DE2243066A1 - Verfahren zur herstellung von (pyro) glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosylglycyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid - Google Patents
Verfahren zur herstellung von (pyro) glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosylglycyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamidInfo
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Description
DIP L.-C H E M. DR. VOLKERVOSSIUS siebebtstrasse a
PHONE· 474075
PATENTANWALT CABLE address: benzolpatent München
I Sep. 1972
u.Z.: K 068 (Vo/Mü/kä)
Case D-I-8I63 (071 - 02)
Case D-I-8I63 (071 - 02)
DAIICHI SEIYAKU CO., LTD.
Tokyo, Japan
Tokyo, Japan
11 Verfahren zur Herstellung von (Pyro)glutamyl-histidyltryptophyl-seryl-tyrosyl-glycyl-leucyl-arginyl-prolylglycinamid
" ·
Priorität: 2. September 1971, Japan, Nr. 67 745/71
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von (Pyro)-glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-glycyl-leucylarginyl-prolyl-glycinamid.
Dieses im folgenden mit RH abgekürzte Decapeptid bewirkt eine Freisetzung des luteinisierenden Hormons (im folgenden mit
LH abgekürzt) und des Follikel-stimulierenden Hormons (im folgenden
als FSH abgekürzt). RH konnte aus Kalbshypothalamus gewonnen und seine Aminosäuresequenz bestimmt werden.
Bisher waren weder ein Syntheseverfahren für RH noch dessen physikalische Eigenschaften bekannt. Im allgemeinen ist die
Synthese von Polypeptiden zwar theoretisch möglich, aber schwierig durchzuführen und häufig erfolglos, auch wenn die
Aminosäurezusammensetzung und die Aminosäuresequenz bekannt ist. Diese Schwierigkeiten beruhen darauf, daß die für einen geplan-
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ten Syntheseweg benötigten Oligopeptidfragmente unerwartete physikalische Eigenschaften aufweisen oder die Reinigung zur
Entfernung von Nebenprodukten unmöglich ist.
Aus diesem Grund wird im allgemeinen die schrittweise Verlängerung
von Aminosäuren als geeignetstes Syntheseverfahren zur Herstellung von Polypeptiden angesehen. Dieses Verfahren ist jedoch
sehr unwirtschaftlich und eignet sich nur zu Forschungszwecken.
Zur Bildung von Peptidbindungen sind eine Reihe von Verfahren bekannt. Zur kommerziellen Herstellung von solchen langkettigen
Polypeptiden benötigt man jedoch einen Syntheseweg, der über Fragmente der langen Sequenz oder über eine geeignete Kombination
des Einsatzes von Fragmenten und der schrittweisen Verlängerung verläuft. Theoretisch sind zahlreiche Kombinationsmöglichkeiten
von Fragmenten für die Herstellung solcher langkettiger Polypeptide möglich. Abgesehen von dieser großen Zahl von
Kombinationsmöglichkeiten sind jedoch die meisten Oligopeptidfragmente neue Verbindungen, deren physikalische Eigenschaften
unbekannt sind, so daß bei der Auffindung des geeignetsten Synthesewegs viele Probleme zu lösen sind, z.B. welche Schutzgruppen
für die Fragmente und welche Art von Kupplungareaktionen verwendet werden können.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Synthese von RH zur Verfugung zu stellen, das wirtschaftlich durchführbar
ist und eine Lösung der vorgenannten Probleme bringt.
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-3- 2243065
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von (Pyrojglutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-glycylleucyl-arginyl-prolyl-glycinamid,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
A. Leucyl-(N-geschütztes)arginyl-prolyl-glycinamid (I), das durch
Kuppeln von geschütztem Arginin mit an der Carboxylgruppe geschütztem Prolin zu Arginyl-prolin, Kuppeln des Arginylprolins
mit Glycinamid zu Arginyl-prolyl-glycinamid, Kuppeln dieses Produktes an der endständigen NHp-Gruppe mit Leucin
und Entfernen der Schutzgruppe an der NHp-Gn1PP6 des Leucylrestes
hergestellt worden ist, mit
B. (N- und O-geschütztes) Seryl-(0-geschütztes)tyrosyl-glycin
(II), das durch schrittweises Kuppeln eines niederen Alkylesters von Glycin mit geeignet geschütztem Tyrosin und Serin
und anschließende Hydrolyse der Estergruppe hergestellt worden ist,
C. zu mit einigen Schutzgruppen versehenem Seryl-tyrosyl-glycylleucyl-arginyl-prolyl-glycinamid
kuppelt und dieses Heptapeptid schrittweise an der arainoendständigen Seite mit ge-
■ eignet geschütztem Tryptophan, Histidin und (Pyrο)glutaminsäure
zu einem geschützten" Decapeptid verlängert und die Schutzgruppen durch Behandlung mit Fluorwasserstoffsäure
entfernt.
