DE2243066A1 - Verfahren zur herstellung von (pyro) glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosylglycyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid - Google Patents

Description

DIP L.-C H E M. DR. VOLKERVOSSIUS siebebtstrasse a

PHONE· 474075

PATENTANWALT _CABLE address: benzolpatent München

I Sep. 1972

u.Z.: K 068 (Vo/Mü/kä)
Case D-I-8I63 (071 - 02)

DAIICHI SEIYAKU CO., LTD.
Tokyo, Japan

¹¹ Verfahren zur Herstellung von (Pyro)glutamyl-histidyltryptophyl-seryl-tyrosyl-glycyl-leucyl-arginyl-prolylglycinamid " ·

Priorität: 2. September 1971, Japan, Nr. 67 745/71

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von (Pyro)-glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-glycyl-leucylarginyl-prolyl-glycinamid.

Dieses im folgenden mit RH abgekürzte Decapeptid bewirkt eine Freisetzung des luteinisierenden Hormons (im folgenden mit LH abgekürzt) und des Follikel-stimulierenden Hormons (im folgenden als FSH abgekürzt). RH konnte aus Kalbshypothalamus gewonnen und seine Aminosäuresequenz bestimmt werden.

Bisher waren weder ein Syntheseverfahren für RH noch dessen physikalische Eigenschaften bekannt. Im allgemeinen ist die Synthese von Polypeptiden zwar theoretisch möglich, aber schwierig durchzuführen und häufig erfolglos, auch wenn die Aminosäurezusammensetzung und die Aminosäuresequenz bekannt ist. Diese Schwierigkeiten beruhen darauf, daß die für einen geplan-

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ten Syntheseweg benötigten Oligopeptidfragmente unerwartete physikalische Eigenschaften aufweisen oder die Reinigung zur Entfernung von Nebenprodukten unmöglich ist.

Aus diesem Grund wird im allgemeinen die schrittweise Verlängerung von Aminosäuren als geeignetstes Syntheseverfahren zur Herstellung von Polypeptiden angesehen. Dieses Verfahren ist jedoch sehr unwirtschaftlich und eignet sich nur zu Forschungszwecken.

Zur Bildung von Peptidbindungen sind eine Reihe von Verfahren bekannt. Zur kommerziellen Herstellung von solchen langkettigen Polypeptiden benötigt man jedoch einen Syntheseweg, der über Fragmente der langen Sequenz oder über eine geeignete Kombination des Einsatzes von Fragmenten und der schrittweisen Verlängerung verläuft. Theoretisch sind zahlreiche Kombinationsmöglichkeiten von Fragmenten für die Herstellung solcher langkettiger Polypeptide möglich. Abgesehen von dieser großen Zahl von Kombinationsmöglichkeiten sind jedoch die meisten Oligopeptidfragmente neue Verbindungen, deren physikalische Eigenschaften unbekannt sind, so daß bei der Auffindung des geeignetsten Synthesewegs viele Probleme zu lösen sind, z.B. welche Schutzgruppen für die Fragmente und welche Art von Kupplungareaktionen verwendet werden können.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Synthese von RH zur Verfugung zu stellen, das wirtschaftlich durchführbar ist und eine Lösung der vorgenannten Probleme bringt.

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Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von (Pyrojglutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-glycylleucyl-arginyl-prolyl-glycinamid, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

A. Leucyl-(N-geschütztes)arginyl-prolyl-glycinamid (I), das durch Kuppeln von geschütztem Arginin mit an der Carboxylgruppe geschütztem Prolin zu Arginyl-prolin, Kuppeln des Arginylprolins mit Glycinamid zu Arginyl-prolyl-glycinamid, Kuppeln dieses Produktes an der endständigen NHp-Gruppe mit Leucin und Entfernen der Schutzgruppe an der NHp-Gn¹PP⁶ des Leucylrestes hergestellt worden ist, mit

B. (N- und O-geschütztes) Seryl-(0-geschütztes)tyrosyl-glycin (II), das durch schrittweises Kuppeln eines niederen Alkylesters von Glycin mit geeignet geschütztem Tyrosin und Serin und anschließende Hydrolyse der Estergruppe hergestellt worden ist,

C. zu mit einigen Schutzgruppen versehenem Seryl-tyrosyl-glycylleucyl-arginyl-prolyl-glycinamid kuppelt und dieses Heptapeptid schrittweise an der arainoendständigen Seite mit ge-

■ eignet geschütztem Tryptophan, Histidin und (Pyrο)glutaminsäure zu einem geschützten" Decapeptid verlängert und die Schutzgruppen durch Behandlung mit Fluorwasserstoffsäure entfernt.

