo gebundene Penicillinacylase (8o mg Bromcyan pro Gramm Dextran).

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Kurve c: Wie b, aber 16ο mg Bromcyan pro Gramm Dextran.

Kurve d: Kovalent an Dextran mit einem ungefähren Molekulargewicht von 60.000 gebundene Peniclllinacylase (80 mg Bromcyan pro Gramm Dextran).

Pro Gramm Dextran wurden bei Versuch b) und d) 80 mg Bromcyan verwendet. Durch die doppelte Menge an Bromcyan wie bei Versuch d) konnte die Stabilität des Enzym-Derivates deutlich verbessert werden (Kurve c).

Mit Stärke als wasserlöslichen Träger lassen sich außerordentlich stabile Derivate der Penicillinacylase herstellen. Die Stabilität des Enzymderivates ist ebenfalls von dem Einsatz an Halogencyan abhängig. Vorzugsweise läßt man pro Gramm Stärke mindestens 15o mg Bromcyan reagieren. Die deutliche Stabilisierung der erfindungsgemäß kovalent an Stärke gebundenen Penicillinacylate veranschaulicht Fig. 3. In den Kurven sind die Restaktivitäten nach Vorinkubation bei 45°C und pH 7.8 angegeben.

Es bedeuten:

Kurve a: Ungebundene Penicillinacylase.

Kurve b: An Stärke gebundene Penicillinacylase (80 mg Bromcyan pro Gramm Stärke).

Kurve c) An Stärke gebundene Penicillinacylaee (I60 mg Bromcyan pro Gramm Stärke).

Die so hergestellten Enzym-Derivate werden erfindungsgemäß verkapselt oder in Polymere eingeschlossen. Besonders vorteilhaft ist es, sie in Fasern zu verspinnen /"vgl. Deutsche Offenlegungsschrift 1 932 426_7 oder einzupolymerisieren. So konnte beispielsweise die an Dextran vom Molekulargewicht 500.000 gebundene Penicillinacylase in Ausbeuten von 60 56 der ursprünglichen Enzymaktivität nach literaturbekannten Verfahren

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/~H. Nilsson, R. Mosbach, E. Hosbach_t Bi ο chin». Biophys. Acta 268 (1972), 253 - 256_7 elnpolymerisiert werden. Im Kontrollversuch mit nativer Penicillinacylase wurden nach Einpolymeris i er en unter gleichen Versuchsbedingungen nur 1o j£ der ursprünglich vorhandenen Enzymaktivität erhalten. Sas einpolymerisierte trägergebundene Enzym erwies sich auch nach wiederholten Einsätzen zur Herstellung von 6-APS als außerordentlich stabil. Sas einpolymerisierte Enzymderivat erlaubt eine schnelle und einfache Abtrennung aus dem Reaktionsmedium, da das Polymerisat in Korngrößen von mehr als 1 mm im Surchmesser hergestellt werden kann. Sie neuen Stoffe weisen eine starke enzymatische Wirkung auf, durch die sie in hohem Maße für die Herstellung von 6-APS geeignet sind. Üblicherweise wird die enzymatische Spaltung von Penicillinen zur Herstellung von 6-APS in verdünnten Lösungen durchgeführt, um nicht das Enzym zu inaktivieren. Vor der Isolierung der 6-APS muß ca. 8o % Wasser verdampft werden. Sa die erfindungsgemäße trägergebundene Penicillinacylase auch Spaltungen bei höheren Konzentrationen ermöglicht, muß entsprechend dem Mehreinsatz an Penicillin weniger Wasser verdampft werden. Sie Herstellung von 6-APS mit der erfindungsgemäßen Penicillinacylaee ist daher wirtschaftlicher.

Sie erfindungsgemäßen Penicillinacylase-Präparate lassen sich nach der enzymatisch en Spaltung ohne weiteres durch Ultrafiltration von den Reaktionsprodukten Penicillin G, Phenylessigsäure und 6-APS abtrennen. Besonders geeignet sind hierfür handelsübliche Membranfilter, die für Moleküle mit Molekulargewichten von mehr als I00.000 undurchlässig sind. Sas auf diese Weise abfiltrierte Enzym-Berivat kann wiederholt zur enzymatischen Spaltung eingesetzt werden. Sie bei der

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enzy statischen Spaltung gebildete 6-APS wird nach Abtrennung des Penieillinacylase-Derivates aus der Reaktionslösung nach bekannten Verfahren gewonnen /~ siehe z. B. Deutsche Patentschrift 1 111 778J und bei pH 4,3 kristallisiert.

