DE2227173A1 - - Google Patents

Description

KECHTSANWXITE

DR. JUR. DIPL-CHEM. WALTER BEIL ALFRED HOEPPENER

OR. JUR. DiPL-CHEM. H.-J. WOLW DR. JUR. HANS CHR. BEIL

623 FRANKFURTAM MA1N-WÖCH5?

ADStONSISASK Sf

30 Mai 1972

Unsere Wr. 17 825 Gfruppo Le pe tit S. p. A. Mailand / Italien

Neue Derivate des 3-Formy!rifamycin SV,

Die vorliegende Erfindung "betrifft Hydrazone des 3-Formylrifamycin SV der allgemeinen Formel

Me Me

HO

MeO

Me

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in welcher K₁ und Κ_? unabhängig voneinander a) v/asserstoff, "b) einen Alkyl-,

c) Alkenyl-,

d) Alkinyl-,

e) Aryl-,

f·) Ar alkyl-,

g) einen heterocyclischen oder h) einen Cycloalkylrest darstellen,

unter der Haßgabe, daß nur einer der xieste K₁ oder ü_? wasserstoff oder ein niedriger Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sein kann, wobei, falls einer der öubstituenten Wasserstoff oder ein niedriger Alkylrest ist, der andere Substituent ^₁ oder K₂ ein unsubstituierter Alkylrest oder Hydroxyalkylrest mit mindestens 5 Kohlenstoffatomen, oder ein vom Dimethylaminoäthylrest verschiedener substituierter Alkylrest, oder sin Rest der obigen Gruppen c) bis h) sein muß, mit Ausnahme des Phenylrests, p-Carboxyphenylrests und Benzylrests j IU in obiger Formel bedeutet Wasserstoff oder den Acetylrest, Auch die entsprechenden Hexahydro-Verbindungen und 27-Uemethoxy-27-hydroxyverMndungen fallen in den Bereich vorliegender Erfindung.

Gewöhnlich enthalten die Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppen maximal etwa 2o Kohlenstoffatome. Biese Gruppen können geradkettig oder verzweigt sein_ä ferner können sie unsubstituiert te ■;.;■» "ix- e:⁵-:ei? oder mehrere ßubstituenten an der Kohlenstoffkette auiVifeios-·.,- A -i Bei.;_;, Ie3,9 für ciubstituenten seien die Halogene (iU/uor, Chlor _s Brom, Jod), die Nitrogruppe, ArniiiogruTjpe, Kono- und JJialkylaminogruppen, Gyangruppe, Hydroxylgruppe, Alko.i:ygruppe, Aryloxygruppe, Uarboxygruppe, Garbalkoxygruppen, Carbarr/lgruppe, Pluorsulfonylgruppe, üulfogruppe und dgl, genannt. Alkenylreste können ferner eine oder mehrere doppelbindungen und die Alkinylreste eine oder mehrere J)rei-

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fachbindungen aufweisen.

Die Aryl- "und Aralkylreste können ebenfalls unsubstituiert sein oder ein oder mehrere Substituenten am King "besitzen, 2.B, niedrige Alkylreste mit 1 Ms 4 Kohlenstoffatomen, aalogenatome, halogensubstituierte niedrige Alkylreste, Aminogruppen, Mono- und Dialkylaminogruppen, Cyan-,. ¥ Carboxy-, Hydroxy-, Acyloxy-, Carbalkoxy-, Nitro-, Carbamyl-, SuIfo-, SuIfamido-, Fluorsulfonylgruppen und dgl. Die Cycloalkylgruppen enthalten gewöhnlich etwa 3 bis etwa 18 Kohlenstoffatome.

Heterocyclische Reste in den erfindungsgemäßen Verbindungen sind 1- und mehrkernige heterocyclische Reste mit mindestens einem Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefel-Heteroatom.

Bestimmte Hydrazone des 3-Formylrifamycin SV sind in der TJ.S.Patentschrift 3 342 81 ο beschrieben. Diese Verbindungen besitzen eine gute antibakterielle Wirkung, sind jedoch praktisch wirkungslos gegen Bakterien, die gegen andere .Rifamycine, insbesondere das bekannteste und therapeutisch nützliche 3-(4-Methyl-1-piperazinyl-iminomethyl)-rifamycin SV (Rifampicin) resistent geworden -sind.

Bekanntlich ist es äußerst schwierig, wenn ein Mikroorganismenstamm gegen ein bestimmtes Antibiotikum resistent geworden ist eine weitere Verbindung aus der gleichen Antibiotika-Familie aufzufinden, die das Wachstum der resistenten Kutante inhibieren kann. Manchmal ist es sogar überhaupt schwierig, auch unter anderen Antibiotika-Arten Verbindungen zu finden, die noch gegen einen solchen resistenten Stamm wirksam sind.

überraschend wurde nun gefunden, daß repräsentative Verbindungen der vorliegenden Erfindung in niedriger Konzentration

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das Wachstum von Bakterienstämmen inhibieren, die gegen andere Rifamycine resistent sind. Insbesondere die Verbindungen der Beispiele 1, 2, 11, 12, 13, 14, 15, 23 und 25 inhibieren bei einer Konzentration von etwa 1o/ug/ml oder weniger das Wachstum eines gegen Rifampicin resistenten Stammes von Staphylococcus aureus Tour.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind allgemein gegen die üblichen gram-positiven und gram-negativen Bakterien Sehr aktiv. Insbesondere zeigen sie beträchtliche V/irkung bei Stämmen von Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Streptococcus hemolyticus und Diplococcus pneumoniae. In diesen Fällen liegt die minimale inhibierende Konzentration zwischen etwa o,oo1 und etwa o,5 /Ug/ml.

