DE2227173A1 - - Google Patents
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- DE2227173A1 DE2227173A1 DE19722227173 DE2227173A DE2227173A1 DE 2227173 A1 DE2227173 A1 DE 2227173A1 DE 19722227173 DE19722227173 DE 19722227173 DE 2227173 A DE2227173 A DE 2227173A DE 2227173 A1 DE2227173 A1 DE 2227173A1
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- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
Description
DR. JUR. DIPL-CHEM. WALTER BEIL ALFRED HOEPPENER
OR. JUR. DiPL-CHEM. H.-J. WOLW DR. JUR. HANS CHR. BEIL
623 FRANKFURTAM MA1N-WÖCH5?
30 Mai 1972
Unsere Wr. 17 825 Gfruppo Le pe tit S. p. A.
Mailand / Italien
Neue Derivate des 3-Formy!rifamycin SV,
Die vorliegende Erfindung "betrifft Hydrazone des 3-Formylrifamycin
SV der allgemeinen Formel
Me Me
HO
MeO
Me
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in welcher K1 und Κ? unabhängig voneinander
a) v/asserstoff, "b) einen Alkyl-,
c) Alkenyl-,
d) Alkinyl-,
e) Aryl-,
f·) Ar alkyl-,
g) einen heterocyclischen oder h) einen Cycloalkylrest darstellen,
unter der Haßgabe, daß nur einer der xieste K1 oder ü? wasserstoff
oder ein niedriger Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sein kann, wobei, falls einer der öubstituenten Wasserstoff
oder ein niedriger Alkylrest ist, der andere Substituent ^1 oder K2 ein unsubstituierter Alkylrest oder Hydroxyalkylrest
mit mindestens 5 Kohlenstoffatomen, oder ein vom Dimethylaminoäthylrest verschiedener substituierter Alkylrest,
oder sin Rest der obigen Gruppen c) bis h) sein muß, mit Ausnahme des Phenylrests, p-Carboxyphenylrests und Benzylrests
j IU in obiger Formel bedeutet Wasserstoff oder den
Acetylrest, Auch die entsprechenden Hexahydro-Verbindungen
und 27-Uemethoxy-27-hydroxyverMndungen fallen in den Bereich
vorliegender Erfindung.
Gewöhnlich enthalten die Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppen maximal etwa 2o Kohlenstoffatome. Biese Gruppen können geradkettig
oder verzweigt seinä ferner können sie unsubstituiert te ■;.;■» "ix- e:5-:ei? oder mehrere ßubstituenten an der Kohlenstoffkette
auiVifeios-·.,- A -i Bei.;;, Ie3,9 für ciubstituenten seien die
Halogene (iU/uor, Chlor s Brom, Jod), die Nitrogruppe, ArniiiogruTjpe,
Kono- und JJialkylaminogruppen, Gyangruppe, Hydroxylgruppe,
Alko.i:ygruppe, Aryloxygruppe, Uarboxygruppe, Garbalkoxygruppen,
Carbarr/lgruppe, Pluorsulfonylgruppe, üulfogruppe
und dgl, genannt. Alkenylreste können ferner eine oder mehrere doppelbindungen und die Alkinylreste eine oder mehrere J)rei-
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fachbindungen aufweisen.
Die Aryl- "und Aralkylreste können ebenfalls unsubstituiert
sein oder ein oder mehrere Substituenten am King "besitzen,
2.B, niedrige Alkylreste mit 1 Ms 4 Kohlenstoffatomen,
aalogenatome, halogensubstituierte niedrige Alkylreste, Aminogruppen, Mono- und Dialkylaminogruppen, Cyan-,. ¥ Carboxy-,
Hydroxy-, Acyloxy-, Carbalkoxy-, Nitro-, Carbamyl-, SuIfo-,
SuIfamido-, Fluorsulfonylgruppen und dgl. Die Cycloalkylgruppen
enthalten gewöhnlich etwa 3 bis etwa 18 Kohlenstoffatome.
Heterocyclische Reste in den erfindungsgemäßen Verbindungen sind 1- und mehrkernige heterocyclische Reste mit mindestens
einem Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefel-Heteroatom.
Bestimmte Hydrazone des 3-Formylrifamycin SV sind in der TJ.S.Patentschrift
3 342 81 ο beschrieben. Diese Verbindungen besitzen eine gute antibakterielle Wirkung, sind jedoch praktisch
wirkungslos gegen Bakterien, die gegen andere .Rifamycine, insbesondere das bekannteste und therapeutisch nützliche
3-(4-Methyl-1-piperazinyl-iminomethyl)-rifamycin SV
(Rifampicin) resistent geworden -sind.
Bekanntlich ist es äußerst schwierig, wenn ein Mikroorganismenstamm
gegen ein bestimmtes Antibiotikum resistent geworden ist eine weitere Verbindung aus der gleichen Antibiotika-Familie
aufzufinden, die das Wachstum der resistenten Kutante inhibieren kann. Manchmal ist es sogar überhaupt schwierig,
auch unter anderen Antibiotika-Arten Verbindungen zu finden, die noch gegen einen solchen resistenten Stamm wirksam sind.
überraschend wurde nun gefunden, daß repräsentative Verbindungen
der vorliegenden Erfindung in niedriger Konzentration
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das Wachstum von Bakterienstämmen inhibieren, die gegen andere
Rifamycine resistent sind. Insbesondere die Verbindungen der Beispiele 1, 2, 11, 12, 13, 14, 15, 23 und 25 inhibieren
bei einer Konzentration von etwa 1o/ug/ml oder weniger
das Wachstum eines gegen Rifampicin resistenten Stammes von Staphylococcus aureus Tour.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind allgemein gegen die üblichen gram-positiven und gram-negativen Bakterien Sehr aktiv.