Der Syntheseweg wird durch folgendes Schema wiedergegeben.
30931 0/1124
Syntheseweg für die Herstellung von RH
Tos
AOC- JÄrg -OH II- [Pröl -OBzI
T03 Γ
AOC-[Ir^-PfO] -OBzI
BzI. HCl
BOC- JTyr [ -OSu H-ICJ^-OEt
1—Γ
BzI _*_' BOC- [Tyr-Gly| -OEt
AOC-
ACC-
Tos
j t
rPd
HCl
-OH H- j(FlyJ -NI^
Tos
WSCI
. _ . . CF,COOH
Bf M 5
AOC-liior] -OSu H- PiÜTrGlyj -OEt
CF,COOH ' ,,Too
BOC- ÖCeül -CSu H-
BzI BzI Tos
BzI BzI
-OEt
HeOH-HaOH BOC-
Τθ3
-HH,
-NII
CFCOOH
AOC-[Sqi^Tyj^G]y] -CH ··· Fraenent(ll) H- fLcu-Arc-l'ro-Giy] -NIL ··· Fra£;r.ent(l)
3,i|wi
B?.l J W§S Tos
Bzl
AOC-[TrpJ-ONp
ΐ
ΐ
H- [Ser-Tyi^Gry-Iöü-Arg-Pro-Glyj-N
ACC- ITrp-Scr-fyr-GDy-Lcu-Arc-Pro-Gly;-NIL
CF,COOII
Tp3
BOC- [[Hai -OH BzI γΒζΙ
Tos
3098 1 0 / 1 1 2 Λ
TonBzl γΒζΙ Tos
CP-COOH -
Tos BzI j BzI _ Tos
I -ONp II- [Sis-Trj>-Sor-Tyr-Gly-^^ArG_;^rci~_.iy.] "^
Tos Bz-I yB/vL Tps
l(Pyro)Glu--Ilis-Trp-SGr~Tyr--G3.y-Lcu-Aro-Pro-Gly|-Nir2
HF
Hi IyrojGlu-liis-Triv-üer-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly -HH2
Die verwendeten Abkürzungen haben folgende Bedeutung:
tert.-Amyloxycarbonylgruppe tert.-Butyloxycarboxylgruppe
p-Toluolsulfonylgruppe Benzylgruppe
Benzyloxycarbonylgruppe verbleibender Rest von Succinimid p-Nitrophenylgruppe
wasserlösliche Carbodiimide, wie
ET-N=CN-(CH2)3- ^^
oder deren Salze mit Mineralsäuren.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von RH hat gegenüber anderen mit Peptidfragmenten arbeitenden Verfahren
folgende Vorteile:
a. Bei den Reinigungsschritten ist nicht eine große Menge eines bestimmten Lösungsmittels nötig, wie es im allgemeinen bei
der Synthese von Polypeptiden mit 8 bis 12 Aminosäuren, wie Angiotensin I oder II, Bradykinin oder Kallidin, die
.309810/11.24
eine ähnliche Kettenlänge wie RH aufweisen, der Fall ist. Beim erfindungsgemäßen Verfahren können die Reinigungsschritte
leicht chromatographisch an Silicagelsäulen unter Verwendung von billigen Lösungsmitteln durchgeführt werden. Dabei
werden gute Ausbeuten an Zwischenproduktensowie an RH erhalten.
Außerdem sind im erfindungsgemäßen Verfahren nur wenige Reinigungsschritte notwendig.
b. Die verwendeten Peptidkupplungsreaktionen verursachen keine Racemisierung der Aminosäuren oder der Fragmente. Es werden
geeignete Acyloxyschutzgruppen für die Aminoreste verwendet, um die Bildung eines Oxazolidonrings bei den Kupplungsreaktionen
zu verhindern.
c. Durch die Reihenfolge der Kupplungsreaktionen bei der Fragraentbildung,
insbesondere bei Fragment I, erhält man leicht handhabbare Zwischenprodukte (z.B. auf Grund der hydrophilen
und lipophilen Eigenschaften), was auf die Reihenfolge
und Auswahl der Schutzgruppen zurückzuführen ist. Außerdem wird kein Diketopiperazin als Nebenprodukt gebildet. Beispielsweise
kann bei einer anderen Kupplungsreihenfolge,
Pro-Gly > Arg-Pro-Gly, Diketopiperazin als Nebenprodukt
entstehen. Diese Zwischenprodukte sind zu stark hydrophil und können deshalb schlecht gehandhabt werden. Diese Tatsache
zeigt, daß die erfindungsgemäße Kupplungsreihenfolge und die erfindungsgemäß verwendeten Schutzgruppen optimal
ausgewählt sind.
