DE2312615A1

DE2312615A1 - Verfahren zum kuppeln von verbindungen mit hydroxyl- und/oder aminogruppen an polymere

Info

Publication number: DE2312615A1
Application number: DE19732312615
Authority: DE
Inventors: Jerker Olof Porath
Original assignee: Exploaterings TBF AB
Current assignee: Exploaterings TBF AB
Priority date: 1972-03-14
Filing date: 1973-03-14
Publication date: 1973-09-27
Also published as: GB1423316A; FR2176033A1; JPS496065A; SE361320B; FR2176033B3

Description

PATENTANWÄLTE

Dipl.-Ing. EIDENEIER Dlpl.-Chern. Dr, R U F F Dipl.-Ing. J. B EIE R

7 STUTTGART 1 Neck&retraße 5O Telefon 007113 22 70 51

12. März 1973 -

Anmelderin: Exploaterings Aktiebolaget T.B.F, Karlsrogatan 42
S-752 39 Uppsala / Schweden

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Verfahren zum Kuppeln von Verbindungen mit Hydroxyl- und/oder Aminogruppen an Polymere

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum chemischen Kuppeln eines quellbaren, im Wasser unlöslichen,insbesondere teilchenförmig vorliegenden Polymers mit Hydroxyl- und/oder primären und/oder sekundären Aminogruppen mit mindestens einer Verbindung oder einem Produkt mit vom Polymer verschiedener Struktur und mindestens einer Hydroxyl- und/oder primären und/oder sekundären Aminogruppe.

Molekülarschichten, Medien für die Verteilungachromatographie, Adsorptionschromatographie und Ionenaustauscher auf dor Grundlage unlöslicher Kohlenhydrate, wie Agar-Agar, vernetzte j>extrane und Cellulose,haben in aen letzten Jahren für die Herstellung von natürlichen Produkten in reiner Form,

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Poateohookkonto Stuttgart 4SO 3O · Dresdner Bank Stuttgart Konto OO11 341

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nicht zuletzt auch Proteine, mehr und mohr an Bedeutung gewonnen. Enzyme, die chemisch an unlösliche teilchenförmige Polysaccharide gekuppelt sind, haben sich in biochemischen Verfahren ebenfalls/als bräuchbar erwiesen, so z. B. bei der Herstellung von synthetischen Aminosäuren.

Die vorliegende Erfindung befaßt sich, mit der Herstellung eines Produktes, das in verschiedenartigen Ausführungsformen für Adsorptionsverfahren auf Grundlage von Ionenaustausch, biospezifischer Adsorption (z. B. Affinitätschromatographie) oder in enzym-katalysierten Reaktionen verwendet werden kann, bei welchen das erfindungsgemäße Gelprodukt als. Matrixmaterial dient.

Das erfindungsgemäße Produkt besteht aus zwei Komponenten, einem unlöslichen, z.B. -hydroxylhaltigen Polymer und einer Substanz, die z. B- Aminogruppen enthält, wobei die "beiden Komponenten mit Divinylsulfon chemisch miteinander gekuppelt sind. Wird das hydroxylhaltige Polymer schematisch mit (P^)-OH und das Amin mit R.HN-(^) bezeichnet,, dann kann die chemische Formel des erfindungsgemäßen Produkts symbolisch folgendermaßen wiedergegeben werden:

(P)-OCH₀-CIi₀UO₀-CH₀

wobei R^ Wasserstoff, Alkyl oder Aryl und (X) eine aliphatische, aromatische oder heterocyclische Gruppe sind. Das erfindungsgemäß hergestellte Produkt kann als Polymer in Teilchenform, z. B. in Perlenform, vorliegen, es kommen jedoch auch andere Formen in Frage.

Das Polymer kann anstelle oder gleichzeitig zusammen mit den Hydroxylgruppen auch Aminogruppen enthalt en, conau i:o wie die an das Polymer zu kuppelnde Verbindung Hydroxylgruppen zusammen mit oder anstelle der Aminogruppen enthalten kann.

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Es sind so zahlreiche Kombinationen möglich, es ist jedoch aus dem oben angeführten Beispiel leicht ersichtlich, in welcher Weise die Kupplungsreaktionen ablaufen.

