DE2312615A1 - PROCESS FOR COUPLING COMPOUNDS WITH HYDROXYL AND / OR AMINO GROUPS TO POLYMERS - Google Patents

PROCESS FOR COUPLING COMPOUNDS WITH HYDROXYL AND / OR AMINO GROUPS TO POLYMERS

Info

Publication number
DE2312615A1
DE2312615A1 DE19732312615 DE2312615A DE2312615A1 DE 2312615 A1 DE2312615 A1 DE 2312615A1 DE 19732312615 DE19732312615 DE 19732312615 DE 2312615 A DE2312615 A DE 2312615A DE 2312615 A1 DE2312615 A1 DE 2312615A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
coupling
gel
product
hydroxyl
activated
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
DE19732312615
Other languages
German (de)
Inventor
Jerker Olof Porath
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Exploaterings TBF AB
Original Assignee
Exploaterings TBF AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Exploaterings TBF AB filed Critical Exploaterings TBF AB
Publication of DE2312615A1 publication Critical patent/DE2312615A1/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J41/00—Anion exchange; Use of material as anion exchangers; Treatment of material for improving the anion exchange properties
    • B01J41/08—Use of material as anion exchangers; Treatment of material for improving the anion exchange properties
    • B01J41/12—Macromolecular compounds
    • B01J41/16—Cellulose or wood; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B11/00—Preparation of cellulose ethers
    • C08B11/02—Alkyl or cycloalkyl ethers
    • C08B11/04—Alkyl or cycloalkyl ethers with substituted hydrocarbon radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0036—Galactans; Derivatives thereof
    • C08B37/0039—Agar; Agarose, i.e. D-galactose, 3,6-anhydro-D-galactose, methylated, sulfated, e.g. from the red algae Gelidium and Gracilaria; Agaropectin; Derivatives thereof, e.g. Sepharose, i.e. crosslinked agarose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/30—Introducing nitrogen atoms or nitrogen-containing groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/34—Introducing sulfur atoms or sulfur-containing groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F2810/00—Chemical modification of a polymer
    • C08F2810/20—Chemical modification of a polymer leading to a crosslinking, either explicitly or inherently

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Description

PATENTANWÄLTEPATENT LAWYERS

Dipl.-Ing. EIDENEIER Dlpl.-Chern. Dr, R U F F Dipl.-Ing. J. B EIE RDipl.-Ing. EIDENEIER Dlpl.-Chern. Dr, R U F F Dipl.-Ing. J. B EIE R

7 STUTTGART 1 Neck&retraße 5O Telefon 007113 22 70 517 STUTTGART 1 Neck & retraße 5O Telephone 007 113 22 70 51

12. März 1973 -March 12, 1973 -

Anmelderin: Exploaterings Aktiebolaget T.B.F, Karlsrogatan 42
S-752 39 Uppsala / SchwedenApplicant: Exploaterings Aktiebolaget TBF, Karlsrogatan 42
S-752 39 Uppsala / Sweden

A 14 767A 14 767

Verfahren zum Kuppeln von Verbindungen mit Hydroxyl- und/oder Aminogruppen an PolymereProcess for coupling compounds with hydroxyl and / or amino groups to polymers

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum chemischen Kuppeln eines quellbaren, im Wasser unlöslichen,insbesondere teilchenförmig vorliegenden Polymers mit Hydroxyl- und/oder primären und/oder sekundären Aminogruppen mit mindestens einer Verbindung oder einem Produkt mit vom Polymer verschiedener Struktur und mindestens einer Hydroxyl- und/oder primären und/oder sekundären Aminogruppe.The invention relates to a method for the chemical coupling of a swellable, water-insoluble, in particular particulate present polymer with hydroxyl and / or primary and / or secondary amino groups with at least a compound or a product with a structure different from the polymer and at least one hydroxyl and / or primary and / or secondary amino group.

Molekülarschichten, Medien für die Verteilungachromatographie, Adsorptionschromatographie und Ionenaustauscher auf dor Grundlage unlöslicher Kohlenhydrate, wie Agar-Agar, vernetzte j>extrane und Cellulose,haben in aen letzten Jahren für die Herstellung von natürlichen Produkten in reiner Form,Molecular layers, media for distribution achromatography, Adsorption chromatography and ion exchangers based on insoluble carbohydrates, such as agar-agar, cross-linked extrane and cellulose, have in the last few years for the production of natural products in pure form,

309839/1 191309839/1 191

Poateohookkonto Stuttgart 4SO 3O · Dresdner Bank Stuttgart Konto OO11 341 Poateohook account Stuttgart 4SO 3O Dresdner Bank Stuttgart account OO11 341

A 14 767 - 2 -A 14 767 - 2 -

nicht zuletzt auch Proteine, mehr und mohr an Bedeutung gewonnen. Enzyme, die chemisch an unlösliche teilchenförmige Polysaccharide gekuppelt sind, haben sich in biochemischen Verfahren ebenfalls/als bräuchbar erwiesen, so z. B. bei der Herstellung von synthetischen Aminosäuren.Last but not least, proteins, more and more important won. Enzymes that chemically form insoluble particles Polysaccharides are coupled, have turned out to be biochemical Procedure also / proven to be usable, see above z. B. in the production of synthetic amino acids.

Die vorliegende Erfindung befaßt sich, mit der Herstellung eines Produktes, das in verschiedenartigen Ausführungsformen für Adsorptionsverfahren auf Grundlage von Ionenaustausch, biospezifischer Adsorption (z. B. Affinitätschromatographie) oder in enzym-katalysierten Reaktionen verwendet werden kann, bei welchen das erfindungsgemäße Gelprodukt als. Matrixmaterial dient.The present invention is concerned with manufacturing of a product that can be used in various forms for adsorption processes based on ion exchange, biospecific adsorption (e.g. affinity chromatography) or in enzyme-catalyzed reactions can be used in which the gel product according to the invention as. Matrix material is used.

Das erfindungsgemäße Produkt besteht aus zwei Komponenten, einem unlöslichen, z.B. -hydroxylhaltigen Polymer und einer Substanz, die z. B- Aminogruppen enthält, wobei die "beiden Komponenten mit Divinylsulfon chemisch miteinander gekuppelt sind. Wird das hydroxylhaltige Polymer schematisch mit (P^)-OH und das Amin mit R.HN-(^) bezeichnet,, dann kann die chemische Formel des erfindungsgemäßen Produkts symbolisch folgendermaßen wiedergegeben werden:The product according to the invention consists of two components, an insoluble, e.g. hydroxyl-containing polymer and one Substance z. B- contains amino groups, the "two Components chemically coupled to one another with divinyl sulfone are. If the hydroxyl-containing polymer is referred to schematically with (P ^) - OH and the amine with R.HN - (^), then the The chemical formula of the product according to the invention can be represented symbolically as follows:

(P)-OCH0-CIi0UO0-CH0 (P) -OCH 0 -CIi 0 UO 0 -CH 0

wobei R^ Wasserstoff, Alkyl oder Aryl und (X) eine aliphatische, aromatische oder heterocyclische Gruppe sind. Das erfindungsgemäß hergestellte Produkt kann als Polymer in Teilchenform, z. B. in Perlenform, vorliegen, es kommen jedoch auch andere Formen in Frage.where R 1 is hydrogen, alkyl or aryl and (X) is an aliphatic, aromatic or heterocyclic group. The product prepared according to the invention can be used as a polymer in particulate form, e.g. B. in the form of pearls, but there are also other shapes in question.