Insbesondere zeigen sie beträchtliche V/irkung bei Stämmen von Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Streptococcus
hemolyticus und Diplococcus pneumoniae. In diesen Fällen liegt die minimale inhibierende Konzentration zwischen
etwa o,oo1 und etwa o,5 /Ug/ml.
Mn weiteres wichtiges Merkmal der erfindungsgemäßen Verbindungen
ist ihre inhibierende Wirkung auf DNA-Polymerasen, die für Lymphoblasten in leukämischem menschlichem Blut charakteristisch
sind, und auf typische Nukleotidyltransferasen (Polymerasen) von Viren, die von der normalen Zelle nicht verwendet
werden. Aus Untersuchungen an repräsentativen Gliedern von Virusarten ist bekannt, daß die Viren in die Wirtszellen
Polymerasen als wesentlichen Teil ihrer Replikation tragen oder dort induzieren. Es gibt Viren, z.B. Picorna-Viren oder
Polio-Viren, welche die RNA-abhängige RNA-Polymerase induzieren, während andere Arten wie z.B. Leukämie-Sarkom-Viren
eine RRA-abhängige DNA-Polymerase tragen. Die Anwesenheit
und die wichtige Rolle der RNA-abhängigen DNA-Polymerase Revers-Transcriptase in oncogenen RNA-Viren wurde durch
D.Baltimore, Nature, 226 t 12o9 (197o) und H.H. Temin et al.,
Nature, 226. 1211 (197o) entdeckt. Die Entdeckung eines RNA-abhängigen
DNA-Polymeraseenzyms in RNA-Tumorviren tierischer
Herkunft wurde auch durch andere Autoren bestätigt, siehe z.B. Green et al.: Mechanism of carcinogenesis by RNA tumor
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viruses. I. An HNA-dependent DNA-polymerase in murine
sarcoma viruses; Proc. Nat.Aead.Sci. USA 62, 385-393 (I97o);
Spiegelman et al.: Characterization of the products of HNA directed DNA-polymerase in oncogenic HNA viruses,
Nature, London, 227. 563 (i97o);
Hatanaka et al.: I)NA polymerase activity associated with HNA
tumor viruses. Proc.Nat.Acad.Sex. USA, 67, 143 (I97o);
Scolnick et al.: DNA synthesis "by RNA containing tumor viruses, Proc.Nat. Acad.Sci., USA, 6J, 1o34 (I97o).
Die Mitwirkung von KNA-Viren in einigen Tumoren wurde auch
durch andere i'atsachen gestützt: Revers-Transcriptase wurde
in Teilchen aus menschlicher Milch gefunden, die von Frauen mit Brustkrebs in der Familiengeschichte erhalten worden war
(Scholn et al. Nature, 2%±, 97 (1971). Priori et al. (Nature,
New Biology 232, 16 (1971) isolierten ein mit «ESP-1» bezeichnetes
Virus, welches iieyers-Transcriptase enthielt, aus
Zellen der Hippenfell-i'lüssigkeit eines Kindes mit Lymphom,
und das mit Erfolg in Gewebekulturen gezüchtet werden konnte. Bei menschlichem Brustkrebs konnte die Anwesenheit einer
KNA durch Molekülhybridation nachgewiesen v/erden, die der
Virus-KNA aus Brustkrebstumoren von Mäusen homolog ist,
siehe R. Axel et al. in Nature, 235« .32 (1972). Bisher gibt
es keine sehr wirksamen Medikamente zur Behandlung von Viruskrankheiten,
da Viren und Zellen gemeinsame metabolische
Anforderungen stellen. Der erfolgversprechendste Weg einer Chemotherapie bei Viruskrankheiten ist eindeutig die Bereitstellung
geeigneter Chemikalien, die sich spezifisch mit der ■Polymerase von Viruszellen oder durch Viren transformierten
Zellen vereinigen, jedoch nicht mit den Polymerasen der Wirtszellen, die den Ausdruck der genetischen Information der
Viren kontrollieren. Spezielle Inhibitoren der Enzyme von Viruszellen oder durch Viren transformierten Zellen, insbesondere
Inhibitoren der Polymerasen von RNA-Tumorviren, können
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eine wichtige Rolle bei der Bereitstellung von Medikamenten gegen Leukämie und anderen Krebskrankheiten spielen.
Die inhiMerenue Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen
wurde anhand der iiNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität
von endogenen Sarkom-Viren von Nagetieren und der DNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität von gereinigten Enzymen getestet.
Die Inhibierung wurde nach den Methoden von C. Gurgo et al.,
Nature, New Biology, _22_9, 111, 1971 getestet.
Der liffekt der verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen auf die
Polymerase-Aktivität wurde bestimmt, indem man den H-dITP
(tritiiertes Thymin-deoxyribosid-triphospnat)-Mnbau in die
unlösliche Fraktion verfolgte. Line typische Versuchsanordnung ist folgende:
1) Isolierung der Virsn anl £. r^iixgung der Virus-Polymerase.
Die Viren wurden aus durch Nagetier-Sarkom-Viren (Moloney-Typ)
transformierten Rattenzellsa (78A1-Seilen) und durch Nagetier-Sarkom-Viren
(Harvey-i'yp) timnsfcrinierten Mäuse zellen (JIhJH-Zellen)
isoliert und gereinigt, siehe Green et al., Proc.Nat. Acad.Sci USA 6_X, 385-393, 197o, Rokutanda et al., Nature,
227» 1o26-1o28, 137o). Die Virus-Polymerase wurde 2o- bis 40-fach
gereinigt durch Inkubation der gereinigten Viren mit o,5/<
> NP-4-0 (Nonidet P-4o) in o,1 14 NaOl, o,o1 M Tris-Puffer
(pH 7,6), o,oo1 Κ iithylendiamintetraessigsäure während 5 Hinuten
bei iiaumtemperatur mit Zonententrifugierung in 15 bis 3o;£
Sucrose-ü-radienten in 1o mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,4),
2,5 mivl 1-igClp, 1o nii'i Dithiothreit und 51^ G-lycerin während
24 Stunden bei 38 ooo UpL in einem Spinco-üiHI-Äotor. Die
Fraktionen maximaler r.nzymaktivität (13-17 von 22) wurden aufgefangen,
vereinigt und bei -7o°G in 5^5- Glycerin aufbewahrt.
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DHA-Polyroerase-Test.
Die Enzym-Inkubation erfolgte 1 Stunde lang bei 37°C in 1oo/ul
eines .Reaktionsgemische, welches 4o mH Tris-Puffer (pH 6,0),
5 mh Dithiothreit, 3ο mM NaGl, 2,5 mi-i MgGl2, o,1 mM dATP,
d&TP, dCTP und 1 ο/uCi 5H-dTTP (12-18 Ci/mMol) enthielt,
siehe Grean et al., in Proc.Nat.Aead.Sci. US 62, 385-393 (I97o).
Die .reaktion wurde durch Zusatz von 15o/ul 1 n-Perchlorsäure
"beendet. Als Träger wurden I00 mg DKA aus Kalbsthymus zugesetzt.
Das radioaktive DiiA-Produkt wurde nach der Vorschrift
der beiden genannten Veröffentlichungen aufgearbeitet. Die Aktivität der endogenen RNA-abhängigen DNA-Polymerase
wurde nach Zusatz von o,o"\fo PlT-40 zu den gereinigten Viren
zum Probezeitpunkt bestimmt. Die DNA-Polymerase-Aktivität
der gereinigten Virus-Polymerase wurde unter Verwendung von 2/Ug Poly d(A-T) ("Template") und ohne NP-4o gemessen.
Test auf die Inhibierung durch üifamycin-derivate.
Kifamycin-derivate wurden in Dimethylsulfoxyd in einer Konzentration
von 5 mg/ml gelöst und bei 4°C gelagert. Die Inhibierung der endogenen iÜtA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität
v/urde getestet durch Zusatz von 2/ul der Derivatlösung in Dimethylsulfoxyd oder von 2 /ul Dimethylsulfoxyd (Vergleich)
zum Testgemisch vor Zugabe der zerkleinerten Viren, die 15-3o
/Ug Virus-Protein enthielten. Die ünzym-Inkubation erfolgte
während 60 Minuten bei 37°C. Die Inhibierung des gereinigten Enzyms wurde getestet unter Vorinkubierung von 2/ul der Derivatlösung
oder von 2/ul Dimethylsulfoxyd mit 30/&I Enzym
(1-2/Ug Protein) während 1o Kinuten bei 37°G; dann wurden
7o/ul Substratgemisch zugegeben und das Gemisch wurde wie oben
beschrieben inkubiert und aufgearbeitet.
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Me erfindungsgemäßen Verbindungen der Beispiele 11, 12, 15, 14, 15 und 16 verminderten bei Konzentrationen von 2-1oo /ug/ml
oder weniger den Einbau von H -dITP auf weniger als 1o';£ der
Vergleichswerte. Dadurch wird die Inhibierung des Mechanismus der Carcinogenese durch RNA-Tumorviren klar erwiesen.
Die inhibierende V/irkung von Revers-Transcriptasen vmrde ebenfalls
durch Versuche mit Polymerase aus Nagetier-Leukämie-Viren bestätigt. Die RNA-Polymerase der Leukämie-Viren wurde
nach der Vorschrift von Gallo et al., Nature, New Biology, 252, 141 (1971) aus zerkleinerten Viren in Iriton X 1oo hergestellt.
Viren vom RauBCher- und vom Moloney-Typ wurden
zunächst gereinigt durch Bandenbildung in der 1,16 g/ml-Region eines Sucrose-Dichte-Gradienten (6o$ Sucrose bis 2o$ Sucrose)
nach erfolgter Zentrifugierung bei niedriger Geschwindigkeit zwecks Entfernung von Zellrückständen. Die Endkonzentration
des Virus-Präparats betrug 1o Teilchen/ml. Als Vorlage (Template) wurde endogene 70S-RNA verwendet. Konzentrationen
von 5o/ug/ml oder weniger erwiesen sich'als wirksam zur
Inhibierung des Enzyms. Beispielsweise wurden Inhibierungen von ca. 5o?ö mit Konzentrationen von nur etwa 5 /ug/ml der
repräsentativen Verbindungen erzielt.
Ähnliche Ergebnisse wurden bei Verwendung von Tumorzellen-Polymerase
menschlichen Ursprungs erhalten. In diesem Fall wurde die inhibierende Uirkung auch an Polymerasen aus normalen
Zellen untersucht, um einen selektiven Effekt festzustellen. Repräsentative Derivate der Formel I wurden hinsichtlich ihrer
\virkung auf zwei gereinigte DNA-Polymerasen bewertet, die
(1) aus normalen menschlichen (PHA-stimulierten) Blutlymphozyten,
(2) einer Lymphoblast-Zell-Familie (von einem normalen
Spender) und (5) leukämischen menschlichen Blut-Lymphoblasten
erhalten worden waren. Es wurden synthetische oder native
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Vorlagen (Templates) verwendet.
Ein typisches Beispiel der Versuchsausführung wird nachstehend
geschildert:
Lympho"blasten aus menschlichem Blut.
Leukämische LympholDlasten vmrden aus dem peripheren Blut
von Patienten mit akuter lymphoaytischer Leukämie (ALL) durch
Leukophorese isoliert. Die Zellen wurden gewaschen und die Erythrozyten" wurden durch hypotonische Lysis entfernt. Ferner
werden normale Lymphozyten aus dem peripheren Blut aus gesunden
Spendern nach Entfernung der G-ranulozyten durch Nylon-Säulenchromatographie
erhalten, sie wurden mit Phytohämagglutinin (PHA) 72 Stunden wie oben beschrieben (Gallo et al., Nature,
228, 927, 197o; Gallo et al. Science, 165« 4oo, 1968)
stimuliert, um die DNA-Polymerase-Aktivität zu erhöhen«
Wegen der rechnerischen Probleme bei der Bereitstellung ausreichender
Mengen dieser Zellen wurde eine "normale" Gewebs- , kultur (1788) verwendet, die weniger hochgereinigte DNA-Polymerasen
für die ersten Ürientierungsversuche lieferten. Die interessanten Verbindungen wurden dann mit den stärker
gereinigten Enzymen aus den normalen und leukämischen Blutlymphozyten
näher untersucht. Die Zellen aus Gewebskulturen waren von Associated Biomedic System, Inc. erhalten worden.
DNA-Polymerase-Präparate.
Zell-DNA-Polymerase wurde aus normalen Blutlymphozyten (PHA-atimuliert),
k leukämischen Blutlymphozyten sowie 1788-Lymphoidzellen
durch Homogenisierung in hypotonischer Pufferlösung mit anschließender Extraktion der extralysosomalen Pellets
mit Triton X 1oo und/oder Lösungen mit hohem Salzgehalt ge-
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- 1ο -
wonnen und gereinigt. Nach der Differential-Zentrifu^ierung
wurden die Zellextrakte durch Säulenchromatographie an DEAE-Cellulose, Phosphocellulose und Sephadex G 2oo weitergereinigt.
DNA-Polymerase-Tests.
Die Tests auf DNA-Polymerase wurden in einem Endvolumen von
1oo/ul durchgeführt. Das Testgemisch enthielt 5o mti 'üris-HOl-Puffer
(pH 8,3), 6,ο mM MgAc, 8,ο mM Dithiothreit und
6o mti NaGl. Die Einstellung des pH-Werts erfolgte nach" Zugabe
der Inhibitoren, die zuvor in Dirnethylsulfoxyd gelöst worden waren. Die Endkonzentration an Dirne thylsulfoxyd betrug o,5>a,
und alle Vergleichsproben entnielten diese Menge Dimethylsulfoxyd. Eine Enzymkonzentration, die einen Einbau von
ca. 1,o pMol/Std. katalysierte, wurde verwendet. Das Enzym
wurde in den meisten iällen mit dem Iiübitor 5 Minuten
vorinkubiert. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 5/Ug/ml synthetischer DNA (Poly d(AQi), Miles Lab.) oder
DNA.RMA-Hybrid (oligo-dT.Poly rA) oder nativen Stoffen,
nämlich aktivierter Salmsperm-DNA in einer Menge von 5o /ug/ml
und endogener 7oS Virus-kNA, lOyuCi (3H-Me^IyI)-QJIP .(New
England Nuclear, 18,6 mCi//uMol, lyophilisiert und direkt vor Verwendung in ο,οIm-SaIzsäure wieder gelöst) und dATP
(8 χ 1o~ M, zusammen mit synthetischem Material) oder sämtlichen drei Deoxynucleosid-triphosphaten (8 χ 1o M bei
RNA- oder DNA-basierenden Reaktionen) initiiert. Bei einigen Versuchen erfolgte keine Vorinkubation des Enzyms mit dem
Inhibitor. In diesen fällen wurden die Reaktionen beim Zusatz
des Enzyms zum gesamten Reaktionsgemisch, welches den Inhibitor enthielt, initiiert. Proben wurden zu Beginn der
Inkubation und nach 3o Minuten abgezogen, ihre Reaktion wurde durch Zugabe von 2 ml o,o8m-Natriumpyrophosphatlösung beendet,
und die Ausfällung erfolgte in 12,5fMger kalter Trichloressig-
209853 Μ1·1
säure mit Hefe-HNA-(4oo ,ng) als Träger. Die Produkte wurden
auf einem Millipox^en-JTilter gesammelt, sox-gfältig mit 5?^iger
Trichloressigsäure und 1 ml eines Gemische aus Dimethylsulfoxyd,
Äthanol, Ojim-Natriumchlorid (o,5:7o:29,5) gewaschen und
getrocknet, dann erfolgte Zählung in 2 ml BBS^ (Beckman) und
1o ml Liquifluor (New England Nuclear) in einem Packard-Scintillationszähler.
wurde gefunden, daß Konzentrationen von 5-1 οyug/ml der
Verbindungen der Beispiele 11 und 12 eine 5 c/°ige 'Inhibierung
der leukämischen Polymerase bei einer synthetischen DNA-Yorlage (Template) bewirkten. Bei synthetischer HNA (Poly rA.rü)
war die Reaktion noch stärker.
Versuche mit Polymerase aus normalen und Tumorzellen bei nativer Vorlage (Template) zeigten eine höhere Empfindlichkeit
der Tumorenzyme auf die getesteten Verbindungen.
Beispielsweise ergibt eine Konzentration von etwa 5/Ug/ml
der Verbindung 12 eine 5O/yoige Inhibierung der Tumorpolymerase,
während sie auf normale Polymerase praktisch unwirksam bleibt, weitere biologische Eigenschaften der neuen Rifamycinderivate
sind die Inhibierung der Focus-Bildung durch Nagetier-Sarkom-Viren
der Holoney- und Kirsten-Stämme in Mäuse-, Hatten- und menschlichen Zellen; die selektive Inhibierung
der Virusproduktion durch bereits tranformierte Mäuse- oder menschliche Zellen; und elii. Auf findung revertierender Zellen
unter Verwendung von durch das Sarkom-Virus-tranformierten, keine Viren produlerenden Mäuse- und Hattenzellen. Die
selektive Voxizität der erfindungsgemäßen Verbindungen für durch Viren transformierte Zellen von Mäusen oder Hatten
oder Zellen menschlicnen Ursprungs wurde ferner beim Test
auf.die Fähigkeit zur Koloniebildung bestätigt.
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Bei Versuchen zur Ermittlung der inhibierenden Wirkung auf die Focus-Bildung durch Moloney-Sarkom-Viren-BALB/JiDJ-Gewebekulturen
wurde folgende Methode angewandt:
BALB/3T3-Zellkulturen wurden in 25 ο ml-Kunststoffkolben in
einem Wachstumsmedium aue Eagle's Mindestnährstoff-Medium i
mit 1ofa Fötus-Rinderserum gezüchtet. Die Zählung der Zellen
erfolgte mit einem Coulter-Zähler, nachdem die Zellen mit Trypsin-A'thylendiamintetraessigsäure suspendiert und im Wachstumsmedium
verdünnt worden waren. Moloney-Sarkom-Virus wurde als Tumorhomogenat verwendet. Es wurde 4 Passagen einer
Mäuseembryo-Zellreihe unterworfen, dann auf Focus-bildende
Einheiten in BALB/3T3-Zellen untersucht. Bei den Versuchen wurde nach einer Abwandlung der Methode von Hartley and Howe,
Proc.Nat.Acad.Sci. 5£, 78o (1966) gearbeitet. Die Kolben
wurden mit 1-2 χ 1o -Zellen in 25 ml Wachstumsmedium geimpft
und bei 37°C 24 Stunden inkubiert. Nach Entfernung des flüssigen Anteils werden Viren mit einer vorher ermittelten
Anzahl Focus-bildender Einheiten in o,5 ml des Wachstumsmediums
eingeführt und an der Schicht aus einer Zellage 9o Minuten bei 37°C adsorbiert. Nach dieser Adsorptionszeit wird eine
vorbestimmte Menge, gewöhnlich eine Dosis von etwa 5-1O/Ug/ml
einer Rifamycin-Verbindung (in Dirnethylsulfoxyd in einer
Konzentration von 1 mg/ml gelöst) in 25 ml Wachstumsmedium zugegeben und die Kulturen werden in die Inkubationsvorrichtung
zurückgesetzt. Zum Vergleich wird Dimethylsulfoxyd allein im Wachstumsmedium einer weiteren Kultur zugegeben. Nach 3-täglger
Inokulierung erfolgt Flüssigkeitsaustausch und die Kerne transformierter Zellen .werden am Tag 7 gezählt.
Auf die gleiche Weise werden Stomatitis-Viren (New Jersey
Serotyp) untersucht; Methoden zur Züchtung und Testung dieser Viren wurden von Hackett et al., Virology, j51_, 114 (1967)
beschrieben.
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Die Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen eine inhibierende Wirkung auf durch Viren induzierte Tumoren
bei Tieren besitzen. ' ·
i)in Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen
besteht darin, daß man 3-iOrniyl-rifamycin SV, dessen 25-Desacetylderivat
oder 16,17,18,19,28,29-üexahydroderivat
in einem organischen Lösungsmittel mit der stöcniometrisehen
Menge eines Hydrazins der I'ormel NHp-NR.Rp, in welcher
R. und Rp die obige Bedeutung besitzen, behandelt. Nachdem
man das xieaktionsgemisch einige Zeit, beispielsweise 1o Minuten bis einige Stunden, bei Räumt emperatiir stehen gelassen
hat, wird das Rohprodukt durch Einengen oder Abdampfen des Lösungsmittels gewonnen. Die Reinigung bereitet keine besonderen
Schwierigkeiten, sie erfolgt im allgemeinen■durch
Kristallisieren aus einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise einem niedrigen Alkanol, niedrigen Acylestern niedriger.
Alkanole oder Benzol.
Wie aus der ^Ormel der erfindungsgemäßen Verbindungen ersichtlich,
kann unter Verwendung des entsprechenden Hydrazins eine große Anzahl erfindungsgemäßer Derivate hergestellt
werden. In einigen Fällen, in welchen das Hydrazin eine stark saure Gruppe, z.B. eine Sulfogruppe, aufweist, wird
das Rifamycin-derivat während der Hydrazonbildung in 27-Stellung hydrolysiert, wobei man die entsprechende 27-Demethoxy-27-hydroxyverbindung
erhält.
Allgemein erfolgt die Herstellung der Hydrazone, indem man zu einer Lösung von o,o1 Mol 5-i1ormylrifamycin SV, dessen 25-Desacetylderivat
oder dessen 16,17,18,19,28,29-riexahydroderivat
in Tetrahydrofuran o,o1 Mol des Mydrazons unter Rühren
bei itaumtemperatur zusetzt. Nach 1o-minütigem bis 3-stündigem
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Rühren wird ein Tropfen der Lösung durch Dünnschi chtenchroma-tographie
an Silikagel getestet, wobei das Verschwinden des Ausgangsmaterials und die Bildung des Lnciproduirts festgestellt
werden können.