Mn weiteres wichtiges Merkmal der erfindungsgemäßen Verbindungen ist ihre inhibierende Wirkung auf DNA-Polymerasen, die für Lymphoblasten in leukämischem menschlichem Blut charakteristisch sind, und auf typische Nukleotidyltransferasen (Polymerasen) von Viren, die von der normalen Zelle nicht verwendet werden. Aus Untersuchungen an repräsentativen Gliedern von Virusarten ist bekannt, daß die Viren in die Wirtszellen Polymerasen als wesentlichen Teil ihrer Replikation tragen oder dort induzieren. Es gibt Viren, z.B. Picorna-Viren oder Polio-Viren, welche die RNA-abhängige RNA-Polymerase induzieren, während andere Arten wie z.B. Leukämie-Sarkom-Viren eine RRA-abhängige DNA-Polymerase tragen. Die Anwesenheit und die wichtige Rolle der RNA-abhängigen DNA-Polymerase Revers-Transcriptase in oncogenen RNA-Viren wurde durch D.Baltimore, Nature, 226 _t 12o9 (197o) und H.H. Temin et al., Nature, 226. 1211 (197o) entdeckt. Die Entdeckung eines RNA-abhängigen DNA-Polymeraseenzyms in RNA-Tumorviren tierischer Herkunft wurde auch durch andere Autoren bestätigt, siehe z.B. Green et al.: Mechanism of carcinogenesis by RNA tumor

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viruses. I. An HNA-dependent DNA-polymerase in murine sarcoma viruses; Proc. Nat.Aead.Sci. USA 62, 385-393 (I97o); Spiegelman et al.: Characterization of the products of HNA directed DNA-polymerase in oncogenic HNA viruses, Nature, London, 227. 563 (i97o);

Hatanaka et al.: I)NA polymerase activity associated with HNA tumor viruses. Proc.Nat.Acad.Sex. USA, 67, 143 (I97o); Scolnick et al.: DNA synthesis "by RNA containing tumor viruses, Proc.Nat. Acad.Sci., USA, 6J, 1o34 (I97o).

Die Mitwirkung von KNA-Viren in einigen Tumoren wurde auch durch andere i'atsachen gestützt: Revers-Transcriptase wurde in Teilchen aus menschlicher Milch gefunden, die von Frauen mit Brustkrebs in der Familiengeschichte erhalten worden war (Scholn et al. Nature, 2%±, 97 (1971). Priori et al. (Nature, New Biology 232, 16 (1971) isolierten ein mit «ESP-1» bezeichnetes Virus, welches iieyers-Transcriptase enthielt, aus Zellen der Hippenfell-i'lüssigkeit eines Kindes mit Lymphom, und das mit Erfolg in Gewebekulturen gezüchtet werden konnte. Bei menschlichem Brustkrebs konnte die Anwesenheit einer KNA durch Molekülhybridation nachgewiesen v/erden, die der Virus-KNA aus Brustkrebstumoren von Mäusen homolog ist, siehe R. Axel et al. in Nature, 235« .32 (1972). Bisher gibt es keine sehr wirksamen Medikamente zur Behandlung von Viruskrankheiten, da Viren und Zellen gemeinsame metabolische Anforderungen stellen. Der erfolgversprechendste Weg einer Chemotherapie bei Viruskrankheiten ist eindeutig die Bereitstellung geeigneter Chemikalien, die sich spezifisch mit der ■Polymerase von Viruszellen oder durch Viren transformierten Zellen vereinigen, jedoch nicht mit den Polymerasen der Wirtszellen, die den Ausdruck der genetischen Information der Viren kontrollieren. Spezielle Inhibitoren der Enzyme von Viruszellen oder durch Viren transformierten Zellen, insbesondere Inhibitoren der Polymerasen von RNA-Tumorviren, können

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eine wichtige Rolle bei der Bereitstellung von Medikamenten gegen Leukämie und anderen Krebskrankheiten spielen.

Die inhiMerenue Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde anhand der iiNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität von endogenen Sarkom-Viren von Nagetieren und der DNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität von gereinigten Enzymen getestet.

Die Inhibierung wurde nach den Methoden von C. Gurgo et al.,

Nature, New Biology, _22_9, 111, 1971 getestet.

Der liffekt der verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen auf die Polymerase-Aktivität wurde bestimmt, indem man den H-dITP (tritiiertes Thymin-deoxyribosid-triphospnat)-Mnbau in die unlösliche Fraktion verfolgte. Line typische Versuchsanordnung ist folgende:

1) Isolierung der Virsn anl £. r^iixgung der Virus-Polymerase.