Das Polymer kann anstelle oder gleichzeitig zusammen mit den Hydroxylgruppen auch Aminogruppen enthalt en, conau i:o wie die an das Polymer zu kuppelnde Verbindung Hydroxylgruppen zusammen mit oder anstelle der Aminogruppen enthalten kann.The polymer may, instead of or containing same together with the hydroxyl groups and amino groups s, conau i: o the like may be included to the polymer to be coupled connection hydroxyl groups together with or instead of the amino groups.

30 9 839/119130 9 839/1191

A 14 767' - 3 -A 14 767 '- 3 -

Es sind so zahlreiche Kombinationen möglich, es ist jedoch aus dem oben angeführten Beispiel leicht ersichtlich, in welcher Weise die Kupplungsreaktionen ablaufen.So many combinations are possible, but it is easy to see from the example above, in which way the coupling reactions take place.

Ein charakteristisches Kupplungsmittel für die Verknüpfung der Komponenten des Produkts ist DivinylsulfonA characteristic coupling agent for linking the components of the product is divinyl sulfone

CH2 = GH - SO2 - CH - CH2 CH 2 = GH - SO 2 - CH - CH 2

bei dem beide Doppelbindungen der Vinylgruppen durch die dazwischenliegende SCU-Gruppe aktiviert sind. Andere analoge Verbindungen', die mindestens zwei mit einer oder mehreren SOp-Gruppen aktivierte Vinylgruppen enthalten; können ebenfalls verwendet werden.in which both double bonds of the vinyl groups are activated by the SCU group in between. Other analog Compounds containing at least two vinyl groups activated with one or more SOp groups; can can also be used.

Das erfindungsgemäße Gelprodukt kann unter Anwendung der folgenden Heaktionsstufen hergestellt werden:The gel product according to the invention can be prepared using the following heating steps:

1) Aktivierung durch Reaktion von Divinylsulfon oder einem geeigneten Derivat hiervon mit einem unlöslichen PoIy-1) Activation by reaction of divinyl sulfone or a suitable derivative thereof with an insoluble poly

- mer mit Hydroxyl- und/oder Aminogruppen in der Form von Gelteilchen unter Bedingungen, die zur Bildung eines reaktiven Gels führen. Die Bedingungen werden im einzelnen noch beschrieben.- mer with hydroxyl and / or amino groups in the form of gel particles under conditions that lead to the formation of a reactive gel. The conditions are will be described in detail later.

2) Kupplung, bei der das reaktive Gel gemäß 1) in Kontakt mit einer Lösung einer Verbindung mit Hydroxylgruppen und/oder primären oder sekundären Aminogruppen gebracht wird, wobei die Verbindung chemisch an das Gel fixiert wird.2) Coupling in which the reactive gel according to 1) is in contact brought with a solution of a compound having hydroxyl groups and / or primary or secondary amino groups whereby the compound is chemically fixed to the gel.

3) Möglicherweise eine dritte nachfolgende Stufe, in der daß Produkt nach 2) mit einom Absättä gun^.smittel zur Blockierung gegeben onf al In noch nicht um^oof-tzter im Gel verbliebener Vinylgruppen umgesetzt wird.3) Possibly a third subsequent stage, in which the product after 2) with a saturating agent Blocking given onf al In not yet at ^ oof-tzter im Gel of remaining vinyl groups is implemented.

309839/119 1309839/119 1

Das Risiko einer verbleibenden Reaktivität ist besonders groß, wenn die Aminogruppen enthaltende gekuppelte· Substanz ein Protein oder eine Nucleinsäure ist. Eine chemische Desaktivierung kann in vielen Anwendungsfällen notwendige werden, wenn ein Kontakt mit Extrakten von Pflanzen, tierischen Organen und dergleichen anderenfalls zu einer chemischen Fixierung und zu unerwünschten Komponenten im Gelprodukt führen und dadurch seine Eigenschaften wesentlich verändern würde.The risk of residual reactivity is particularly great when the coupled substance containing amino groups is a protein or a nucleic acid. Chemical deactivation can be necessary in many applications if contact with extracts of plants, animal organs and the like otherwise become a chemical fixation and lead to undesirable components in the gel product and thus its properties are essential would change.

Als unlösliches hydroxylhaitiges Polymer kann ein Polysaccharide beispielsweise Gellusose, Agar-Agar, Agarose, Carrageen oder Mischungen dieser Materialien verwendet werden. Vernetztes Agar-Agar und Agarose sind besonders geeignet, wie auch Gelteilchen aus einer quervernetzten Mischung von Agar-Agar und einem Manan, z. B. Gummi aus Johannisbrotbohnen. Quervernetztes Dextran kann ebenfalls verwendet werden. Das Polymer braucht jedoch nicht notwendigerweise ein unlösliches Saccharid zu sein. Es kann auch eine synthetische hydroxylhaltige makromolekulare Substanz sein, wie z.B. quervernetzter Polyvinylalkohol.A polysaccharide can be used as the insoluble hydroxyl-containing polymer for example gellusose, agar-agar, agarose, carrageenan or mixtures of these materials are used will. Crosslinked agar-agar and agarose are particularly suitable, as are gel particles from a crosslinked one Mixture of agar-agar and a manan, e.g. B. Carob Gum. Cross-linked dextran can also be used. However, the polymer does not necessarily need to be an insoluble saccharide. It can also be a synthetic hydroxyl-containing macromolecular substance such as cross-linked polyvinyl alcohol.

Wie oben erwähnt, kann das Polymer auch Aminogruppen enthalten, so z. B. aus Aminopolystyrol bestehen. Polymere, die Hydroxylgruppen sowie auch Aminogruppen (Aminosäuren) enthalten, kommen ebenfalls in Frage.As mentioned above, the polymer can also contain amino groups, so z. B. consist of aminopolystyrene. Polymers, the hydroxyl groups as well as amino groups (amino acids) are also possible.

Die Aktivierung gemäß'Stufe 1) wird in der Art durchgeführt, daß das Polymer mit dem Divinylsulfon in basischer Umgebung und vorzugsweise in Abwesenheit von Sauerstoff ' zur Reaktion gebracht wird. Wenn der pH-Wert zu niedrig i.r3t, dann findet keine Reaktion statt, und wenn der pH-Wert zu hoch iöt, dann zorst-tzt sich dac Ln.vj nyl^ul fön odor j:ein Kupplungsprodukt mit 'dem hydroxylhaltigen Polymer hydrolytisch, so daß keine Aktivierung erhalten wird. Deshalb sollte die Reaktion in einem begrenzten pH-Bereich durch-The activation according to stage 1) is carried out in such a way that the polymer is reacted with the divinyl sulfone in a basic environment and preferably in the absence of oxygen. If the pH is too low i. r 3t, then no reaction takes place, and if the pH iöt too high, then zorst-TZT to dac Ln.vj nyl ^ ul fön odor j: a coupling product with 'the hydroxyl-containing polymer by hydrolysis, such that no activation is obtained . Therefore, the reaction should be carried out in a limited pH range.