Bei der enzymatisehen Spaltung von Penicillin mit der erfindungsgemäß hergestellten trägergebundenen wasserlöslichen Penicillinacylase werden wesentlich höhere Ausbeuten an 6-APS erhalten als bei Verwendung von E.coli-Schlamm. So wurde 6-APS in Ausbeuten von ca. 85 - 9o $> isoliert, unabhängig davon, ob das wasserlösliche Derivat der Penicillinacylase in einem Polymeren eingeschlossen vorlag oder nicht.

Das erfindungsgemäße Penicillinacylase-Derivat gestattet aufgrund seiner außerordentlich hohen Stabilität über einen langen Zeitraum einen vielfachen Einsatz. Auch hiernach ist die Enzymaktivität noch praktisch vollständig erhalten. Für die wirtschaftliche Verwendung der wasserlöslichen trägergebundenen Penicillinacylase ist die Stabilität nach mehrfacher Wiederverwendung von großer Bedeutung.

Die in den nachfolgenden Beispielen angegebenen Enzymaktivitäten (E) sind definiert als die Aktivität, die 1 /uMol Penicillin 6 pro Minute bei 37⁰C zu 6-AP3 und Phenylessigsäure hydrolysiert.

Beispiel 1

a) 5 g Dextran 5oo mit einem ungefähren Molekulargewicht von 5OO.OOO werden in 165 ml Wasser gelöst und mit 2 ϊ Natronlauge auf pH 11.0 eingestellt. Bei einer Temperatur von 2o°C gibt man unter Rühren 85 mg Bromcyan zu und hält den pH-Wert der Lösung mit 2 N NaOH bei 11,o. 1o Minuten nach Zufügen des Bromcyans wird die Lösung mit 2 N Salzsäure

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auf pH 8,3 gestellt und mit 17o ml einer wässrigen Lösung von 55o mg Penicillinacylase (enzymatische Aktivität 7,3 E/mg) vermischt. Die Lösung wird 16 Stunden im Kühlraum bei 4⁰C gerührt. Nach Ultrafiltration kann im PiItrat keine Enzymaktivität nachgewiesen werden. Sie Kupplung mit dem Träger verläuft demnach vollständig. Die Ausbeute an enzymatischer Aktivität beträgt 98 #, bezogen auf die Ausgangsaktivität. Nach Gefriertrocknung bleibt die Enzymaktivität vollständig erhalten.

Eine Lösung der Dextran 5oo-gebundenen Penicillinacylase wurde zur Stabilitätspriifung bei 45°C und pH 7,8 eingelagert. Die nach verschiedenen Zeiten bestimmten Restaktivitäten sind in Fig. 1, Kurve b, angegeben. Kurve a wurde entsprechend mit nativer Penicillinacylase erhalten.

b) 5 g Dextran 5oo mit einem ungefähren Molekulargewicht von 5OO.OOO werden in 165 ml Wasser gelöst und mit 2 N Batronlauge auf pH 11,ο eingestellt. Bei einer Temperatur von 2o°C gibt man unter Rührung 4oo mg Bromcyan zu und hält den pH-Wert der Lösung mit 2 H Natronlauge bei 11,o. 2ο Minuten nach Zufügen des Bromcyans wird die Lösung mit 2 N Salzsäure auf pH 8,5 gestellt und mit 17o ml einer wässrigen Lösung von 55o mg Penicillinacylase (enzymatische Aktivität 7,3 E/mg) vermischt. Die Lösung wird 16 Stunden im Kühlraum bei 4°C gerührt. Das Enzym wird unter diesen Bedingungen vollständig an den Träger gebunden. Die Ausbeute an enzymatischer Aktivität beträgt 96 #, bezogen auf die Ausgangeaktivität. Die Haltbarkeit des Enzym-Derivates - entsprechend Beispiel 1 a) bestimmt - ist in Flg. 1, Kurve c, graphisch dargestellt.

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Beispiel 2 . ü^%

a) 5 g Dextran 2o mit einem ungefähren Molekulargewicht von 2o.ooo werden wie in Beispiel 1 b) angegeben mit 4oo mg Bromcyan und dann mit 55o mg Penicillinacylase umgesetzt. Die Ausbeute an enzymatischer Aktivität beträgt nach der Umsetzung 96 96, bezogen auf die Ausgangsaktivität. Die Haltbarkeit dieses Enzym-Derivates - entsprechend Beispiel 1 a) bestimmt - ist in Fig. 2, Kurve b, graphisch dargestellt.

b) 5 g Dextran 2o werden wie in Beispiel 1 b) angegeben mit 800 mg Bromcyan und dann mit 55o mg Penicillinacylase umgesetzt. Die Ausbeute an enzymatischer Aktivität beträgt nach der Umsetzung 87 $>, bezogen auf die Ausgangsaktivität, Die Haltbarkeit dieses Enzymderivates ist - entsprechend Beispiel 1a) bestimmt - in Fig. 2, Kurve c, graphisch dargestellt.