Sobald keine Carbonylverbindung mehr vorhanden ist, wird die
Lösung zur Trockene eingeengt, wobei man das Rohprodukt erhält, das durch Kristallisieren aus einem Lösungsmittel
oder durch fciäulenchromatographie gereinigt v.ird.
In Tabelle I sind die c emischen und physikalischen Daten einiger erfindungsgemäßer Verbindungen aufgeführt. Die Tabelle
enthält lediglich Verbindungen, in denen R, ein Acetylrest
ist, sowie keine hydrierten Derivate.
Das Ausgangsmaterial zur Herstellung der Hexahydroderivate der Rifamycine der Formel I, d.h. 16,17,18,19,28,29-Hexahyaro-3-formylrifamycin
SV wird wie folgt hergestellt: 2o g rifamycin S, in 600 ml trockenen Äthanols suspendiert,
werden in einer Parr-Hydriervorrichtung mit 2 g Platinoxyd als Katalysator 5 Stunden bei Raumtemperatur und einem "Wasserstoff
druck von etwa 5 Atmospaären hydriert. Nach dem Abfiltrieren
des Katalysators wird die Lösung zur Trockene eingeengt, das Rohprodukt wird in Tetrahydrofuran gelöst und
bei xiaumtemperatur mit 18 g Kangandioxyd gerührt. Der anorganische
Niederschlag wird abfiltriert, das Filtrat wird auf ein kleines Volumen eingeengt, in 5oo ml Xtnylacetat
aufgenommen und mit Äther gewaschen. Die organische Schicht wird über Natriumsulfat getrocknet und ergibt beim Eindampfen
8 g riexahydro-Rifamycin ü vom Schmelzpunkt 150-I60 0
(aus Methanol). Das Produkt wird sodann nach der Vorschrift
von Beispiel 5 der britischen Patentschrift 1 219 36o in das 3-I'1ormylderivat überfünrt. Das dabei erhaltene Roh-
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- Vf ,
produkt kann durch Säulenchromatographie der Ghloroformlösung
an Silikagel unter Sluieren mit Chloroform/Y/o Methanol
gereinigt werden. Dabei erhält man das 16,17,18,19,28,29-Hexahydro-3-formylrifamycin
SV vom Schmelzpunkt 126-133°C.
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ι)
2) H
3)
4) H
5) H
6) H
CH2COOH
OH.OH.H
C2E5
Kristallisations- oder Chromatographie-Lösungs
mittel
Säule CHCl,/lieOH
Säule
CHCl5/Me0H
Äthjlaoetat/ Ligroin
Benzol
Äthylacetat
Benzol
1 157-9
j 157-9
I
j >280
j >280
j>280
j
j
|ci200 (Zers.)
(Zers.)
Charakterist. U.T.-u. sichtbare Banden
Λ max E t0
1 cm.
475 331
475
330
478 340
480
335
491 356
485 352
170,6 281,9
178,5 290,0
200,9 328,9
150 320
180,5 291
165,9 258,3
Tabelle 1 (Fortsetzung)}
O CO CD
7) H
8) H
9) H
10) H
in).
// X
R,
N.
OH
N-CH,
Kristallisationsoder Chromatographie-Lösungs
mittel
mittel
Methanol
Benzol
Äthylacetat
Methanol
Methanol
Ausb.
48
3?.°C
Charakterist. TJ.Y.-u. sichtbare Banden
max
I 200 (Zers.)
485 543
188-90
485 348
j 473 (Zers.) j 332
208-10
168-72
480 345
486 360
l<fo
1 cm.
191,6 341,3
164,3 326,8
166 275
191,4 344,0
185,8 238,9
Tabelle 1 (Fortsetzung):
12) H
! 13)
: U) H
I 16) H
Kristallisations- oder Chromatographie-Lösungsmittel
Säule CHCl,/MeOH
Säule
CHC1,/MeOH
Säule
CHC1,/MeOH
Säule CHCl,/MeOH
Säule CHClj/MeOH
Ausb.
46
40
F-0C
205-15
(Zers.)
(Zers.)
157-9
152-6
! 150-I
140
Charakterist. U.V.-u. sichtbare Banden
/\ max
500 390
475 330
476 335
490 363
483 343
1 cm.
200,5
279,3
173,0 274,0
175,0 282,3
173,2 231,2
135,4 240,9·
Tabelle 1 (Fortsetzung):
17) H
.18) H
19) H
CH,
OCH.
20) H
ί Ii
Kristallisationsoaer
Chromatographie-Lösungsmittel
Äthylacetat
Methanol
Äthylacetat
ιAthylacetat
75
75
F.°C
Charakterist« TJ.Y.-u. sichtbare Banden
! A max
206
(Zers.)
195
(Zers.)
(Zers.)
212
(Zers.)
(Zers.)
510
383
383
504
364
364
512
582
582
325
1 cm.
166 297
194 246
17.Q 283 178
512 | 167 | |
208- i | 383 | 304 |
(Zers.) ; |
Tabelle 1 (Portsetzung)s
N) O CO CO
1
21) H
22) H
23) H
■: 24) H
CH-
KristallisationsocLer Chromatogra-
I phie-Lösungs-
I mittel
Ausb.
F. 0O
Methanol
Benzol
Benzol
ithylaoetat
215
(Zers.)
(Zers.)
185
(Zers.)
(Zers.)