Ein charakteristisches Kupplungsmittel für die Verknüpfung der Komponenten des Produkts ist Divinylsulfon

CH₂ = GH - SO₂ - CH - CH₂

bei dem beide Doppelbindungen der Vinylgruppen durch die dazwischenliegende SCU-Gruppe aktiviert sind. Andere analoge Verbindungen', die mindestens zwei mit einer oder mehreren SOp-Gruppen aktivierte Vinylgruppen enthalten; können ebenfalls verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Gelprodukt kann unter Anwendung der folgenden Heaktionsstufen hergestellt werden:

1) Aktivierung durch Reaktion von Divinylsulfon oder einem geeigneten Derivat hiervon mit einem unlöslichen PoIy-

- mer mit Hydroxyl- und/oder Aminogruppen in der Form von Gelteilchen unter Bedingungen, die zur Bildung eines reaktiven Gels führen. Die Bedingungen werden im einzelnen noch beschrieben.

2) Kupplung, bei der das reaktive Gel gemäß 1) in Kontakt mit einer Lösung einer Verbindung mit Hydroxylgruppen und/oder primären oder sekundären Aminogruppen gebracht wird, wobei die Verbindung chemisch an das Gel fixiert wird.

3) Möglicherweise eine dritte nachfolgende Stufe, in der daß Produkt nach 2) mit einom Absättä gun^.smittel zur Blockierung gegeben onf al In noch nicht um^oof-tzter im Gel verbliebener Vinylgruppen umgesetzt wird.

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Das Risiko einer verbleibenden Reaktivität ist besonders groß, wenn die Aminogruppen enthaltende gekuppelte· Substanz ein Protein oder eine Nucleinsäure ist. Eine chemische Desaktivierung kann in vielen Anwendungsfällen notwendige werden, wenn ein Kontakt mit Extrakten von Pflanzen, tierischen Organen und dergleichen anderenfalls zu einer chemischen Fixierung und zu unerwünschten Komponenten im Gelprodukt führen und dadurch seine Eigenschaften wesentlich verändern würde.

Als unlösliches hydroxylhaitiges Polymer kann ein Polysaccharide beispielsweise Gellusose, Agar-Agar, Agarose, Carrageen oder Mischungen dieser Materialien verwendet werden. Vernetztes Agar-Agar und Agarose sind besonders geeignet, wie auch Gelteilchen aus einer quervernetzten Mischung von Agar-Agar und einem Manan, z. B. Gummi aus Johannisbrotbohnen. Quervernetztes Dextran kann ebenfalls verwendet werden. Das Polymer braucht jedoch nicht notwendigerweise ein unlösliches Saccharid zu sein. Es kann auch eine synthetische hydroxylhaltige makromolekulare Substanz sein, wie z.B. quervernetzter Polyvinylalkohol.

Wie oben erwähnt, kann das Polymer auch Aminogruppen enthalten, so z. B. aus Aminopolystyrol bestehen. Polymere, die Hydroxylgruppen sowie auch Aminogruppen (Aminosäuren) enthalten, kommen ebenfalls in Frage.

Die Aktivierung gemäß'Stufe 1) wird in der Art durchgeführt, daß das Polymer mit dem Divinylsulfon in basischer Umgebung und vorzugsweise in Abwesenheit von Sauerstoff ' zur Reaktion gebracht wird. Wenn der pH-Wert zu niedrig i.^r3t, dann findet keine Reaktion statt, und wenn der pH-Wert zu hoch iöt, dann zorst-tzt sich dac Ln.vj nyl^ul fön odor j:ein Kupplungsprodukt mit 'dem hydroxylhaltigen Polymer hydrolytisch, so daß keine Aktivierung erhalten wird. Deshalb sollte die Reaktion in einem begrenzten pH-Bereich durch-

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geführt werden, der zwischen 8 und 12, vorzugsweise zwinchen 9 und 11 liegt, Die Aktivierungsreaktion kann bei niederen Temperaturen (0° C), Haumtemperatur oder erhöhten Temperaturen, ζ. Β. 4-0° C, durchgeführt werden. Im letzteren Falle sollte der pH-Wert nicht über 10 liegen. Lie Aktivierung wird in wässriger Lösung durchgeführt, sie kann aber auch in Mischungen von Wasser und organischen Lösungsmitteln, wie Alkohol, Dioxan oder Dirnethylsulfoxyd, vorgenommen werden.