3 0 9 8 3 9/11913 0 9 8 3 9/1191

geführt werden, der zwischen 8 und 12, vorzugsweise zwinchen 9 und 11 liegt, Die Aktivierungsreaktion kann bei niederen Temperaturen (0° C), Haumtemperatur oder erhöhten Temperaturen, ζ. Β. 4-0° C, durchgeführt werden. Im letzteren Falle sollte der pH-Wert nicht über 10 liegen. Lie Aktivierung wird in wässriger Lösung durchgeführt, sie kann aber auch in Mischungen von Wasser und organischen Lösungsmitteln, wie Alkohol, Dioxan oder Dirnethylsulfoxyd, vorgenommen werden.be performed, between 8 and 12, preferably zwinchen 9 and 11, the activation reaction can take place at low temperatures (0 ° C), skin temperature or elevated Temperatures, ζ. Β. 4-0 ° C. In the latter case, the pH should not be above 10. Lie Activation is carried out in aqueous solution, but it can also be carried out in mixtures of water and organic Solvents such as alcohol, dioxane or dimethyl sulfoxide, be made.

Die Aminogruppen.enthaltende Substanz kann niedermolekular sein, z. B. ein aliphatisches, aromatisches oder heterocyclisches primäres oder sekundäres Amin. Bei verschiedenen Varianten des Gelprodukts kann das chemisch gekuppelte Amin eine Aminosäure, Peptid, Protein, Amino enthaltender Zucker, Nucleotid oder Polynucleotid, z. B. Nucleinsäure, sein. Bei der Kupplung von hydroxylhaltigen Vorbindungen über die Hydroxylgruppen können Agar-Agar oder Cellulose mit Alkoholen, wie Sorbit, oder mit Phenolen, wie Resorcin, substituiert werden.The amino group-containing substance can be of low molecular weight be e.g. B. an aliphatic, aromatic or heterocyclic primary or secondary amine. At different Variants of the gel product, the chemically coupled amine can be an amino acid, peptide, protein, amino-containing sugar, Nucleotide or polynucleotide, e.g. B. nucleic acid. When coupling hydroxyl-containing pre-bonds via the Agar-agar or cellulose hydroxyl groups can be substituted with alcohols such as sorbitol or with phenols such as resorcinol will.

Die Kupplungsreaktion gemäß Stufe 2) wird innerhalb eines pH-Intervalls von 4 bic 12, vorzugsweise 7 bis 10 durchgeführt. Aromatische Amine lassen sich am besten bei pH 9 bis 10,5 kuppeln.The coupling reaction according to stage 2) is within one pH interval of 4 bic 12, preferably 7 to 10 carried out. Aromatic amines are best at pH 9 to 10.5 couple.

Das Kuppeln von Hydroxylgruppen enthaltenden Verbindungen über die Hydroxylgruppen wird am besten bei pH 10 bis 11 durchgeführt.Coupling of hydroxyl-containing compounds via the hydroxyl groups is best done at pH 10-11 carried out.

Die Kupplungsreaktion wird im allgemeinen in wässriger Lönunp; durchgeführt, es können jedoch auch boir.piol «weise ' 11 iiif.huΐιμ,'^i nun Wnnrfr· und Alkohol odr-r Im/xnri VT-w^ririot worden. Die Kupplung fixidct boi Temporat,urf%n zwinrhon ü und 20° C statt, sie kann aber auch bei höheren Temperaturen,The coupling reaction is generally carried out in aqueous Lönunp; carried out, however, it can also boir.piol 'as' iiif.huΐιμ 11,' ^ i has now Wnnrfr · and alcohol odr-r In / xnri VT w ^ ririot. The coupling fixidct boi Temporat, urf % n zwinrhon ü and 20 ° C, but it can also be used at higher temperatures,

3 0 9 8 3 9/11913 0 9 8 3 9/1191

A Vi ?f,7 A Vi? F, 7

ζ. B. 40 G, vorgenommen werden.ζ. B. 40 G, can be made.

In besonderen Fällen, kann es erwünscht sein, das Gelprodukt in einer Stufe herzustellen, d. h. durch Verbinden der Substanz, die z. B. Aminogruppen enthält, mit der Polymermatrix in Gegenwart von Divinylsulfon. Beispiele hierfür, sind unten angegeben.In special cases it may be desirable to use the gel product manufacture in one step, d. H. by joining the substance, e.g. B. contains amino groups with the Polymer matrix in the presence of divinyl sulfone. Examples for this, are given below.

Die-Blockierung restlicher Vinylgruppen in Stufe 3) wird vorteilhafterweise durchgeführt, indem die verminderten nicht umgesetzten Vinylgruppen mit Aminoverbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, z. B. Glycin oder A'thanolamin, umgesetzt werden. Die Reaktion wird vorteilhafterweise in einer Lösung von 1M Glycin bei Raumtemperatur während einer Lauer von 24 Stunden in neutraler oder leicht alkalischer Umgebung durchgeführt. The blocking of remaining vinyl groups in step 3) is advantageously carried out by reducing the unreacted vinyl groups with amino compounds having low molecular weight, e.g. B. glycine or ethanolamine are implemented. The reaction is advantageously carried out in a solution of 1M glycine at room temperature during carried out in a neutral or slightly alkaline environment for a period of 24 hours.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist das Gelprodukt ein Adsorptionsmittel und gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, bei der das aminhaltige Element ein Enzym ist, ist das Gelprodukt ein Katalysator. Ein Beispiel für die letztere Ausführungsform ist Trypsin-Agar-Agar-Gel, das durch Kuppeln von Trypsin an quervernetztes Agar-Agar mit Divinylsulfon hergestellt wurde. Dieses Gel hat proteolytische Aktivität, d. h. es katalysiert die Hydrolyse von Proteinen, und es adsorbiert auch Sojabohneninhibitor (biospezifische Adsorption) und kann daher zur Herstellung reinen Sojabohneninhibitors aus Sojaextrakt verwendet werden.According to one embodiment of the invention, the gel product is an adsorbent and according to a further embodiment of the invention where the amine-containing element is an enzyme, the gel product is a catalyst. An example of the latter embodiment is trypsin agar agar gel, made by coupling trypsin to cross-linked agar-agar with divinyl sulfone. This gel has proteolytic activity; H. it catalyzes the hydrolysis of proteins, and it also adsorbs Soybean inhibitor (biospecific adsorption) and can therefore for the production of pure soybean inhibitor from soy extract be used.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich auD ob η folgenden Beispielen von Aucführun^slormen der Erfindung zur Herstellung des Gelproduktu. Further features and advantages of the invention result also whether the following examples of embodiments of the invention for the production of the gel product.

309 83S/1309 83S / 1

Beispiel 1example 1

Kupplung von Sojabohneninhibitor (STI) an mit Divinylsulfon aktivierte Agarose.Coupling of soybean inhibitor (STI) to divinyl sulfone activated agarose.

a) Aktivierunga) Activation

20 ml sedimentierte Agarose (Sepharose 6B) wird mit destiliertem Wasser auf einem Glasfilter gereinigt. Das Gel wird dann in ein Reaktionsgefäß überführt, das 20 ml Carbonatpuffer pH 11.0 und 0.6 ml Divinylsulfon enthält. Man läßt die Reaktion unter Rühren 20 Minuten lang bei 25° C fortlaufen, wonach sie durch Erniedrigendes pH auf 7-0 mit HGL beendet wird. Das aktivierte Gel wird auf einem Glasfilter mit Wasser und Carbonatpuffer pH 9*0 gesäubert.20 ml of sedimented agarose (Sepharose 6B) is added Purified distilled water on a glass filter. The gel is then transferred to a reaction vessel containing 20 ml of carbonate buffer pH 11.0 and contains 0.6 ml divinyl sulfone. The reaction is allowed to stir for 20 minutes at 25 ° C after which it is terminated by lowering the pH to 7-0 with HGL. The activated gel is on a glass filter cleaned with water and carbonate buffer pH 9 * 0.