Die Viren wurden aus durch Nagetier-Sarkom-Viren (Moloney-Typ) transformierten Rattenzellsa (78A1-Seilen) und durch Nagetier-Sarkom-Viren (Harvey-i'yp) timnsfcrinierten Mäuse zellen (JIhJH-Zellen) isoliert und gereinigt, siehe Green et al., Proc.Nat. Acad.Sci USA 6_X, 385-393, 197o, Rokutanda et al., Nature, 227» 1o26-1o28, 137o). Die Virus-Polymerase wurde 2o- bis 40-fach gereinigt durch Inkubation der gereinigten Viren mit o,5/< > NP-4-0 (Nonidet P-4o) in o,1 14 NaOl, o,o1 M Tris-Puffer (pH 7,6), o,oo1 Κ iithylendiamintetraessigsäure während 5 Hinuten bei iiaumtemperatur mit Zonententrifugierung in 15 bis 3o;£ Sucrose-ü-radienten in 1o mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,4), 2,5 mi^vl 1-igClp, 1o nii'i Dithiothreit und 5¹^ G-lycerin während 24 Stunden bei 38 ooo UpL in einem Spinco-üiHI-Äotor. Die Fraktionen maximaler r.nzymaktivität (13-17 von 22) wurden aufgefangen, vereinigt und bei -7o°G in 5^5- Glycerin aufbewahrt.

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DHA-Polyroerase-Test.

Die Enzym-Inkubation erfolgte 1 Stunde lang bei 37°C in 1oo/ul eines .Reaktionsgemische, welches 4o mH Tris-Puffer (pH 6,0), 5 mh Dithiothreit, 3ο mM NaGl, 2,5 mi-i MgGl₂, o,1 mM dATP, d&TP, dCTP und 1 ο/uCi ⁵H-dTTP (12-18 Ci/mMol) enthielt, siehe Grean et al., in Proc.Nat.Aead.Sci. US 62, 385-393 (I97o). Die .reaktion wurde durch Zusatz von 15o/ul 1 n-Perchlorsäure "beendet. Als Träger wurden I00 mg DKA aus Kalbsthymus zugesetzt. Das radioaktive DiiA-Produkt wurde nach der Vorschrift der beiden genannten Veröffentlichungen aufgearbeitet. Die Aktivität der endogenen RNA-abhängigen DNA-Polymerase wurde nach Zusatz von o,o"\fo PlT-40 zu den gereinigten Viren zum Probezeitpunkt bestimmt. Die DNA-Polymerase-Aktivität der gereinigten Virus-Polymerase wurde unter Verwendung von 2/Ug Poly d(A-T) ("Template") und ohne NP-4o gemessen.

Test auf die Inhibierung durch üifamycin-derivate.

Kifamycin-derivate wurden in Dimethylsulfoxyd in einer Konzentration von 5 mg/ml gelöst und bei 4°C gelagert. Die Inhibierung der endogenen iÜtA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität v/urde getestet durch Zusatz von 2/ul der Derivatlösung in Dimethylsulfoxyd oder von 2 /ul Dimethylsulfoxyd (Vergleich) zum Testgemisch vor Zugabe der zerkleinerten Viren, die 15-3o /Ug Virus-Protein enthielten. Die ünzym-Inkubation erfolgte während 60 Minuten bei 37°C. Die Inhibierung des gereinigten Enzyms wurde getestet unter Vorinkubierung von 2/ul der Derivatlösung oder von 2/ul Dimethylsulfoxyd mit 30/&I Enzym (1-2/Ug Protein) während 1o Kinuten bei 37°G; dann wurden 7o/ul Substratgemisch zugegeben und das Gemisch wurde wie oben beschrieben inkubiert und aufgearbeitet.

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Me erfindungsgemäßen Verbindungen der Beispiele 11, 12, 15, 14, 15 und 16 verminderten bei Konzentrationen von 2-1oo /ug/ml oder weniger den Einbau von H -dITP auf weniger als 1o';£ der Vergleichswerte. Dadurch wird die Inhibierung des Mechanismus der Carcinogenese durch RNA-Tumorviren klar erwiesen.

Die inhibierende V/irkung von Revers-Transcriptasen vmrde ebenfalls durch Versuche mit Polymerase aus Nagetier-Leukämie-Viren bestätigt. Die RNA-Polymerase der Leukämie-Viren wurde nach der Vorschrift von Gallo et al., Nature, New Biology, 252, 141 (1971) aus zerkleinerten Viren in Iriton X 1oo hergestellt. Viren vom RauBCher- und vom Moloney-Typ wurden zunächst gereinigt durch Bandenbildung in der 1,16 g/ml-Region eines Sucrose-Dichte-Gradienten (6o$ Sucrose bis 2o$ Sucrose) nach erfolgter Zentrifugierung bei niedriger Geschwindigkeit zwecks Entfernung von Zellrückständen. Die Endkonzentration des Virus-Präparats betrug 1o Teilchen/ml. Als Vorlage (Template) wurde endogene 70S-RNA verwendet. Konzentrationen von 5o/ug/ml oder weniger erwiesen sich'als wirksam zur Inhibierung des Enzyms. Beispielsweise wurden Inhibierungen von ca. 5o?ö mit Konzentrationen von nur etwa 5 /ug/ml der repräsentativen Verbindungen erzielt.

Ähnliche Ergebnisse wurden bei Verwendung von Tumorzellen-Polymerase menschlichen Ursprungs erhalten. In diesem Fall wurde die inhibierende Uirkung auch an Polymerasen aus normalen Zellen untersucht, um einen selektiven Effekt festzustellen. Repräsentative Derivate der Formel I wurden hinsichtlich ihrer \virkung auf zwei gereinigte DNA-Polymerasen bewertet, die (1) aus normalen menschlichen (PHA-stimulierten) Blutlymphozyten, (2) einer Lymphoblast-Zell-Familie (von einem normalen Spender) und (5) leukämischen menschlichen Blut-Lymphoblasten erhalten worden waren. Es wurden synthetische oder native

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Vorlagen (Templates) verwendet.

