DE2258080C3

DE2258080C3 - Verfahren zur Gewinnung von Hexatriacontapeptiden

Info

Publication number: DE2258080C3
Application number: DE19722258080
Authority: DE
Inventors: William Eugene Indianapolis Ind. Jones
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1972-11-27
Filing date: 1972-11-27
Publication date: 1981-12-17
Also published as: DE2258080A1; DE2258080B2

Description

worin

X = Pro, Y = Gin, Z = GIu, Z' = GIu, oder X = Pro, Y = VaI, Z = GIu, Z' = GIu, oder X = Ser, Y = Gin, Z = GIu, Z' = GIu, oder X = Pro, Y = VaI, Z = GIu, Z' = Asn, oder X = Pro. Y = VaI, Z = Asn, Z' = GIu

bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß man Rinder-, Schweine-, Schaf- oder Human-Pankreata

a) in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel bis zn einem nahezu einulgierten Zustand mahlt,

b) die gemahlenen Drüsen mit wäßrigem Alkohol, der auf etwa pH 2,8 angesäuert ist, behandelt,

c) die unlöslichen Gewebesubstanzen durch Filtration abtrennt,

d) die Lösung durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak auf pH 8 bis 8,5 einstellt,

e) bei diesem pH-Wert Fette und Ammoniumphosphat durch Fällung abtrennt,

f) mit einer Säure auf einen pH-Wert von etwa 5,2

einstellt,

g) diese Lösung mit einer Mischung van Diäthyläther und Äthanol verdünnt, 12 oder mehr Stunden stehen läßt, und danach

h) den abgeschiedenen Niederschlag gewinnt,

i) das so erhaltene, getrocknete Polypeptid-Gemisch in Essigsäure aufnimmt, die Lösung an Sephadex® G-50 (fein) Chromatographien und mit dem sauren Medium eluiert,

j) die einschlägigen Fraktionen zu einer trockenen Substanz lyophilisiert und diese in einer Harnstoff enthaltenden, auf einen pH-Wert von etwa 9,0 eingestellten Pufferlösung aufnimmt, k) die so erhaltene Lösung an Diäthylaminoäthyl cellulose Chromatographien und mit der glei

chen Pufferlösung eluiert,

1) das Eluat an Sephadex® G - 25 (grob) Chromatographien und mit wäßriger Essigsäure eluiert und

m) das jeweilige Hexatriacontapeptid durch Lyophilisieren des Eluats isoliert

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Hexatriacontapeptiden der Formel H₂N-AIa-X-LeU-GIu-PrO- Y-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asp-Ala-Thr-Pro-Z-GIn-Met-Ala-Gln-Tyr-AIa-Ala-Z'-l

12 18

24 25

'-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr — C — NH₂, 30 36

55

χ _ pro, Y - Gin, Z - GIu, Z' - GIu, oder X - Pro, Y - VaI, Z = GIu, Z' - GIu, oder X - Ser, Y - Gin, Z - GIu, Z' - GIu, oder X - Pro, Y - VaI, Z - GIu, Z' - Asn, oder X - Pro, Y - VaI, Z = Asn, Z' - GIu

bedeuten.

Aus der DE-AS 21 38 848 ist bereits ein Verfahren zur Abtrennung von Glucagon aus Pankreas-Extrakten, die außer Glucagon Insulin und insulinähnliche Polypeptide enthalten, bekannt. Nach diesem Verfahren überführt man den Extrakt in eine im wesentlichen wäßrige Lösung, stellt diese auf einen pH-Wert im Bereich von 7 bis 8 ein, leitet die Lösung bei einer Temperatur unter etwa 5° C über die Alkali- oder Erdalkalimetallform eines sulfonierten weitmaschigen Styrol-Divinylbenzol-Copolymeren, wäscht das Harz mit dem daran adsorbierten Glucagon mit einer Pufferlösung bei pH 7 bis 8 und eluiert das Glucagon dann mit einer verdünnten wäßrigen Lösung einer Base.

Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Gewinnung von neuen Hexatriacontapeptiden aus Rinder-, Schweine-, Schaf- oder Human-Pankreata, die interessante biologische Wirkungen zeigen. So verstärken sie die Darmmobilität, verengen den Gallengang und entspannen die Gallenblase. Sie können daher als Veterinärabführmittel verwendet werden, die keine orale Verabreichung erfordern.