b) Kupplungb) clutch

10 ml aktiviertes Gel werden mit 60 mg STI umgesetzt, das in 10 ml Carbonatpui'fer pH 9*0 gelöst ist. Man läßt die Kupplungsreaktion unter Rühren, während 20 Stunden bei 25° C ablaufen, wonach nicht gekuppelter Inhibitor aus dem Gel mit Garbonatpuffer pH 9'.0,der 1 M NaCl enthält, destilliertem Wasrer, Glycinpuffer pH 3-0 mit 1 M NaCl und letztlich Trispuffer pH 7-8 mit 0.5 M NaCl ausgewaschen wird.10 ml of activated gel are reacted with 60 mg of STI, which is dissolved in 10 ml of carbonate buffer pH 9 * 0. You let them Coupling reaction with stirring for 20 hours at 25 ° C run, after which uncoupled inhibitor from the gel with carbonate buffer pH 9'.0, which contains 1 M NaCl, distilled Water, glycine buffer pH 3-0 with 1 M NaCl and finally Tris buffer pH 7-8 is washed out with 0.5 M NaCl.

Die Kupplungsausbeute wurde bestimmt durch Aminosäureanalyse und ergab 3·9 Mikroäquivalente STl/g Konjugat oder 90 mg STl/g Konjugat. Die prozentuale Ausbeute betrug 90 %. Die verbleibenden 10 % STI können durch erneute Kupplung mit im wesentlichen voller Aktivität (90 %) verknüpft werden.The coupling yield was determined by amino acid analysis and resulted in 3 x 9 microequivalents STl / g conjugate or 90 mg STl / g conjugate. The percentage yield was 90%. The remaining 10 % STI can be linked to essentially full activity (90%) by recoupling.

Die somit erzielbare Ausbeute liegt um 50 % höher als die- jenign, die bir;hnr mit der BrON-Mothode erhüJtlich war.The yield that can be achieved in this way is 50 % higher than that which was obtainable with the BrON method.

Die Aktivität des gekuppelten Inhibitors wurde durch Bestimmung der Adsorption von Trypsin auf dem Konjugat geprüft. The activity of the coupled inhibitor was checked by determining the adsorption of trypsin on the conjugate.

309839/1191309839/1191

A 1,767 . ■ -β-A 1.767. ■ -β-

Eine TrypsinlÖsung (1 mg/ml) wird durch ein Bett aus STI-Agarose geleitet,^ 8 ml bei pH 7.8 (0.05 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.02 M Ca +~). Inaktive Enzyme laufen regelrecht durch, ohne festgehalten oder verzögert zu werden. Aktives Trypsin wird festgehalten und kann durch Erniedrigung des pH auf 5.0 (0.05 :A trypsin solution (1 mg / ml) is passed through a bed of STI agarose, ^ 8 ml at pH 7.8 (0.05 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.02 M Ca + ~). Inactive enzymes literally run through without being held or delayed. Active trypsin is retained and can be reduced by lowering the pH to 5.0 (0.05:

werdenwill

(0.05 M Glycin, 0.5 M NaCl, 0.02 M Ca2+) wieder desorbiert(0.05 M glycine, 0.5 M NaCl, 0.02 M Ca 2+ ) desorbed again

Das auf diese Weise aus handelsüblichem Trypsin gewonnene gereinigte Enzym besitzt eine 30 % höhere Aktivität als das handelsübliche Enzym. Die\ Menge an adsorbiertem und desorbiertem Trypsin betrug 15 mg, d. h. 2 mg Trypsin/ml Gel.The one obtained in this way from commercially available trypsin purified enzyme has a 30% higher activity than the commercial enzyme. The \ amount of adsorbed and desorbed trypsin was 15 mg, i.e. H. 2 mg trypsin / ml Gel.

Beispiel 2Example 2

Kupplung von Trypsin an mit Divinylsulfon (DVS)-aktivierte Agarose. .Coupling of trypsin to divinyl sulfone (DVS) -activated Agarose. .

a) Aktivierunga) Activation

Die Aktivierung wird in der gleichen Weise vorgenommen wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß die Konzentration von DVS auf 1 ml erhöht wurde. - ■ Activation is carried out in the same way as in Example 1, with the exception that the concentration of DVS was increased to 1 ml. - ■

b) Kupplung -,.'.-■b) coupling -, .'.- ■

10 ml aktiviertes Gel werden mit '50 mg Trypsin, das in 70 ml Phosphatpuffer pH 8.0 gelöst ist, umgesetzt und drei Tage· lang bei 5° C gerührt. Das Produkt wird entsprechend Beispiel 1 gereinigt, und die Kupplungsausbeute betrug 2.Q Mikroäquivalente/g Konjugat, d. h.'48 mg Trypsin/g Konjugat. Las erhaltene Produkt war aktiv.10 ml of activated gel are mixed with 50 mg of trypsin, the is dissolved in 70 ml of phosphate buffer pH 8.0, reacted and Stirred for three days at 5 ° C. The product is purified according to Example 1, and the coupling yield was 2.Q microequivalents / g conjugate, i.e. i.e., 48 mg Trypsin / g conjugate. The product received was active.

3 0 9 8 3 9/11913 0 9 8 3 9/1191

Beispiel 5Example 5

Kupplung von DL-Penicillamin an DVS-aktivierte AgaroseCoupling of DL-penicillamine to DVS-activated agarose

a) Aktivierunga) Activation

Die Aktivierung wurde wie. in Beispiel 2 durchgeführt,Activation was like. carried out in example 2,

b) Kupplungb) clutch

10 ml aktiviertes Gel wird unter Rühren mit 100 mg Penicillamin, das in 10 ml Phosphatpuffer pH 8.0 gelöst ist, während drei Tagen bei 25° G umgesetzt. Das Produkt wurde wie in Beispiel 1 gereinigt.10 ml of activated gel is stirred with 100 mg of penicillamine dissolved in 10 ml of phosphate buffer pH 8.0 is implemented for three days at 25 ° G. The product was purified as in Example 1.

Der Stickstoffgehalt wurde nach Kjeldahl bestimmt, und die Kupplungsausbeute wurde aus dem Stickstoffgehalt gerechnet, der O.52 % betrug. Kupplung bei einem höheren pH führte zu keiner Erhöhung der Ausbeute.The nitrogen content was determined according to Kjeldahl, and the Coupling yield was calculated from the nitrogen content, which was 0.52%. Coupling at a higher pH did not lead to an increase in the yield.

Beispiel 4Example 4

Kupplung von Sulfanilamid an mit DVS-aktivierte AgaroseCoupling of sulfanilamide to agarose activated with DVS.

a) Die Aktivierung wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt.a) Activation was carried out in the same manner as in Example 1.

b) Kupplungb) clutch

10 ml aktiviertes Gel wird mit 200 ml SuI f .anilamid, das in 10 ml Carbonatpuffer pH 10 gelöst ist, unter Rühren während 20 Stunden bei 20° G umgesetzt. Das Produkt wird wie in Boinpinl 1 pjorcinißb und analysiert;, um den Stickstoffgehalt nach Kjeldahl. zu bestimmen. Die Ausbeute wurde aus dem Stickstoffgehalt errechnet, der bei 0.44 % lag.10 ml of activated gel is mixed with 200 ml of SuI f .anilamide, which is dissolved in 10 ml of carbonate buffer pH 10, with stirring reacted for 20 hours at 20 ° G. The product is analyzed as in Boinpinl 1 pjorcinißb and; to determine the nitrogen content to Kjeldahl. to determine. The yield was calculated from the nitrogen content, which was 0.44%.