Ein typisches Beispiel der Versuchsausführung wird nachstehend

geschildert:

Lympho"blasten aus menschlichem Blut.

Leukämische LympholDlasten vmrden aus dem peripheren Blut von Patienten mit akuter lymphoaytischer Leukämie (ALL) durch Leukophorese isoliert. Die Zellen wurden gewaschen und die Erythrozyten" wurden durch hypotonische Lysis entfernt. Ferner werden normale Lymphozyten aus dem peripheren Blut aus gesunden Spendern nach Entfernung der G-ranulozyten durch Nylon-Säulenchromatographie erhalten, sie wurden mit Phytohämagglutinin (PHA) 72 Stunden wie oben beschrieben (Gallo et al., Nature, 228, 927, 197o; Gallo et al. Science, 165« 4oo, 1968) stimuliert, um die DNA-Polymerase-Aktivität zu erhöhen«

Wegen der rechnerischen Probleme bei der Bereitstellung ausreichender Mengen dieser Zellen wurde eine "normale" Gewebs- , kultur (1788) verwendet, die weniger hochgereinigte DNA-Polymerasen für die ersten Ürientierungsversuche lieferten. Die interessanten Verbindungen wurden dann mit den stärker gereinigten Enzymen aus den normalen und leukämischen Blutlymphozyten näher untersucht. Die Zellen aus Gewebskulturen waren von Associated Biomedic System, Inc. erhalten worden.

DNA-Polymerase-Präparate.

Zell-DNA-Polymerase wurde aus normalen Blutlymphozyten (PHA-atimuliert), k leukämischen Blutlymphozyten sowie 1788-Lymphoidzellen durch Homogenisierung in hypotonischer Pufferlösung mit anschließender Extraktion der extralysosomalen Pellets mit Triton X 1oo und/oder Lösungen mit hohem Salzgehalt ge-

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- 1ο -

wonnen und gereinigt. Nach der Differential-Zentrifu^ierung wurden die Zellextrakte durch Säulenchromatographie an DEAE-Cellulose, Phosphocellulose und Sephadex G 2oo weitergereinigt.

DNA-Polymerase-Tests.

Die Tests auf DNA-Polymerase wurden in einem Endvolumen von 1oo/ul durchgeführt. Das Testgemisch enthielt 5o mti 'üris-HOl-Puffer (pH 8,3), 6,ο mM MgAc, 8,ο mM Dithiothreit und 6o mti NaGl. Die Einstellung des pH-Werts erfolgte nach" Zugabe der Inhibitoren, die zuvor in Dirnethylsulfoxyd gelöst worden waren. Die Endkonzentration an Dirne thylsulfoxyd betrug o,5>a, und alle Vergleichsproben entnielten diese Menge Dimethylsulfoxyd. Eine Enzymkonzentration, die einen Einbau von ca. 1,o pMol/Std. katalysierte, wurde verwendet. Das Enzym wurde in den meisten iällen mit dem Iiübitor 5 Minuten vorinkubiert. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 5/Ug/ml synthetischer DNA (Poly d(AQi), Miles Lab.) oder DNA.RMA-Hybrid (oligo-dT.Poly rA) oder nativen Stoffen, nämlich aktivierter Salmsperm-DNA in einer Menge von 5o /ug/ml und endogener 7oS Virus-kNA, lOyuCi (³H-Me^IyI)-QJIP .(New England Nuclear, 18,6 mCi//uMol, lyophilisiert und direkt vor Verwendung in ο,οIm-SaIzsäure wieder gelöst) und dATP (8 χ 1o~ M, zusammen mit synthetischem Material) oder sämtlichen drei Deoxynucleosid-triphosphaten (8 χ 1o M bei RNA- oder DNA-basierenden Reaktionen) initiiert. Bei einigen Versuchen erfolgte keine Vorinkubation des Enzyms mit dem Inhibitor. In diesen fällen wurden die Reaktionen beim Zusatz des Enzyms zum gesamten Reaktionsgemisch, welches den Inhibitor enthielt, initiiert. Proben wurden zu Beginn der Inkubation und nach 3o Minuten abgezogen, ihre Reaktion wurde durch Zugabe von 2 ml o,o8m-Natriumpyrophosphatlösung beendet, und die Ausfällung erfolgte in 12,5^fMger kalter Trichloressig-

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säure mit Hefe-HNA-(4oo ,ng) als Träger. Die Produkte wurden auf einem Millipox^en-JTilter gesammelt, sox-gfältig mit 5?^iger Trichloressigsäure und 1 ml eines Gemische aus Dimethylsulfoxyd, Äthanol, Ojim-Natriumchlorid (o,5:7o:29,5) gewaschen und getrocknet, dann erfolgte Zählung in 2 ml BBS^ (Beckman) und 1o ml Liquifluor (New England Nuclear) in einem Packard-Scintillationszähler.

wurde gefunden, daß Konzentrationen von 5-1 οyug/ml der Verbindungen der Beispiele 11 und 12 eine 5 ^c/°ige 'Inhibierung der leukämischen Polymerase bei einer synthetischen DNA-Yorlage (Template) bewirkten. Bei synthetischer HNA (Poly rA.rü) war die Reaktion noch stärker.