Gegenstand der Erfindung ist daher das Verfahren gemäß Patentanspruch.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewon-

nenen Hexatriacontapeptide entsprechen der folgenden Formel

HjN-Ala-X-Leu-Glu-Pro-Y-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asp-Ala-Thr-Pro-Z-Gln-Met-AIa-Gln-Tyr-Ala-Ala-Z'-Leu-Arg 1 12 13 18 24 25

^LArg-Tyr-IIe-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr —C —NH₂, 30 36

worin in Abhängigkeit von dem für die Gewinnung eingesetzten Ausgangsmaterial X, Y, Z und Z' die folgenden Bedeutungen besitzen:

	X	Y	Z	Z'
Rind	Pro	GIn	GIu	GIu
Schwein	Pro	VaI	GIu	GIu
Schaf	Set	GIn	GIu	GIu
Mensch	Pro	Vai	Giu	Asn oder
	Pro	VaI	Asn	GIu

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Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Hexatriacontapeptide sind in handelsüblichem kristallinem Insulin in niedrigeD Konzentrationen enthalten. In höheren Konzentrationen liegen sie in dem rohen Pankreasextrakt vor, der bei der Abtrennung von Insulin erzeugt wird und in der Fachwelt als »Salzkuchen« bekannt ist Das Produkt ist in der so Mutterlauge des alkalischen Insulin-Kristallisationsverfahrens enthalten und ist daraus extrahiert worden. Es kann ferner aus Pankreas selbst und aus rohen flüssigen Pankreasextrakten extrahiert werden.

Erfindungsgemäß geht man vorzugsweise von ganzem Pankreas aus, der sauber aus dem Körper eines frisch getöteten Tieres herausgelöst wurde, beispielsweise bei der Fleischgewinnung. Die Drüse wird abgewaschen und sofort eingefroren. Wenn sie länger als für kurze Zeit aufbewahrt werden soll, wird sie in gefrorenem Zustand gehalten. Die verwendete Drüsenmenge ist nicht wesentlich, für eine zweckmäßige Ausbeute von 30 bis 50 mg Produkt werden jedoch etwa 10 kg benötigt Alle folgenden Arbeitsgänge, die anschließend beschrieben werden, werden sauber, hygienisch, nach Bedarf aseptisch und bei 4 ± 0,5° C durchgeführt Lösungsmittel und ähnliche Stoffe werden bei der angegebenen Temperatur eingeführt.

Die Drüse wird bis zu einem fast emulgierten Zustand fein gemahlen und dann mit wäßrigem Alkohol versetzt, der auf etwa pH 2,8 angesäuert ist Die erhaltene Aufschlämmung wird gerührt und dann werden unlösliche Gewebesubstanzen durch Filtration entfernt. Die betreffende Fraktion befindet sich in der Lösung. Zur Einstellung des benötigten pH-Werts können Phosphorsäure, Salzsäure, Schwefelsäure und andere Säuren verwendet werden.

Die gewebefreie saure Lösung wird durch vorsichtige Zugabe von wäßrigem Ammoniak auf pH 8 bis 8,5 eingestellt. Bei diesem pH-Wert scheiden sich aus dem erhaltenen konzentrierten Präparat etwas Fett und Ammoniumphosphat ab. Die Lösung wird abgetrennt, beispielsweise durch Dekantieren, Filtrieren oder beide Maßnahmen.

Die gewonnene Lösung wird dann auf einen pH-Wert von etwa 5,2 eingestellt, beispielsweise mit Essigsäure. Diese Lösung wird dann mit einer Mischung von 4 Vol.-Teilen Diäthyläther und 2 Vol.-Teilen Äthanol verdünnt Die Mischung wird über Nacht oder für eine äquivalente oder längere Zeitdauer stehengelassen. In dieser Zeit scheiden sich fast alle Proteine, darunter das gewünschte Hexatriacontapeptid ab. Die erhaltene Suspension wird zentrifugiert und der Niederschlag wird gewonnen. Der Niederschlag wird im Vakuum vom Wasser befreit zur Entfernung restlicher Fette, falls vorhanden, mit Äther gewaschen und dann im Vakuum von restlichem Äther befreit Das getrocknete Produkt wird dann in molarer Essigsäure aufgenommen. In dem sauren Medium lösen sich verschiedene Proteine. Die Lösung wird hierauf an einer Kolonne mit Sephadex® G-50 (fein) Chromatographien, wodurch eine Trennung ungefähr nach dem Molekulargewicht erfolgt

