DE2258080C3 - Verfahren zur Gewinnung von Hexatriacontapeptiden - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von HexatriacontapeptidenInfo
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Description
worin
X = Pro, Y = Gin, Z = GIu, Z' = GIu, oder
X = Pro, Y = VaI, Z = GIu, Z' = GIu, oder
X = Ser, Y = Gin, Z = GIu, Z' = GIu, oder
X = Pro, Y = VaI, Z = GIu, Z' = Asn, oder
X = Pro. Y = VaI, Z = Asn, Z' = GIu
bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß man Rinder-, Schweine-, Schaf- oder Human-Pankreata
a) in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel bis zn einem nahezu einulgierten Zustand
mahlt,
b) die gemahlenen Drüsen mit wäßrigem Alkohol, der auf etwa pH 2,8 angesäuert ist, behandelt,
c) die unlöslichen Gewebesubstanzen durch Filtration abtrennt,
d) die Lösung durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak auf pH 8 bis 8,5 einstellt,
e) bei diesem pH-Wert Fette und Ammoniumphosphat durch Fällung abtrennt,
f) mit einer Säure auf einen pH-Wert von etwa 5,2
einstellt,
g) diese Lösung mit einer Mischung van Diäthyläther und Äthanol verdünnt, 12 oder mehr
Stunden stehen läßt, und danach
h) den abgeschiedenen Niederschlag gewinnt,
i) das so erhaltene, getrocknete Polypeptid-Gemisch in Essigsäure aufnimmt, die Lösung an
Sephadex® G-50 (fein) Chromatographien und mit dem sauren Medium eluiert,
j) die einschlägigen Fraktionen zu einer trockenen Substanz lyophilisiert und diese in einer
Harnstoff enthaltenden, auf einen pH-Wert von etwa 9,0 eingestellten Pufferlösung aufnimmt,
k) die so erhaltene Lösung an Diäthylaminoäthyl
cellulose Chromatographien und mit der glei
chen Pufferlösung eluiert,
1) das Eluat an Sephadex® G - 25 (grob) Chromatographien und mit wäßriger Essigsäure eluiert
und
m) das jeweilige Hexatriacontapeptid durch Lyophilisieren des Eluats isoliert
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Hexatriacontapeptiden der Formel
H2N-AIa-X-LeU-GIu-PrO- Y-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asp-Ala-Thr-Pro-Z-GIn-Met-Ala-Gln-Tyr-AIa-Ala-Z'-l
12
18
24 25
'-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr — C — NH2,
30 36
55
χ _ pro, Y - Gin, Z - GIu, Z' - GIu, oder
X - Pro, Y - VaI, Z = GIu, Z' - GIu, oder X - Ser, Y - Gin, Z - GIu, Z' - GIu, oder
X - Pro, Y - VaI, Z - GIu, Z' - Asn, oder
X - Pro, Y - VaI, Z = Asn, Z' - GIu
bedeuten.
Aus der DE-AS 21 38 848 ist bereits ein Verfahren
zur Abtrennung von Glucagon aus Pankreas-Extrakten, die außer Glucagon Insulin und insulinähnliche Polypeptide enthalten, bekannt. Nach diesem Verfahren
überführt man den Extrakt in eine im wesentlichen wäßrige Lösung, stellt diese auf einen pH-Wert im
Bereich von 7 bis 8 ein, leitet die Lösung bei einer Temperatur unter etwa 5° C über die Alkali- oder
Erdalkalimetallform eines sulfonierten weitmaschigen Styrol-Divinylbenzol-Copolymeren, wäscht das Harz
mit dem daran adsorbierten Glucagon mit einer Pufferlösung bei pH 7 bis 8 und eluiert das Glucagon
dann mit einer verdünnten wäßrigen Lösung einer Base.
Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Gewinnung von neuen Hexatriacontapeptiden aus
Rinder-, Schweine-, Schaf- oder Human-Pankreata, die interessante biologische Wirkungen zeigen. So verstärken sie die Darmmobilität, verengen den Gallengang
und entspannen die Gallenblase. Sie können daher als Veterinärabführmittel verwendet werden, die keine
orale Verabreichung erfordern.