Die Aminogruppen.enthaltende Substanz kann niedermolekular sein, z. B. ein aliphatisches, aromatisches oder heterocyclisches primäres oder sekundäres Amin. Bei verschiedenen Varianten des Gelprodukts kann das chemisch gekuppelte Amin eine Aminosäure, Peptid, Protein, Amino enthaltender Zucker, Nucleotid oder Polynucleotid, z. B. Nucleinsäure, sein. Bei der Kupplung von hydroxylhaltigen Vorbindungen über die Hydroxylgruppen können Agar-Agar oder Cellulose mit Alkoholen, wie Sorbit, oder mit Phenolen, wie Resorcin, substituiert werden.

Die Kupplungsreaktion gemäß Stufe 2) wird innerhalb eines pH-Intervalls von 4 bic 12, vorzugsweise 7 bis 10 durchgeführt. Aromatische Amine lassen sich am besten bei pH 9 bis 10,5 kuppeln.

Das Kuppeln von Hydroxylgruppen enthaltenden Verbindungen über die Hydroxylgruppen wird am besten bei pH 10 bis 11 durchgeführt.

Die Kupplungsreaktion wird im allgemeinen in wässriger Lönunp; durchgeführt, es können jedoch auch boir.piol «weise ' 11 iiif.huΐιμ,'^i nun Wnnrfr· und Alkohol odr-r Im/xnri VT-w^ririot worden. Die Kupplung fixidct boi Temporat,urf^%n zwinrhon ü und 20° C statt, sie kann aber auch bei höheren Temperaturen,

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A Vi ?f,7

ζ. B. 40 G, vorgenommen werden.

In besonderen Fällen, kann es erwünscht sein, das Gelprodukt in einer Stufe herzustellen, d. h. durch Verbinden der Substanz, die z. B. Aminogruppen enthält, mit der Polymermatrix in Gegenwart von Divinylsulfon. Beispiele hierfür, sind unten angegeben.

Die-Blockierung restlicher Vinylgruppen in Stufe 3) wird vorteilhafterweise durchgeführt, indem die verminderten nicht umgesetzten Vinylgruppen mit Aminoverbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, z. B. Glycin oder A'thanolamin, umgesetzt werden. Die Reaktion wird vorteilhafterweise in einer Lösung von 1M Glycin bei Raumtemperatur während einer Lauer von 24 Stunden in neutraler oder leicht alkalischer Umgebung durchgeführt.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist das Gelprodukt ein Adsorptionsmittel und gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, bei der das aminhaltige Element ein Enzym ist, ist das Gelprodukt ein Katalysator. Ein Beispiel für die letztere Ausführungsform ist Trypsin-Agar-Agar-Gel, das durch Kuppeln von Trypsin an quervernetztes Agar-Agar mit Divinylsulfon hergestellt wurde. Dieses Gel hat proteolytische Aktivität, d. h. es katalysiert die Hydrolyse von Proteinen, und es adsorbiert auch Sojabohneninhibitor (biospezifische Adsorption) und kann daher zur Herstellung reinen Sojabohneninhibitors aus Sojaextrakt verwendet werden.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich auD ob η folgenden Beispielen von Aucführun^slormen der Erfindung zur Herstellung des Gelproduktu.

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Beispiel 1

Kupplung von Sojabohneninhibitor (STI) an mit Divinylsulfon aktivierte Agarose.

a) Aktivierung

20 ml sedimentierte Agarose (Sepharose 6B) wird mit destiliertem Wasser auf einem Glasfilter gereinigt. Das Gel wird dann in ein Reaktionsgefäß überführt, das 20 ml Carbonatpuffer pH 11.0 und 0.6 ml Divinylsulfon enthält. Man läßt die Reaktion unter Rühren 20 Minuten lang bei 25° C fortlaufen, wonach sie durch Erniedrigendes pH auf 7-0 mit HGL beendet wird. Das aktivierte Gel wird auf einem Glasfilter mit Wasser und Carbonatpuffer pH 9*0 gesäubert.

b) Kupplung

10 ml aktiviertes Gel werden mit 60 mg STI umgesetzt, das in 10 ml Carbonatpui'fer pH 9*0 gelöst ist. Man läßt die Kupplungsreaktion unter Rühren, während 20 Stunden bei 25° C ablaufen, wonach nicht gekuppelter Inhibitor aus dem Gel mit Garbonatpuffer pH 9'.0,der 1 M NaCl enthält, destilliertem Wasrer, Glycinpuffer pH 3-0 mit 1 M NaCl und letztlich Trispuffer pH 7-8 mit 0.5 M NaCl ausgewaschen wird.