d. Beim erfindungsgeraäßen Syntheseweg wird das "aktivierte
Ester-Verfahren und das WSCI-Verfahren so günstig zusammen
309810/1 12 Λ .
mit geeigneten Schutzgruppen kombiniert, daß die Bildung von Nebenprodukten (Acylharnstoffderivate) vermieden wird, wobei
die hydrophilen Eigenschaften und die leichte Oxidierbarkeit des Peptidzwischenprodukts berücksichtigt wird.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Zwischenprodukte mit geeigneten Schutzgruppen an den endständigen Amino- oder
Carboxylgruppen sind neue Verbindungen.
Bei der Herstellung von Fragment II eignet sich am besten die Estergruppe als Carboxylschutzgruppe des Glycins. Es war zu befürchten,
daß beim Entfernen der Esterschutzgruppe gleichzeitig eine Peptidspaltung eintritt. Aber durch selektive Hydrolyse
läßt sich die Estergruppe von Fragment II ohne Nebenreaktion abspalten.
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte RH ist biologisch aktiv und setzt LH und FSH frei, wie durch Tierversuche
bestätigt wurde.
Das Beispiel erläutert die Erfindung.
Beispiel
A. Herstellung von Fragment I
1. Synthese von AOC-Arg(Tos)-Pro-OBzl
A. Herstellung von Fragment I
1. Synthese von AOC-Arg(Tos)-Pro-OBzl
In 60 ml·Methylenchlorid werden 23 g (52 mMol) AOC-Arg(Tos)-OH
und 13,9 g (57 mMol) H-Pro-OBzl . HCl gelöst. Die Lösung wird
in einem Kühlbad auf -1O0C gekühlt. Anschließend werden in drei
Portionen unter Kühlen auf -10 bis -20C 8,1 g (»52 mMol)
N-Äthyl-N'-(dimothylaminopropyl)-carbodiimid zugegeben. Das erhaltene
Gemisch wird durch Zusatz von 0,53 ml N-Methylmorpholin
30981 0/1124
auf einen p„-Wert von 7 gebracht und 30 Minuten bei -5°C und
16 bis 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das nach dem Abdestillieren des Methylenchlorids aus dem Reaktionsgemisch erhaltene
ölige Produkt wird in Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung wird nacheinander mit 0,5 η Salzsäure, Wasser,
5prozentiger Natriumhydrogencarbonatlösung und V/asser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und abfiltriert. Das
nach dem Eindampfen des Filtrates erhaltene ölige Produkt wird in 150 ml Essigsäureäthylester unter Erwärmen gelöst. Die Lösung
wird anschließend in einen Kühlschrank gestellt, wobei Nadeln ausfallen. Die Kristalle werden abfiltriert, mit Essigsäureäthylester
gewaschen und im Exsikkator über Phosphorpentoxid unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 24,0 g
(73,4 Prozent der Theorie) des gewünschten Produktes vom F. 163,5 bis 164,50C fa/^6'3 - 33,4° (c = 1,1; Dimethylformamid).
CHN C31H43O7N5S; ber.: 59,13 6,88 11,12
gef.: 59,09 6,65 11,02.
2. Synthese von A0C-Arg(Tos)-Pro-0H
In 200 ml Methanol werden 22 g (35 mMol) AOC-Arg(Tos)-Pro-OBzl
gelöst. Nach der Zugabe von 1,5g Palladium-auf-Kohlenstoff
wird unter Rühren 5 Stunden Wasserstoff durch die Lösung geleitet. Anschließend wird der Katalysator abfiltriert und das
Methanol abgedampft. Der erhaltene Rückstand wird in 300 ml Essigsäureäthylester gelöst und mit 5prozentiger Natriumhydrogencarbonatlösung
extrahiert. Der Extrakt wird unter Kühlen mit 6 η Salzsäure auf den ρ,,-Wert 3 gebracht und nochmals rasch
mit Essigüäureäthylester extrahiert. Nach dem Waschen mit Was-
3098 1 0/ 1 1 2A
■ser wird der Extrakt über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet
und filtriert. Das Filtrat wird zur Trockene eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird mit Diäthyläther versetzt. Der erhaltene
Niederschlag wird über Phosphorpentoxid im Vakuumexsikkator getrocknet. Man erhält 17 g (90 Prozent der Theorie)
des gewünschten Produktes.