Gegenstand der Erfindung ist daher das Verfahren gemäß Patentanspruch.
nenen Hexatriacontapeptide entsprechen der folgenden Formel
HjN-Ala-X-Leu-Glu-Pro-Y-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asp-Ala-Thr-Pro-Z-Gln-Met-AIa-Gln-Tyr-Ala-Ala-Z'-Leu-Arg
1 12 13 18 24 25
LArg-Tyr-IIe-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr —C —NH2,
30 36
worin in Abhängigkeit von dem für die Gewinnung eingesetzten Ausgangsmaterial X, Y, Z und Z' die
folgenden Bedeutungen besitzen:
X | Y | Z | Z' | |
Rind | Pro | GIn | GIu | GIu |
Schwein | Pro | VaI | GIu | GIu |
Schaf | Set | GIn | GIu | GIu |
Mensch | Pro | Vai | Giu | Asn oder |
Pro | VaI | Asn | GIu |
15
20
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Hexatriacontapeptide sind in handelsüblichem
kristallinem Insulin in niedrigeD Konzentrationen enthalten. In höheren Konzentrationen liegen sie in dem
rohen Pankreasextrakt vor, der bei der Abtrennung von Insulin erzeugt wird und in der Fachwelt als
»Salzkuchen« bekannt ist Das Produkt ist in der so Mutterlauge des alkalischen Insulin-Kristallisationsverfahrens
enthalten und ist daraus extrahiert worden. Es kann ferner aus Pankreas selbst und aus rohen flüssigen
Pankreasextrakten extrahiert werden.
Erfindungsgemäß geht man vorzugsweise von ganzem Pankreas aus, der sauber aus dem Körper eines
frisch getöteten Tieres herausgelöst wurde, beispielsweise bei der Fleischgewinnung. Die Drüse wird
abgewaschen und sofort eingefroren. Wenn sie länger als für kurze Zeit aufbewahrt werden soll, wird sie in
gefrorenem Zustand gehalten. Die verwendete Drüsenmenge ist nicht wesentlich, für eine zweckmäßige
Ausbeute von 30 bis 50 mg Produkt werden jedoch etwa 10 kg benötigt Alle folgenden Arbeitsgänge, die
anschließend beschrieben werden, werden sauber, hygienisch, nach Bedarf aseptisch und bei 4 ± 0,5° C
durchgeführt Lösungsmittel und ähnliche Stoffe werden bei der angegebenen Temperatur eingeführt.
Die Drüse wird bis zu einem fast emulgierten Zustand fein gemahlen und dann mit wäßrigem Alkohol versetzt,
der auf etwa pH 2,8 angesäuert ist Die erhaltene Aufschlämmung wird gerührt und dann werden
unlösliche Gewebesubstanzen durch Filtration entfernt. Die betreffende Fraktion befindet sich in der Lösung.
Zur Einstellung des benötigten pH-Werts können Phosphorsäure, Salzsäure, Schwefelsäure und andere
Säuren verwendet werden.
Die gewebefreie saure Lösung wird durch vorsichtige Zugabe von wäßrigem Ammoniak auf pH 8 bis 8,5
eingestellt. Bei diesem pH-Wert scheiden sich aus dem erhaltenen konzentrierten Präparat etwas Fett und
Ammoniumphosphat ab. Die Lösung wird abgetrennt, beispielsweise durch Dekantieren, Filtrieren oder beide
Maßnahmen.
Die gewonnene Lösung wird dann auf einen pH-Wert von etwa 5,2 eingestellt, beispielsweise mit Essigsäure.