Der Syntheseweg wird durch folgendes Schema wiedergegeben.

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Syntheseweg für die Herstellung von RH

Tos

AOC- JÄrg -OH II- [Pröl -OBzI

T03 Γ

AOC-[Ir^-PfO] -OBzI

BzI. HCl

BOC- JTyr [ -OSu H-ICJ^-OEt

¹—Γ

BzI _*_' BOC- [Tyr-Gly| -OEt AOC-

ACC-

Tos

j t

^rPd

HCl

-OH H- j(FlyJ -NI^

Tos

WSCI

. _ . . CF,COOH

^Bf M ⁵

AOC-liior] -OSu H- PiÜTrGlyj -OEt CF,COOH ' ,,Too

BOC- ÖCeül -CSu H-

BzI BzI Tos

BzI BzI

-OEt

HeOH-HaOH BOC-

Τθ3

-HH,

-NII

CFCOOH

AOC-[Sqi^Tyj^G]y] -CH ··· Fraenent(ll) H- fLcu-Arc-l'ro-Giy] -NIL ··· Fra£;r.ent(l)

₃,i|^wi

B?.l J ^W§S Tos

Bzl

AOC-[TrpJ-ONp
ΐ

H- [Ser-Tyi^Gry-Iöü-Arg-Pro-Glyj-N

ACC- ITrp-Scr-fyr-GDy-Lcu-Arc-Pro-Gly;-NIL CF,COOII

Tp3

BOC- [[Hai -OH BzI γΒζΙ

Tos

3098 1 0 / 1 1 2 Λ

BAD ORIGINAL

TonBzl γΒζΙ Tos

CP-COOH -

Tos BzI j BzI _ Tos

I -ONp II- [Sis-Trj>-Sor-Tyr-Gly-^^ArG_;^^rci~_.iy.] "^

Tos Bz-I yB/vL Tps

l(Pyro)Glu--Ilis-Trp-SGr~Tyr--G3.y-Lcu-Aro-Pro-Gly|-Nir₂

HF

Hi IyrojGlu-liis-Triv-üer-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly -HH₂

Die verwendeten Abkürzungen haben folgende Bedeutung:

tert.-Amyloxycarbonylgruppe tert.-Butyloxycarboxylgruppe p-Toluolsulfonylgruppe Benzylgruppe Benzyloxycarbonylgruppe verbleibender Rest von Succinimid p-Nitrophenylgruppe wasserlösliche Carbodiimide, wie

ET-N=CN-(CH₂)₃- ^^ oder deren Salze mit Mineralsäuren.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von RH hat gegenüber anderen mit Peptidfragmenten arbeitenden Verfahren folgende Vorteile:

a. Bei den Reinigungsschritten ist nicht eine große Menge eines bestimmten Lösungsmittels nötig, wie es im allgemeinen bei der Synthese von Polypeptiden mit 8 bis 12 Aminosäuren, wie Angiotensin I oder II, Bradykinin oder Kallidin, die

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eine ähnliche Kettenlänge wie RH aufweisen, der Fall ist. Beim erfindungsgemäßen Verfahren können die Reinigungsschritte leicht chromatographisch an Silicagelsäulen unter Verwendung von billigen Lösungsmitteln durchgeführt werden. Dabei werden gute Ausbeuten an Zwischenproduktensowie an RH erhalten. Außerdem sind im erfindungsgemäßen Verfahren nur wenige Reinigungsschritte notwendig.

b. Die verwendeten Peptidkupplungsreaktionen verursachen keine Racemisierung der Aminosäuren oder der Fragmente. Es werden geeignete Acyloxyschutzgruppen für die Aminoreste verwendet, um die Bildung eines Oxazolidonrings bei den Kupplungsreaktionen zu verhindern.