309839/1191309839/1191

Kupplung von Glycyl-L-leucin an mit LVS-aktivierte AgaroseCoupling of glycyl-L-leucine to those activated with LVS Agarose

a) Die Aktivierung wurde wie in Beispiel 2 durchgeführt. a) The activation was carried out as in Example 2.

b) Kupplungb) clutch

10 ml aktiviertes Gel wurden mit 160 mg Glycyl-L-leucin, das in 10 ml Phosphatpuffer pH 8.0 gelöst ist, unter Rühren während 20 Stunden bei 25° G umgesetzt. Das Produkt wurde wie in Beispiel 1 gereinigt. Die Kupp— lungsausbeute wurde durch Aminosäureanalyse des Konjugats bestimmt und betrug 208 Mikroäquivalente Gly-L-Leu/g Konjugat.10 ml activated gel with 160 mg glycyl-L-leucine, which is dissolved in 10 ml phosphate buffer pH 8.0, reacted with stirring for 20 hours at 25 ° G. The product was purified as in Example 1. The coupling yield was determined by amino acid analysis of the conjugate and was 208 microequivalents Gly-L-Leu / g Conjugate.

Beispiel 6Example 6

Kupplung von p-Phenylendiamin an 6 % Agar-Agar.Coupling of p-phenylenediamine to 6% agar-agar.

Aktivierung ,Activation,

10 ml eines 6 %igen Agar-Agar wird in 10 ml Carbonatpuffer pH 11 mit 0.5 ml DVS 30 Minuten lang bei 25° C aktiviert. 10 ml of a 6% agar-agar is in 10 ml carbonate buffer pH 11 activated with 0.5 ml DVS for 30 minutes at 25 ° C.

. Kupplung. coupling

150 mg p-Phenylendiamin werden 5 nil aktivem Gel iii 5 ml Garbonatpuffer pH 11 zugegeben. Nach dem üblichen Waschen ergibt die Stickstoffanalyse einen Gehalt von 270 Mikromol/g Trockensubstanz.150 mg of p-phenylenediamine become 5 nil active gel iii 5 ml carbonate buffer pH 11 added. According to the usual On washing, the nitrogen analysis shows a content of 270 micromol / g dry substance.

3 09839/11913 09839/1191

767 . -τ,-767. -τ, -

Beispiel 7Example 7

Kupplung von Adenosin-Monophosphat (AMP) an 6 % Agarose (Sepharose 6B).Coupling of adenosine monophosphate (AMP) to 6% Agarose (Sepharose 6B).

Die Aktivierung"wird in üblicher Weise durchgeführt mit 6 ml 6 %iger Agarose (Sepharose 6B) in 10 ml Carbonatpuffer pH 11.0 und 0.5 ml DVS während 30 Minuten bei 25° C.The activation "is carried out in the usual way with 6 ml of 6% agarose (Sepharose 6B) in 10 ml Carbonate buffer pH 11.0 and 0.5 ml DVS for 30 minutes at 25 ° C.

Die Kupplung wird durchgeführt mit 8 g aktiviertem Gel in 10 ml Carbonatpuffer pH 11.2 und 200 mg AMP. Nach der üblichen Reinigung erhält man ein gekuppeltes Produkt mit 0.138 % Stickstoff entsprechend 16 Mikromol AMP/g Trockensubstanz.The coupling is carried out with 8 g of activated gel in 10 ml of carbonate buffer pH 11.2 and 200 mg of AMP. To the usual purification gives a coupled product with 0.138% nitrogen corresponding to 16 micromoles AMP / g Dry matter.

Beispiel 8Example 8

Kupplung von AMP an 6 %ige Agarose (Sepharose 6B) in einer einzigen Stufe.Coupling of AMP to 6% agarose (Sepharose 6B) in a single step.

0.5 ml DVS werden einer Lösung von 100 mg AMP in 10 ml Carbonatpuffer pH 10.0 zugegeben. Nach 30 Minuten bei 40° C werden 10 ml 6 %ige Agarose (Sepharose 6B) zugegeben. Nach der üblichen Reinigung erhält man ein Produkt mit einem Gehalt von 0.082 % Stickstoff.0.5 ml DVS is added to a solution of 100 mg AMP in 10 ml carbonate buffer pH 10.0. After 30 minutes at 40 ° C., 10 ml of 6% agarose (Sepharose 6B) are added. After the usual purification, a product is obtained with a nitrogen content of 0.082%.

Beispiel 9Example 9

Kupplung von DNA (Deoxyribonucleinsäure) an Agarose. Durch Kupplung in einer Beispiel 8 analogen Weise wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:Coupling of DNA (deoxyribonucleic acid) to agarose. By coupling in a manner analogous to Example 8 were get the following results:

309839/1191309839/1191

A 14 767 - 12 -A 14 767 - 12 -

Ausgangsmaterial ProduktStarting material product

2 % Agarose + 0.3 % DVS ' %N » 0.0812 % agarose + 0.3% DVS '% N »0.081

0.5 % Agar-Agar +. 0.3 % DVS " %N = 0.058 2 % Epichlorhydrin quervernetzt0.5% agar-agar +. 0.3% DVS "% N = 0.058 2% epichlorohydrin cross-linked

2 % Agarose + 0.3 % DVS %N = 0.022 2% agarose + 0.3% DVS% N = 0.022

Beispiel 10Example 10

Kupplung an quervernetztes Dextran (Sephadex).Coupling to cross-linked dextran (Sephadex).

Ausgangsmaterial: 50 mi quervernetztes Dextran CSephadex "G 25) in 50 ml Carbonatpuffer pH = 1T.0 aktiviert mit 2.5 ml DVS während 30 Minuten bei 25° C. Nach Reinigung wird die Kupplung mit 10 ml Gel und den folgenden Substanzen durchgeführt:Starting material: 50 ml of cross-linked dextran CSephadex "G 25) activated in 50 ml of carbonate buffer pH = 1T.0 with 2.5 ml DVS for 30 minutes at 25 ° C. After cleaning the coupling is carried out with 10 ml of gel and the following substances:

' . Endprodukt'. End product

a) 0.2 g Rivanol (2~Äthoxy - 6.9 - Diamin-a) 0.2 g rivanol (2 ~ ethoxy - 6.9 - diamine

oacridin) pH = 11 0.019oacridine) pH = 11 0.019

b). 0.2 g Aminoguanidin pH » 9.0 0.134b). 0.2 g aminoguanidine pH 9.0 0.134

c) 0.2 g " pH = 11 0.600c) 0.2 g "pH = 11 0.600

d) 0.2 g Aminomethansulfonsäure pH = 9 0.145d) 0.2 g of aminomethanesulfonic acid pH = 9 0.145

Beispiel.11Example 11

Kupplung an Cellulose'Coupling to cellulose '

JiI Munktoll No. ^OO-Cellulosepulver für die Zonen- ^loktroly.Mo und [J,:iu.lrnchromntop;rnphj ο wird ηΊ ti -Α»«ρ;«ΐ«Β«- nmt.erial verwendet, im V\x£Ϊer gequollen und .dann, ßedlmontiert. 30 ml Gel in 30 ml Garbonatpuffer werden bei pHJiI Munktoll No. ^ OO cellulose powder for the zone ^ loktroly.Mo and [J: iu.lrnchromntop; rnphj ο is ηΊ ti -Α "" ρ, "ΐ" Β "- nmt.erial used in V \ x £ Ϊ he swollen and then, ßedlmontiert. 30 ml gel in 30 ml carbonate buffer are at pH