Glucagon hat ein Molekulargewicht von etwa 3500. Die erfindungsgemäß gewonnenen Hexatriacontapeptide besitzen ein Molekulargewicht von etwa 4200, bei einer Bestimmung der Rinderform genau 4231, während Insulin ein Molekulargewicht von etwa 5800 aufweist

Ferner enthält Glucagon einen Tryptophanrest, durch den das Molekül in gewissem Ausmaß die Fähigkeit zur Sorption auf Sephadex· erhält Aus diesem Grund ist die Trennung von Glucagon und des neuen Proteins mit Sephadex® etwas besser als auf Grund des Molekulargewichts allein zu erwarten wäre. Erfindungsgemäß wird daher die Trennung mit Sephadex® bevorzugt

Nach diesem Verfahren werden die Hexatriacontapeptide und einige andere von Stoffen geschieden, die in diesem Zusammenhang nicht von Interesse sind. Das Eluat kann mittels Ultraviolettabsorption überwacht werden. Dabei wird jede Proteineluatbande durch eine starke Absorption bei 276 bis 280 ηιμπι angezeigt Wenn die Abnahme eines solchen Extinktionsmaximums festgestellt wird, wird das Auffanggefäß gewechselt und gegebenenfalls nochmals gewechselt, wenn das Auftreten eines weiteren Extinktionsmaximums beobachtet wird. Bei einer anderen Arbeitsweise werden die Auffanggefäße nach einem Zeitplan gewechselt und durch visuelle Beobachtung oder mittels eines Meßblattes mit Zeitkoordinate festgestellt, welche getrennt aufgefangenen Proben von Interesse sind. Die Fraktion, die das gewünschte Hexatriacontapeptid enthält, enthält gewöhnlich auch Insulin und Glucagon.

Diese Mischung wird dann bei der bevorzugten Arbeitsweise zu einer trockenen Substanz lyophilisiert. Diese trocken« Substanz wird dann in einer Pufferlösung aufgenommen, die 0,01 molar in bezug auf Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 0,001 molar in bezug auf Tetranatriumätnylendiamintetraacetat und 7 molar in bezug auf Harnstoff ist, und der pH-Wert der entstandenen Lösung (ursprünglich etwa 11) wird mit HCI auf etwa 9,0 eingestellt.

Wenn die trockene Substanz in einer ausreichenden Mindestmenge des Puffers völlig gelöst ist, wird die entstandene Lösung durch eine Kolonne mit Diäthylaminoäthylcellulose unter Verwendung weiterer Anteile der gleichen Pufferlösung als Eluiermittel chromato-

graphiert.

Bei dieser Elution werden Spuren von unerwünschten Stoffen, die hier nicht von Interesse sind, zuerst eluiert, gefolgt von Glucagon. Nach dem Glucagon wird das erfindungsgemäß angestrebte Hexatriacontapeptid sauber eluiert Bei der hier beschriebenen bevorzugten Arbeitsweise bleibt Insulin in der Chromatographiekolonne gebunden. Es kann, wenn dies gewünscht wird, mittels stärkerer Salzlösungen eluiert werden, diese Maßnahme bildet jedoch keinen Teil der Erfindung.

Das Eluat in Pufferlösung wird dann an einer Kolonne mit Sephadex® G-25 (grob) mit 2%iger wäßriger Essigsäure als Eluiermittel chromatographiert. In dieser Stufe werden nichtvväßrige Pufferkomponenten fast vollständig entfernt Die erhaltene Lösung wird erneut lyophilisiert und das getrocknete Produkt, das nach dem Lyophilisieren verbleibt, ist das erfindungsgemäße Hexatriacontapeptid.