Versuche mit Polymerase aus normalen und Tumorzellen bei nativer Vorlage (Template) zeigten eine höhere Empfindlichkeit der Tumorenzyme auf die getesteten Verbindungen.

Beispielsweise ergibt eine Konzentration von etwa 5/Ug/ml der Verbindung 12 eine 5O/^yoige Inhibierung der Tumorpolymerase, während sie auf normale Polymerase praktisch unwirksam bleibt, weitere biologische Eigenschaften der neuen Rifamycinderivate sind die Inhibierung der Focus-Bildung durch Nagetier-Sarkom-Viren der Holoney- und Kirsten-Stämme in Mäuse-, Hatten- und menschlichen Zellen; die selektive Inhibierung der Virusproduktion durch bereits tranformierte Mäuse- oder menschliche Zellen; und elii. Auf findung revertierender Zellen unter Verwendung von durch das Sarkom-Virus-tranformierten, keine Viren produlerenden Mäuse- und Hattenzellen. Die selektive Voxizität der erfindungsgemäßen Verbindungen für durch Viren transformierte Zellen von Mäusen oder Hatten oder Zellen menschlicnen Ursprungs wurde ferner beim Test auf.die Fähigkeit zur Koloniebildung bestätigt.

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Bei Versuchen zur Ermittlung der inhibierenden Wirkung auf die Focus-Bildung durch Moloney-Sarkom-Viren-BALB/JiDJ-Gewebekulturen wurde folgende Methode angewandt:

BALB/3T3-Zellkulturen wurden in 25 ο ml-Kunststoffkolben in einem Wachstumsmedium aue Eagle's Mindestnährstoff-Medium i mit 1ofa Fötus-Rinderserum gezüchtet. Die Zählung der Zellen erfolgte mit einem Coulter-Zähler, nachdem die Zellen mit Trypsin-A'thylendiamintetraessigsäure suspendiert und im Wachstumsmedium verdünnt worden waren. Moloney-Sarkom-Virus wurde als Tumorhomogenat verwendet. Es wurde 4 Passagen einer Mäuseembryo-Zellreihe unterworfen, dann auf Focus-bildende Einheiten in BALB/3T3-Zellen untersucht. Bei den Versuchen wurde nach einer Abwandlung der Methode von Hartley and Howe, Proc.Nat.Acad.Sci. 5£, 78o (1966) gearbeitet. Die Kolben wurden mit 1-2 χ 1o -Zellen in 25 ml Wachstumsmedium geimpft und bei 37°C 24 Stunden inkubiert. Nach Entfernung des flüssigen Anteils werden Viren mit einer vorher ermittelten Anzahl Focus-bildender Einheiten in o,5 ml des Wachstumsmediums eingeführt und an der Schicht aus einer Zellage 9o Minuten bei 37°C adsorbiert. Nach dieser Adsorptionszeit wird eine vorbestimmte Menge, gewöhnlich eine Dosis von etwa 5-1O/Ug/ml einer Rifamycin-Verbindung (in Dirnethylsulfoxyd in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst) in 25 ml Wachstumsmedium zugegeben und die Kulturen werden in die Inkubationsvorrichtung zurückgesetzt. Zum Vergleich wird Dimethylsulfoxyd allein im Wachstumsmedium einer weiteren Kultur zugegeben. Nach 3-täglger Inokulierung erfolgt Flüssigkeitsaustausch und die Kerne transformierter Zellen .werden am Tag 7 gezählt.

Auf die gleiche Weise werden Stomatitis-Viren (New Jersey Serotyp) untersucht; Methoden zur Züchtung und Testung dieser Viren wurden von Hackett et al., Virology, j51_, 114 (1967) beschrieben.

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Die Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen eine inhibierende Wirkung auf durch Viren induzierte Tumoren bei Tieren besitzen. ' ·

i)in Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen besteht darin, daß man 3-iOrniyl-rifamycin SV, dessen 25-Desacetylderivat oder 16,17,18,19,28,29-üexahydroderivat in einem organischen Lösungsmittel mit der stöcniometrisehen Menge eines Hydrazins der I'ormel NHp-NR.Rp, in welcher R. und Rp die obige Bedeutung besitzen, behandelt. Nachdem man das xieaktionsgemisch einige Zeit, beispielsweise 1o Minuten bis einige Stunden, bei Räumt emperatiir stehen gelassen hat, wird das Rohprodukt durch Einengen oder Abdampfen des Lösungsmittels gewonnen. Die Reinigung bereitet keine besonderen Schwierigkeiten, sie erfolgt im allgemeinen■durch Kristallisieren aus einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise einem niedrigen Alkanol, niedrigen Acylestern niedriger. Alkanole oder Benzol.

Wie aus der ^Ormel der erfindungsgemäßen Verbindungen ersichtlich, kann unter Verwendung des entsprechenden Hydrazins eine große Anzahl erfindungsgemäßer Derivate hergestellt werden. In einigen Fällen, in welchen das Hydrazin eine stark saure Gruppe, z.B. eine Sulfogruppe, aufweist, wird das Rifamycin-derivat während der Hydrazonbildung in 27-Stellung hydrolysiert, wobei man die entsprechende 27-Demethoxy-27-hydroxyverbindung erhält.

Allgemein erfolgt die Herstellung der Hydrazone, indem man zu einer Lösung von o,o1 Mol 5-i¹ormylrifamycin SV, dessen 25-Desacetylderivat oder dessen 16,17,18,19,28,29-riexahydroderivat in Tetrahydrofuran o,o1 Mol des Mydrazons unter Rühren bei itaumtemperatur zusetzt. Nach 1o-minütigem bis 3-stündigem

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Rühren wird ein Tropfen der Lösung durch Dünnschi chtenchroma-tographie an Silikagel getestet, wobei das Verschwinden des Ausgangsmaterials und die Bildung des Lnciproduirts festgestellt werden können.

Sobald keine Carbonylverbindung mehr vorhanden ist, wird die Lösung zur Trockene eingeengt, wobei man das Rohprodukt erhält, das durch Kristallisieren aus einem Lösungsmittel oder durch fciäulenchromatographie gereinigt v.ird.

In Tabelle I sind die c emischen und physikalischen Daten einiger erfindungsgemäßer Verbindungen aufgeführt. Die Tabelle enthält lediglich Verbindungen, in denen R, ein Acetylrest ist, sowie keine hydrierten Derivate.

Das Ausgangsmaterial zur Herstellung der Hexahydroderivate der Rifamycine der Formel I, d.h. 16,17,18,19,28,29-Hexahyaro-3-formylrifamycin SV wird wie folgt hergestellt: 2o g rifamycin S, in 600 ml trockenen Äthanols suspendiert, werden in einer Parr-Hydriervorrichtung mit 2 g Platinoxyd als Katalysator 5 Stunden bei Raumtemperatur und einem "Wasserstoff druck von etwa 5 Atmospaären hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird die Lösung zur Trockene eingeengt, das Rohprodukt wird in Tetrahydrofuran gelöst und bei xiaumtemperatur mit 18 g Kangandioxyd gerührt. Der anorganische Niederschlag wird abfiltriert, das Filtrat wird auf ein kleines Volumen eingeengt, in 5oo ml Xtnylacetat aufgenommen und mit Äther gewaschen. Die organische Schicht wird über Natriumsulfat getrocknet und ergibt beim Eindampfen 8 g riexahydro-Rifamycin ü vom Schmelzpunkt 150-I60 0 (aus Methanol). Das Produkt wird sodann nach der Vorschrift von Beispiel 5 der britischen Patentschrift 1 219 36o in das 3-I'¹ormylderivat überfünrt. Das dabei erhaltene Roh-

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- Vf ,

produkt kann durch Säulenchromatographie der Ghloroformlösung an Silikagel unter Sluieren mit Chloroform/Y/o Methanol gereinigt werden. Dabei erhält man das 16,17,18,19,28,29-Hexahydro-3-formylrifamycin SV vom Schmelzpunkt 126-133°C.

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Tabelle 1

ι)

2) H

3)

4) H

5) H

6) H

CH₂COOH

OH.OH.H

^C2^E5

Kristallisations- oder Chromatographie-Lösungs mittel

Säule CHCl,/lieOH

Säule

CHCl₅/Me0H

Äthjlaoetat/ Ligroin

Benzol

Äthylacetat

Benzol

1 157-9

j 157-9

I
j >280

j>280
j

|ci200 (Zers.)

(Zers.)

Charakterist. U.T.-u. sichtbare Banden

Λ max E t⁰

1 cm.

475 331

475

330

478 340

480

335

491 356

485 352

170,6 281,9

178,5 290,0

200,9 328,9

150 320

180,5 291

165,9 258,3

Tabelle 1 (Fortsetzung)}

O CO CD

7) H

8) H

9) H

10) H

in).

// X

R,

N.

OH

N-CH,

Kristallisationsoder Chromatographie-Lösungs
mittel

Methanol

Benzol

Äthylacetat

Methanol

Methanol

Ausb.

48

3?.°C

Charakterist. TJ.Y.-u. sichtbare Banden

max

I 200 (Zers.)

485 543

188-90

485 348

j 473 (Zers.) j 332

208-10

168-72

480 345

486 360

l<fo

1 cm.

191,6 341,3

164,3 326,8

166 275

191,4 344,0

185,8 238,9

Tabelle 1 (Fortsetzung):

12) H

! 13)

: U) H

I 16) H

Kristallisations- oder Chromatographie-Lösungsmittel

Säule CHCl,/MeOH

Säule

CHC1,/MeOH

Säule

CHC1,/MeOH

Säule CHCl,/MeOH

Säule CHClj/MeOH

Ausb.

46

40

F-⁰C

205-15
(Zers.)

157-9

152-6

! 150-I

140

Charakterist. U.V.-u. sichtbare Banden

/\ max

500 390

475 330

476 335

490 363

483 343

1 cm.

200,5

279,3

173,0 274,0

175,0 282,3

173,2 231,2

135,4 240,9·

Tabelle 1 (Fortsetzung):

17) H

.18) H

19) H

CH,

OCH.

20) H

ί Ii

Kristallisationsoaer Chromatographie-Lösungsmittel

Äthylacetat

Methanol

Äthylacetat

ιAthylacetat

75

75

F.°C

Charakterist« TJ.Y.-u. sichtbare Banden

! A max

206

(Zers.)

195
(Zers.)

212
(Zers.)

510
383

504
364

512
582

325

1 cm.

166 297

194 246

17.Q 283 178

	512	167
208- i	383	304
(Zers.) ;

Tabelle 1 (Portsetzung)s

N) O CO CO

1

21) H

22) H

23) H

■: 24) H

CH-

KristallisationsocLer Chromatogra-

I phie-Lösungs-

I mittel

Ausb.

F. ⁰O

Methanol

Benzol

Benzol

ithylaoetat

215
(Zers.)

185
(Zers.)

185
(Zers,)

' 50 i 200

;(Zers.)

Charakterist. U.¥,-u.. sichtbare Banden

487
348

500

384

508
389

502

384

1 cm.

191,6 382,8

149,1 249,5

134,2 190

161,2 259,2

Tabelle 1 (Fortsetzung)ι

ΙΟ O CO OO

Rl	R2	Kristallisations oder Chromatogra- phie-Lösungs mittel	Ausb.	F.°C	Charakterist. U.V.- u. sichtbare Banden /\ max E l'fo 1 cm.
25) H ! S i N) H I 27) H I 128) i j	CH5 CH3 CH5 NO2 \^N02 -CH2-CH-CH2	Methanol Tetrachlor kohlenstoff Methanol Methanol	j 50 90 90 40	193-4 178-80 220-4 I7O-5	502 157,8 ! 368 248,7 i 485 237,5; 358 243,8 525 210 ; 425 235 : 340 228 i 475 160,5! 332 272,1 j

Tabelle 1 (Fortsetzung):

O (O OO

29)

30) CH₉-CH₉OH

2 ^U"2^V

51) H

52) H

-CH₂-CH₂-O

-O

NO,

NO,

16,17,18,19,28,29-Hexahydro-

-ο-

27-Demethoxy-27-hydroxy-

Kristallisations- oder Chromatographie-Lösungsmittel

Ausb.

Ithylacetat 75

Tetrachlorkohlenstoff

Säule -

Chloroform:Methanol| 55 96 ι 4 j

j Ithylacetat/Leicht-j

benzin

ithylacetat

50

145-8

Charakterist. U.V.-u. sichtbare Banden

120-4
(Zers.)

I
(Zers.) j

max

470 531

485

555

502 401

475 358

If₀ 1 cm.

135 255

196 250,8

145,5 215,9

179,4 268,1

rc

CO

Tabelle 1 (Fortsetzung):

S 33) ' 34) I 35) i 36)

: 37)

Kristallisations- oder Chromatographie-Lösungsmittel

Aceton

Tetrachlor-

2j kohlenstoff

A'thylacetat

'Tetrachlorjkohlenstoff

JMethanol

Ausb.

60

95

Θ5

70

80

F.°C

280

160-3

244-6

200-3

Charakterist. U.V.- u. sichtbare Banden

max

475 330

474 333

348

490 357

ί 485 190-3 ! 358

cm.

155

322

154,5 244,4

187,7 225,5

204 284

222 233

fs»

tv

Tabelle 1 (Fortsetzung):

ro ο co

V , f	R2 ι 1 i	Kristallisations oder Chromatogra phie-Lösungs mittel	Ausb. t>	F. °C	.Charakterist. U.T.- u. sicht bare Banden λ max E 1* 1 cm.
ι 38) H 39) H 40) H 41) CH5 42)_ H	5 Cl 0-0, • Cl 1 -(CH 2)ll-CH3 -(CHg)4-CH3	Tetrachlor- kohlenstoff/Li- groin Methanol Ligroin Methanol Methanol	85 90 70 60 85	160-4 174-6 118-20 150-3 214-16	484 203 357 226 485 156,8 342 250,8 478 127,8 340 251,3 480 130 i 343 235 ί 501 326,9 440 326,9 34-8 186,5

Die in der obigen Tabelle aufgeführten Verbindungen sollen nur der Illustration dienen. Auch andere Hydrazone der obigen allgemeinen Formel werden von vorliegender Erfindung umfaßt und sind für die angegebenen Zwecke brauchbar.

Weitere Hydrazone werden beispielsweise erhalten aus 3-I'ormyl-rifamycin SV, dessen 25-Desacetylderivat oder den entsprechenden Hexahydroverbindungen und folgenden Hydrazinen der formel

2 0 9 8 Fi 3 /1 1 6 1

Beisp.	■n	1	R	2
Nr.	O+Hg	C5H11
1	H	6-Bis-(hydroxyätliyl)-ainino-3-
2		pyridazinyl-
	CH3	1H-2,3-Benzoxazin.-4-yl-
3	H	lH-2,3-Benzoxazin-4yl-
4	°2H5	6-Clilor-lH-2,3-benzoxazin-4-yl-
5	H	6-Chlor-lH-2,3-t>enzoxazin-4-yl-
6	CH3	6-Amino-lH-2,3-"benzoxanzin-4-yl-
7	H	o-Pluorphthalazin-i-yl-
8	CH3	-(CH2J5-OH
9	CH3
1o	H	-CH2-C6H4-C6H4
11	C4H9	Cyclohexyl-
12	H	2-Phenyl-6-methoxy-4-chinolyl-
13	C2H5	-(CH2J11-CH3
14	H	"6 4" 2 3
15	H	-CgH.-SOpi1^
16	H	-C6H3(N02-2)(S02P-4)
17	H	9-Acridinyl-
18	C5H9	CgH17
19	(C3H7J2NC2H4	C8H16OH
2o	CH2Cl-CHCl	m-Nitrophenyl-
21	CH2CH2COOH	3-Plienylpropyl-
22	IjXl0VyXl J Vnll\jXIoVy"rf C. C. J	Isoamyl-
23	C=C-CH5	CH, •5
24	C4H9	p-Witrophenyl-
25	CH3	m-iMitropiienyl-
26	H	p-Cnlorphenyl-
27	H	p-ürompnenyl-
28	H	m-Fluorphenyl-
29	H	2,5--Ui±'luo3?pli-enyl-
3 ο

209853/1161

Beisp. p ρ

fat ' 1 2

31	h
32	H
33	H
34	H
35	H
36	H
37	H
38
39	H
4ο	H
41 ·	H
42	H
43	H
44	H
45	H
46	H
47	H
48	H
49'	H
5ο	H
51	H
52	H
53	H
54	H
55	H
56	H
57	H
58	H
59	H
6ο	H

_5?