309839/1191309839/1191

A 14 767A 14 767

während 30 Minuten bei £ίί)° U mit 1.5 ml DVL! uktiviert, worauf die folgenden Kupplungen durchgeführt werden:for 30 minutes at £ ίί) ° U with 1.5 ml DVL! activated, whereupon the following couplings are carried out:

a) 0.1 g Aminoguanidina) 0.1 g of aminoguanidine

b) .0.1 g Aminomethansulfonsäureb) .0.1 g of aminomethanesulfonic acid

c) 0.1 g Glycyl-L-leucinc) 0.1 g glycyl-L-leucine

%N in Endprodukt% N in final product

0.133
0.0180.133
0.018

38.738.7

Beispiel 12Example 12

Kupplung an 6 % Agarose (Sephadex 6B).Coupling to 6 % agarose (Sephadex 6B).

Der Versuch wurde entsprechend Beispiel 11 durdjgelühit ud. es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:The experiment was carried out according to Example 11. it the following results were obtained:

%N in Endprodukt% N in final product

a) 0.1 g Aminoguanidin pH = 11.0 1.05a) 0.1 g aminoguanidine pH = 11.0 1.05

b) 0.1 g Aminomethansulfonsäure pH =10 0.15^b) 0.1 g aminomethanesulfonic acid pH = 10 0.15 ^

c) 0.1 g " pH » 9 0.193c) 0.1 g "pH» 9 0.193

d) 0.1 g Glycyl-L-leucin pH = 11 277 >ä mol/gd) 0.1 g glycyl-L-leucine pH = 11 277> ä mol / g

Beispiel 13Example 13

Kupplung von quervernetztem Dextran (Sephadex G-200) mit Trypsininhibitor (STI).Coupling of cross-linked dextran (Sephadex G-200) with trypsin inhibitor (STI).

20 ml Sephadex G-200 in 20 ml Carbonatpuffer werden bei pH = 11 während 30. Minuten und 25° C mit 1 ml LVS aktiviert. Das gereinigte Gel wurde gekuppelt mit20 ml of Sephadex G-200 in 20 ml of carbonate buffer activated at pH = 11 for 30 minutes and 25 ° C with 1 ml LVS. The purified gel was coupled with

a). 0.1 p; STJ. pH « 9.0 b) 0.1 g GTI pH =10.0a). 0.1 p; STJ. pH «9.0 b) 0.1 g GTI pH = 10.0

Das Produkt enthieltThe product contained

8.0 mol/p; 8.6 mol/g8.0 mol / p; 8.6 mol / g

n i «pi eln i «pi el

Kupplung von Polyvinylalkohol-Gel (PVA-Gel).Coupling of polyvinyl alcohol gel (PVA gel).

20 ml PVA-Gel werden in 20 ml Carbonatpuffer pH = 11 während 30 Minuten bei 25° C mit 1 ml DVS aktiviert. Nach Reinigung werden gekuppelt20 ml of PVA gel are dissolved in 20 ml of carbonate buffer pH = 11 activated for 30 minutes at 25 ° C with 1 ml DVS. To Cleaning are coupled

a) 10 ml Gel mit 0.1 g STI Produkt 2.25^mol/ga) 10 ml gel with 0.1 g STI product 2.25 ^ mol / g

b) .10 ml G-el mit 0.1 g Aminomethan-b) .10 ml G-EL with 0.1 g aminomethane

sulfönsäure · Produkt N = 0.027%.sulfonic acid · product N = 0.027%.

Beispiel 15Example 15

Kupplung an Polyacrylamid-Gel (PAA-GeI).Coupling to polyacrylamide gel (PAA-Gel).

• 10 ml Biogel P100 (Teilchengröße 100 bis 200 mesh.) werden in 10 ml Carbonatpuffer pH = 11 mit 0.5 ml DVS ' während 30 Minuten bei 25° G aktiviert. Nach Reinigung wird mit 80 mg STI in 5 ml Carbonatpuffer pH = 9.0 gekuppelt. Das Kupplungsprodukt enthielt 0.2 Mikromol STl..• 10 ml Biogel P100 (particle size 100 to 200 mesh.) are in 10 ml carbonate buffer pH = 11 with 0.5 ml DVS ' activated for 30 minutes at 25 ° G. After cleaning it will coupled with 80 mg STI in 5 ml carbonate buffer pH = 9.0. The coupling product contained 0.2 micromoles of STl ..

Beispiel 16Example 16

Kupplung an Polyvinyl-Pyridin-Divinylbenzol-Gel (PVP-DVB-GeI).Coupling to polyvinyl pyridine divinylbenzene gel (PVP-DVB-GeI).

5 ml DVP-DVB-GeI werden in 5 ml Carbonatpuffer pH 11.0 mit 0.25 ml DVS aktiviert. Nach Reinigung kuppelt man es bei pH 9.0 mit 30 mg STI. Das Produkt enthält 0.Λ5 Mikromol STI.5 ml of DVP-DVB-Gel are dissolved in 5 ml of carbonate buffer pH 11.0 activated with 0.25 ml DVS. After cleaning it is coupled pH 9.0 with 30 mg STI. The product contains 0.Λ5 micromoles of STI.

Beispiel 17 -Example 17 -

Kupplung von Lactose an Agarose.Coupling of lactose to agarose.

Die Aktivierung erfolgt wie in Beispiel 1, wobei 5 ml DVS auf 50 ml 6 % Agarose bei pH 10 verwendet werden·Activation takes place as in Example 1, wherein 5 ml DVS can be used on 50 ml 6% agarose at pH 10

Lactose wird im Carbonatpuffer pH 10 aufgelöst,und man läßt sie 15 Stunden lang bei 25° C mit dem aktivierten Gel reagieren. Das Produkt ist in der Lage Pflanzen-Agglutinine zu adsorbieren, wogegen das nicht aktivierte Gel diese Eigenschaft nicht' zeigt.Lactose is dissolved in carbonate buffer pH 10, and one leave them with the activated gel for 15 hours at 25 ° C react. The product is capable of plant agglutinins to adsorb, whereas the non-activated gel does not show this property.

Ein Vergleich zwischen der erfindungsgemäßen Divinylsulfon-Methode mit der Bromcyv-an- und Oxiran-Methode zeigt, daß . Divinylsulfon Proteine^ in vielen Fällen mit besserer Ausbeute kuppelt als es bei der Bromcyan-Methode der Fall ist. Die Divinylsulfon-Methode kuppelt auch aromatische Amine besser als die Bromcyan-Methode, möglicherweise aber nicht so gut wie die Oxiran-Methode.A comparison between the divinyl sulfone method of the invention with the Bromcyv-an- and Oxiran-Method shows that. Divinyl sulfone proteins ^ in many cases with better yield coupled than is the case with the cyanogen bromide method. The divinyl sulfone method also couples aromatic amines better than the cyanogen bromide method, but may not be as good as the oxirane method.

Im Gegensatz zur Oxiran-Methode und wie bei der Bromcyan-Methode kann die Aktivierung bei .Raumtemperatur öder darunter durchgeführt werden.In contrast to the oxirane method and as with the cyanogen bromide method, activation can take place at room temperature or below be performed.