3. Synthese von BOC-LeU-ArR(TOs)-PrO-GIy-NH 2
In einem Gemisch aus 10 ml Dimethylformamid und 4 ml Wasser werden 1,2 g (10,5 mMol) H-GIy-NH2-HCl gelöst. Die Lösung wird
mit einer Lösung von 3,8 g (7 mMol) AOC-Arg(Tos)-Pro-OH in
15 ml Methylenchlorid versetzt. Das entstandene Gemisch wird in
einem Kühlbad auf -50C gekühlt und unter Rühren mit 1,1 g
(7 mMol) N-Äthyl-N'-Cdimethylaminopropj^O-carbodiimid (v/asserlöslich)
und 3 ml Methylenchlorid versetzt. Nach dem Einstellen des ρττ-Wertes mit 0,4 ml N~Methylmorpholin auf 7 wird die Lösung
30 Minuten unter Kühlung heftig gerührt und anschließend weitere 16 bis 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Methylenchlorid abgedampft. Nach der Zugabe
einer gesättigten Natriumsulfatlösung wird die erhaltene Flüssigkeit mit einem großen Volumen Essigsäureäthylester extrahiert.
Die Essigsäureäthylesterphase wird nacheinander mit 0,5 η Salzsäure,
Wasser, 5prozentiger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen. Bei diesen Waschvorgängen ist die wäßrige
Phase jeweils mit Natriumsulfat gesättigt. Die Essigsäureäthylesterphase
wird anschließend über Magnesiumsulfat getrocknet und abfiltriert. Das Filtrat wird zu einem öligen Rückstand
eingedampft. Der nach dem Versetzen dieses Rückstands mit Di-
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äthyläther gebildete Niederschlag wird auf einer Glasfritte
■und
abgenutscht / über Phosphorpentoxid im Vakuumexsikkator getrock net. Man erhält 2 g (48 Prozent der Theorie) des gewünschten AOC-Arg(Tos)-PrO-GIy-NH2.
abgenutscht / über Phosphorpentoxid im Vakuumexsikkator getrock net. Man erhält 2 g (48 Prozent der Theorie) des gewünschten AOC-Arg(Tos)-PrO-GIy-NH2.
Das ganze Produkt wird in 7,5 ml Trifluoressigsäure gelöst und
1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird die Trifluoressigsäure unter vermindertem Druck abgedampft und der
Rückstand über Natriumhydroxid in einem Vakuumexsikkator getrocknet. Man erhält H-Arg(Tos)-PrO-GIy-NH2.CF3COOH als Öl.
„ und
Dieses 01 wird in 2,5 ml Dimethylformamid gelöst /durch Zugabe von 2 ml Triäthylamin unter Eiskühlung auf den pH-Wert 4 gebracht.
Anschließend wird die Lösung durch weitere Zugabe von 1 ml N-Methylmorpholin auf den ρτ,-Wert 7 gebracht. Diese Lösung
wird mit 1,7 g (5 mMol) BOC-Leu-OSu und 1 ml Dimethylformamid versetzt. Nach 17stündigem Rühren bei Raumtemperatur
werden 1,5 ml Ν,Ν'-Dimethylaminopropylamin zugegeben. Anschließend
wird die Lösung 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit einem großen Volumen V/asser
versetzt und mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformphase wird nacheinander mit 0,5 η Salzsäure, Wasser, 5prozentiger
Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Magnesiumsulfat wird sodann
abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird mit Äthanol und Essigsäureäthylester versetzt
und erwärmt. Die beim Stehen im Kühlschrank ausgefallenen Kristalle werden abfiltriert, mit einer ausreichenden Menge
Essigsäureäthylester gewaschen und im Vakuumexsikkator über Phosphorpentoxid getrocknet. Man erhält 1,78 g (76,4 Prozent
309810/112 4
der Theorie) der gewünschten Verbindung vom F. 150,5 bis
152,50C (zersetzt sich und wird durchsichtig bei 1820C).
/cc/p7 - 33,0° (c = 1,0; Dimethylformamid).
CH N
C31H50O8N8S.1/2H2O; ber.: 52,89 7,31 15,92
gef,·: 52,79 7,35 15,67.