Die saubere Durchführung der vorher im einzelnen beschriebenen Stufen führt mit Zuverlässigkeit zu dem Produkt Das Produkt läßt sich jedoch gewünschtenfalls leicht folgendermaßen weiter charakterisieren. Eine bevorzugte erste Charakterisierungsmethode ist die Analyse auf die N-terminale Aminosäure. Dazu wird ein Teil des Produkts in bekannter Weise mit 1-DimethylaminonaphthaIin-5-sulfonylchlorid umgesetzt, das ein N-terminales Addukt bildet Das Addukt wird hydrolysiert, wodurch die terniinale Aminosäure als solches Addukt entfernt wird. Dieses wird dann einer Dünnschichtchromatographie unterworfen und im Ultraviolettlicht auf einen einzigen fluoreszierenden Fleck des 1 -Dimethylaminonaphthalin-S-sulfonylchlorid-Addukts von Alanin geprüft

Wenn die Ergebnisse dieses Tests befriedigend ausfallen, wird das Produkt durch Polyacrylamidscheibengel-EIektrophorese in einem Trisborat-Puffer in einer Produktionskonzentration von 0,1% geprüft. Nach 2 Stunden bei einem konstanten elektrophoretischen Strom von 2 mAmpere wird das Gel mit Coomassie-Brilliantblau in einer Konzentration von etwa 0,025% in 10%iger wäßriger Trichloressigsäure angefärbt. Dieser Test soll eine einzelne blaue Zone mit beträchtlicher Dichte ergeben, die dem erfindungsgemäß angestrebten Hexatriacontapeptid entspricht.

Wenn dieser Test befriedigende Ergebnisse liefert, 4-, kann mit der Probe gewünschtenfalls eine partielle oder vollständige Aminosäurensequenzanalyse durchgeführt werden.

Das trockene isolierte Produkt ist eine weiße kristalline Substanz, die sich beim Erwärmen zersetzt, bevor eine definierte Schmelztemperatur festgestellt wird. Die Analyse durch eine Folge von subtraktiven Edman-Schritten führt zu der vorher angegebenen Struktur.

Die erfindungsgemäß gewonnenen Hexatriaconta- π peptide sind als Veterinärabführmittel vorteilhaft, das keine orale Verabreichung erfordert. Für solche Zwecke werden sie in bekannter Art und Weise so verabreicht, daß das Polypeptid undenaturiert in den Blutstrom gelangt. Die Verabreichung des Mittels führt zu einer (,ο unwillkürlichen Defalcation des Dickdarminhalts. Wenn eine rasche Wirkung gewünscht wird, wird es intravenös verabreicht. Wenn eine länger anhaltende Wirkung, die langsamer einsetzt, gewünscht wird, wird es als Depot verabreicht, aus dem es langsam in den Blutstrom b^r> abgegeben wird, z. B. subkutan in einem Gebiet mit guter peripherer Kreislaufversorgung.

Die Dosierungsmengen werden entsprechend der Tierart, der Stärke der gewünschten Wirkung und anderen Faktoren eingestellt, die üblicherweise bei der Festlegung von Dosierungsmengen berücksichtigt werden. Bei Hunden wurden mit dem erfindungsgemäßen Produkt bei intravenösen Injektionen von 5 bis 50 μg pro kg Körpergewicht gute Ergebnisse erzielt, was als allgemeine Richtlinie dienen kann. Dosierungen von nur 0,5 μg pro kg sind ebenfalls wirksam.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Aus menschlichem Pankreas gewonnenes Hexatriacontapeptid (HPP)

Man gewinnt bei Autopsien etwa 10 kg Humanpankreas und lagert ihn bei -20° C. Nach dem Vermählen bereitet man unter Anwendung der Verfahrensweise von Keller et al (J. Biol. Chem. 223 (1956) 457—467) aus jedem Pankreasansatz (1 bis 2 kg pro Ansatz) eine Aufschlämmung in Aceton, Wv/oei diese Behandlung unmittelbar nach der Lieferung des Pankreata in das Laboratorium erfolgt Die mit Aceton gebildeten Pulver mit einem Gesamtgewicht von 3 kg werden einzeln nach der Methode von Jackson et al (Diabetes 18 (1969) 2Of. -211) extrahiert, mit dem Unterschied, daß man pro Gramm des pulverförmigen Materials 65%iges angesäuertes Äthanol (mit Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 2,8 angesäuert) verwendet, um das während des Entfettungsvorgangs beseitigte Wasser zu kompensieren. Normalerweise extrahiert man jedes Gramm des feuchten Gewebes mit 2,5 ml angesäuertem 82%igem Äthanol (auf einen pH-Wert von 2,8 mit Phosphorsäure angesäuert).