ο -Methoxyplienylp-Ialyl-

4-Cai"l3oxymetliOxyplienyl-

( 2,6-Dime th.yl-4-i sobutyl) -phenyl-

°12^H25
2-Phenäthyl- ·

CH₂CH(OH)(CH₂)Q-CH₅

4-Biphenylyl-CH₂COOC₂H₅

CH(CH₅)COOC₂H₅

Pentafluorphenylo-Chlorbenzyl- 3,4-Dimethoxy'benzylo-Irifluormethylphenyl-

2-(2,6-Dibrom-4-aminophenoxy)-äthyl-

2-(2,6-Dibrom-4-acetamidophenoxy)-äthyl- 3-Phenylpropyl-4-Phenyl"butyl- 2-Phenylpropyl-4-Phenylbenzyl- 2-Pyridyl-2-Iso"butenyl- CHp-C=CH

Cyclopropyl-CycloTDutyl- 2-Iaphthyl-2-( 1,2,3 ,^V4-Tetrahydronaphthyl)-

209853/1161

Beisp.	J?
Nr.	1S
61	Amyl
62	H
63	H
64	H
65	H
66	CH-.
67	CH5
68	CH-
69	H
7o	H
71	H
72	H
73	H
74	H
75	GH5
76	H
77	H
78	H
79	H
8o	H
81	Benzyl
82	H
83	H
84	H
85	H
86	H
87	H
88	K
89	H
9o	H

Amyl-

₂₈₅

2,4,6-Irinitrophenyl-GH₂CH(OH)C₆H₅ GH₂(GH(SH)CH₃ CH₂C(CH₅)₂SGH₂ 5-Cyan-6-chlor-2-pyridyl-CH₂CH CH₂SO₅H 2-Thiazolyl-3,4-Methylendioxy"benzyl-Cyclohexylmethyl-CH₂CH₂CH₂CH(CH₅)C₆H₅ CH₂CH₂NHCH₂CH₂C₆H₅ 4-Pyridyl-N-oxid 4-Amino-6-chlor-3-py^idazinyl-5-Mtro-2-pyrimidyl-1,3,4-TMadiazol-2-yl-1,2,5-i¹hiadiazol-3-yl-Benzyl-3-Methyl-5-nitro-2-pyridyl-

2-Methylsulfonyl-3,5-dichlor-4-pyridyl-

2-Benzimidazolyl-8-Purinyl- 3-(4-Pyridyl)-propyl-6-Purinyl- 1-Adamantany1-Hexachlorchinolin-4-yl- CH₀CH=CHC^H₁-

209853/1161

Beisp.

91 H 3-Pyridylmethyl-

92 H 1-Methyl~8-purinyl-

93 H 3-Methyl-8-purinyl-

94 H 7-Methyl-8-purinyl-

95 CH₃ -(CHg)-OCOCH₅

209853M 161

Claims (2)

1. Patentansprüche

   . 1/i Rifamycin SV der Formel

   HO Me Me Me
   ή R X
   OH
   OH OH
   ■ MeQ UU
   —J ^0H 0 ι >
   ο' Me

   0,

   in welcher R₁ und Rp unabhängig voneinander

   (a) ein Vasserstoffatom,

   (b) einen Alkyl-,

   (c) Alkenyl-,

   (d) Alkinyl-,

   (e) Aryl-,

   (f) Aralkyl-,

   (g) einen heterocyclischen oder

   (ii) einen Cycloalkylrest darstellen,

   unter der Maßgabe, daß nur einer der Reste R₁ oder R₂ Wasserstoff oder ein niedriger Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sein kann, v/obei bei Vornandensein eines Wasserstoffatoms oder niedrigen Alkylrests der andere üubstituent R₁ oder Kp ein unsubstittiierter Alkyl- oder hydroxyalkylrest mit mindestens 5 Kohlenstoffatomen oder ein substituierter Alkylrest mit Ausnahme des uimethylaminoätnyli'üsts, oder ein

   209853 M161

   Glied der Gruppe (c) bis (h) ist, mit Ausnahme von Phenyl, p-Carboxyphenyl und Benzyl, in der ferner R₀₅ Wasserstoff oder den Acetylrest bedeutet, sowie dessen 16,17,18,19,28,29-• Hexahydro- und 27-Bemethoxy-27-hydroxyderrvate_β
2. 2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein 3-i¹ormylrifamycin der Formel

   MeO

   OH

   in welcher R-, die obige Bedeutung besitzt, oder dessen Hexahydroderivat mit einem Hydrazin der formel HpK-WR.Rp, worin η, und R₂ die obige Bedeutung besitzen, in Berührung bringt,

   5¹Ur: Gruppo Lepetit ü.p.A. Mailand/Italien

   Dr. H. J. Wolff

   (Rechtsanwalt)

   209853/1161