c. Durch die Reihenfolge der Kupplungsreaktionen bei der Fragraentbildung, insbesondere bei Fragment I, erhält man leicht handhabbare Zwischenprodukte (z.B. auf Grund der hydrophilen und lipophilen Eigenschaften), was auf die Reihenfolge und Auswahl der Schutzgruppen zurückzuführen ist. Außerdem wird kein Diketopiperazin als Nebenprodukt gebildet. Beispielsweise kann bei einer anderen Kupplungsreihenfolge,

Pro-Gly > Arg-Pro-Gly, Diketopiperazin als Nebenprodukt

entstehen. Diese Zwischenprodukte sind zu stark hydrophil und können deshalb schlecht gehandhabt werden. Diese Tatsache zeigt, daß die erfindungsgemäße Kupplungsreihenfolge und die erfindungsgemäß verwendeten Schutzgruppen optimal ausgewählt sind.

d. Beim erfindungsgeraäßen Syntheseweg wird das "aktivierte Ester-Verfahren und das WSCI-Verfahren so günstig zusammen

309810/1 12 Λ .

mit geeigneten Schutzgruppen kombiniert, daß die Bildung von Nebenprodukten (Acylharnstoffderivate) vermieden wird, wobei die hydrophilen Eigenschaften und die leichte Oxidierbarkeit des Peptidzwischenprodukts berücksichtigt wird.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Zwischenprodukte mit geeigneten Schutzgruppen an den endständigen Amino- oder Carboxylgruppen sind neue Verbindungen.

Bei der Herstellung von Fragment II eignet sich am besten die Estergruppe als Carboxylschutzgruppe des Glycins. Es war zu befürchten, daß beim Entfernen der Esterschutzgruppe gleichzeitig eine Peptidspaltung eintritt. Aber durch selektive Hydrolyse läßt sich die Estergruppe von Fragment II ohne Nebenreaktion abspalten.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte RH ist biologisch aktiv und setzt LH und FSH frei, wie durch Tierversuche bestätigt wurde.

Das Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel
A. Herstellung von Fragment I
1. Synthese von AOC-Arg(Tos)-Pro-OBzl

In 60 ml·Methylenchlorid werden 23 g (52 mMol) AOC-Arg(Tos)-OH und 13,9 g (57 mMol) H-Pro-OBzl . HCl gelöst. Die Lösung wird in einem Kühlbad auf -1O⁰C gekühlt. Anschließend werden in drei Portionen unter Kühlen auf -10 bis -2⁰C 8,1 g (»52 mMol) N-Äthyl-N'-(dimothylaminopropyl)-carbodiimid zugegeben. Das erhaltene Gemisch wird durch Zusatz von 0,53 ml N-Methylmorpholin

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auf einen p„-Wert von 7 gebracht und 30 Minuten bei -5°C und 16 bis 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das nach dem Abdestillieren des Methylenchlorids aus dem Reaktionsgemisch erhaltene ölige Produkt wird in Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung wird nacheinander mit 0,5 η Salzsäure, Wasser, 5prozentiger Natriumhydrogencarbonatlösung und V/asser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und abfiltriert. Das nach dem Eindampfen des Filtrates erhaltene ölige Produkt wird in 150 ml Essigsäureäthylester unter Erwärmen gelöst. Die Lösung wird anschließend in einen Kühlschrank gestellt, wobei Nadeln ausfallen. Die Kristalle werden abfiltriert, mit Essigsäureäthylester gewaschen und im Exsikkator über Phosphorpentoxid unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 24,0 g (73,4 Prozent der Theorie) des gewünschten Produktes vom F. 163,5 bis 164,5⁰C fa/^⁶'³ - 33,4° (c = 1,1; Dimethylformamid). CHN C₃₁H₄₃O₇N₅S; ber.: 59,13 6,88 11,12

gef.: 59,09 6,65 11,02.