B. Herstellung von Fragment II
1· Synthese von BOC-Tyr(BzI)-GIy-OEt 5 ml Dimethylformamid werden mit 500 mg GIy-OEt.HCl versetzt. Anschließend werden unter Rühren und Kühlung 0,5 ml Triäthyl- ■ amin zugesetzt. Das Gemisch wird anschließend mit 1,45 g BOC-Tyr(BzI)-OSU versetzt , 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und sodann mit Chloroform verdünnt. Nach der Zugabe von 0,5 ml Dimethylaminopropylamin wird das erhaltene Gemisch 30 Minuten gerührt. Sodann wird mit 1n Salzsäure, Wasser, 1n Natriumcarbonatiösung und Wasser gewaschen. Die Chloroformphase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und abfiltriert. Nach dem Abdampfen des Chloroforms aus dem Filtrat erhält man Kristalle, die aus einer Mischung von Essigsäureäthylester und Hexan zu 1,21 g (85,8 Prozent der Theorie) der gewünschten Verbindung vom F. 131,5 bis 132,5°C umkristallisiert werden.
1· Synthese von BOC-Tyr(BzI)-GIy-OEt 5 ml Dimethylformamid werden mit 500 mg GIy-OEt.HCl versetzt. Anschließend werden unter Rühren und Kühlung 0,5 ml Triäthyl- ■ amin zugesetzt. Das Gemisch wird anschließend mit 1,45 g BOC-Tyr(BzI)-OSU versetzt , 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und sodann mit Chloroform verdünnt. Nach der Zugabe von 0,5 ml Dimethylaminopropylamin wird das erhaltene Gemisch 30 Minuten gerührt. Sodann wird mit 1n Salzsäure, Wasser, 1n Natriumcarbonatiösung und Wasser gewaschen. Die Chloroformphase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und abfiltriert. Nach dem Abdampfen des Chloroforms aus dem Filtrat erhält man Kristalle, die aus einer Mischung von Essigsäureäthylester und Hexan zu 1,21 g (85,8 Prozent der Theorie) der gewünschten Verbindung vom F. 131,5 bis 132,5°C umkristallisiert werden.
2. Synthese von AOC-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Gly-OEt
5 ml Trifluoressigsäure werden unter Rühren und Kühlung zu 3,76 g BOC-Tyr(BzI)-GIy-OEt gegeben. Nach 10 Minuten läßt
man auf Raumtemperatur erwärmen und rührt weitere 40 Minuten. Die Trifluoressigsäure wird unter vermindertem Druck abgedampft
und der erhaltene ölige Rückstand über Natriumhydroxid im Exsikkator getrocknet. Das Produkt wird in 4 ml Dirnethyl-
309810/1124
formamid gelöst und mit 2,64 ml Triethylamin unter Rühren und
Kühlung auf den p^-Wert 7 bis 8 eingestellt. Sodann gibt man
3f7O g AOC-Ser(Bzl)-OSu zu und rührt 2 Tage bei Raumtemperatur.
Anschließend wird das Reaktionsgemisch mit Chloroform verdünnt, mit 1n Salzsäure, Wasser, 1n NatriumcarbonatiÖsung
und Wasser gewaschen. Die Chloroformphase wird über Magnesiumsulfat
getrocknet und abfiltriert. Nach dem Abdampfen des Chloroforms aus dem Filtrat erhält man Kristalle, die beim Um^
kristallisieren aus einer Mischung von Essigsäureäthylester und Hexan 4,54 g (84,1 Prozent der Theorie) des gewünschten Produktes
vom F. 71 bis 74,50C ergeben.
CHN
C36H45°8N3; ber·* 66,74 7,00 6,48
gef.: 66,95 7,20 6,42.
3. Synthese von AOC-Ser(BzI)-Tyr(BzI)-GIy-OH
In 5 ml Methanol werden 2,02 g AOC-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Gly-OEt
gelöst. Die Lösung wird unter Rühren tropfenweise mit 3 ml 1n Natriumhydroxidlösung versetzt und anschließend 4 Stunden
zur Umsetzung gebracht. Nach der Einstellung des pu-Wertes mit 1n Salzsäure auf 7 wird das Methanol entfernt. Anschliessend
wird die Lösung mit weiterer 1n Salzsäure auf den pH-Wert
3 eingestellt. Die ausgefallenen Kristalle werden mit Essigsäureäthylester extrahiert. Die Essigsäureäthylesterphase wird
mit Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren wird der Essigsäureäthylester abgedampft.
Das erhaltene Produkt wird aus einer Mischung von Essigsäureäthylester und Hexan zu 3,54 g (80,4 Prozent der Theorie) des
gewünschten Produktes vom F. 94,5 bis 98,O0C umkristallisiert.
ä/D -16,1° (c = 1,5; Dimethylformamid).
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- 13 - | H | 67 | N | 2243066 | * |
C | 6, | 76 | 6,78 | ||
65,89 | 6, | 6,68« | |||
66,20 | |||||
C34H41O8N3; ber.;
gef.:
Aminosäureanalyse (6 η HCl, 1O5°C, 24 Stunden):
Ser 0,95, Tyr 0,89, GIy 1,00.