Die Kupplungsausbeute wurde bestimmt durch Aminosäureanalyse und ergab 3·9 Mikroäquivalente STl/g Konjugat oder 90 mg STl/g Konjugat. Die prozentuale Ausbeute betrug 90 %. Die verbleibenden 10 % STI können durch erneute Kupplung mit im wesentlichen voller Aktivität (90 %) verknüpft werden.

Die somit erzielbare Ausbeute liegt um 50 % höher als die- jenign, die bir;hnr mit der BrON-Mothode erhüJtlich war.

Die Aktivität des gekuppelten Inhibitors wurde durch Bestimmung der Adsorption von Trypsin auf dem Konjugat geprüft.

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A 1,767 . ■ -β-

Eine TrypsinlÖsung (1 mg/ml) wird durch ein Bett aus STI-Agarose geleitet,^ 8 ml bei pH 7.8 (0.05 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.02 M Ca ⁺~). Inaktive Enzyme laufen regelrecht durch, ohne festgehalten oder verzögert zu werden. Aktives Trypsin wird festgehalten und kann durch Erniedrigung des pH auf 5.0 (0.05 :

werden

(0.05 M Glycin, 0.5 M NaCl, 0.02 M Ca²⁺) wieder desorbiert

Das auf diese Weise aus handelsüblichem Trypsin gewonnene gereinigte Enzym besitzt eine 30 % höhere Aktivität als das handelsübliche Enzym. Die\ Menge an adsorbiertem und desorbiertem Trypsin betrug 15 mg, d. h. 2 mg Trypsin/ml Gel.

Beispiel 2

Kupplung von Trypsin an mit Divinylsulfon (DVS)-aktivierte Agarose. .

a) Aktivierung

Die Aktivierung wird in der gleichen Weise vorgenommen wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß die Konzentration von DVS auf 1 ml erhöht wurde. - ■

b) Kupplung -,.'.-■

10 ml aktiviertes Gel werden mit '50 mg Trypsin, das in 70 ml Phosphatpuffer pH 8.0 gelöst ist, umgesetzt und drei Tage· lang bei 5° C gerührt. Das Produkt wird entsprechend Beispiel 1 gereinigt, und die Kupplungsausbeute betrug 2.Q Mikroäquivalente/g Konjugat, d. h.'48 mg Trypsin/g Konjugat. Las erhaltene Produkt war aktiv.

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Beispiel 5

Kupplung von DL-Penicillamin an DVS-aktivierte Agarose

a) Aktivierung

Die Aktivierung wurde wie. in Beispiel 2 durchgeführt,

b) Kupplung

10 ml aktiviertes Gel wird unter Rühren mit 100 mg Penicillamin, das in 10 ml Phosphatpuffer pH 8.0 gelöst ist, während drei Tagen bei 25° G umgesetzt. Das Produkt wurde wie in Beispiel 1 gereinigt.

Der Stickstoffgehalt wurde nach Kjeldahl bestimmt, und die Kupplungsausbeute wurde aus dem Stickstoffgehalt gerechnet, der O.52 % betrug. Kupplung bei einem höheren pH führte zu keiner Erhöhung der Ausbeute.

Beispiel 4

Kupplung von Sulfanilamid an mit DVS-aktivierte Agarose

a) Die Aktivierung wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt.

b) Kupplung

10 ml aktiviertes Gel wird mit 200 ml SuI f .anilamid, das in 10 ml Carbonatpuffer pH 10 gelöst ist, unter Rühren während 20 Stunden bei 20° G umgesetzt. Das Produkt wird wie in Boinpinl 1 pjorcinißb und analysiert;, um den Stickstoffgehalt nach Kjeldahl. zu bestimmen. Die Ausbeute wurde aus dem Stickstoffgehalt errechnet, der bei 0.44 % lag.

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Kupplung von Glycyl-L-leucin an mit LVS-aktivierte Agarose

a) Die Aktivierung wurde wie in Beispiel 2 durchgeführt.

b) Kupplung

10 ml aktiviertes Gel wurden mit 160 mg Glycyl-L-leucin, das in 10 ml Phosphatpuffer pH 8.0 gelöst ist, unter Rühren während 20 Stunden bei 25° G umgesetzt. Das Produkt wurde wie in Beispiel 1 gereinigt. Die Kupp— lungsausbeute wurde durch Aminosäureanalyse des Konjugats bestimmt und betrug 208 Mikroäquivalente Gly-L-Leu/g Konjugat.