2. Synthese von A0C-Arg(Tos)-Pro-0H

In 200 ml Methanol werden 22 g (35 mMol) AOC-Arg(Tos)-Pro-OBzl gelöst. Nach der Zugabe von 1,5g Palladium-auf-Kohlenstoff wird unter Rühren 5 Stunden Wasserstoff durch die Lösung geleitet. Anschließend wird der Katalysator abfiltriert und das Methanol abgedampft. Der erhaltene Rückstand wird in 300 ml Essigsäureäthylester gelöst und mit 5prozentiger Natriumhydrogencarbonatlösung extrahiert. Der Extrakt wird unter Kühlen mit 6 η Salzsäure auf den ρ,,-Wert 3 gebracht und nochmals rasch mit Essigüäureäthylester extrahiert. Nach dem Waschen mit Was-

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■ser wird der Extrakt über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wird zur Trockene eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird mit Diäthyläther versetzt. Der erhaltene Niederschlag wird über Phosphorpentoxid im Vakuumexsikkator getrocknet. Man erhält 17 g (90 Prozent der Theorie) des gewünschten Produktes.

3. Synthese von BOC-LeU-ArR(TOs)-PrO-GIy-NH ₂ In einem Gemisch aus 10 ml Dimethylformamid und 4 ml Wasser werden 1,2 g (10,5 mMol) H-GIy-NH₂-HCl gelöst. Die Lösung wird mit einer Lösung von 3,8 g (7 mMol) AOC-Arg(Tos)-Pro-OH in 15 ml Methylenchlorid versetzt. Das entstandene Gemisch wird in einem Kühlbad auf -5⁰C gekühlt und unter Rühren mit 1,1 g (7 mMol) N-Äthyl-N'-Cdimethylaminopropj^O-carbodiimid (v/asserlöslich) und 3 ml Methylenchlorid versetzt. Nach dem Einstellen des ρττ-Wertes mit 0,4 ml N~Methylmorpholin auf 7 wird die Lösung 30 Minuten unter Kühlung heftig gerührt und anschließend weitere 16 bis 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Methylenchlorid abgedampft. Nach der Zugabe einer gesättigten Natriumsulfatlösung wird die erhaltene Flüssigkeit mit einem großen Volumen Essigsäureäthylester extrahiert.

Die Essigsäureäthylesterphase wird nacheinander mit 0,5 η Salzsäure, Wasser, 5prozentiger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen. Bei diesen Waschvorgängen ist die wäßrige Phase jeweils mit Natriumsulfat gesättigt. Die Essigsäureäthylesterphase wird anschließend über Magnesiumsulfat getrocknet und abfiltriert. Das Filtrat wird zu einem öligen Rückstand eingedampft. Der nach dem Versetzen dieses Rückstands mit Di-

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äthyläther gebildete Niederschlag wird auf einer Glasfritte

■und
abgenutscht / über Phosphorpentoxid im Vakuumexsikkator getrock net. Man erhält 2 g (48 Prozent der Theorie) des gewünschten AOC-Arg(Tos)-PrO-GIy-NH₂.

Das ganze Produkt wird in 7,5 ml Trifluoressigsäure gelöst und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird die Trifluoressigsäure unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand über Natriumhydroxid in einem Vakuumexsikkator getrocknet. Man erhält H-Arg(Tos)-PrO-GIy-NH₂.CF₃COOH als Öl.

„ und

Dieses 01 wird in 2,5 ml Dimethylformamid gelöst /durch Zugabe von 2 ml Triäthylamin unter Eiskühlung auf den p_H-Wert 4 gebracht. Anschließend wird die Lösung durch weitere Zugabe von 1 ml N-Methylmorpholin auf den ρτ,-Wert 7 gebracht. Diese Lösung wird mit 1,7 g (5 mMol) BOC-Leu-OSu und 1 ml Dimethylformamid versetzt. Nach 17stündigem Rühren bei Raumtemperatur werden 1,5 ml Ν,Ν'-Dimethylaminopropylamin zugegeben. Anschließend wird die Lösung 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit einem großen Volumen V/asser versetzt und mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformphase wird nacheinander mit 0,5 η Salzsäure, Wasser, 5prozentiger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Magnesiumsulfat wird sodann abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird mit Äthanol und Essigsäureäthylester versetzt und erwärmt. Die beim Stehen im Kühlschrank ausgefallenen Kristalle werden abfiltriert, mit einer ausreichenden Menge Essigsäureäthylester gewaschen und im Vakuumexsikkator über Phosphorpentoxid getrocknet. Man erhält 1,78 g (76,4 Prozent

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der Theorie) der gewünschten Verbindung vom F. 150,5 bis 152,5⁰C (zersetzt sich und wird durchsichtig bei 182⁰C). /cc/p⁷ - 33,0° (c = 1,0; Dimethylformamid).