C. Kondensation der Fragmente I und II und schrittweise Verlängerung ziu RH
1. Synthese von AOC-Ser(Bzl)~Tyr(Bzl)-Glv-Leu~Arg(Tos)-Pro·-
GIy-NH2
694 mg BOC-Leu-Arg(Tos)-PrO-GIy-NH2 werden unter Rühren und
Kühlen mit 3 ml Trifluoressigsäure versetzt. Nach 40minütigem Rühren bei Raumtemperatur wird die Trifluoressigsäure unter
vermindertem Druck abgedampft. Der erhaltene ölige Rückstand wird durch Zusatz von Diäthyläther zur Kristallisation gebracht.
Der abfiltrierte Niederschlag wird im Exsikkator über Natriumhydroxid
getrocknet und in einem Gemisch aus 20 ml Tetrahydrofuran und 3 ml Acetonitril gelöst. Die erhaltene Lösung wird
bei -15 bis -200C unter Rühren mit 0,17 ml N-lthyl-N«(dimethylaminopropyl)-carbodiimid
versetzt. Dieser Verfahrensschritt wird bei einem pH-Wert von 7 bis 8 durchgeführt. Anschließend
wird das Geraisch mit 711 mg AOC-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Gly-OH versetzt,
das erhaltene Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und sodann 16 bis 18 Stunden stehengelassen. Das Lösungsmittel
wird unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in Chloroform gelöst. Die Chloroformphase wird nacheinander
mit 1 η Salzsäure, Wasser, 5prozentiger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat
getrocknet und abfiltriert. Nach dem Abdampfen des Chloroforms aus dem Filtrat erhält man ein gelartiges Produkt.
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Dieses Produkt wird chromatographisch an einer Siliciumdioxidsäule
unter Elution mit einem Gemisch aus Chloroform,Methanol und Essigsäure (95 : 5 : 3) gereinigt. Das nach dem Aufarbeiten
erhaltene Pulver ergibt bei der DünnschichtChromatographie
einen einzigen Flecken. Das Pulver wird aus einer Mischung von Chloroform und Diäthyläther umgefällt. Man erhält 960 mg
(78,7 Prozent der Theorie) des gewünschten Produktes vom
F. 118,5 bis 1230C. faJO -29,1° (c = 1; Dimethylformamid).
CHN
C60H82°13N11S*H20; ber*: 59'29 6'97 12'67
gef.: 59,35 6,97 12,20.
2. Synthese von AOC-TrP-(I)-(II)
856 mg A0C-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Gly-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-NH2 werden
unter Rühren und Kühlen mit 5 ml Trifluoressigsäure versetzt. Nach 10 Minuten wird das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmt
und weitere 40 Minuten gerührt. Nach dem Entfernen der überschüssigen Trifluoressigsäure durch Destillation erhält
man einen öligen Rückstand, der nach dem Versetzen mit Diäthyläther einen weißen Niederschlag ergibt. Der Niederschlag
wird über Natriumhydroxid im Exsikkator getrocknet und in 2 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird durch Zusatz von
0,2 ml N-Methylmorpholin unter Rühren und Kühlen auf den
PH-Wert 8 eingestellt. Nach Zugabe von 400 mg AOC-Trp-ONp
wird die Lösung 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit Chloroform verdünnt. Das Gemisch wird mit 0,5 ml
Dimethylaminopropylamin versetzt und 45 Minuten gerührt. Die
Chloroformphase wird nacheinander mit 1n Salzsäure, Wasser, 1n Natriumcarbonatlösung und Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat
getrocknet. Nach dem Abfiltrieren und Eindampfen
309810/1124
des Filtrates zur Entfernung des Chloroforms erhält man ein gelartiges Produkt, das chromatographisch an einer Siliciumdioxidsäule
unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform, Essigsäureäthylester und Äthanol (5 s 5 : 2) als Elutiönsmittel
gereinigt wird. Das nach dem Aufarbeiten erhaltene Produkt ergibt bei der Dünnschichtchromatographie einen einzigen
Flecken. Das Produkt wird aus einer Mischung von Chloroform und Diäthyläther zu 777 mg (78,7 Prozent der Theorie) der
gewünschten Verbindung vom F. 143,0 bis 14S9O0C umkristallisiert.
/Ö7jj -34,5° (c = 1; Dimethylf ormamid).
CHN ■
C71H92O14N13S-H2O; ber.: 60,83 6,76 12,99
gef.; 60,96 6,66 13,10.