Diese Lösung wird dann mit einer Mischung von 4 Vol.-Teilen Diäthyläther und 2 Vol.-Teilen Äthanol
verdünnt Die Mischung wird über Nacht oder für eine äquivalente oder längere Zeitdauer stehengelassen. In
dieser Zeit scheiden sich fast alle Proteine, darunter das gewünschte Hexatriacontapeptid ab. Die erhaltene
Suspension wird zentrifugiert und der Niederschlag wird gewonnen. Der Niederschlag wird im Vakuum vom
Wasser befreit zur Entfernung restlicher Fette, falls vorhanden, mit Äther gewaschen und dann im Vakuum
von restlichem Äther befreit Das getrocknete Produkt wird dann in molarer Essigsäure aufgenommen. In dem
sauren Medium lösen sich verschiedene Proteine. Die Lösung wird hierauf an einer Kolonne mit Sephadex®
G-50 (fein) Chromatographien, wodurch eine Trennung ungefähr nach dem Molekulargewicht erfolgt
Glucagon hat ein Molekulargewicht von etwa 3500. Die erfindungsgemäß gewonnenen Hexatriacontapeptide
besitzen ein Molekulargewicht von etwa 4200, bei einer Bestimmung der Rinderform genau 4231, während
Insulin ein Molekulargewicht von etwa 5800 aufweist
Ferner enthält Glucagon einen Tryptophanrest, durch den das Molekül in gewissem Ausmaß die Fähigkeit zur
Sorption auf Sephadex· erhält Aus diesem Grund ist die Trennung von Glucagon und des neuen Proteins mit
Sephadex® etwas besser als auf Grund des Molekulargewichts allein zu erwarten wäre. Erfindungsgemäß wird
daher die Trennung mit Sephadex® bevorzugt
Nach diesem Verfahren werden die Hexatriacontapeptide und einige andere von Stoffen geschieden, die in
diesem Zusammenhang nicht von Interesse sind. Das Eluat kann mittels Ultraviolettabsorption überwacht
werden. Dabei wird jede Proteineluatbande durch eine starke Absorption bei 276 bis 280 ηιμπι angezeigt Wenn
die Abnahme eines solchen Extinktionsmaximums festgestellt wird, wird das Auffanggefäß gewechselt und
gegebenenfalls nochmals gewechselt, wenn das Auftreten eines weiteren Extinktionsmaximums beobachtet
wird. Bei einer anderen Arbeitsweise werden die Auffanggefäße nach einem Zeitplan gewechselt und
durch visuelle Beobachtung oder mittels eines Meßblattes mit Zeitkoordinate festgestellt, welche getrennt
aufgefangenen Proben von Interesse sind. Die Fraktion, die das gewünschte Hexatriacontapeptid enthält,
enthält gewöhnlich auch Insulin und Glucagon.
Diese Mischung wird dann bei der bevorzugten Arbeitsweise zu einer trockenen Substanz lyophilisiert.
Diese trocken« Substanz wird dann in einer Pufferlösung aufgenommen, die 0,01 molar in bezug auf
Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 0,001 molar in bezug auf Tetranatriumätnylendiamintetraacetat und 7 molar
in bezug auf Harnstoff ist, und der pH-Wert der entstandenen Lösung (ursprünglich etwa 11) wird mit
HCI auf etwa 9,0 eingestellt.
Wenn die trockene Substanz in einer ausreichenden Mindestmenge des Puffers völlig gelöst ist, wird die
entstandene Lösung durch eine Kolonne mit Diäthylaminoäthylcellulose unter Verwendung weiterer Anteile
der gleichen Pufferlösung als Eluiermittel chromato-
graphiert.
Bei dieser Elution werden Spuren von unerwünschten Stoffen, die hier nicht von Interesse sind, zuerst eluiert,
gefolgt von Glucagon. Nach dem Glucagon wird das erfindungsgemäß angestrebte Hexatriacontapeptid sauber
eluiert Bei der hier beschriebenen bevorzugten Arbeitsweise bleibt Insulin in der Chromatographiekolonne
gebunden. Es kann, wenn dies gewünscht wird, mittels stärkerer Salzlösungen eluiert werden, diese
Maßnahme bildet jedoch keinen Teil der Erfindung.
Das Eluat in Pufferlösung wird dann an einer Kolonne
mit Sephadex® G-25 (grob) mit 2%iger wäßriger Essigsäure als Eluiermittel chromatographiert. In dieser
Stufe werden nichtvväßrige Pufferkomponenten fast vollständig entfernt Die erhaltene Lösung wird erneut
lyophilisiert und das getrocknete Produkt, das nach dem Lyophilisieren verbleibt, ist das erfindungsgemäße
Hexatriacontapeptid.
Die saubere Durchführung der vorher im einzelnen beschriebenen Stufen führt mit Zuverlässigkeit zu dem
Produkt Das Produkt läßt sich jedoch gewünschtenfalls leicht folgendermaßen weiter charakterisieren. Eine
bevorzugte erste Charakterisierungsmethode ist die Analyse auf die N-terminale Aminosäure. Dazu wird ein
Teil des Produkts in bekannter Weise mit 1-DimethylaminonaphthaIin-5-sulfonylchlorid
umgesetzt, das ein N-terminales Addukt bildet Das Addukt wird hydrolysiert,
wodurch die terniinale Aminosäure als solches Addukt entfernt wird. Dieses wird dann einer
Dünnschichtchromatographie unterworfen und im Ultraviolettlicht auf einen einzigen fluoreszierenden Fleck
des 1 -Dimethylaminonaphthalin-S-sulfonylchlorid-Addukts
von Alanin geprüft
Wenn die Ergebnisse dieses Tests befriedigend ausfallen, wird das Produkt durch Polyacrylamidscheibengel-EIektrophorese
in einem Trisborat-Puffer in einer Produktionskonzentration von 0,1% geprüft. Nach 2 Stunden bei einem konstanten elektrophoretischen
Strom von 2 mAmpere wird das Gel mit Coomassie-Brilliantblau in einer Konzentration von
etwa 0,025% in 10%iger wäßriger Trichloressigsäure angefärbt. Dieser Test soll eine einzelne blaue Zone mit
beträchtlicher Dichte ergeben, die dem erfindungsgemäß angestrebten Hexatriacontapeptid entspricht.