CH N

C₃₁H₅₀O₈N₈S.1/2H₂O; ber.: 52,89 7,31 15,92

gef,·: 52,79 7,35 15,67.

B. Herstellung von Fragment II
1· Synthese von BOC-Tyr(BzI)-GIy-OEt 5 ml Dimethylformamid werden mit 500 mg GIy-OEt.HCl versetzt. Anschließend werden unter Rühren und Kühlung 0,5 ml Triäthyl- ■ amin zugesetzt. Das Gemisch wird anschließend mit 1,45 g BOC-Tyr(BzI)-OSU versetzt , 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und sodann mit Chloroform verdünnt. Nach der Zugabe von 0,5 ml Dimethylaminopropylamin wird das erhaltene Gemisch 30 Minuten gerührt. Sodann wird mit 1n Salzsäure, Wasser, 1n Natriumcarbonatiösung und Wasser gewaschen. Die Chloroformphase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und abfiltriert. Nach dem Abdampfen des Chloroforms aus dem Filtrat erhält man Kristalle, die aus einer Mischung von Essigsäureäthylester und Hexan zu 1,21 g (85,8 Prozent der Theorie) der gewünschten Verbindung vom F. 131,5 bis 132,5°C umkristallisiert werden.

2. Synthese von AOC-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Gly-OEt 5 ml Trifluoressigsäure werden unter Rühren und Kühlung zu 3,76 g BOC-Tyr(BzI)-GIy-OEt gegeben. Nach 10 Minuten läßt man auf Raumtemperatur erwärmen und rührt weitere 40 Minuten. Die Trifluoressigsäure wird unter vermindertem Druck abgedampft und der erhaltene ölige Rückstand über Natriumhydroxid im Exsikkator getrocknet. Das Produkt wird in 4 ml Dirnethyl-

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formamid gelöst und mit 2,64 ml Triethylamin unter Rühren und Kühlung auf den p^-Wert 7 bis 8 eingestellt. Sodann gibt man 3f7O g AOC-Ser(Bzl)-OSu zu und rührt 2 Tage bei Raumtemperatur. Anschließend wird das Reaktionsgemisch mit Chloroform verdünnt, mit 1n Salzsäure, Wasser, 1n NatriumcarbonatiÖsung und Wasser gewaschen. Die Chloroformphase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und abfiltriert. Nach dem Abdampfen des Chloroforms aus dem Filtrat erhält man Kristalle, die beim Um^ kristallisieren aus einer Mischung von Essigsäureäthylester und Hexan 4,54 g (84,1 Prozent der Theorie) des gewünschten Produktes vom F. 71 bis 74,5⁰C ergeben.

CHN

^C36^H45°8^N3^{; ber}·* 66,74 7,00 6,48 gef.: 66,95 7,20 6,42.

3. Synthese von AOC-Ser(BzI)-Tyr(BzI)-GIy-OH In 5 ml Methanol werden 2,02 g AOC-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Gly-OEt gelöst. Die Lösung wird unter Rühren tropfenweise mit 3 ml 1n Natriumhydroxidlösung versetzt und anschließend 4 Stunden zur Umsetzung gebracht. Nach der Einstellung des pu-Wertes mit 1n Salzsäure auf 7 wird das Methanol entfernt. Anschliessend wird die Lösung mit weiterer 1n Salzsäure auf den p_H-Wert 3 eingestellt. Die ausgefallenen Kristalle werden mit Essigsäureäthylester extrahiert. Die Essigsäureäthylesterphase wird mit Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren wird der Essigsäureäthylester abgedampft. Das erhaltene Produkt wird aus einer Mischung von Essigsäureäthylester und Hexan zu 3,54 g (80,4 Prozent der Theorie) des gewünschten Produktes vom F. 94,5 bis 98,O⁰C umkristallisiert. ä/_D -16,1° (c = 1,5; Dimethylformamid).