3. Synthese von BOC-His(Tos)-Trp-(l)-(Il)
549 mg AOC-Trp-Ser(BzI)-Tyr(BzI)-Gly-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-NH2
werden mit 0,05 ml Mercaptoäthanol (HSCH2CH2OH) und 5 ml Trifluoressigsäure
versetzt. Nach 10 Minuten läßt man auf Raumtemperatur erwärmen und rührt 40 Minuten. Die überschüssige
Trifluoressigsäure wird abdestilliert und der ölige Rückstand mit Diäthyläther versetzt. Der gebildete weiße Niederschlag
wird abfiltriert, über Natriumhydroxid im Exsikkator getrocknet und in einem Gemisch aus 2 ml Dimethylformamid und 3 ml
Acetonitril gelöst. Die Lösung wird bei -15 bis -200C unter
Rühren mit 0,08 ml N-Äthyl-N1-(dimethylarainopropyl)-carbodiimid
und anschließend 226 mg BOC-His(Tos)-OH versetzt. Sodann
wird das Gemisch eine weitere Stunde bei der gleichen Temperatur
gerührt, auf Raumtemperatur erwärmt und 16 bis 18 Stunden
stehengelassen. Nach dem Entfernen des Aceton!trils unter
309810/112A
vermindertem Druck wird mit Chloroform versetzt. Die Chloroformphase
wird mit 1 η Salzsäure, Wasser, 5prozentiger Natriumhydrogencarbonatlösung
und Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Nach dem Entfernen des
Chloroforms aus dem Filtrat erhält man ein gelartiges Produkt, das chromatographisch an einer Siliciumdioxidsäule unter Verwendung
eines Gemisches aus Chloroform, Essigsäureäthylester und Äthanol (5:5:2) als Elutionsmittel gereinigt wird. Das erhaltene
Produkt zeigt bei der DUnnschichtchromatographie einen einzigen Flecken. Es wird aus einer Mischung von Chloroform
und Äther zu 390 mg (59»3 Prozent /der gewünschten Verbindung vom F. 154,0 bis 157,50C umgefällt, /Ji]^ -36,8° (c = 0,4;
Dimethylformamid).
CH N
C83H1O3°17N16S2'H2O; ber*: 58'74 6'35 13'20
gef.: 58,40 6,11 13,00.
4. Synthese von Z<Pvro)Glu-His(Tos)-Trp-(l)-(Il)
252 mg BOC-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Gly-Leu-Arg(Tos)-PrO-GIy-NH2
werden unter Rühren und Kühlen mit 0,05 ml Mercaptoäthanol, 10 mg Tryptophan und 3 ml Trifluoressigsäure
versetzt. Nach 10 Minuten wird das erhaltene Gemisch auf Raumtemperatur erwärmt und 40 Minuten gerührt. Anschließend
wird die überschüssige Trifluoressigsäure durch Destillation entfernt. Der erhaltene ölige Rückstand ergibt beim Versetzen
mit Diäthyläther einen weißen Niederschlag, der über Natriumhydroxid
im Exsikkator getrocknet und in 1 ml Dimethylformamid gelöst wird. Die Lösung wird unter Rühren und Kühlen durch
Zusatz von 0,15 ml N-Methylraorpholin auf den p^-Wert 7 bis 8
eingestellt. Anschließend werden 86 mg Z-(Pyro)Glu-ONp zuge-
30981 0/ 1 1 24
geben, und das Gemisch wird auf Raumtemperatur erwärmt und 2 Tage gerührt. Nach Zugabe von Chloroform wird das Reaktionsgemisch mit 1 η HCl, H2O, 1 η Natriumcarbonatlösung und H2O
gewaschen. Die Chloroformphase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Nach dem Abdampfen des Chloroforms
aus dem Filtirat erhält man ein gelförmiges Produkt. Dieses wird chromatographisch an einer Siliciumdioxidsäule unter Verwendung
eines Gemisches von Chloroform, Methanol und Essigsäure (95 : 5 : 3) als Elutionsmittel gereinigt. Das erhaltene
Produkt zeigt bei der Dünnschichtchromatographie einen einzigen Flecken, Dieses Produkt wird aus einer Mischung von Chloroform und Diäthyläther zu 150 mg (54,6 Prozent der Theorie)
des gewünschten Produktes vom F. 153 bis 138,50C (Zersetzung)
umgefällt.