Beispiel 6

Kupplung von p-Phenylendiamin an 6 % Agar-Agar.

Aktivierung ,

10 ml eines 6 %igen Agar-Agar wird in 10 ml Carbonatpuffer pH 11 mit 0.5 ml DVS 30 Minuten lang bei 25° C aktiviert.

. Kupplung

150 mg p-Phenylendiamin werden 5 nil aktivem Gel iii 5 ml Garbonatpuffer pH 11 zugegeben. Nach dem üblichen Waschen ergibt die Stickstoffanalyse einen Gehalt von 270 Mikromol/g Trockensubstanz.

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Beispiel 7

Kupplung von Adenosin-Monophosphat (AMP) an 6 % Agarose (Sepharose 6B).

Die Aktivierung"wird in üblicher Weise durchgeführt mit 6 ml 6 %iger Agarose (Sepharose 6B) in 10 ml Carbonatpuffer pH 11.0 und 0.5 ml DVS während 30 Minuten bei 25° C.

Die Kupplung wird durchgeführt mit 8 g aktiviertem Gel in 10 ml Carbonatpuffer pH 11.2 und 200 mg AMP. Nach der üblichen Reinigung erhält man ein gekuppeltes Produkt mit 0.138 % Stickstoff entsprechend 16 Mikromol AMP/g Trockensubstanz.

Beispiel 8

Kupplung von AMP an 6 %ige Agarose (Sepharose 6B) in einer einzigen Stufe.

0.5 ml DVS werden einer Lösung von 100 mg AMP in 10 ml Carbonatpuffer pH 10.0 zugegeben. Nach 30 Minuten bei 40° C werden 10 ml 6 %ige Agarose (Sepharose 6B) zugegeben. Nach der üblichen Reinigung erhält man ein Produkt mit einem Gehalt von 0.082 % Stickstoff.

Beispiel 9

Kupplung von DNA (Deoxyribonucleinsäure) an Agarose. Durch Kupplung in einer Beispiel 8 analogen Weise wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

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Ausgangsmaterial Produkt

2 % Agarose + 0.3 % DVS ' %N » 0.081

0.5 % Agar-Agar +. 0.3 % DVS " %N = 0.058 2 % Epichlorhydrin quervernetzt

2 % Agarose + 0.3 % DVS %N = 0.022

Beispiel 10

Kupplung an quervernetztes Dextran (Sephadex).

Ausgangsmaterial: 50 mi quervernetztes Dextran CSephadex "G 25) in 50 ml Carbonatpuffer pH = 1T.0 aktiviert mit 2.5 ml DVS während 30 Minuten bei 25° C. Nach Reinigung wird die Kupplung mit 10 ml Gel und den folgenden Substanzen durchgeführt:

' . Endprodukt

a) 0.2 g Rivanol (2~Äthoxy - 6.9 - Diamin-

oacridin) pH = 11 0.019

b). 0.2 g Aminoguanidin pH » 9.0 0.134

c) 0.2 g " pH = 11 0.600

d) 0.2 g Aminomethansulfonsäure pH = 9 0.145

Beispiel.11

Kupplung an Cellulose'

JiI Munktoll No. ^OO-Cellulosepulver für die Zonen- ^loktroly.Mo und [J,^:iu.lrnchromntop;rnphj ο wird ηΊ ti -Α»«ρ;«ΐ«Β«- nmt.erial verwendet, im V\x£Ϊer gequollen und .dann, ßedlmontiert. 30 ml Gel in 30 ml Garbonatpuffer werden bei pH

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während 30 Minuten bei £ίί)° U mit 1.5 ml DVL! uktiviert, worauf die folgenden Kupplungen durchgeführt werden:

a) 0.1 g Aminoguanidin

b) .0.1 g Aminomethansulfonsäure

c) 0.1 g Glycyl-L-leucin

%N in Endprodukt

0.133
0.018

38.7

Beispiel 12

Kupplung an 6 % Agarose (Sephadex 6B).