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- 13 -	H	67	N	2243066	*
C	6,	76	6,78
65,89	6,		6,68«
66,20

C₃₄H₄₁O₈N₃; ber.;

gef.:

Aminosäureanalyse (6 η HCl, 1O5°C, 24 Stunden): Ser 0,95, Tyr 0,89, GIy 1,00.

C. Kondensation der Fragmente I und II und schrittweise Verlängerung ziu RH

1. Synthese von AOC-Ser(Bzl)~Tyr(Bzl)-Glv-Leu~Arg(Tos)-Pro·- GIy-NH₂

694 mg BOC-Leu-Arg(Tos)-PrO-GIy-NH₂ werden unter Rühren und Kühlen mit 3 ml Trifluoressigsäure versetzt. Nach 40minütigem Rühren bei Raumtemperatur wird die Trifluoressigsäure unter vermindertem Druck abgedampft. Der erhaltene ölige Rückstand wird durch Zusatz von Diäthyläther zur Kristallisation gebracht. Der abfiltrierte Niederschlag wird im Exsikkator über Natriumhydroxid getrocknet und in einem Gemisch aus 20 ml Tetrahydrofuran und 3 ml Acetonitril gelöst. Die erhaltene Lösung wird bei -15 bis -20⁰C unter Rühren mit 0,17 ml N-lthyl-N«(dimethylaminopropyl)-carbodiimid versetzt. Dieser Verfahrensschritt wird bei einem p_H-Wert von 7 bis 8 durchgeführt. Anschließend wird das Geraisch mit 711 mg AOC-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Gly-OH versetzt, das erhaltene Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und sodann 16 bis 18 Stunden stehengelassen. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in Chloroform gelöst. Die Chloroformphase wird nacheinander mit 1 η Salzsäure, Wasser, 5prozentiger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und abfiltriert. Nach dem Abdampfen des Chloroforms aus dem Filtrat erhält man ein gelartiges Produkt.

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Dieses Produkt wird chromatographisch an einer Siliciumdioxidsäule unter Elution mit einem Gemisch aus Chloroform,Methanol und Essigsäure (95 : 5 : 3) gereinigt. Das nach dem Aufarbeiten erhaltene Pulver ergibt bei der DünnschichtChromatographie einen einzigen Flecken. Das Pulver wird aus einer Mischung von Chloroform und Diäthyläther umgefällt. Man erhält 960 mg (78,7 Prozent der Theorie) des gewünschten Produktes vom

F. 118,5 bis 123⁰C. faJ_O -29,1° (c = 1; Dimethylformamid).

CHN

^C60^H82°13^N11^S*^H2^{0; ber}*^{: 59}'^{29 6}'^{97 12}'⁶⁷

gef.: 59,35 6,97 12,20.

2. Synthese von AOC-TrP-(I)-(II)

856 mg A0C-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Gly-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-NH₂ werden unter Rühren und Kühlen mit 5 ml Trifluoressigsäure versetzt. Nach 10 Minuten wird das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmt und weitere 40 Minuten gerührt. Nach dem Entfernen der überschüssigen Trifluoressigsäure durch Destillation erhält man einen öligen Rückstand, der nach dem Versetzen mit Diäthyläther einen weißen Niederschlag ergibt. Der Niederschlag wird über Natriumhydroxid im Exsikkator getrocknet und in 2 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird durch Zusatz von 0,2 ml N-Methylmorpholin unter Rühren und Kühlen auf den P_H-Wert 8 eingestellt. Nach Zugabe von 400 mg AOC-Trp-ONp wird die Lösung 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit Chloroform verdünnt. Das Gemisch wird mit 0,5 ml Dimethylaminopropylamin versetzt und 45 Minuten gerührt. Die Chloroformphase wird nacheinander mit 1n Salzsäure, Wasser, 1n Natriumcarbonatlösung und Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Abfiltrieren und Eindampfen

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des Filtrates zur Entfernung des Chloroforms erhält man ein gelartiges Produkt, das chromatographisch an einer Siliciumdioxidsäule unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform, Essigsäureäthylester und Äthanol (5 s 5 : 2) als Elutiönsmittel gereinigt wird. Das nach dem Aufarbeiten erhaltene Produkt ergibt bei der Dünnschichtchromatographie einen einzigen Flecken. Das Produkt wird aus einer Mischung von Chloroform und Diäthyläther zu 777 mg (78,7 Prozent der Theorie) der gewünschten Verbindung vom F. 143,0 bis 14S₉O⁰C umkristallisiert. /Ö7jj -34,5° (c = 1; Dimethylf ormamid).