185
(Zers,)
(Zers,)
' 50 i 200
;(Zers.)
Charakterist. U.¥,-u.. sichtbare Banden
487
348
348
500
384
508
389
389
502
384
1 cm.
191,6 382,8
149,1 249,5
134,2 190
161,2 259,2
Tabelle 1 (Fortsetzung)ι
ΙΟ O CO OO
Rl | R2 | Kristallisations oder Chromatogra- phie-Lösungs mittel |
Ausb. | F.°C | Charakterist. U.V.- u. sichtbare Banden /\ max E l'fo 1 cm. |
25) H ! S i N) H I 27) H I 128) i j |
CH5 CH3 CH5 NO2 \^N02 -CH2-CH-CH2 |
Methanol Tetrachlor kohlenstoff Methanol Methanol |
j 50 90 90 40 |
193-4 178-80 220-4 I7O-5 |
502 157,8 ! 368 248,7 i 485 237,5; 358 243,8 525 210 ; 425 235 : 340 228 i 475 160,5! 332 272,1 j |
Tabelle 1 (Fortsetzung):
O (O OO
29)
30) CH9-CH9OH
2 U"2V
51) H
52) H
-CH2-CH2-O
-O
NO,
NO,
16,17,18,19,28,29-Hexahydro-
-ο-
27-Demethoxy-27-hydroxy-
Kristallisations- oder Chromatographie-Lösungsmittel
Ausb.
Ithylacetat 75
Tetrachlorkohlenstoff
Säule -
Chloroform:Methanol| 55 96 ι 4 j
j Ithylacetat/Leicht-j
benzin
ithylacetat
50
145-8
Charakterist. U.V.-u. sichtbare Banden
120-4
(Zers.)
(Zers.)
I
(Zers.) j
(Zers.) j
max
470 531
485
555
502 401
475 358
If0 1 cm.
135 255
196 250,8
145,5 215,9
179,4 268,1
rc
CO
Tabelle 1 (Fortsetzung):
S 33) ' 34) I 35) i 36)
: 37)
Kristallisations- oder Chromatographie-Lösungsmittel
Aceton
Tetrachlor-
2j kohlenstoff
A'thylacetat
'Tetrachlorjkohlenstoff
JMethanol
Ausb.
60
95
Θ5
70
80
F.°C
280
160-3
244-6
200-3
Charakterist. U.V.- u. sichtbare Banden
max
475 330
474 333
348
490 357
ί 485 190-3 ! 358
cm.
155
322
154,5 244,4
187,7 225,5
204 284
222 233
fs»
tv
Tabelle 1 (Fortsetzung):
ro ο co
V , f |
R2 ι 1 i |
Kristallisations oder Chromatogra phie-Lösungs mittel |
Ausb. t> |
F. °C | .Charakterist. U.T.- u. sicht bare Banden λ max E 1* 1 cm. |
ι
38) H 39) H 40) H 41) CH5 42)_ H |
5 Cl 0-0, • Cl 1 -(CH 2)ll-CH3 -(CHg)4-CH3 |
Tetrachlor- kohlenstoff/Li- groin Methanol Ligroin Methanol Methanol |
85 90 70 60 85 |
160-4 174-6 118-20 150-3 214-16 |
484 203 357 226 485 156,8 342 250,8 478 127,8 340 251,3 480 130 i 343 235 ί 501 326,9 440 326,9 34-8 186,5 |
Die in der obigen Tabelle aufgeführten Verbindungen sollen nur der Illustration dienen. Auch andere Hydrazone der
obigen allgemeinen Formel werden von vorliegender Erfindung umfaßt und sind für die angegebenen Zwecke brauchbar.
Weitere Hydrazone werden beispielsweise erhalten aus 3-I'ormyl-rifamycin
SV, dessen 25-Desacetylderivat oder den entsprechenden Hexahydroverbindungen und folgenden Hydrazinen
der formel
2 0 9 8 Fi 3 /1 1 6 1
Beisp. | ■n | 1 | R | 2 |
Nr. | O+Hg | C5H11 | ||
1 | H | 6-Bis-(hydroxyätliyl)-ainino-3- | ||
2 | pyridazinyl- | |||
CH3 | 1H-2,3-Benzoxazin.-4-yl- | |||
3 | H | lH-2,3-Benzoxazin-4yl- | ||
4 | °2H5 | 6-Clilor-lH-2,3-benzoxazin-4-yl- | ||
5 | H | 6-Chlor-lH-2,3-t>enzoxazin-4-yl- | ||
6 | CH3 | 6-Amino-lH-2,3-"benzoxanzin-4-yl- | ||
7 | H | o-Pluorphthalazin-i-yl- | ||
8 | CH3 | -(CH2J5-OH | ||
9 | CH3 | |||
1o | H | -CH2-C6H4-C6H4 | ||
11 | C4H9 | Cyclohexyl- | ||
12 | H | 2-Phenyl-6-methoxy-4-chinolyl- | ||
13 | C2H5 | -(CH2J11-CH3 | ||
14 | H | "6 4" 2 3 | ||
15 | H | -CgH.-SOpi1^ | ||
16 | H | -C6H3(N02-2)(S02P-4) | ||
17 | H | 9-Acridinyl- | ||
18 | C5H9 | CgH17 | ||
19 | (C3H7J2NC2H4 | C8H16OH | ||
2o | CH2Cl-CHCl | m-Nitrophenyl- | ||
21 | CH2CH2COOH | 3-Plienylpropyl- | ||
22 |
IjXl0VyXl J Vnll\jXIoVy"rf
C. C. J |
Isoamyl- | ||
23 | C=C-CH5 | CH, •5 |
||
24 | C4H9 | p-Witrophenyl- | ||
25 | CH3 | m-iMitropiienyl- | ||
26 | H | p-Cnlorphenyl- | ||
27 | H | p-ürompnenyl- | ||
28 | H | m-Fluorphenyl- | ||
29 | H | 2,5--Ui±'luo3?pli-enyl- | ||
3 ο |
209853/1161
Beisp. p ρ
fat ' 1 2
31 | h |
32 | H |
33 | H |
34 | H |
35 | H |
36 | H |
37 | H |
38 | |
39 | H |
4ο | H |
41 · | H |
42 | H |
43 | H |
44 | H |
45 | H |
46 | H |
47 | H |
48 | H |
49' | H |
5ο | H |
51 | H |
52 | H |
53 | H |
54 | H |
55 | H |
56 | H |
57 | H |
58 | H |
59 | H |
6ο | H |
5?