Zur Herstellung des HPP verwendet man die herkömmliche Methode zur Bereitung von Insulin in Laboratoriumsmaßstab. Die vereinigten Äthanol/ Äther-Niederschläge machen insgesamt 160 g aus. Dieses pulverförmige Material wird an Sephadex® G —50F chromatographiert, um die insulinhaltige Fraktion zu gewinnen. In dieser Weise bildet man aus 17 Ansätzen 1700 mg dieses Materials. Diese rohe, lyophilisierte Insulinfraktion wird in 245 ml 0,005 η Chlorwasserstoffsäure bei 25° C gelöst Dann gibt man langsam unter Rühren ein gleich großes Volumen 30%iger Natriumchloridlösung, die mit Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 3,0 angesäuert worden ist, zu zentrifugiert den gebildeten Niederschlag nach 15 Minuten ab, entsalzt ihn durch eine Chromatographie an Sephadex® G —25C und lyophilisiert. Die erhaltene Probe mit einem Gewicht von 550 mg wird an Diäthylaminoäthylcellulose bei einem pH-Wert von 8 chromatographiert, wobei man 65 mg rohes HPP und 2'jO mg hochreines Insulin erhält. Man gewinnt hochreines HPP aus dem rohen HPP-Präparat durch Chromatograpiiie an Sephadex® G —50F gefolgt von einer Chromatographie an Diäthylaminoäthylcellulose bei einem pH-Wert von 9.

Beispiele 2bis4

Nach der Verfahrensweise von Beispie! 1 bereitet man Rinder-Hexatriacontapeptid (BPP), Schweine-I Iexatriacontapeptid (PPP) und Schaf-Hexatriacontapeptid (OPP), indem man von Rinder-, Schweine- bzw. Schafpankreas ausgeht. Die Aminosäurezusammensetzung der erhaltenen Hexatriacontapeptide sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt.

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Tabelle

Aminosäurezusammensetzung der aus Pankreas gewonnenen llexatriacontapeptide

	Rinder-Ilexatna-	Schweine-Hexatria-	Schaf-Hexalria-
	contapeptid (BPI')	contapeptid (PPP)	contapeptid (OPP)
Lysin	_	0,05	0,09
Histidin	-	0,07	0,06
Arginin	4.00 (4)	3.92 (4)	3,85 (4)
Asparaginsäure	3.00 (3)	3.03 (3)	3.11 (3)
Thrcoin	1.79 (2)	1,82 (2)	1,93 (2)
Serin	-	0.13	1.06 (1)
Glutaminsäure	6.19 (6)	5.09 (5)	5.85 (6)
Prolin	5.13 (5)	4,90 (5)	3,68 (4)
CiIvein	ι is <n	ι η i\\	!.09 i!)
Alanin	4.83 (5)	4,72 (5)	4,90 (5)
Valin	-	1.01 (I)	0,11
Methionin	2,08 (2)	1.77 (2)	1.69 (2)
Isoleucin	0.94 (I)	0,98 (1)	1.00 (1)
Leucin	3.02 (3)	3.02 (3)	3.10 (3)
Tyrosin	3.74 (4)	3.70 (4)	3.83 (4)
Phenylalanin	-	-	0,16
Gesamtzahl von	36	36	36
Resten
NII.-terminaler Rest	Alanin	Alanin	Alanin

Claims

Patentanspruch: Verfahren zur Gewinnung von Hexatriacontapetiden der Formel

HiN-Ala-X-Leu-GIu-Pro-Y-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asp-Ala-Thr-Pro-Z-Gin-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-AIa-Z'-Leu-A 1 12 13 18 24 25

^LArg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr — C—NH₂, 30 36