CHN ■

C₇₁H₉₂O₁₄N₁₃S-H₂O; ber.: 60,83 6,76 12,99

gef.; 60,96 6,66 13,10.

3. Synthese von BOC-His(Tos)-Trp-(l)-(Il) 549 mg AOC-Trp-Ser(BzI)-Tyr(BzI)-Gly-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-NH₂ werden mit 0,05 ml Mercaptoäthanol (HSCH₂CH₂OH) und 5 ml Trifluoressigsäure versetzt. Nach 10 Minuten läßt man auf Raumtemperatur erwärmen und rührt 40 Minuten. Die überschüssige Trifluoressigsäure wird abdestilliert und der ölige Rückstand mit Diäthyläther versetzt. Der gebildete weiße Niederschlag wird abfiltriert, über Natriumhydroxid im Exsikkator getrocknet und in einem Gemisch aus 2 ml Dimethylformamid und 3 ml Acetonitril gelöst. Die Lösung wird bei -15 bis -20⁰C unter Rühren mit 0,08 ml N-Äthyl-N¹-(dimethylarainopropyl)-carbodiimid und anschließend 226 mg BOC-His(Tos)-OH versetzt. Sodann wird das Gemisch eine weitere Stunde bei der gleichen Temperatur gerührt, auf Raumtemperatur erwärmt und 16 bis 18 Stunden stehengelassen. Nach dem Entfernen des Aceton!trils unter

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vermindertem Druck wird mit Chloroform versetzt. Die Chloroformphase wird mit 1 η Salzsäure, Wasser, 5prozentiger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Nach dem Entfernen des Chloroforms aus dem Filtrat erhält man ein gelartiges Produkt, das chromatographisch an einer Siliciumdioxidsäule unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform, Essigsäureäthylester und Äthanol (5:5:2) als Elutionsmittel gereinigt wird. Das erhaltene Produkt zeigt bei der DUnnschichtchromatographie einen einzigen Flecken. Es wird aus einer Mischung von Chloroform und Äther zu 390 mg (59»3 Prozent /der gewünschten Verbindung vom F. 154,0 bis 157,5⁰C umgefällt, /Ji]^ -36,8° (c = 0,4; Dimethylformamid).

CH N

^C83^H1O3°17^N16^S2'^H2^{O; ber}*^{: 58}'^{74 6}'^{35 13}'²⁰

gef.: 58,40 6,11 13,00.

4. Synthese von Z<Pvro)Glu-His(Tos)-Trp-(l)-(Il) 252 mg BOC-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Gly-Leu-Arg(Tos)-PrO-GIy-NH₂ werden unter Rühren und Kühlen mit 0,05 ml Mercaptoäthanol, 10 mg Tryptophan und 3 ml Trifluoressigsäure versetzt. Nach 10 Minuten wird das erhaltene Gemisch auf Raumtemperatur erwärmt und 40 Minuten gerührt. Anschließend wird die überschüssige Trifluoressigsäure durch Destillation entfernt. Der erhaltene ölige Rückstand ergibt beim Versetzen mit Diäthyläther einen weißen Niederschlag, der über Natriumhydroxid im Exsikkator getrocknet und in 1 ml Dimethylformamid gelöst wird. Die Lösung wird unter Rühren und Kühlen durch Zusatz von 0,15 ml N-Methylraorpholin auf den p^-Wert 7 bis 8 eingestellt. Anschließend werden 86 mg Z-(Pyro)Glu-ONp zuge-