Wenn dieser Test befriedigende Ergebnisse liefert, 4-, kann mit der Probe gewünschtenfalls eine partielle oder
vollständige Aminosäurensequenzanalyse durchgeführt werden.
Das trockene isolierte Produkt ist eine weiße kristalline Substanz, die sich beim Erwärmen zersetzt,
bevor eine definierte Schmelztemperatur festgestellt wird. Die Analyse durch eine Folge von subtraktiven
Edman-Schritten führt zu der vorher angegebenen Struktur.
Die erfindungsgemäß gewonnenen Hexatriaconta- π
peptide sind als Veterinärabführmittel vorteilhaft, das keine orale Verabreichung erfordert. Für solche Zwecke
werden sie in bekannter Art und Weise so verabreicht, daß das Polypeptid undenaturiert in den Blutstrom
gelangt. Die Verabreichung des Mittels führt zu einer (,ο
unwillkürlichen Defalcation des Dickdarminhalts. Wenn
eine rasche Wirkung gewünscht wird, wird es intravenös verabreicht. Wenn eine länger anhaltende Wirkung, die
langsamer einsetzt, gewünscht wird, wird es als Depot verabreicht, aus dem es langsam in den Blutstrom br>
abgegeben wird, z. B. subkutan in einem Gebiet mit guter peripherer Kreislaufversorgung.
Die Dosierungsmengen werden entsprechend der Tierart, der Stärke der gewünschten Wirkung und
anderen Faktoren eingestellt, die üblicherweise bei der Festlegung von Dosierungsmengen berücksichtigt werden.
Bei Hunden wurden mit dem erfindungsgemäßen Produkt bei intravenösen Injektionen von 5 bis 50 μg
pro kg Körpergewicht gute Ergebnisse erzielt, was als allgemeine Richtlinie dienen kann. Dosierungen von nur
0,5 μg pro kg sind ebenfalls wirksam.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung
der Erfindung.
Aus menschlichem Pankreas gewonnenes Hexatriacontapeptid (HPP)
Man gewinnt bei Autopsien etwa 10 kg Humanpankreas und lagert ihn bei -20° C. Nach dem Vermählen
bereitet man unter Anwendung der Verfahrensweise von Keller et al (J. Biol. Chem. 223 (1956) 457—467) aus
jedem Pankreasansatz (1 bis 2 kg pro Ansatz) eine Aufschlämmung in Aceton, Wv/oei diese Behandlung
unmittelbar nach der Lieferung des Pankreata in das Laboratorium erfolgt Die mit Aceton gebildeten Pulver
mit einem Gesamtgewicht von 3 kg werden einzeln nach der Methode von Jackson et al (Diabetes 18 (1969)
2Of. -211) extrahiert, mit dem Unterschied, daß man pro
Gramm des pulverförmigen Materials 65%iges angesäuertes Äthanol (mit Phosphorsäure auf einen
pH-Wert von 2,8 angesäuert) verwendet, um das während des Entfettungsvorgangs beseitigte Wasser zu
kompensieren. Normalerweise extrahiert man jedes Gramm des feuchten Gewebes mit 2,5 ml angesäuertem
82%igem Äthanol (auf einen pH-Wert von 2,8 mit Phosphorsäure angesäuert).
Zur Herstellung des HPP verwendet man die herkömmliche Methode zur Bereitung von Insulin in
Laboratoriumsmaßstab. Die vereinigten Äthanol/ Äther-Niederschläge machen insgesamt 160 g aus.