Zur Stabilität der Produkte kann folgendes ausgeführt werden:The following can be carried out for the stability of the products will:

A. Stabilität des aktivierten Gel A. Stability of the activated gel

550 ml 6 % Agarose (üephadex 6B) werden in 500 ml Carbonatpuffer pH » 10.0 während 3 Stunden bei 25° C mit . 37·5 ml DVS aktiviert. Nach Heinigung wird eine Probe direkt mit Glycin bei pil = 10.0 Rokuppolt· Das Produkt enthielt 640 Mikromol Stickstoff/g.550 ml of 6% agarose (uephadex 6B) are in 500 ml of carbonate buffer pH »10.0 for 3 hours at 25 ° C with. 37 x 5 ml DVS activated. After cleaning there is a rehearsal directly with glycine at pil = 10.0 Rokuppolt · The product contained 640 micromoles nitrogen / g.

309839/1191309839/1191

von ,jo ?.() in! werden unter unLci-.'-.chi cdJ iclu-n Bedingungen aufbewahrt, wonach £;ie nach den angegebenen Lagerzeiten, wie oben erwähnt, mit Glycin gekuppelt wurden. Uabei wurden die folgenden ,Ergebnisse erhalten:from, jo ?. () in! are stored under unLci -.'-. chi cdJ iclu-n conditions, after which £; ie were coupled with glycine after the specified storage times, as mentioned above. The following results were obtained:

Lagerung /i mol N nach 11 Tagen bei 50°C ctmol N nach ' . ~ Tagen bei 230CStorage / 1 mol N after 11 days at 50 ° C ctmol N after '. ~ Days at 23 0 C

Alkohol - 620 640Alcohol - 620 640

Aceton · - 640Acetone · - 640

Dimethylsulfon ' 640 640Dimethyl sulfone '640 640

Pyridin 518 630Pyridine 518 630

Dioxan - " 650Dioxane - "650

Acetat-Puffer .Acetate buffer.

pH = 3.2 520 620pH = 3.2 520 620

Acetat-PufferAcetate buffer

pH = 4.0 530 . 590pH = 4.0 530. 590

Acetat-PufferAcetate buffer

pH - 5.0 480 520pH - 5.0 480 520

Phosphat-PufferPhosphate buffer

pH = 6.0 ' 390 470pH = 6.0 '390 470

Gefriergetrocknetes Produkt - 640Freeze-dried product - 640

Es kann somit als Ergebnis festgestellt werden,' daß die Aktivität im gefriergetrockneten Zustand selbst nach Tagen bei 23 C noch vollständig unverändert ist. Dasselbe gilt für eine große Anzahl von Lösungsmitteln. In der puffernden wässrigen Aufschlämmung ist die Aktivität bei pH 3 bis 5 relativ beständig, sie läßt jedoch bei höheren pH-Werten nach.It can thus be determined as a result that the Activity in the freeze-dried state is still completely unchanged even after days at 23 C. The same thing applies to a large number of solvents. In the buffering aqueous slurry is the activity at pH 3 to 5 relatively stable, but leaves at higher pH values according to.

309839/1191309839/1191

Λ 1>» 7^7 - 17 -Λ 1> » 7 ^ 7 - 17 -

B. Stabilität des p;t;kuppr;J Um Produkte;.;· ·B. Stability of the p; t; kuppr; J To products;.; · ·

250 ml des gemäß A aktivierten Produktes werden mit Glycin bei pH 10 gekuppelt. Es wird ein Produkt mit 640 Mikromol N erhalten. Proben hiervon werden unter verschiedenen Bedingungen verschieden lange Zeit.dauern aufbewahrt, wonach eine Stickstoffanalyse durchgeführt wird.250 ml of the product activated according to A are with Glycine coupled at pH 10. A product with 640 micromoles of N is obtained. Samples of this are below different conditions take different lengths of time stored, after which a nitrogen analysis is carried out.

Lagerungstorage .-^.raol N nach 11
Tagen bei 50° C.- ^. raol N after 11
Days at 50 ° C ^mol N nach 71
iagen bei 23° C^ mol N after 71
iagen at 23 ° C Acetat-Puffer ■
pH=3-2Acetate buffer ■
pH = 3-2 590590 630630 " pH=4.0"pH = 4.0 630630 630630 " pH=5.0"pH = 5.0 640640 630630 Pho sphat-Puffer
pH=6.0Pho sphat buffer
pH = 6.0 560560 630630 pH*7-0pH * 7-0 410410 630630 11 pH=8.0 11 pH = 8.0 400400 570570 11 pH=9.0 11 pH = 9.0 260260 570570

GefriergetrocknetesFreeze-dried

Produkt - 640Product - 640

Die gekuppelten Produkte zeigen eine bemerkenswert hohe Stabilität.The coupled products show a remarkably high stability.

Die Divinylsulfon-Methode läßt sich erheblich leichter auf den technischen Maßstab übertragen als die Bromcyan-Methode. Hinsichtlich der relativen Giftigkeit der Heagenzien läßt sich derzeit noch keine endgültige Beurteilung abgeben, es sprechen jedoch gute Gründe für die Annahme, daß die gleiche Vorsicht wie bei der Handhabung aller dier;c:r Memento gorochtiV:rtip;t int.The divinyl sulfone method is much easier to use transferred to the technical scale as the cyanogen bromide method. With regard to the relative toxicity of the substances, no final assessment can be made at the moment, it but there are good reasons to believe that the same caution as in the handling of all dier; c: r Memento gorochtiV: rtip; t int.

309839/1 191309839/1 191

A Vi Ψ>Ί - 1ft - A Vi Ψ> Ί - 1ft -

Er> ic;t n« türlich nuch tnc3f.j; L ic·, h, zuiiüchiit (Ja;; DViJ mit dom j?.u absorbierenden Molekül zu kuppeln und dnrm <iio Bindung mit dem Gel herbeizuführen. La diese Arbeitsweise ,iedoch zu weniger guten Ergebnissen führt, ist es deshalb bevorzugt,, das DVS in der ersten Stufe mit dem Gel reagieren zu lassen und dann die Kupplung in der zweiten Stufe durchzuführen, sofern nicht eine einstufige Arbeitsweise gewünscht wird. He ' ic; tn' of course also tnc3f. j ; L ic ·, h, zuiiüchiit (Ja ;; DViJ to couple with dom j? .U absorbent molecule and to bring about dnrm <iio binding with the gel. If this method of operation, however, leads to less good results, it is therefore preferred, that Allow DVS to react with the gel in the first stage and then carry out the coupling in the second stage, unless a one-step procedure is desired.