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geben, und das Gemisch wird auf Raumtemperatur erwärmt und 2 Tage gerührt. Nach Zugabe von Chloroform wird das Reaktionsgemisch mit 1 η HCl, H₂O, 1 η Natriumcarbonatlösung und H₂O gewaschen. Die Chloroformphase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Nach dem Abdampfen des Chloroforms aus dem Filtirat erhält man ein gelförmiges Produkt. Dieses wird chromatographisch an einer Siliciumdioxidsäule unter Verwendung eines Gemisches von Chloroform, Methanol und Essigsäure (95 : 5 : 3) als Elutionsmittel gereinigt. Das erhaltene Produkt zeigt bei der Dünnschichtchromatographie einen einzigen Flecken, Dieses Produkt wird aus einer Mischung von Chloroform und Diäthyläther zu 150 mg (54,6 Prozent der Theorie) des gewünschten Produktes vom F. 153 bis 138,5⁰C (Zersetzung) umgefällt.

5. Synthese von RH

In ein HF-Reaktionsgefäß werden 100 mg Z-(Pyro)Glu-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(BzI)-Gly-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-NH₂ gebracht. Anschließend werden 51 mg Tryptophan, 21,6 mg Skatol, 0,6 ml Anisol und 5 ml HF zugegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde bei O⁰C zur Umsetzung gebracht. Anschließend wird der Fluorwasserstoff bei O⁰C abdestilliert. Der Rückstand wird im Exsikkator über Natriumhydroxid getrocknet, in kaltem Wasser gelöst und mit Diäthyläther gewaschen. Die wäßrige Phase wird auf eine ' mit einem Ionenaustauscherharz (Dowex 1x2; AcO~ -Form) beschickte Säule aufgesetzt und mit V/asser eluiert.

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22A3066

Die wäßrige Lösung ergibt nach Gefriertrocknung ein Pulver, das chromatographisch mit Hilfe eines Molekularsiebs (Sephadex G-15) unter Verwendung von 0,2 η Essigsäure als Elutionsmittel gereinigt wird. Die Hauptfraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet. Man erhält 25 mg Pulver. Dieses Pulver zeigt bei der Elektrophorese einen einzigen Flecken,, dessen Ninhydrinreaktion negativ und Paurireaktion positiv ist. /ö/_D -46,2° (c = 0,3; Wasser).

	C	H	68	N	60
51	,07	6,	59	16,	48.
51	,00	6,	16,

.C₅₅H₇₅O₁₃N₁₇.3(CH₃COOH).4H₂O;

ber.:
gef.:

Aminosäureanalyse (6 η HCl, 105⁰C, 24 Stunden):

GIu 1,11, His 0,90, Trp 0,94, Ser 0,97, Tyr 0,96, GIy 2,02, Lea 1,00, Arg 1,02, Pro 1,05.

Der Wert für Trp wurde aus dem UV-Absorptionsspektrum, das in Fig. 1 wiedergegeben ist, gewonnen.

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Claims (1)

1. Patentanspruch

   Verfahren zur Herstellung von (Pyro)glutamyl-histidyltryptophyl-seryl-tyrosyl-glycyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid, dadurch gekennzeichnet, daß man

   A. Leucyl-(N-geschütztes)arginyl-prolyl-glycinamid (I),

   das durch Kuppeln von geschütztem Arginin mit an der Carboxylgruppe geschütztem Prolin zu Arginyl-prolin, Kuppeln des Arginyl-prolins mit Glycinamid zu Arginyl-prolyl-glycinamid, Kuppeln dieses Produktes an der endständigen NH₂" Gruppe mit Leucin und Entfernen der Schutzgruppe an der NHp-CrmPP⁰ des Leucylrestes hergestellt worden ist, mit

   B. (N- und O-geschütztes) Seryl-(O-geschütztes) Tyrosyl-glycin, das durch schrittweises Kuppeln eines niederen Alkylesters von Glycin mit geeignet geschütztem Tyrosin und Serin und anschließende Hydrolyse der Estergruppe hergestellt worden ist,

   C. zu mit einigen Schutzgruppen versehenem Seryl-tyrosylglycyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid kuppelt und dieses Heptapeptid schrittweise an der aminoendständigen Seite mit geeignet geschütztem Tryptophan, Histidin und (Pyrο)glutaminsäure zu einem geschützten Decapeptid verlängert und die Schutzgruppen durch Behandlung mit Fluorwasserstoffsäure entfernt.

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