ο -Methoxyplienylp-Ialyl-
4-Cai"l3oxymetliOxyplienyl-
( 2,6-Dime th.yl-4-i sobutyl) -phenyl-
°12H25
2-Phenäthyl- ·
2-Phenäthyl- ·
CH2CH(OH)(CH2)Q-CH5
4-Biphenylyl-CH2COOC2H5
CH(CH5)COOC2H5
Pentafluorphenylo-Chlorbenzyl-
3,4-Dimethoxy'benzylo-Irifluormethylphenyl-
2-(2,6-Dibrom-4-aminophenoxy)-äthyl-
2-(2,6-Dibrom-4-acetamidophenoxy)-äthyl-
3-Phenylpropyl-4-Phenyl"butyl-
2-Phenylpropyl-4-Phenylbenzyl-
2-Pyridyl-2-Iso"butenyl-
CHp-C=CH
Cyclopropyl-CycloTDutyl-
2-Iaphthyl-2-( 1,2,3 ,V4-Tetrahydronaphthyl)-
209853/1161
Beisp. | J? |
Nr. | 1S |
61 | Amyl |
62 | H |
63 | H |
64 | H |
65 | H |
66 | CH-. |
67 | CH5 |
68 | CH- |
69 | H |
7o | H |
71 | H |
72 | H |
73 | H |
74 | H |
75 | GH5 |
76 | H |
77 | H |
78 | H |
79 | H |
8o | H |
81 | Benzyl |
82 | H |
83 | H |
84 | H |
85 | H |
86 | H |
87 | H |
88 | K |
89 | H |
9o | H |
Amyl-
285
2,4,6-Irinitrophenyl-GH2CH(OH)C6H5
GH2(GH(SH)CH3 CH2C(CH5)2SGH2
5-Cyan-6-chlor-2-pyridyl-CH2CH
CH2SO5H
2-Thiazolyl-3,4-Methylendioxy"benzyl-Cyclohexylmethyl-CH2CH2CH2CH(CH5)C6H5
CH2CH2NHCH2CH2C6H5
4-Pyridyl-N-oxid 4-Amino-6-chlor-3-py^idazinyl-5-Mtro-2-pyrimidyl-1,3,4-TMadiazol-2-yl-1,2,5-i1hiadiazol-3-yl-Benzyl-3-Methyl-5-nitro-2-pyridyl-
2-Methylsulfonyl-3,5-dichlor-4-pyridyl-
2-Benzimidazolyl-8-Purinyl-
3-(4-Pyridyl)-propyl-6-Purinyl-
1-Adamantany1-Hexachlorchinolin-4-yl-
CH0CH=CHC^H1-
209853/1161
Beisp.
91 H 3-Pyridylmethyl-
92 H 1-Methyl~8-purinyl-
93 H 3-Methyl-8-purinyl-
94 H 7-Methyl-8-purinyl-
95 CH3 -(CHg)-OCOCH5
209853M 161
Claims (2)
- Patentansprüche. 1/i Rifamycin SV der Formel
HO Me Me Me
ήR X
OH
OH OH
■MeQ UU
—J 0H0 ι >
ο'Me 0,in welcher R1 und Rp unabhängig voneinander(a) ein Vasserstoffatom,(b) einen Alkyl-,(c) Alkenyl-,(d) Alkinyl-,(e) Aryl-,(f) Aralkyl-,(g) einen heterocyclischen oder(ii) einen Cycloalkylrest darstellen,unter der Maßgabe, daß nur einer der Reste R1 oder R2 Wasserstoff oder ein niedriger Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sein kann, v/obei bei Vornandensein eines Wasserstoffatoms oder niedrigen Alkylrests der andere üubstituent R1 oder Kp ein unsubstittiierter Alkyl- oder hydroxyalkylrest mit mindestens 5 Kohlenstoffatomen oder ein substituierter Alkylrest mit Ausnahme des uimethylaminoätnyli'üsts, oder ein209853 M161Glied der Gruppe (c) bis (h) ist, mit Ausnahme von Phenyl, p-Carboxyphenyl und Benzyl, in der ferner R05 Wasserstoff oder den Acetylrest bedeutet, sowie dessen 16,17,18,19,28,29-• Hexahydro- und 27-Bemethoxy-27-hydroxyderrvateβ - 2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein 3-i1ormylrifamycin der FormelMeOOHin welcher R-, die obige Bedeutung besitzt, oder dessen Hexahydroderivat mit einem Hydrazin der formel HpK-WR.Rp, worin η, und R2 die obige Bedeutung besitzen, in Berührung bringt,51Ur: Gruppo Lepetit ü.p.A. Mailand/ItalienDr. H. J. Wolff(Rechtsanwalt)209853/1161
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