309839/1 191309839/1 191

Claims (1)

AnsprücheExpectations Verfahren zum chemischen Kuppeln eines quellbaren, in Wasser unlöslichen, insbesondere teilchenförmig vorliegenden Polymers mit Hydroxyl- und/oder primären und/oder sekundären Aminogruppen mit mindestens einer Verbindung oder einem Produkt mit vom Polymer verschiedener Struktur und mindestens einer Hydroxyl- und/oder primären und/oder sekundären Aminogruppe, dadurch gekennzeichnet, daß als Kupplungsmittel zur Bildung von Verknüpfungen zwischen dem Polymer und der anzukuppelnden Verbindung oder dem Produkt Bivinylsulfon oder ein Derivat hiervon mit mindestens zwei durch die Sulfongruppe aktivierten Vinylgruppen verwendet wird.Process for the chemical coupling of a swellable, water-insoluble, in particular in particulate form Polymers with hydroxyl and / or primary and / or secondary amino groups with at least one Compound or a product with a structure different from the polymer and at least one hydroxyl and / or primary and / or secondary amino group, characterized in that as a coupling agent for the formation of Linkages between the polymer and the compound to be coupled or the product bivinyl sulfone or a A derivative thereof having at least two vinyl groups activated by the sulfonic group is used. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer mit dem Bivinylsulfon zunächst unter Bildung eines beständigen Zwischenprodukts in einer ersten' Stufe aktiviert wird und dieses dann mit Hydroxyl- oder Amingruppcn enthaltenden Vorbindungen boi einer ,späteren Gelegenheit gekuppelt wird.Process according to Claim 1, characterized in that the polymer with the bivinyl sulfone initially forms a stable intermediate is activated in a first 'stage and this then with hydroxyl or Pre-bonds containing amine groups in one, later Opportunity is coupled. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierung und die Kupplung in einer einzigen Stufe durchgeführt werden.Process according to Claim 1, characterized in that the activation and the coupling are carried out in a single stage be performed. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierung bei einem pH von 8 .bis 12, vorzugsweise 9 bir, 11 ,durchgeführt wird.Method according to one of Claims 1 to 3, characterized in that that the activation is carried out at a pH of 8 to 12, preferably 9 to 11. 309839/1191309839/1191
DE19732312615 1972-03-14 1973-03-14 PROCESS FOR COUPLING COMPOUNDS WITH HYDROXYL AND / OR AMINO GROUPS TO POLYMERS Pending DE2312615A1 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE325272A SE361320B (en) 1972-03-14 1972-03-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE2312615A1 true DE2312615A1 (en) 1973-09-27

Family

ID=20261715

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19732312615 Pending DE2312615A1 (en) 1972-03-14 1973-03-14 PROCESS FOR COUPLING COMPOUNDS WITH HYDROXYL AND / OR AMINO GROUPS TO POLYMERS

Country Status (5)

Country Link
JP (1) JPS496065A (en)
DE (1) DE2312615A1 (en)
FR (1) FR2176033B3 (en)
GB (1) GB1423316A (en)
SE (1) SE361320B (en)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2430128A1 (en) * 1974-06-22 1976-01-15 Roehm Gmbh PROCESS FOR PRODUCING CARRIED POLYPEPTIDES
DE3434104A1 (en) * 1983-12-15 1985-08-29 Biomatrix Inc., Ridgefield, N.J. WATER-INSOLUBLE PREPARATION OF HYALURONIC ACID AND METHOD THEREFOR
DE3520008A1 (en) * 1984-12-06 1986-06-19 Biomatrix Inc HYALURONIC ACID GELS AND MIXED GELS AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL49752A (en) * 1975-07-09 1979-07-25 Kabi Ab Compositions having affinity for hepatitis virus and method for hepatitis virus removal or concentration
DE3019163C2 (en) 1980-05-20 1984-07-26 B.A.T. Cigaretten-Fabriken Gmbh, 2000 Hamburg Use of cellulose fibers containing amino groups as a material for tobacco smoke filters
SE470099B (en) * 1984-05-17 1993-11-08 Jerker Porath Sulfone activated thioether adsorbents for separation of eg protein
JPH01235593A (en) * 1988-03-15 1989-09-20 Fuji Photo Film Co Ltd Functional organic thin membrane
JPH01240188A (en) * 1988-03-18 1989-09-25 Fuji Photo Film Co Ltd Functional organic thin film
DK130991D0 (en) * 1991-07-04 1991-07-04 Immunodex K S POLYMER CONJUGATES
US20080045654A1 (en) * 2006-08-16 2008-02-21 Boston Scientific Scimed, Inc. Polymer particles including covalently bonded chemical species

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2430128A1 (en) * 1974-06-22 1976-01-15 Roehm Gmbh PROCESS FOR PRODUCING CARRIED POLYPEPTIDES
DE3434104A1 (en) * 1983-12-15 1985-08-29 Biomatrix Inc., Ridgefield, N.J. WATER-INSOLUBLE PREPARATION OF HYALURONIC ACID AND METHOD THEREFOR
DE3520008A1 (en) * 1984-12-06 1986-06-19 Biomatrix Inc HYALURONIC ACID GELS AND MIXED GELS AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF

Also Published As

Publication number Publication date
FR2176033A1 (en) 1973-10-26
FR2176033B3 (en) 1976-03-12
JPS496065A (en) 1974-01-19
SE361320B (en) 1973-10-29
GB1423316A (en) 1976-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2840503C2 (en) Process for the preparation of a solid porous material for chromatographic purposes
DE1768512C3 (en) Process for the preparation of chemically or biologically active derivatives of proteins, peptides and derivatives thereof which are insoluble in water
DE2319495A1 (en) PROCESS FOR SELECTIVE AND REVERSIBLE BINDING OF BIOMOLECULES TO ADSORBENTS
DE2805056A1 (en) ACTIVATED BASIC DIMENSIONS AND METHOD OF MANUFACTURING IT
DE2430356A1 (en) METHOD OF MARKING IMMUNOGLOBULIN OR ITS FC FRAGMENT AND MEANS OF CARRYING OUT THE METHOD
DE3039566A1 (en) METHOD FOR CLEANING INTERFERON
DE2312615A1 (en) PROCESS FOR COUPLING COMPOUNDS WITH HYDROXYL AND / OR AMINO GROUPS TO POLYMERS
DE3801053C2 (en)
WO2003011453A1 (en) Adsorber materials made of renewable raw materials, method for the production thereof and their use
DE69522564T2 (en) ALKALINE-RESISTANT PROTEIN ADSORBENT
CH628246A5 (en) METHOD FOR PRODUCING A PROTECTIVE PERTUSSIS ANTIGENT.
DE3435491A1 (en) 9-Aminoalkyl-8-hydroxyadenines and processes for their preparation
DE2551966C3 (en) Method of purifying urokinase
DE2307051C3 (en) Process for purifying α and β slow glycoproteins from microbial bodies and pharmaceutical compositions containing them
DE2534412A1 (en) IMMOBILIZED GLYCOENZYMS, METHOD FOR MANUFACTURING AND USING them
DE2823573A1 (en) IMMOBILIZED RESTRICTIONS-ENDONUCLEASES AND PROCEDURES FOR IMMOBILIZED RESTRICTIONS-ENDONUCLEASES
DE2061009A1 (en) Process for fixing polymers
DE3779914T2 (en) NEW LECTINE, DERIVED FROM BACTERIAL HAIR.
DE3490222T1 (en) Urokinase derivatives
DE2724081A1 (en) IMMOBILIZED, NON-SPECIFIC PROTEASES AND METHODS FOR PRODUCING THEREOF
DE2818086C2 (en) Carrier material for immobilizing enzymes and process for their production
DE1907365A1 (en) Process for the production of a cell-free penicillin acylase
DE2812609A1 (en) METHOD FOR PURIFYING CRUDE UROKINASE
DE2424118B2 (en) PROCESS FOR MANUFACTURING HIGHLY PURE KALLIKREIN
DE2819297A1 (en) PROCESS FOR SEPARATION AND CLEANING OF PRODUCTS WITH INTERFERONACTIVITY, THE PRODUCTS THEREOF AND THEIR USE AS ACTIVE INGREDIENTS

Legal Events

Date Code Title Description
OHA Expiration of time for request for examination