c) 5 g Dextran 60 mit einem ungefähren Molekulargewicht von 60.000 werden wie in Beispiel 1 b) angegeben mit 400 mg Bromcyan und dann mit 55o mg Penicillinacylase umgesetzt. Die Ausbeute an enzymatischer Aktivität beträgt nach der Umsetzung 99 #, bezogen auf die Ausgangsaktivität. Die Haltbarkeit dieses Enzymderivates ist - entsprechend Beispiel 1 a) bestimmt - in Fig. 2, Kurve d, graphisch dargestellt.

Beispiel 5

a) 5 g lösliche Stärke nach Zulkowsky werden in 165 ml Wasser gelöst und mit 2 N Natronlauge auf pH 11,o eingestellt. Bei einer Temperatur von 20⁰C gibt man unter Rühren 4oo mg Bromcyan zu und hält den pH-Wert der Lösung mit 2 N NaOH

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bei 11,o. 2o Minuten nach Zufügen des Bromcyans wird die Lösung mit 2 N Salzsäure auf pH 8,5 gestellt und mit 17o ml einer wässrigen Lösung von 55o mg Penicillinacylae· (enzymatische Aktivität 7,3 E/mg) vermischt. Die Lösung wird 16 Stunden im Kühlraum bei 4⁰C gerührt. Nach der Umsetzung beträgt die Ausbeute an Enzymaktivität 98 $>, bezogen auf die Ausgangsaktivität. Sie kovalent an Stärke gebundene Penicillinacylase läßt sich ohne Aktivitätsverlust gefriertrocknen. Ausbeute 6,2 g mit einer enzystatischen Aktivität von o,65 E/mg. Die Stabilität der an Stärke gebundenen Penicillinacylase wurde, wie in Beispiel 1a) angegeben, in wässriger Lösung bei 45⁰C und pH 7,9 geprüft ( siehe graphische Darstellung Fig. 3, Kurve b ).

b) 5g lösliche Stärke nach Zulkowsky werden wie in Beispiel 3a) angegeben mit 8oo mg Bromcyan und dann mit 55o mg Penicillinacylaee umgesetzt. Die Ausbeute an Enzymaktivität beträgt nach der Umsetzung 98 #, bezogen auf die Ausgangsaktivität. Die Stabilität der an Stärke gebundenen Penicillinacylase wurde in wässriger Lösung bei 45°C und pH 7,8 geprüft (siehe graphische Darstellung Fig. 3, Kurve c). Ausbeute nach Gefriertrocknen 6,1 g mit einer enzymatischen Aktivität von o,65 E/mg.

Beispiel 4

ο ml einer Lösung von wasserlöslicher, an Dextran 5oo gebundener Penicillinacylase mit einer Aktivität von 9,6 E/ml, gemäß Beispiel 1 b) dargestellt, werden zu einer Lösung von g Penicillin G-KaIium in 8oo ml Wasser gegeben und bei 38⁰C gerührt. Der pH-Wert des Reaktionsansatzes wird durch laufende Zugabe von Triäthylamin konstant bei 7,8 gehalten. Nach 6 Stunden wird kein Triäthylamin mehr aufgenommen. Die Lösung wird

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durch ein Ultrafilter bis auf ein Restvolumen von 1oo ml filtriert, man fügt zur zurückbleibenden Lösung 25o ml Wasser zu und filtriert erneut bis auf 1oo ml. Das Filtrat einschließlich Waschwasser wird im Vakuum auf 15o ml eingeengt. Durch Zugabe von halbkonzentrierter Salzsäure wird die 6-APS am isoelektrischen Punkt bei pH 4,3 in Gegenwart von 1oo ml Methylisobutylketon ausgefällt. Nach einer Stunde wird die 6-APS abfiltriert, mit 1oo ml Wasser und 1oo ml Aceton nachgewaschen. Getrocknet wird im Vakuum bei 4o°C; Schmelzpunkt 2o8°C; Ausbeute 31,9 g 6-APS, das sind 87,2 # der Theorie.

Die durch Ultrafiltration abgetrennte wasserlösliche, trägergebundene Penicillinacylase kann für weitere Spaltungsansätze eingesetzt werden. Nach fünfmaliger Wiederholung der Spaltung ist keine Enzymaktivität verbraucht, so daß die Reaktionszeit nicht verlängert werden muß.