Dieses pulverförmige Material wird an Sephadex® G —50F chromatographiert, um die insulinhaltige
Fraktion zu gewinnen. In dieser Weise bildet man aus 17
Ansätzen 1700 mg dieses Materials. Diese rohe, lyophilisierte Insulinfraktion wird in 245 ml 0,005 η
Chlorwasserstoffsäure bei 25° C gelöst Dann gibt man langsam unter Rühren ein gleich großes Volumen
30%iger Natriumchloridlösung, die mit Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 3,0 angesäuert
worden ist, zu zentrifugiert den gebildeten Niederschlag nach 15 Minuten ab, entsalzt ihn durch eine Chromatographie
an Sephadex® G —25C und lyophilisiert. Die erhaltene Probe mit einem Gewicht von 550 mg wird an
Diäthylaminoäthylcellulose bei einem pH-Wert von 8 chromatographiert, wobei man 65 mg rohes HPP und
2'jO mg hochreines Insulin erhält. Man gewinnt
hochreines HPP aus dem rohen HPP-Präparat durch Chromatograpiiie an Sephadex® G —50F gefolgt von
einer Chromatographie an Diäthylaminoäthylcellulose bei einem pH-Wert von 9.
Beispiele 2bis4
Nach der Verfahrensweise von Beispie! 1 bereitet man Rinder-Hexatriacontapeptid (BPP), Schweine-I Iexatriacontapeptid
(PPP) und Schaf-Hexatriacontapeptid (OPP), indem man von Rinder-, Schweine- bzw.
Schafpankreas ausgeht. Die Aminosäurezusammensetzung der erhaltenen Hexatriacontapeptide sind in der
nachstehenden Tabelle zusammengestellt.
7 8
Aminosäurezusammensetzung der aus Pankreas gewonnenen llexatriacontapeptide
Rinder-Ilexatna- | Schweine-Hexatria- | Schaf-Hexalria- | |
contapeptid (BPI') | contapeptid (PPP) | contapeptid (OPP) | |
Lysin | _ | 0,05 | 0,09 |
Histidin | - | 0,07 | 0,06 |
Arginin | 4.00 (4) | 3.92 (4) | 3,85 (4) |
Asparaginsäure | 3.00 (3) | 3.03 (3) | 3.11 (3) |
Thrcoin | 1.79 (2) | 1,82 (2) | 1,93 (2) |
Serin | - | 0.13 | 1.06 (1) |
Glutaminsäure | 6.19 (6) | 5.09 (5) | 5.85 (6) |
Prolin | 5.13 (5) | 4,90 (5) | 3,68 (4) |
CiIvein | ι is <n | ι η i\\ | !.09 i!) |
Alanin | 4.83 (5) | 4,72 (5) | 4,90 (5) |
Valin | - | 1.01 (I) | 0,11 |
Methionin | 2,08 (2) | 1.77 (2) | 1.69 (2) |
Isoleucin | 0.94 (I) | 0,98 (1) | 1.00 (1) |
Leucin | 3.02 (3) | 3.02 (3) | 3.10 (3) |
Tyrosin | 3.74 (4) | 3.70 (4) | 3.83 (4) |
Phenylalanin | - | - | 0,16 |
Gesamtzahl von | 36 | 36 | 36 |
Resten | |||
NII.-terminaler Rest | Alanin | Alanin | Alanin |
Claims (1)
- Patentanspruch: Verfahren zur Gewinnung von Hexatriacontapetiden der FormelHiN-Ala-X-Leu-GIu-Pro-Y-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asp-Ala-Thr-Pro-Z-Gin-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-AIa-Z'-Leu-A 1 12 13 18 24 25LArg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr — C—NH2, 30 36
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19722258080 DE2258080C3 (de) | 1972-11-27 | 1972-11-27 | Verfahren zur Gewinnung von Hexatriacontapeptiden |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19722258080 DE2258080C3 (de) | 1972-11-27 | 1972-11-27 | Verfahren zur Gewinnung von Hexatriacontapeptiden |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2258080A1 DE2258080A1 (de) | 1974-05-30 |
DE2258080B2 DE2258080B2 (de) | 1981-04-23 |
DE2258080C3 true DE2258080C3 (de) | 1981-12-17 |
Family
ID=5862842
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19722258080 Expired DE2258080C3 (de) | 1972-11-27 | 1972-11-27 | Verfahren zur Gewinnung von Hexatriacontapeptiden |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE2258080C3 (de) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4033941A (en) * | 1975-12-17 | 1977-07-05 | Eli Lilly And Company | Process for purifying glucagon |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3715345A (en) * | 1970-08-03 | 1973-02-06 | Lilly Co Eli | Glucagon separation process |
-
1972
- 1972-11-27 DE DE19722258080 patent/DE2258080C3/de not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE2258080A1 (de) | 1974-05-30 |
DE2258080B2 (de) | 1981-04-23 |
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