Der Versuch wurde entsprechend Beispiel 11 durdjgelühit ud. es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

%N in Endprodukt

a) 0.1 g Aminoguanidin pH = 11.0 1.05

b) 0.1 g Aminomethansulfonsäure pH =10 0.15^

c) 0.1 g " pH » 9 0.193

d) 0.1 g Glycyl-L-leucin pH = 11 277 >ä mol/g

Beispiel 13

Kupplung von quervernetztem Dextran (Sephadex G-200) mit Trypsininhibitor (STI).

20 ml Sephadex G-200 in 20 ml Carbonatpuffer werden bei pH = 11 während 30. Minuten und 25° C mit 1 ml LVS aktiviert. Das gereinigte Gel wurde gekuppelt mit

a). 0.1 p; STJ. pH « 9.0 b) 0.1 g GTI pH =10.0

Das Produkt enthielt

8.0 mol/p; 8.6 mol/g

n i «pi el

Kupplung von Polyvinylalkohol-Gel (PVA-Gel).

20 ml PVA-Gel werden in 20 ml Carbonatpuffer pH = 11 während 30 Minuten bei 25° C mit 1 ml DVS aktiviert. Nach Reinigung werden gekuppelt

a) 10 ml Gel mit 0.1 g STI Produkt 2.25^mol/g

b) .10 ml G-el mit 0.1 g Aminomethan-

sulfönsäure · Produkt N = 0.027%.

Beispiel 15

Kupplung an Polyacrylamid-Gel (PAA-GeI).

• 10 ml Biogel P100 (Teilchengröße 100 bis 200 mesh.) werden in 10 ml Carbonatpuffer pH = 11 mit 0.5 ml DVS ' während 30 Minuten bei 25° G aktiviert. Nach Reinigung wird mit 80 mg STI in 5 ml Carbonatpuffer pH = 9.0 gekuppelt. Das Kupplungsprodukt enthielt 0.2 Mikromol STl..

Beispiel 16

Kupplung an Polyvinyl-Pyridin-Divinylbenzol-Gel (PVP-DVB-GeI).

5 ml DVP-DVB-GeI werden in 5 ml Carbonatpuffer pH 11.0 mit 0.25 ml DVS aktiviert. Nach Reinigung kuppelt man es bei pH 9.0 mit 30 mg STI. Das Produkt enthält 0.Λ5 Mikromol STI.

Beispiel 17 -

Kupplung von Lactose an Agarose.

Die Aktivierung erfolgt wie in Beispiel 1, wobei 5 ml DVS auf 50 ml 6 % Agarose bei pH 10 verwendet werden·

Lactose wird im Carbonatpuffer pH 10 aufgelöst,und man läßt sie 15 Stunden lang bei 25° C mit dem aktivierten Gel reagieren. Das Produkt ist in der Lage Pflanzen-Agglutinine zu adsorbieren, wogegen das nicht aktivierte Gel diese Eigenschaft nicht' zeigt.

Ein Vergleich zwischen der erfindungsgemäßen Divinylsulfon-Methode mit der Bromcyv-an- und Oxiran-Methode zeigt, daß . Divinylsulfon Proteine^ in vielen Fällen mit besserer Ausbeute kuppelt als es bei der Bromcyan-Methode der Fall ist. Die Divinylsulfon-Methode kuppelt auch aromatische Amine besser als die Bromcyan-Methode, möglicherweise aber nicht so gut wie die Oxiran-Methode.

Im Gegensatz zur Oxiran-Methode und wie bei der Bromcyan-Methode kann die Aktivierung bei .Raumtemperatur öder darunter durchgeführt werden.

Zur Stabilität der Produkte kann folgendes ausgeführt werden:

A. Stabilität des aktivierten Gel

550 ml 6 % Agarose (üephadex 6B) werden in 500 ml Carbonatpuffer pH » 10.0 während 3 Stunden bei 25° C mit . 37·5 ml DVS aktiviert. Nach Heinigung wird eine Probe direkt mit Glycin bei pil = 10.0 Rokuppolt· Das Produkt enthielt 640 Mikromol Stickstoff/g.

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von ,jo ?.() in! werden unter unLci-.'-.chi cdJ iclu-n Bedingungen aufbewahrt, wonach £;ie nach den angegebenen Lagerzeiten, wie oben erwähnt, mit Glycin gekuppelt wurden. Uabei wurden die folgenden ,Ergebnisse erhalten:

Lagerung /i mol N nach 11 Tagen bei 50°C ctmol N nach ' . ~ Tagen bei 23⁰C

Alkohol - 620 640

Aceton · - 640

Dimethylsulfon ' 640 640

Pyridin 518 630

Dioxan - " 650

Acetat-Puffer .

pH = 3.2 520 620

Acetat-Puffer

pH = 4.0 530 . 590

Acetat-Puffer

pH - 5.0 480 520

Phosphat-Puffer

pH = 6.0 ' 390 470

Gefriergetrocknetes Produkt - 640

Es kann somit als Ergebnis festgestellt werden,' daß die Aktivität im gefriergetrockneten Zustand selbst nach Tagen bei 23 C noch vollständig unverändert ist. Dasselbe gilt für eine große Anzahl von Lösungsmitteln. In der puffernden wässrigen Aufschlämmung ist die Aktivität bei pH 3 bis 5 relativ beständig, sie läßt jedoch bei höheren pH-Werten nach.

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B. Stabilität des p;t;kuppr;J Um Produkte;.;· ·

250 ml des gemäß A aktivierten Produktes werden mit Glycin bei pH 10 gekuppelt. Es wird ein Produkt mit 640 Mikromol N erhalten. Proben hiervon werden unter verschiedenen Bedingungen verschieden lange Zeit.dauern aufbewahrt, wonach eine Stickstoffanalyse durchgeführt wird.

Lagerung	.-^.raol N nach 11 Tagen bei 50° C	^mol N nach 71 iagen bei 23° C
Acetat-Puffer ■ pH=3-2	590	630
" pH=4.0	630	630
" pH=5.0	640	630
Pho sphat-Puffer pH=6.0	560	630
pH*7-0	410	630
¹¹ pH=8.0	400	570
¹¹ pH=9.0	260	570

Gefriergetrocknetes

Produkt - 640

Die gekuppelten Produkte zeigen eine bemerkenswert hohe Stabilität.

Die Divinylsulfon-Methode läßt sich erheblich leichter auf den technischen Maßstab übertragen als die Bromcyan-Methode. Hinsichtlich der relativen Giftigkeit der Heagenzien läßt sich derzeit noch keine endgültige Beurteilung abgeben, es sprechen jedoch gute Gründe für die Annahme, daß die gleiche Vorsicht wie bei der Handhabung aller dier;c:r Memento gorochtiV:rtip;t int.

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A Vi Ψ>Ί - 1ft -

Er> ic;t n« türlich nuch tnc3f.^j; L ic·, h, zuiiüchiit (Ja;; DViJ mit dom j?.u absorbierenden Molekül zu kuppeln und dnrm <iio Bindung mit dem Gel herbeizuführen. La diese Arbeitsweise ,iedoch zu weniger guten Ergebnissen führt, ist es deshalb bevorzugt,, das DVS in der ersten Stufe mit dem Gel reagieren zu lassen und dann die Kupplung in der zweiten Stufe durchzuführen, sofern nicht eine einstufige Arbeitsweise gewünscht wird.

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Claims

Ansprüche

Verfahren zum chemischen Kuppeln eines quellbaren, in Wasser unlöslichen, insbesondere teilchenförmig vorliegenden Polymers mit Hydroxyl- und/oder primären und/oder sekundären Aminogruppen mit mindestens einer Verbindung oder einem Produkt mit vom Polymer verschiedener Struktur und mindestens einer Hydroxyl- und/oder primären und/oder sekundären Aminogruppe, dadurch gekennzeichnet, daß als Kupplungsmittel zur Bildung von Verknüpfungen zwischen dem Polymer und der anzukuppelnden Verbindung oder dem Produkt Bivinylsulfon oder ein Derivat hiervon mit mindestens zwei durch die Sulfongruppe aktivierten Vinylgruppen verwendet wird.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer mit dem Bivinylsulfon zunächst unter Bildung eines beständigen Zwischenprodukts in einer ersten' Stufe aktiviert wird und dieses dann mit Hydroxyl- oder Amingruppcn enthaltenden Vorbindungen boi einer ,späteren Gelegenheit gekuppelt wird.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierung und die Kupplung in einer einzigen Stufe durchgeführt werden.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierung bei einem pH von 8 .bis 12, vorzugsweise 9 bir, 11 ,durchgeführt wird.

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