Beispiel 5

2,9 g kovalent an Stärke gebundene Penicillinacylase mit einer Aktivität von 65o E/g, hergestellt gemäß Beispiel 3b), werden in 6oo ml o,o5 m Triäthanolamin-Salzsäure Puffer pH 7.ο gelöst. Zur Lösung werden 85.5 g Acrylamid, 4,5 g N, N¹-Methylen bisacrylamid und 5 ml einer wässrigen Lösung von 2,5 g Ammoniumperoxidisulfat gegeben (Lösung A).

In einem Dreihalskolben mit Rührer werden 29oo ml Toluol, 11oo ml Chloroform, 5 ml Ν,Ν,Ν¹ ,N'-Tetramethyläthylendiamin und 1o ml Emulgator 1736 (Bayer AG) gegeben, auf 4⁰C abgekühlt und bei einer Drehzahl von 25o U/min gerührt. Unter Stickstoff- Schutzgas läßt man über einen Tropftrichter Lösung A in das Reaktionsgefäß eintropfen, rührt 3o Minuten und saugt das Polymerisat ab. Nachgewaschen wird zweimal mit je 1 1 Toluol und 2 1 o,5 m Natriumchloridlösung. Im Polymerisat sind 63 # der ursprünglichen Aktivität an Penicillinacylase enthalten.

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Bas einpolymerisierte Penicillinacylase-Derivat wird zu einer Lösung von 31,5 g Penicillin G-KaIium in 5oo ml Wasser gegeben und bei 38⁰C gerührt. Der pH-Wert des Reaktionsansatzes wird durch Zugabe von Triäthylamin konstant bei 7.8 gehalten. Nach 6 Stunden wird kein Triäthylamin mehr verbraucht. Das einpolymerisierte Penicillinacylase-Derlvat wird abfiltriert und mit wenig Wasser ausgewaschen. Das Filtrat einschließlich Waschwaeser wird im Vakuum auf 8o ml eingeengt. Durch Zugabe von halbkonzentrierter Salzsäure wird die 6-APS am isoelektrlachen Punkt bei pH 4.3 in Gegenwart von 8o ml Methylieobutylketon ausgefällt. Nach einer Stunde filtriert man die 6-APS ab und wäscht mit 75 ml Wasser und 75 ml Aceton nach. Getrocknet wird im Vakuum bei 4o C. Schmelzpunkt 2o8°C, Ausbeute 16,7 g (91 i> der Theorie).

Das einpolymerisierte Penicillinacylase-Derivat kann ohne Einbuße an Enzymaktivität für mindestens 2ο aufeinanderfolgende Ansätze verwendet werden.

Beispiel 6

21 ο ml eimer Lösung von wasserlöslicher, an Dextran 5oo gebundener Penicillinacylase mit einer Aktivität von 9,6 j2/ml, gemäß Beispiel 1 b) dargestellt, werden zu 63 g Penicillin G-KaIium und 290 ml Wasser gegeben und bei 38⁰C gerührt. Der pH-Wert des Reaktionsansatzes wird durch laufende Zugabe von Triäthylamin konstant bei 7,8 gehalten. Nach 12 Stunden wird kein Triäthylamin mehr aufgenommen. Die Weiterverarbeitung des Reaktionsansatzes erfolgt gemäß Beispiel 4. In der durch Ultrafiltration abgetrennten Enzymlösung war eine Restaktivität von 92 i> enthalten. Ausbeute an 6-APS 3o,8 g (84 i> der Theorie)

Im Parallelversuch mit ebensoviel nativer, ungebundener Penicillinacylase war im entsprechend durchgeführten Reaktlons-

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ansatz nach einer Spaltungszeit von 12 Stunden noch nicht umgesetztes Penicillin vorhanden. Die noch vorhandene Restaktivität an Penicillinacylaee betrug 67 fo der Theorie.

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9' ' M / Ü

Claims

Pat entansprüche - ^

Wasserlösliche, !covalent an polymere Träger gebundene Penicillinacylase.
2. Verfahren zur Herstellung von wasserlöslicher, !covalent an polymere Träger gebundenerPenicillinacylase, dadurch gekennzeichnet, daß man Penicillinacylase kovalent an einen wasserlöslichen Träger, vorzugsweise Dextran, Stärke, Laevan, Carboxymethylcellulose, bindet und das dabei entstehende Enzym-Derivat entweder verkapselt oder in Polymere einschließt.
3. Verwendung von wasserlöslicher, kovalent an polymere Träger gebundener Penicillinacylase zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure aus Penicillinen.
4. Verwendung von wasserlöslicher, kovalent an polymere Träger gebundener Penicillinacylase, die entweder verkapselt oder in Polynere eingeschlossen ist, zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure aus Penicillinen.

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