5. Synthese von RH
In ein HF-Reaktionsgefäß werden 100 mg Z-(Pyro)Glu-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(BzI)-Gly-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-NH2
gebracht. Anschließend werden 51 mg Tryptophan, 21,6 mg Skatol, 0,6 ml Anisol und 5 ml HF zugegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde bei
O0C zur Umsetzung gebracht. Anschließend wird der Fluorwasserstoff
bei O0C abdestilliert. Der Rückstand wird im Exsikkator
über Natriumhydroxid getrocknet, in kaltem Wasser gelöst und mit Diäthyläther gewaschen. Die wäßrige Phase wird auf eine '
mit einem Ionenaustauscherharz (Dowex 1x2; AcO~ -Form) beschickte
Säule aufgesetzt und mit V/asser eluiert.
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22A3066
Die wäßrige Lösung ergibt nach Gefriertrocknung ein Pulver, das chromatographisch mit Hilfe eines Molekularsiebs
(Sephadex G-15) unter Verwendung von 0,2 η Essigsäure als
Elutionsmittel gereinigt wird. Die Hauptfraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet. Man erhält 25 mg Pulver. Dieses
Pulver zeigt bei der Elektrophorese einen einzigen Flecken,, dessen Ninhydrinreaktion negativ und Paurireaktion positiv
ist. /ö/D -46,2° (c = 0,3; Wasser).
C | H | 68 | N | 60 | |
51 | ,07 | 6, | 59 | 16, | 48. |
51 | ,00 | 6, | 16, | ||
.C55H75O13N17.3(CH3COOH).4H2O;
ber.:
gef.:
gef.:
Aminosäureanalyse (6 η HCl, 1050C, 24 Stunden):
GIu 1,11, His 0,90, Trp 0,94, Ser 0,97, Tyr 0,96, GIy 2,02,
Lea 1,00, Arg 1,02, Pro 1,05.
Der Wert für Trp wurde aus dem UV-Absorptionsspektrum, das in Fig. 1 wiedergegeben ist, gewonnen.
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Claims (1)
- PatentanspruchVerfahren zur Herstellung von (Pyro)glutamyl-histidyltryptophyl-seryl-tyrosyl-glycyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid, dadurch gekennzeichnet, daß manA. Leucyl-(N-geschütztes)arginyl-prolyl-glycinamid (I),das durch Kuppeln von geschütztem Arginin mit an der Carboxylgruppe geschütztem Prolin zu Arginyl-prolin, Kuppeln des Arginyl-prolins mit Glycinamid zu Arginyl-prolyl-glycinamid, Kuppeln dieses Produktes an der endständigen NH2" Gruppe mit Leucin und Entfernen der Schutzgruppe an der NHp-CrmPP0 des Leucylrestes hergestellt worden ist, mitB. (N- und O-geschütztes) Seryl-(O-geschütztes) Tyrosyl-glycin, das durch schrittweises Kuppeln eines niederen Alkylesters von Glycin mit geeignet geschütztem Tyrosin und Serin und anschließende Hydrolyse der Estergruppe hergestellt worden ist,C. zu mit einigen Schutzgruppen versehenem Seryl-tyrosylglycyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid kuppelt und dieses Heptapeptid schrittweise an der aminoendständigen Seite mit geeignet geschütztem Tryptophan, Histidin und (Pyrο)glutaminsäure zu einem geschützten Decapeptid verlängert und die Schutzgruppen durch Behandlung mit Fluorwasserstoffsäure entfernt.309810/1 124Leerseite
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6774571 | 1971-09-02 | ||
JP46067745A JPS528830B2 (de) | 1971-09-02 | 1971-09-02 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2243066A1 true DE2243066A1 (de) | 1973-03-08 |
DE2243066B2 DE2243066B2 (de) | 1976-04-08 |
DE2243066C3 DE2243066C3 (de) | 1976-11-25 |
Family
ID=
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4301066A (en) * | 1980-05-08 | 1981-11-17 | American Home Products Corp. | Preparation of (D-Trp 6)-LH-RH via the heptapeptide H-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4301066A (en) * | 1980-05-08 | 1981-11-17 | American Home Products Corp. | Preparation of (D-Trp 6)-LH-RH via the heptapeptide H-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR2152069A5 (de) | 1973-04-20 |
DE2243066B2 (de) | 1976-04-08 |
GB1374321A (en) | 1974-11-20 |
JPS528830B2 (de) | 1977-03-11 |
CA1082172A (en) | 1980-07-22 |
CH556327A (fr) | 1974-11-29 |
NL7211974A (de) | 1973-03-06 |
SE376913B (de) | 1975-06-16 |
US3856769A (en) | 1974-12-24 |
JPS4834160A (de) | 1973-05-16 |
NL161436B (nl) | 1979-09-17 |
NL161436C (nl) | 1980-02-15 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |