DE2212285A1 - Process for the determination of the carcinogenic activity of substances as well as examination equipment for the implementation of the determination method - Google Patents

Description

Brian Robert .RABIET, London, England und David John WILLIAMS, London„Brian Robert .RABIET, London, England and David John WILLIAMS, London "

" Verfahren sur Bestimmung der careinogenen Aktivität Von Substanzen sowie Untersuchungs-Ausstattung sur Durchführung der Bestimmungsmethode ^SB "Procedure for the determination of the careinogenic activity of substances and test equipment for the implementation of the determination method ^SB

Priorität: 16» März I97I,GrosBbritannien,"Hr. 6963/71Priority: 16 »March I97I, Great Britain," Hr. 6963/71

Die Erfindung betrifft eine neue Methode sur Bestimmung der careinogenen Aktivität von Substanzen, wobei unter den Begriff "carcinogene Aktivität" auch hepatotoxische Eigenschaften fallen« Die erfindungsgemässe neue Bestimmungsmethode ermöglichtes, insbesondere festzustellen, ob bestimmte Substanzen eine carcinogene Aktivität aufweisen. Die Erfindung betrifft weiterhin eine Untersuchungs-Ausstattung zur Durchführung der neuen Bestimmungsmethode.The invention relates to a new method for determining the careinogenic activity of substances, with the term "Carcinogenic activity" also drop in hepatotoxic properties «The novel determination method according to the invention enables in particular to determine whether certain substances have carcinogenic activity. The invention also relates to an examination equipment for carrying out the new Determination method.

Es ist von grösster Bedeutung, festzustellen, ob von Mensch .und Tier aufgenommene Drogen oder andere Substanzen carcinogene Aktivität bzw. hepatotoxische Eigenschaften aufweisen. It is of the utmost importance to determine whether drugs or other substances ingested by humans and animals have carcinogenic activity or hepatotoxic properties .

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Die derzeit zugänglichen Testverfahren zur Bestimmung der carcinogenen Eigenschaften sind ausserordentlich zeitraubende Beispielsweise müssen die zu untersuchenden Substanzen eine Dsörächtliohe Zeit lang im lebenden Organismus zur Einwirkung ton-menj und die entsprechenden Auswirkungen müssen über einen längeren Eeiträum beobachtet- werden, um auf diese Weise feststellen 27. können5 ofc elr. Gewebe krebsartig wird oder nicht« YiriäoJatiii Siibstansen "^srden äe'ü verschiedensten Laborunter- :-.-":.ι^λ\ιζ^,. i:.its::^:;;orfs;i_ 1ε, 'Άζ'-'-ϊ;:? ":iii,- schnell, durchführbarer ■. :. -."i:^:li3£J.i;'.:.3j; ±'i "'1"JL=C■--■^\'^:r:::;,Jv.".:.zstest .bekannt ist, der ι? - :..':r.*:*gl Lo.:.~^::- · 3"-':l"^:0::.::.. r/il.J/^i"·' .;. .-:·:".:"._ ?s en S^ostan^ön mtic! anclo- :?ΐ-ν. 5ui?ϊ"ti"Γ= 5" si", ^rν5:^;:5"1.3LiI3:ι= ..^1;:ιβ dami v/sitcr im lebendenThe test methods currently available for determining the carcinogenic properties are extremely time-consuming.For example, the substances to be examined must be observed for a certain period of time in the living organism for action and the corresponding effects must be observed over a longer period in order to determine in this way 27. can5 ofc elr. Tissue becomes cancerous or not "YiriäoJatiii Siibstansen" ^ srden äe'ü various laboratory sub-: -.- ":. ι ^ λ \ ιζ ^ ,. i: .its :: ^;; orf; i_ 1ε, 'Άζ'-'-ϊ;? ^3y;:;:'li3 £ Ji ": -: - iii, fast, feasible ■..." i.. ± 'i " '1" JL = C ■ - ■ ^ \ '^: r ::: ;, Jv. ".:. Zs test .is known who ι? -: ..': r. *: * gl ^Lo.:.~: - x 3 "-;^':l" 0 :: :: .. r / il.J / ^ i' ·. '.. .-: ·: ".:" ._? S en S ^ ostan ^ ön mtic! anclo- :? ΐ-ν. ? 5ui ϊ "ti" Γ = 5 "si" ^ ^rν5:; : 5 "1.3LiI3: ι = .. ^ 1;: ιβ dami v / sitcr in the living

Im Gewebe kommt im allgemeinen ein Enzym vor, welches die Umlagerung von Bisulfidbindungen in Proteinen katalysiert und nachstehend ale Rearrangase bezeichnet wird. Dieses Enzym ist fest mit der Zellmembran verbunden und in Rattengeweben wird das betreffende Enzym beispielsweise sowohl in den rauhen als auch in den glatten Bestandteilen des endoplasmischeji Reticulums gefunden. In dem rauhen Reticulum ist jedoch die Aktivität des Enzyms im allgemeinen durch an die Zellmembran gebundene Ribosomen maskiert, so dass die enzymatische Aktivität latent bleibt, bis diese Ribosomen von der Zellmembran abgelöst werden.In general, an enzyme is found in tissue, which is responsible for the rearrangement catalyzed by bisulfide bonds in proteins and hereinafter referred to as ale rearrangase. This enzyme is firmly attached to the cell membrane and in rat tissues the enzyme in question is, for example, both in the rough and in the also in the smooth components of the endoplasmic reticulum found. In the rough reticulum, however, the activity of the enzyme is generally through bound to the cell membrane Ribosomes masked so that enzymatic activity remains latent until these ribosomes are detached from the cell membrane.

Die Membranen des Reticulums können, in zwei Fraktionen aufgetrennt werden, wobei die glatten Membranen keine daran gebun-The membranes of the reticulum can be separated into two fractions the smooth membranes are not bound to

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denen Ribosomen enthalten, während an die rauhen Membranen derartige Ribosome gebunden sind οwhich contain ribosomes, while rough membranes contain such Ribosomes are bound ο

Me glatten Membranen zeigen die volle Rearrangase-Aktivität, welche jedoch dadurch maskiert werden "kann, dass Ribosome an diese glatten Membranen angelagert werden» Im reinen Zustand enthalten dagegen die rauhen Membranen das Rearrangese-Enzym im vollständig maskierten Zustand, doch kann die Enzymaktivität durch Entfernung der Ribosome reaktiviert werdenβMe smooth membranes show the full rearrangase activity, which, however, can be masked "by the fact that ribosomes are attached to these smooth membranes" in the pure state on the other hand, the rough membranes contain the rearrangese enzyme in the fully masked state, but the enzyme activity can be reactivated by removing the ribosomesβ

Es wurde nun gefunden, dass eine Reihe von co.rjinogenen Sub- . stanzen eine Degranulierung der rauhen Mikrosomal-Membran hervorrufen und dadurch eine Ablösung der Ribosome bewirken, wodurch das aktive Enzym freigesetzt wird» Der Anstieg der Enzymaktivität kann bei Anwendung geeigneter Untersuchungsmethoden verfolgt werden.It has now been found that a number of co.rjinogenic sub-. punch causing degranulation of the rough microsomal membrane and thereby cause the ribosomes to detach, releasing the active enzyme »The increase in enzyme activity can be tracked with the use of suitable investigation methods.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Bestimmung der carcinogenen Aktivität von Substanzen ist demgemäss dadurch gekennzeichnet, dass man die zu untersuchende Substanz mit isolierten Zellmembranen kontaktiert, welche eine maskierte Rearrangase-Aktivität aufweisen, und dass man nach einem vorher bestimmten Zeitraum die Rearrangase-Aktivität missteThe inventive method for determining the carcinogenic The activity of substances is accordingly characterized in that the substance to be investigated is treated with isolated cell membranes contacted who have a masked rearrangase activity, and that one after a previously determined Period measured the rearrangase activity

Das für die Durchführung des erfindungsgemässen Bestimmungsverfahrens anzuwendende Membranpräparat wird vorzugsweise aus dem endoplasmischen Reticulum von Rattenlebern gewonnen, obwohl an sich auch aus anderen Körperteilen erhaltene Reticularmembranen für diesen Zweck eingesetzt werden können. Vorzugs-That for carrying out the determination method according to the invention membrane preparation to be used is preferably obtained from the endoplasmic reticulum of rat livers, though reticular membranes obtained per se from other parts of the body can be used for this purpose. Preferential

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weise werden dabei solche Reticularmembrane verwendet, bei denen die enzymatische Aktivität der Rearrangase vollständig durch die Ribosomen maskiert ist und erst in dem Masse wieder zur.Wirkung kommt, wie die Ribosome von der Membran abgelöst werden. Gemäss einer speziellen Ausführungsform der erfindungsgemässen Bestimmungsmethode können jedoch auch Reticularmembrane einge-wisely such reticular membranes are used in which the enzymatic activity of the rearrangase is completely masked by the ribosomes and only to the extent that it becomes effective again comes how the ribosomes are detached from the membrane. According to a special embodiment of the invention Determination methods can, however, also include reticular membranes.

setzt werden, welche von Haus aus keine angelagerten Ribosome enthalten» Diese Ausführungsform wird nachstehend noch im einzelnen beschrieben werden«which inherently do not contain any attached ribosomes. This embodiment will be described in detail below to be discribed"

Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Bestimmungsverfahrens beginnt man daher vorzugsweise mit einer Reticularmembran, welche von sich aus intakte Ribosomen enthält.When carrying out the determination method according to the invention it is therefore preferable to start with a reticular membrane which inherently contains intact ribosomes.

Die zu untersuchende Substanz wird sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit von reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (nachstehend abgekürzt als "NADPH") bebrütet.The substance to be examined is reduced both in the presence and in the absence of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (hereinafter abbreviated as "NADPH") is incubated.

Aufgabe der Substanz NADPH ist es, die in der Microsomal-Membran vorhandene Hydroxylase zur Wirkung zu bringen. Es wird nämlich angenommen, dass dieses Enzym Hydroxylase eine Wirkung auf Substanzen hat, welche eine latente carcinogene Aktivität zeigen und erst nach Umwandlung durch dieses Enzym die carcinogenen Eigenschaften voll zur Auswirkung kommen lassen. Das erfindungsgemässe Bestimmungsverfahren iBt daher nicht nur auf Substanzen anwendbar, die eine direkte carcinogene Aktivität zeigen, sondern es können damit auch Substanzen festgestellt werden, welche als carcinogene Vorläufer bezeichnet werden können und bei denen die carcinogene Aktivität durch dieThe task of the substance NADPH is to act in the microsomal membrane to bring existing hydroxylase to effect. Namely, it is believed that this enzyme hydroxylase has an effect on substances which show a latent carcinogenic activity and only after conversion by this enzyme the carcinogenic Let the properties take full effect. The determination method according to the invention is therefore not only effective Substances can be used which show a direct carcinogenic activity, but substances can also be determined with it which can be referred to as carcinogenic precursors and in which the carcinogenic activity by the

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Hydroxylase zum Tragen gebracht wirdoHydroxylase is brought to bear o

Das angewendete Zellmembran-Präparat kann auch Bestandteile von glatten Membranen enthalten, um auf diese Weise microsomale Hydroxylase zur Verfugung zu stellenο _: The applied cell membrane preparation can also contain ingredients of smooth membranes to microsomal hydroxylase in this way at your disposal to _stellenο:

Das Bebrütungsmedium für die Reticularmembrän wird' mehrere Stunden lang auf konstanter Temperatur und konstantem pH-Wert gehaltene Nach Beendigung dieser Bebrütungsbehandlung hat die Anwesenheit von carcinogenen Substanzen zur Ablösung von Ribosomen von der Ret ic ¹J-I^ !membran geführt und dementsprechend i.sf das Enzym Rearrangase freigesetzt worden und zeigt seine bisher maskierte Aktivität. Das Ausmass der !Enzymaktivität lässt sich auf Grund ihrer Fähigkeit zur Umlagerung von Disulfid-Bindungen in einem Protein mit statistischer Anordnung für Disulfid-Bindungen bestimmen» Als Substrat für die Messung der Rearrangase-Aktivität kann beispielsweise ungezielt oxydierte Ribonuclease' verwendet werden, in welcher die Cystein-Schwefelatome statistisch gepaart sind« Zu diesem Zweck "wird das Substrat zusammen mit einem Mercaptan; beispielsweise·Mercatoäthanol, zu der Untersuchungsmischung zugesetzt, welche anschliessend ■ wiederum bebrütet wirdc Die in der ersten Verfahrensstufe freigesetzte Rearrangase überführt die inaktive ungezielt oxydierte Ribonuclease in die aktive Enzymformο Diese aktive Ribonuclease lässt sich dann anhand von Standardmethoden bestimmen, welche in der Literatur beschrieben sind, beispielsweise durch Messung der Veränderungen in der optischen Dichte (J. Biolo Chenu 2Q7 (1954) S«2O1) oder durch Messung der Veränderung des pH-Werts mittels eines entsprechenden Messgerätes (Biochim. Biophys.The Bebrütungsmedium for Reticularmembrän is' several hours has long kept at constant temperature and pH After completion of this Bebrütungsbehandlung the presence of carcinogenic substances for release from ribosomes of the Ret ic ¹ JI ^! Membrane-out and accordingly the enzyme i.sf Rearrangase has been released and shows its previously masked activity. The extent of the! Enzyme activity can be determined on the basis of its ability to rearrange disulfide bonds in a protein with a statistical arrangement for disulfide bonds. A substrate for measuring the rearrangase activity, for example, can be used in a non-targeted manner, oxidized ribonuclease, in which the Cysteine sulfur atoms are statistically paired "For this purpose" the substrate is added to the test mixture together with a mercaptan; for example mercatoethanol, which is then incubated again Enzyme form This active ribonuclease can then be determined using standard methods which are described in the literature, for example by measuring the changes in the optical density (J. Biolo Chenu 2Q7 (1954) S «2O1) or by measuring the change in the pH value by means of a correspond the measuring device (Biochim. Biophys.

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Acta 26ί (1£37) 3, 3Q2)_O ' ^Acta 26ί (1 £ 37) 3, 3Q2) _O '^

Die Menge an aktiver Ribonuclease lässt sich aber auch aufgrund ihrer Fähigkeit zur hydrolytischen Umwandlung von Cytidin-2»3¹-phosphat in Cytidin-3'-phosphat bestimmen. Diese Umwandlung lässt sich durch Messung der Veränderung in der optischen Dichte messend verfolgen (Biochemo Je 7j_ (1960) S«.234)o Die betreffende hydrolytische Umlagerung kann auch anhand von Veränderungen im pH-Wert bestimmt werden.But the amount of active ribonuclease can also be due to their ability to hydrolytic conversion of cytidine 2 '3 ¹ phosphate in cytidine 3'-phosphate determined. This transformation can be followed by measuring the change in the optical density (Biochemo Je 7j_ (1960) S «.234) o The hydrolytic rearrangement in question can also be determined on the basis of changes in the pH value.

Theoretisch kann die Aktivität des Enzyms Rcr.mngase durch die Reaktivierung jedes beliebigen Proteins mit falsch angeordneten Cysteinbausteinen bestimmt werden, weil diese Reaktivierung durch die Rearrangase katalysiert wird, doch ist Ribonuclease für diesen Zweck besonders bevorzugt, weil die Geschwindigkeit einer spontanen Reaktivierung sehr gering ist und eine Anzahl von Standardmethoden zur Bestimmung der Ribonuclease-Aktivität zur Verfügung steht₀ Anstelle von Ribonuclease kann bei diesem Aktivitätstest auch ein Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor eingesetzt werden.Theoretically, the activity of the enzyme Rcr.mngase can be determined by reactivating any protein with misaligned cysteine units, because this reactivation is catalyzed by the rearrangase, but ribonuclease is particularly preferred for this purpose because the rate of spontaneous reactivation is very slow and A number of standard methods are available for determining ribonuclease activity ₀ Instead of ribonuclease, a soybean trypsin inhibitor can also be used in this activity test.

Das Ausmass der insgesamt durch die carcinogene Substanz freigesetzten Rearrangase-Aktivität lässt sich berechnen und kann als Bewertungsmaßstab für die carcinogene Aktivität der untersuchten Substanz verwendet werden.The total amount released by the carcinogenic substance Rearrangase activity can and can be calculated can be used as a yardstick for assessing the carcinogenic activity of the substance under investigation.

Die erfindungsgemässe Bestimmungsmethode ermöglicht daher eine einfache und direkte Überprüfung von Substanzen bezüglich ihrer carcinogenen Aktivität. Die verschiedenen Verfahrens-The determination method according to the invention therefore enables a simple and direct check of substances with regard to their carcinogenic activity. The various procedural

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stufen können standardisiert v/erden, und die mittels Substanzen mit bekannter careinogener Aktivität erhaltenen Ergebnisse können als Eichmaßstab verwendet werden, so dass eine Bezugsgrösse vorhanden ist, mittels welcher das Vorhandensein und die relative "Höhe der carcinogenen Aktivität irgendeines Untersuchungsmaterials 'abgeschätzt werden können. Die erfindungsgemässe Bestimmungsmethode hat daher besonderen Wert für Herstellungsverfahren der verschiedensten Art, weil sie es dem Hersteller ermöglicht, festzustellen, ob das von ihm zu verarbeitende Material etwa potentielle carcinomas Eigenschaften aufweist, und der Hersteller kann dadurch den gesamten Herstellungsprozess aufgrund solcher Untersuchungsergebnisse überwachen und regeln»levels can be standardized and the results obtained using substances with known careinogenic activity can be used as a standard so that a reference value is available by means of which the presence and the "relative" level of carcinogenic activity of any test material 'can be estimated. The determination method according to the invention is therefore of particular value for manufacturing processes of various kinds, because they enable the manufacturer to determine whether this is to be processed by him Material about potential carcinomas properties has, and the manufacturer can thereby the entire manufacturing process on the basis of such test results monitor and regulate »

Gemäss einer speziellen Ausführungsform der erfindungsgemässen Bestimmungsmethode wird ein Membranpräparat verwendet, welches aus einer glatten Oberflächen-Reticularmembran ohne daran gebundene Ribosomen besteht, wobei aber solche Ribosomen in Gegenwart eines Steroidhormons an das Reticulum gebunden werden₀ Für diesen Zweck eignet sich beispielsweise Oestradiol, falls männliche Ribosomen an von männlichen Lebewesen stammende, glatte Oberflächenmembrane gebunden .werden sollen, während Testosteron für von weiblichen Lebewesen stammende Gewebe Anwendung findete Oestradiol kann auch durch einen Extrakt von weiblichen Ribosomen ersetzt werden und anstelle von Testosteron kann ein Extrakt von männlichen Ribosomen Anwendung finden< >· In beiden Fällen kann das betreffende Hormon auch durch einen Extrakt des rauhen Reticulums ersetzt werden.According to a special embodiment of the determination method according to the invention, a membrane preparation is used which consists of a smooth surface reticular membrane without ribosomes bound to it, but such ribosomes being bound to the reticulum in the presence of a steroid hormone ₀ For this purpose, for example, estradiol is suitable if male ribosomes should be bound to smooth surface membranes derived from male living beings, while testosterone is used for tissues derived from female living beings, oestradiol can also be replaced by an extract from female ribosomes and an extract from male ribosomes can be used instead of testosterone <> · In In both cases the hormone in question can also be replaced by an extract of the rough reticulum.

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Das glatte endoplasmische Reticulum zeigt eine hohe Rearranga.se-Aktivität, aber wenn Ribosomen in Anwesenheit eines Steroid-Hormons an das Reticulum angelagert werden, verschwindet diese enzymatische Aktivität vollständig. Wenn jedoch ein solches glattes Reticulum vor der Behandlung zwecks Anlagerung von Ribosomen mit einer carcinogenen Substanz behandelt wird, dann lassen sich die Ribosomen nicht an die Membran anlagern und daher tritt keine Veränderung in der ursprünglichen Rearrangase-Aktivität ein. Die vorstehend beschriebene Methode zur Bestimmung der Rearrangase-Aktivität kann daher auch in diesem Fall zur Bestimmung der carcinogenen Aktivität der untersuchten Substanz Anwendung finden.The smooth endoplasmic reticulum shows high Rearranga.se activity, but when ribosomes are attached to the reticulum in the presence of a steroid hormone, it disappears enzymatic activity complete. However, if such a smooth reticulum prior to treatment for the purpose of attachment of If ribosomes are treated with a carcinogenic substance, then the ribosomes cannot attach to the membrane and therefore there is no change in the original rearrangase activity. The method of determination described above the rearrangase activity can therefore also be used in this case to determine the carcinogenic activity of the investigated Substance find application.

Die erfindungsgemässe Untersuchungs-Ausstattung zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Bestimmungsverfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass sie die folgenden Reagentien enthält .:The examination equipment according to the invention for implementation the determination method described above is characterized in that it uses the following reagents contains.:

(a) Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat oder ein diese Verbindung lieferndes Material(a) Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate or one of these Connection providing material

(b) eine Sucrose-MgClpKCl-Tris-Pufferlösung(b) a sucrose-MgClpKCl-Tris buffer solution

(c) Protein mit statistischer Verteilung der Disulfid-Bindungen, das durch Einwirkung von Rearrangase in eine enzymatisch aktive Form umgelagert wird(c) Protein with random distribution of the disulfide bonds, which is produced by the action of rearrangase in an enzymatically active form is rearranged

(d) 2-Mercaptoäthanol oder ein äquivalent wirkendes Thiol(d) 2-mercaptoethanol or an equivalent thiol

(e) ein Substrat zur Bestimmung dee A'asmasses der enzymatischen Aktivität des in -uie ak+v-~ ν λ-.τ? -r.gelagerten Pro-(e) a substrate for determining the mass of the enzymatic Activity of the in -uie ak + v- ~ ν λ-.τ? -r stored product

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teins gemäss (c).teins according to (c).

•Die Untersuchungs-Ausstattung enthält vorzugsweise, auch eine detaillierte G-ebrauchsanleitung zur Durchführung der folgenden Massnahmen : .• The examination equipment preferably also includes one detailed instructions on how to use the following Activities : .

1) Herstellung einer ersten Lösung durch·Zusatz der zu untersuchenden Substanz zu Reagenz (a);1) Preparation of a first solution by adding the one to be examined Substance to reagent (a);

2) Zusatz von Reagenz (b) zu dieser Lösung und weiterer Zusatz von isolierten Zellmembranen mit maskierter Rearrangase-Aktivität;2) addition of reagent (b) to this solution and further addition of isolated cell membranes with masked Rearrangase activity;

3) Herstellung einer zweiten Lösung durch Zusatz von Reagenz (c) zu einem Elektrolyt und Einstellung des pH-Werts mittels einer Base auf· einen vorherbestimmten Wert, sowie weiterer Zusatz von Reagenz (d) zu dieser Lösung;3) Prepare a second solution by adding reagent (c) to an electrolyte and adjusting the pH by means of a base to a predetermined value, as well as further addition of reagent (d) to this solution;

4) ' Herstellung einer dritten Lösung durch Zusatz von Reagenz (e) zu einem Elektrolyten;4) 'Preparation of a third solution by adding reagent (e) to an electrolyte;

5) Zusetzen einer Probe der ersten Lösung zu einem vorherbestimmten Zeitpunkt zu einer Probe der zweiten Lösung;5) adding a sample of the first solution to a predetermined one Point in time at a sample of the second solution;

6) Zusatz einer Probe der Mischung von der vorhergehenden Stufe (5) zu einem vorherbestimmten Zeitpunkt zu einer Probe der dritten Lösung;6) adding a sample of the mixture from the previous step (5) at a predetermined time at one Sample of the third solution;

7) Bestimmung und Verfolgung ■ r.. einer Eigens chaf t sand erung dieser Mischung, welche auf den Grad der Aktivierung des Proteins gemäss (c) durch die Rearrangase anspricht;7) Determination and pursuit of ■ r .. a property surrender this mixture, which responds to the degree of activation of the protein according to (c) by the rearrangase;

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8) Auswertung des Ausmasses der Degranulierung der rauhen Microsomal-Membran. ·8) Evaluation of the degree of degranulation of the rough Microsomal membrane. ·

Als Protein (c) wird vorzugsweise ungezielt,oxydierte Ribo-, nuclease und als Substrat (e) wird vorzugsweise Oytidin-2·,5"·- cyclische Phosphorsäure oder.ein davon abgeleitetes Salz, insbesondere das Natriumsalz, verwendet= Als Elektrolyt für die Auflösung des Proteins (c) und des Substrats (e) w-ird vorzugsweise Kaliumchlorid oder eine äquivalent wirkende Verbindung verwendet, und als Base zur Einregelung des pH-Wertes der zweiten Lösung ist Borax oder eine äquivalent wirkende Verbindung gut geeignet"» Diese Elektrolytsubstanz bzw. die Base sowie ein Präparat aus isolierten Zellmembranen können gleichfalls als Reagentien in der erfindungsgemässen Untersuchungs-Ausstattung vorhanden sein»The protein (c) is preferably untargeted, oxidized ribo-, nuclease and as substrate (s) is preferably oytidine-2 ·, 5 "· - cyclic phosphoric acid or a salt derived therefrom, in particular the sodium salt, used = as an electrolyte for the dissolution of the protein (c) and the substrate (e) is preferred Potassium chloride or an equivalent acting compound is used, and as a base to regulate the pH of the second Solution, borax or an equivalent acting compound is well suited "» This electrolyte substance or the base as well A preparation made from isolated cell membranes can also be used as reagents in the examination equipment according to the invention to be available"

Die Beispiele erläutern die Erfindung οThe examples explain the invention ο

Beispiel 1example 1

5/^ug d^{e D1}1 ^{der zu} untersuchenden Substanz werden zu ^einem Präparat zugesetzt, welches die rauhe Microsomal-Membran aus der Leber männlicher Ratten zusammen mit etwa 10 mg Protein/ml in Anwesenheit von 1 mMol WADPH, 50 mMol Tris-Pufferlösung (Tris ist die Abkürzung von der Verbindung Tris-(hydroxymethyl) aminomethan), 25 mMol KCl, 5 mMol MgGl₂ und 250 mMol Sucrose enthält. Das die rauhe Microsomal-Membran enthaltende Präparat enthält ausserdem einige Bestandteile von glatter Membran, welche die microsomale Hydroxylase liefert, die zur Aktivierung5 / ^u g d ^{e D1} 1 of ^{the substance to be} examined are added to a preparation which removes the rough microsomal membrane from the liver of male rats together with about 10 mg protein / ml in the presence of 1 mmol WADPH, 50 mmol Tris buffer solution (Tris is the abbreviation of the compound tris (hydroxymethyl) aminomethane), which contains 25 mmol KCl, 5 mmol MgGl ₂ and 250 mmol sucrose. The preparation containing the rough microsomal membrane also contains some components of the smooth membrane, which the microsomal hydroxylase supplies, which are necessary for activation

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bestimmter carcinogener Substanzen erforderlich ist ο Anschliessend setzt man 10 Volumenprozent überstehender Flüssigkeit des Microsomäi-Präparates hinzu und bebrütet· dann diese Untersuchuhgsmischung 2 Stunden lang bei 20⁰C und einem pH-Wert von 7»3<required certain carcinogenic substances ο then is set to add 10 percent by volume of supernatant of Microsomäi-preparation and then incubated · this Untersuchuhgsmischung 2 hours at 20 ⁰ C and a pH value of 7 '3 <

Ausserdem wird eine entsprechend zusammengesetzte Untersuchungsmischung in gleicher Weise bebrütet .welche jedoch kein ITADHi enthält, um so der Möglichkeit Rechnung zu tragen, dass die' cai?cino.gene Aktivität der zu untersuchenden Substanz durch die Microsomai-Hydroxylase nicht gefördert sondern zerstört wird»In addition, an appropriately composed test mixture is incubated in the same way, but which is not ITADHi contains, so as to take into account the possibility that the 'cai? cino.gene activity of the substance to be examined by the Microsomai hydroxylase is not promoted but destroyed »

Anschliessend wird der prozentuale Anteil der insgesamt vornan- " denen latenten Enzymaktivität, welche freigesetzt worden ist, aufgrund ihrer Wirkung auf ungezielt oxydierte Ribonuelease bestimmt. ■Then the percentage of the total those latent enzyme activity which has been released due to its action on undelectedly oxidized ribonuelease certainly. ■

Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle I zusammengefasst. In der Pussnote ist angegeben, falls die z.ü untersuchende Substanz nicht in einer Konzentration von 5/u.g/ml eingesetzt worden isf bzw ο falle keine NADPH mitverwendet wurde.The results obtained are shown in Table I below summarized. The puss note indicates if the substance to be examined is not in a concentration of 5 / u g / ml has been used or ο if no NADPH was also used.

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Tabelle ITable I.

Geprüfte SubstanzTested substance Prozent Gesamt-
Enzym-Aktivität
nach 2 StundenPercent total
Enzyme activity
after 2 hours *%,ug / ml*%, µg / ml In der Literatur
angegebenes
carcinogenes
VerhaltenIn the literature
specified
carcinogenes
behavior NaphtalinNaphthalene O.O. **)10/Ug / ml, ohne NADPH**) 10 / Ug / ml, without NADPH Nullzero 2-Naphthylamin2-naphthylamine 0-50-5 ++ AnthracenAnthracene 00 Nullzero 2,7-Diaminofluoren .2,7-diaminofluorene. 1515th ++ 1,2-Benzanthracen1,2-benzanthracene 1010 ++ 1,2-Benzanthrachinon1,2-benzanthraquinone 1515th ++ 2-Aminochrysen2-aminochrysene 1515th ++ 6-Aminochrysen6-aminochrysenic 00 Nullzero 3-Aminopyren3-aminopyrene 1717th 44th 5,4-Benzopyren5,4-benzopyrene 4040 44th Benzo-(b)-chrysenBenzo (b) chrysenic 00 Nullzero 5 > 4»8,9-Dibenzpyren5> 4 »8,9-dibenzpyrene 2525th 4-4- ^CG14*⁾: ^CG1 4 * ⁾ : • 15• 15th 4-4- Aflatoxin B**^Aflatoxin B ** ^ 2020th ++

Beispiel 2Example 2

In diesem Beispiel werden die einzelnen Verfahrensschritte mehr im einzelnen erläutert.In this example, the individual process steps are explained in more detail.

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ORIGINAL INSPECTEDORIGINAL INSPECTED

Bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Messverfahren wird Ribonuclease verwendet, wel'che auf chemischem Wege reduziert wurde und die dann wieder oxydiert wurde. Da sich bei diesem Oxydationsvorgang die Disulfid-Brücken nicht wieder in ihren ur-i sprünglichen Stellungen ausbilden, wird das Enzym durch eine . solche Oxydation inaktiv» Die Reaktivierung.erfolgt'dann durch das freigesetzte Rearrangase-Enzym in der vorstehend erläuterten V/eise ο Wenn man daher den Anstieg der Menge an aktiver Ribonuclease verfolgt, so ist dieser Anstieg dem Ausmass der Begranulation proportional„In the measurement method described in Example 1, ribonuclease used, which was reduced chemically and which was then re-oxidized. Since this oxidation process the disulfide bridges do not return to their ur-i to form initial positions, the enzyme is activated by a. such oxidation inactive. Reactivation then takes place through the released rearrangase enzyme in the above explained ο If one therefore considers the increase in the amount of active ribonuclease followed, this increase is proportional to the extent of the granulation "

Der Geschwindigkeitsanstieg, mit dem sich aktive Ribonuclease bildet, wird bei diesem Messverfahren durch Beobachtung der Veränderungen im pH-Wert verfolgt, der eintritt, weil Ribonuclease im aktiven Zustand Cytidin-2»,3'-cyclisches Monophosphat hydrolysiert»The increase in the rate at which active ribonuclease forms, is followed in this measurement method by observing the changes in pH that occur because ribonuclease in the active state, cytidine-2 », 3'-cyclic monophosphate hydrolyzed »

¹° Herstellung der reduzierten Ribonuclease ■ ¹ ° Production of the reduced ribonuclease ■

50 mg einer Ribonuclease, die viermal umkristallisiert worden war und 40 bis 50 Kunitz-Einheiten je mg entspricht, werden zu 1,3 ml einer 8 m-Harnstofflösung zugesetzt und der pH-Wert wird unter Verwendung von Methylamin auf.etwa 8,5 eingestellt» Dann setzt man 0,05 ml Mercapto-äthanol hinzu und leitet Stickstoff in Blasen durch die Lösung.50 mg of a ribonuclease which has been recrystallized four times and corresponds to 40 to 50 Kunitz units per mg become 1.3 ml of an 8 M urea solution are added and the pH is adjusted adjusted to about 8.5 using methylamine. 0.05 ml of mercaptoethanol are then added and nitrogen is passed in in bubbles through the solution.

Das Teströhrchen wird dann abgeschmolzen und 4 bis 5 Stunden lang bei 30 bis 35⁰C bebrütet» Anschliessend gibt man die Lösung auf eine lonenaustauschersäule (Sephadex G-25) und eluiert mitThe test tube is then melted and 4 to 5 hours at 30 to 35 ⁰ C incubated »Subsequently, the solution is an ion exchange column (Sephadex G-25) and eluted with

ORiQiNAL INSPEGTEOORiQiNAL INSPEGTEO

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0,1 m-Essigsäure» Die einzelnen Fraktionen werden gesammelt ^ und ihre optische Dichte "wird bei 280 m/u bestimmte Die reduzierte Ribonuclease enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und mittels 0,1 m-Essigsäure bis zu einer optischen,Dichte von 0,500 bei 280 m/U verdünnt» Diese verdünnte Lösung wird dann für die weitere Messung verwendet.0.1 m-acetic acid »The individual fractions are collected ^ and its optical density "is determined at 280 m / u The fractions containing reduced ribonuclease are combined and treated with 0.1 m-acetic acid to an optical density diluted from 0.500 at 280 m / rev. »This diluted solution is then used for further measurement.

2 α Oxydation der reduzierten Ribonuclease 2 α oxidation of the reduced ribonuclease

Man lässt die Ribonuclease-Lösungen sich spontan oxydieren. Für diesen Zweck sind'etwa 3 Tage vollständig ausreichend.The ribonuclease solutions are allowed to oxidize spontaneously. About 3 days are completely sufficient for this purpose.

3 ο Herstellung vom Membranpräparaten aus Rattenleber 3 ο Manufacture of membrane preparations from rat liver

Lösungen : ' Solutions : '

a) TKM-Pufferlösung .a) TKM buffer solution.

TRIS - 50 mMol KCl - 25 mMol MgCl₂ - 5 mMolTRIS - 50 mmol KCl - 25 mmol MgCl ₂ - 5 mmol

Einstellen auf pH 7,6 mit HClAdjust to pH 7.6 with HCl

b) 2 m-Sucrose in TKMb) 2 m-sucrose in TKM

c) 0,25 m-Sucrose in TKMc) 0.25 m sucrose in TKM

d) 1,35 m-Sucrose in TKMd) 1.35 M sucrose in TKM

■ Methode :■ Method :

5 Ratten werden getötet, ihre Lebern werden entfernt und in kalte TKM-Pufferlösung eingelegt, welche 0,25 molar an Sucrose ist. Unter Verwendung von Scheren werden die Rattenlebern in kleine5 rats are sacrificed, their livers are removed and placed in cold TKM buffer solution which is 0.25 molar in sucrose. Using scissors, the rat livers are cut into small ones

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Stückchen zerschnitten. Anschliessend werden die Lebern homogenisiert» Dieses Homogenat wird dann zentrifugiert (15 000 g_s 20 Minuten, 4⁰C). Die überstehende Suspension wird abgetrennt und das gebildete Pellet wird verworfen.Cut up pieces. The livers are then homogenized. This homogenate is then centrifuged (15,000 g _s, 20 minutes, 4 ^° C.). The supernatant suspension is separated off and the pellet formed is discarded.

Die Fraktionierung der Membransuspension erfolgt in einer Sucrose-Gradientenlösung in Zentrifugenröhrchen von 12 il, Die Gradientenlösung wird hergestellt, indem man jeweils 2,5 ml einer 2,0 molaren Sucroselösung in jedes Röhrchen einpipettiert und dann mit 3 ml einer 1,35 m-Sucroselösung überschichtet„ Man füllt jedes Röhrchen mit der Membransuspension auf, wobei man diese sorgfältig über die Gradientenlösung überschichtet und dabei ein Vermischen der einzelnen Schichten vermeidet. Man zentrifugiert dann diese Röhrchen (120 000 g, 4 Stunden, 4⁰C). Auf diese V/eise wird die Membransuspension in 4 Hauptkomponenten aufgetrennte Man erhält eine überstehende rotgefärbte Lösung, welche als S II bezeichnet wird».In der Grenzschicht zwischen der 0,25 m-Sucroselösung und der 1,35 m-Sucroselösung hat sich die glatte Membran angereichert", während sich die rauhe Membran an der Grenzschicht zwischen der 1,35 m-Sucrose- und der 2 m-Sucroselösung befindete Ausserdem erhält man ein Pellet aus Polysomeno Die einzelnen Komponenten werden unter Verwendung einer Injektionsspritze voneinander getrennt und die die rauhe Membran enthaltende Fraktion wird im Verhältnis von etwa 1 : 2 unter Verwendung einer TKM-Pufferlösung, welche etwa 0,25 molar an Sucrose ist, verdünnt. Diese Suspension wird anschliessend zentrifugiert (120 000 g, 1 Stunde, 4⁰C) und das aus der rauhen Membran bestehende Pellet wird in etwa 6 mlThe membrane suspension is fractionated in a sucrose gradient solution in centrifuge tubes of 12 μl. The gradient solution is prepared by pipetting 2.5 ml of a 2.0 molar sucrose solution into each tube and then with 3 ml of a 1.35 M sucrose solution layered “ Each tube is filled with the membrane suspension, carefully layering it over the gradient solution and avoiding mixing of the individual layers. These tubes are then centrifuged (120,000 g, 4 hours, 4 ^° C.). In this way, the membrane suspension is separated into 4 main components. A supernatant red-colored solution is obtained, which is referred to as S II. In the boundary layer between the 0.25 m sucrose solution and the 1.35 m sucrose solution, the smooth Membrane enriched ", while the rough membrane is located at the boundary layer between the 1.35 M sucrose and the 2 M sucrose solution. In addition, a pellet of polysomeno is obtained. The individual components are separated from one another using an injection syringe and the rough membrane The fraction containing the fraction is diluted in a ratio of about 1: 2 using a TKM buffer solution which is about 0.25 molar in sucrose.This suspension is then centrifuged (120,000 g, 1 hour, 4 ^° C.) and that from the rough membrane existing pellet is about 6 ml

'-. * - 209844/1221 ORtStNAt INSPECTED'-. * - 209844/1221 LOCATION INSPECTED

einer TKM-Pufferlösung, welche etwa 0,25 molar an Sucrose ist,, suspendiert.a TKM buffer solution, which is about 0.25 molar in sucrose, suspended.

4. Bestimmung der Ribonuclease im Membranpräparat 4. Determination of the ribonuclease in the membrane preparation

Von der in der vorstehenden Weise erhaltenen Membransuspension werden 2 Proben von etwa jeweils 100 >ul für.die Bestimmung der Ribonuclease entnommene Zu jeder Probe werden 3 ml einer 0,1 n-Perchlorsäurelösung zugesetzt, und die Teströhrchen werden 10 Minuten lang in Eis gestellt. Anschliessend werden die Röhrchen auf einer niedrigtourigen Zentrifuge zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wird verworfen. Dann setzt man zu jedem Teetröhrchen 3,2 ml einer 3n-Kaliumhydroxidlösung hinzu und bebrütet die Mischung 1 Stunde lang bei 37°C. Nach dem Abkühlen der Mischung in Eis setzt man zu jedem Röhrchen 0,8 ml einer 2,2 n-Perchlorsäurelösung hinzu und lässt diese Mischung 5 Minuten lang stehen. Die Suspension wird dann zentrifugiert und die .dabei erhaltene überstehende Lösung wird im Verhältnis 1 : 2 mit Wasser verdünnt« Alischiiessend bestimmt man die optische Dichte dieser Lösung bei 260 nyu.From the membrane suspension obtained in the above manner 2 samples of approximately 100 μl each are used for the determination of the Ribonuclease removed 3 ml of a 0.1 N perchloric acid solution are added to each sample are added and the test tubes are placed in ice for 10 minutes. Then the tubes centrifuged on a low speed centrifuge and the supernatant liquid is discarded. Then you sit down with everyone Add 3.2 ml of a 3N potassium hydroxide solution to the tea tube and incubate the mixture for 1 hour at 37 ° C. After cooling down to the mixture in ice, 0.8 ml of a 2.2N perchloric acid solution is added to each tube and this mixture is left Stand for 5 minutes. The suspension is then centrifuged and the resulting supernatant solution is in the ratio Diluted 1: 2 with water Density of this solution at 260 nyu.

256/Ug/ml der ursprünglichen Probe entsprechen einer optischen Dichte von 0,1 .256 / Ug / ml of the original sample correspond to an optical one Density of 0.1.

5. Bestimmung des Proteingehalts der rauhen Membran 5. Determination of the protein content of the rough membrane

Hierfür verwendet man die Methode nach Lowry, welche in einer Verdünnung von 1 : 50 bzw. 1 : 100 an der gemäss Absatz 3) erhaltenen Membransuspension durchgeführt wird.For this purpose, the Lowry method is used, which is diluted 1: 50 or 1: 100 on the basis of paragraph 3) obtained membrane suspension is carried out.

ORIGINAL INSPECTEDORIGINAL INSPECTED

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Für diese Bestimmung sind die folgenden Lösungen erforderlich :The following solutions are required for this determination:

A 2 Prozent Natriumcarbonat in 0,1 n-Natriumhydroxid B₁ 1 Prozent KupfersulfatA 2 percent sodium carbonate in 0.1 N sodium hydroxide B ₁ 1 percent copper sulfate

B₂ 2 Prozent Na- oder K- oder KNa-Tartrat · B 1 : 1 B₁ + B₂ B ₂ 2 percent Na or K or KNa tartrate B 1: 1 B ₁ + B ₂

C 50 ml A + 1 ml B ·■-.··C 50 ml A + 1 ml B · ■ -. ··

D. 1 : 2,5 in Wasser: Folin-CiocalteuD. 1: 2.5 in water: Folin-Ciocalteu

Zu 5 ml der Lösung C setzt man 0,2 ml der Memb.ransuspension ' hinzu ο Man "bebrütet: dann 15 Minuten lang bei Zimmertemperatur, setzt weiterhin 0,3 ml der Lösung D hinzu und vermischt¹ganz rasche Nach 30 Minuten wird die optische Dichte bei 750 ni/U bestimmt. Als Standard kann für diese Methode ein OctenserumAlbumin verwendet werden=0.2 ml of the membrane suspension is added to 5 ml of solution C o Incubate: then for 15 minutes at room temperature, further 0.3 ml of solution D is added and mixed ¹ very quickly optical density determined at 750 ni / U. An octenserum album can be used as a standard for this method =

6 ο Verhältnisse von Ribonuclease zu Protein 6 ο Ribonuclease to Protein Ratios

Damit ein Membranpräparat als rauh bezeichnet werden kann, soll das Verhältnis von Ribonuclease zu !Protein im Bereich von 0,14 bis 0,19 liegen. Durch dieses Verhältnis unterscheidet sich eine rauhe Membran sehr deutlich von einer glatten Membran, bei der das entsprechende Verhältnis einen Wert im Bereich von 0,02 bis 0,03 hat ο ' 'So that a membrane preparation can be described as rough, the ratio of ribonuclease to protein should be in the range from 0.14 to 0.19. This ratio is different A rough membrane differs very clearly from a smooth membrane, in which the corresponding ratio has a value in the range of 0.02 to 0.03 has ο ''

7 ο Bestimmung der carcinogenen Aktivität 7 ο Determination of the carcinogenic activity

Für diese Bestimmungsmethode sind die folgenden Lösungen erforderlich : .·■■'■·The following solutions are required for this determination method :. · ■■ '■ ·

INSPECTEDINSPECTED

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*) Cytidin-2*,^-cyclische Phosphorsäure >*) Cytidine-2 *, ^ - cyclic phosphoric acid >

Natriumsalz (abgekürzt CMP) · 10 mg/ml 0,1 m KClSodium salt (abbreviated CMP) 10 mg / ml 0.1 m KCl

carcinogene Substanz 1 mg/ml Wasser oder DM?carcinogenic substance 1 mg / ml water or DM?

*) Mercaptoäthanol 10 /Ul in 7 ml Wasser*) Mercaptoethanol 10 / Ul in 7 ml of water

*) Raite Membrane 10 - 20 mg Protein / ml*) Raite Membrane 10-20 mg protein / ml

0,25 m-Sucrose in TKM0.25 m sucrose in TKM

KCl 0,1 m in WasserKCl 0.1 m in water

Essigsäure 0,1 m in WasserAcetic acid 0.1 m in water

Borax-Lösung 0,05 m in V/asserBorax solution 0.05 m in water / water

*) NADPH ■ 5 mMol in TKM*) NADPH ■ 5 mmol in TKM

*) ungezielt oxidierte '., *) randomly oxidized '.,

Ribonucleases lösung mit einem Wert fürRibonucleases solution with a value for

die optische Dichte bei 280 m/U von 0,500 in 0,1 m-Essigsäurethe optical density at 280 m / rev of 0.500 in 0.1 m acetic acid

*) In Eis gekühlt
***) DMP = Dimethylformamid*) Chilled in ice
***) DMP = dimethylformamide

Erforderliche MessvorrichtungRequired measuring device

Diese Bestimmungsmethode beruht auf der Veränderung des pH-Werts einer Lösung von cyclischer CMP während der durch Ribonuclease hervorgerufenen Hydrolyse ο Da jedoch die Veränderung im pH-Wert nur,etwa einer Grössenordnung von 0,1 bis 0,2 pH-Wert-Einheit entspricht, muss das pH-Wert-Messgerät mit einem Scalenverbreiterer verbunden werden, damit die Messungen mit dem erforderlichen Genauigkeitsgrad durchgeführt werden können. Beispielsweise eignet sich zu diesem Zweck ein E.I.L.-pH-Meter Modell 7030. Dieses Messgerät ist über eine Rückschaltung mit einem Registriergerät mit einem vollen Scalenausschlag fürThis determination method is based on the change in the pH of a solution of cyclic CMP during that caused by ribonuclease Induced hydrolysis ο However, there is the change in pH only, roughly in the order of 0.1 to 0.2 pH value unit corresponds, the pH-value measuring device must be connected to a scale expander so that the measurements with the required Degree of accuracy can be performed. For example, an E.I.L. pH meter is suitable for this purpose Model 7030. This measuring device is via a switch back with a recording device with a full scale deflection for

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10 mV verbundene Alle pH-Wert-Messungen werden in einer mit ^; Wassermantel versehenen Zelle von 5 ml Fassungsvermögen bei einer Temperatur von 35⁰G durchgeführt»10 mV connected All pH measurements are made in one with ^; Water-jacketed cell of 5 ml capacity carried out ^{at a temperature of 35 0 G »}

Messmethode · ' · Measurement method · '·

a) Unter Verwendung geeigneter Puffersubstanzen wird das pH-Wert-Messgerät standardisiert.a) Using suitable buffer substances, the Standardized pH value measuring device.

b) Man stellt die degranulierte zu untersuchende Mischung her<>b) The degranulated mixture to be examined is produced <>

Zu 100 /Ul NADPH werden 5 bis 50 zug der zu untersuchenden carcinogenen Substanz zugesetzt, und dann füllt man mit TKM-Pufferlösung "bis auf 0,3 ml auf« Zu dieser Mischung setzt man 0,2 ml der Membransuspensiou hinzii und beginnt die Zeitmessung der Degranulierung»At 100 / UI NADPH, 5 to 50 of those to be examined are added carcinogenic substance is added, and then it is made up to 0.3 ml with TKM buffer solution. Add to this mixture add 0.2 ml of the membrane suspension and start timing of degranulation »

c) Herstellung der Messlösung. . ' 'c) Preparation of the measurement solution. . ''

Zu 0,65 g ml einer Oj,1 molaren KCl-lösung setzt man iOQ/ul reoxidierte Ribonuclease hinzu und stellt unter Verwendung von 0,05 molarer Boraxlösung auf einen pH-Wert von 7,0 ein« Eu dieser Mischung setzt man 50/ul Meroaptoäthanol hinzu und · unmittelbar nachdem die Degranulierung eingesetzt hat, wird eine Probe von 100/Ul entnommen und mit der vorstehend beschriebenen Mischung vereinigt» Zu diesem Zeitpunfk soll ein zweiter "Zeitmesser in Gang gesetzt werden» Der pH-Wert der Misqhung wird ijetzt unter Verwendung von Boraxlösung auf 7»6 eingestellt, Diese Mischung wird in eine zweite Messzelle überführt und bei 35⁰G bebrütet« ' - ■ . ' 'To 0.65 g ml of a 0.1 molar KCl solution is added 10% / μl of reoxidized ribonuclease and, using 0.05 molar borax solution, a pH of 7.0 is added. μl meroaptoethanol is added and · immediately after degranulation has started, a sample of 100 μl is taken and combined with the mixture described above Use of borax solution set to 7 »6. This mixture is transferred to a second measuring cell and ^{incubated at 35 0} G« '- ■.''

2 0 9 8 A k / 1 2 2.1 ORlGlNAi INSPECTED2 0 9 8 A k / 1 2 2.1 ORlGlNAi INSPECTED

d) Herstellung einer Lösung von cyclischer CMPd) Preparation of a solution of cyclic CMP

Eine Messzelle wird mit 0,9 ml Kaliumchloridlösung beschickt, und dann setzt man 1OO/U1 cyclische CMP hinzu< > Während 2 bis 3 Minuten lässt man das Gleichgewicht sich einstellen»A measuring cell is charged with 0.9 ml of potassium chloride solution, and then 100 / U1 of cyclic CMP are added > The equilibrium can be set for 2 to 3 minutes »

e) Durchführung der eigentlichen Messunge) Carrying out the actual measurement

Nachdem die durch Verfahrensmassnahme (c) eingeleitete Reaktiv ierung der inaktiven Ribonuclease etwa 7 Minuten lang abgelaufen ist, wird eine Probe von 100/ul in die Lösung der cyclischen CMP- übertragen und das pH-Wert-Messgerät wird auf die verbreiterte pH-Wert-Scala eingestellte Der Ablauf der Hydrolyse der cyclischen CMP kann nunmehr anhand der Veränderungen im pH-Wert verfolgt werden© Während der Messung soll Stickstoff über die Oberfläche der Reaktionsmischung geblasen werden, um eine atmosphärische Verseuchung zu vermeiden und damit zufällige pH-Wertänderungen auszuschaltenο Diese Bestimmung wird in Zeitabständen von 10 Minuten bis zu einer Gesamtzeit von etwa 40 Minuten wiederholte Der Gradient der Messkurven soll allmählich ansteigen, da die Konzentration an aktiver Ribonuclease mit der Zeit in dem Ausmass zunimmt, wie die inaktive Form durch die Rearrangase reaktiviert wird.After the reactive ization of the inactive ribonuclease has elapsed for about 7 minutes, a sample of 100 / μl is added to the solution of the cyclic CMP- transferred and the pH value measuring device is set to the widened pH value scale. The process of hydrolysis of the cyclic CMP can now be followed on the basis of the changes in the pH value © During the measurement, nitrogen should be over the Surface of the reaction mixture are blown to an atmospheric To avoid contamination and thus to switch off accidental changes in the pH value ο This determination is carried out at time intervals repeated from 10 minutes up to a total time of about 40 minutes. The gradient of the measurement curves should be gradual increase as the concentration of active ribonuclease increases over time to the same extent as the inactive form is reactivated by the rearrangase.

Eine Stunde nach Beginn der Massnahmen von Verfahrensstufe . (b) wird die Verfahrensstufe (c) wiederholt, und der ganze Messvorgang wird wiederum so vorgenommen, wie es vorstehend unter (e) beschrieben ist β Diesen gesamten Messvorgang wiederholt man dann nochmals nach etwa 2 Stunden οOne hour after the start of the measures at procedural level. (b) the process step (c) is repeated, and the entire measuring process is carried out again as described above under (e) β This entire measuring process is then repeated again after about 2 hours ο

20984 4/1221 original. iMS?«=cr?o20984 4/1221 original. iMS? «= cr? o

^;Die gesamte Messung soll ausserdem in Abwesenheit von NADPH Wiederholt werden« ^; The entire measurement should also be repeated in the absence of NADPH «

Auswertung der Messresultate ' Evaluation of the measurement results '

Der Anstieg in der Rearrangase-Konzentratlon, welche: durch den Degranulierungsvorgang freigesetzt worden ist, wird nach Ablauf einer Stunde, nach Ablauf von 2 Stunden gemessen und mit dem Blindwert zum Zeitpunkt 0 verglichene Zu den jeweiligen Zeitpunkten ist ausserdem der Anstieg der Konzentration an aktiver Ribonuclease gemessen worden, indem man eine Berie von pH-Wert-Veränderungen verfolgt, welche sich aus der Hydrolyse cyclischer CMP mittels aktiver Ribonuclease ergeben.The increase in the rearrangase concentration, which: by the Degranulation process has been released is measured after one hour, after 2 hours and with the Blank value at time 0 compared at the respective time points, the increase in concentration is also more active Ribonuclease has been measured by looking at a range of pH changes followed, which result from the hydrolysis of cyclic CMP by means of active ribonuclease.

Daher erhält man zu jedem Zeitpunkt der Degranulierungsbestimmung T , T.J ufnd Tg eine Reihe von Messkurven (a, b und c) mit steigendem Gradienten«. Dieser Sachverhalt ist in dem Diagramm von Figo 1 für einen Zeitpunkt T wiedergegeben.The degranulation determination is therefore obtained at any point in time T, T.J and Tg a series of measurement curves (a, b and c) with increasing gradient «. This fact is in the diagram of FIG. 1 for a point in time T.

Es wird dann graphisch die Abhängigkeit der·" Gradienten der Kurven a, b und c gegen die Zeit für jede Probe im Anschluss an die Bestimmung des Ribonuclease-Wertes aufgetragen. Dieser Sachverhalt i3t in Fig. 2 der Zeichnung wiedergegebeneThe dependence of the gradients of curves a, b and c against time for each sample is then graphically displayed applied to the determination of the ribonuclease value. This state of affairs is reproduced in FIG. 2 of the drawing

Beide graphischen Darstellungen werden für den Zeitpunkt T=O, T = 1 Stunde und T = 2 Stunden angefertigt, und im lalle des . Vorliegens einer carcinogenen Aktivität, d«h. bei positivem Ausfall der Bestimmung, ergibt sich das Gesamtergebnis aus der graphischen Darstellung von Fig. 3»Both graphical representations are made for the time point T = 0, T = 1 hour and T = 2 hours, and in the course of the. Presence of carcinogenic activity, i. E. with positive If the determination fails, the overall result is derived from the graphic representation of Fig. 3 »

^ -^O ORIGINAL INSPECTED^ - ^ O ORIGINAL INSPECTED

SchliesBlioh kann man die Gradienten der Kurven A, B und C von Fig;.. 3 gegen die Zeit für den Zeitpunkt T = O, T = 1 Stunde und T = 2 Stunden auftragen.SchliesBlioh one can see the gradients of curves A, B and C from Fig. 3 versus time for the time T = 0, T = 1 hour and apply T = 2 hours.

Im Falle eines negativen Ergebnisses der Bestimmungsmethode hat keine Degranulierung stattgefunden, und daher nimmt die Menge an Rearrangäse auch nicht' zu. Die Blindwert-Bestimmung der Rearrangäse ergibt daher einen mit der Zeit abnehmenden Wert (Denaturierungseffekt) und daher ist die Neigung der Kurve C ".'<'... als die .Neigung der Kurve B und diese wiederum <^ als die Neigung der Kurve A.In case of a negative result of the determination method no degranulation has taken place and therefore the Amount of rearrangement also not 'too. The blank value determination of the rear ranks therefore results in a decrease over time Value (denaturing effect) and therefore the inclination is the Curve C ". '<' ... as the slope of curve B and this in turn <^ as the slope of curve A.

B e i α ρ i ^:e 1 3B ei α ρ i ^: e 1 3

Dieses Beispiel erläutert die Anwendung des erfindungsgemässen Bestimmungsverfahrens an der Substanz Aminopyren.This example explains the application of the method of determination according to the invention to the substance aminopyrene.

Aminopyren wird in einer Konzentration von 5/Ug/ml eingesetzt. Die erste BebrUtungsmischung hat die folgende Zusammensetzung :Aminopyrene is used in a concentration of 5 / Ug / ml. The first incubation mix has the following composition:

0,4 ml eines Microsomal-Membranpräparates (rauhe Membran0.4 ml of a microsomal membrane preparation (rough membrane

\ '. * in einer Konzentration von 10 mg/ml)\ '. * in a concentration of 10 mg / ml)

0,1 ml einer NADPH-Iösung (5. mMol) / .0.1 ml of a NADPH solution (5th mmol) /.

5 /ul einer Lösung, welche 0,5 mg/ml Aminopyren in Dimethylformamid enthält5 / µl of a solution containing 0.5 mg / ml aminopyrene in dimethylformamide contains

Alle Lösungen werden in einem Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 der folgenden Zusammensetzung hergestellt :All solutions are prepared in a buffer with a pH of 7.5 of the following composition:

2098447122!2098447122!

250 mMol Sucrose250 millimoles of sucrose

50 mMol TRIS-Base - '50 mmol TRIS base - '

25 »Mol KCl ' ·25 »moles of KCl '

5 mMol MgCl₂ · '5 mmol MgCl ₂ · '

Von dieser ersten Bebrütungslösung werden jeweils Anteile von 100/Ul zum Zeitpunkt T = 0,' T = 60Minuten und T = 120 Minuten entnommen und mit einer zweiten Bebrtitungsmischung der folgenden Zusammensetzung vermischt :From this first incubation solution, portions of 100 / U1 at time T = 0, 'T = 60 minutes and T = 120 minutes taken and mixed with a second processing mixture of the following composition:

0,7 ml 0,1 m KCl0.7 ml 0.1 M KCl

0,10 ml eines ungezielt oxydierten Ribonuclease-Substrats (500vug/ml in 0,1 m-Essigsäure)0.10 ml of an untargeted oxidized ribonuclease substrate (500vug / ml in 0.1M acetic acid)

0,05 ml ß-Mercaptoäthanol (2 χ 10 Mol)0.05 ml ß-mercaptoethanol (2 χ 10 mol)

Zusatz von ' 0,05 molarer Boratlösung zur EinstellungAddition of 0.05 molar borate solution for adjustment

eines pH-Wertes von 7,6«, ·a pH value of 7.6 «, ·

Diese zweite Lösung wird dann "bei 32⁰C gehalten.This second solution is then kept ^{at 32 ° C.}

Jeweils 100/ul-Proben dieser zweiten Lösung werden zum Zeitpunkt t = 5 Minuten, 12 Minuten, 20 Minuten,! 28 Minuten und 35 Mrtiuten in 1 ml einer Lösung von Cytidin-2»3'-CVcIiBc]IeS Monophosphat in 0,1 molarer KCl (1 mg/ml) eingetragen und der pH-Wert dieser Lösung wird 5 Minuten lang unter Verwendung eines Registriergeräts mit entsprechendem Streifen-Registrierpapier registriert (volle Ablesungsbreite der Skala =0,1 pH-Wert-Einheiten) OEach 100 / μl samples of this second solution are taken at the time t = 5 minutes, 12 minutes, 20 minutes ,! 28 minutes and 35 minutes in 1 ml of a solution of cytidine-2 »3'-CVcIiBc] IeS monophosphate added to 0.1 molar KCl (1 mg / ml) and the pH of this solution is adjusted for 5 minutes using a Recording device with a corresponding strip of recording paper (full reading range of the scale = 0.1 pH value units) O

Die pH-Wert-Änderungen der einzelnen Proben werden zum Zeitpunkt t = 5 Minuten, 12 Minuten, 20 Minuten, 28 Minuten undThe pH changes of each sample are recorded at the time t = 5 minutes, 12 minutes, 20 minutes, 28 minutes and

209844/1221209844/1221

35 Minuten gemessen (vergl# nächstehende Tabelle II), und die ' Geschwindigkeit des Anstiegs der pH-Wertveränderung für Proben der ersten Bebrütungslösung zum Zeitpunkt 0 sowie nach 60 und 120 Minuten wird aus den Rearrangase-Aktivitäten zu diesen , Zeitpunkten berechnet.35 minutes measured (see Table II below), and the ' Rate of increase in pH change for samples of the first incubation solution at time 0 and after 60 and 120 minutes is calculated from the rearrangase activities at these points in time.

Tabelle IITable II

-- pH-pH *)
Wert-Änderung ' *)
Value change ' T =T = 60 Min60 min T =T = 120 Min.120 min. T =T = 00 0,0, 3232 0,0, 3636 t = 5 Min.t = 5 min. 0.·0. · 3232 0,0, 3838 0,0, 4848 t = 12 «t = 12 « 0,0, 3535 0,0, 4848 0,0, 6161 t = 20 "t = 20 " 0,0, 3838 0,0, 5555 0,0, 7474 t = 28 ^tt t = 28 ^tt 0,0, 4242 0,0, 6363 0,0, 8686 t = 35 *t = 35 * 0,0, 4545 Geschwindigkeit desSpeed of the Anstiegs der pH-Increase in pH Wert -YeränderungValue change (willkürliche Ein(arbitrary one VJlVJl 88th heiten)units) 22 *) 80 x pH/Min*) 80 x pH / min

Die pH-Wert-Änderungen sind in Fig» 4 gegen die Bebrütungszeit der zweiten Mischung aufgetragen und ergeben die Rearrangase-Aktivitäten, d.h.«, den Gradienten der einzelnen Kurven.The changes in pH are shown in FIG. 4 against the incubation time of the second mixture and give the rearrangase activities, i.e. «, the gradients of the individual curves.

2098U/12212098U / 1221

Diese Rearrangase-Aktivitäten werden dann gemäss ]?ig. 5 gegen die Bebrütungszeit der ersten BebrütungalöBung aufgetragen, wodurch man das Ablösen der Ribosome von der Membran verfolgen -kann.These rearrangase activities are then according to]? Ig. 5 applied against the incubation time of the first incubation, which leads to the detachment of the ribosomes from the membrane track -can.

Offensichtlich steigt bei der Substanz Aminopyren- die Rearrangase-Aktivität im Lauf der Zeit an, so dass diese Verbindung als carcinogen-aktiv eingestuft werden muss.Obviously, the rearrangase activity of the substance aminopyrene increases over time, so that this Compound must be classified as carcinogen-active.

ORIGINAL INSPECTEDORIGINAL INSPECTED

Claims (1)

PatentansprücheClaims 1. Verfahren zur Bestimmung der carcinogenen Aktivität von Substanzen, dadurch gekennzeichnet , dass man die zu untersuchende Substanz mit isolierten Zellmembranen kontaktiert, welche eine maskierte Rearrangase-Aktivität aufweisen, und dass man nach einem vorher bestimmten Zeitraum die Rearranga3e-Aktivität misst.1. Method for determining the carcinogenic activity of Substances, characterized in that the substance to be examined is isolated with Cell membranes contacted, which masked rearrangase activity and that the rearranga3e activity is measured after a predetermined period of time. 2. Verfahren nach Anspruch 1,-dadurch gekennzeichnet, dass man aus dem endoplasmischen Reticulum von Rattenlebern gewonnene- Zellmembran anwendete2. The method according to claim 1, characterized in that cell membrane obtained from the endoplasmic reticulum of rat livers was used 3ο Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die zu untersuchende Substanz in Anwesenheit von reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat mit der isolierten. Zellmembran kontaktiert und dadurch die in der Microsomal-Membran vorhandene ftydroxylase aktivierte3ο method according to claim 1 and 2, characterized in that that you can test the substance in the presence of reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate with the isolated. Contacted the cell membrane and thereby activated the hydroxylase present in the microsomal membrane 4ο Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Rearrangase-Aktivität aufgrund ihrer Fähigkeit zur Umlagerung von Disulfid-Bindungen in einem Protein mit statistischer Anordnung der Disülfidbindungen bestimmt»4ο method according to claim 1 to 3, characterized in that that one has rearrangase activity due to its ability to rearrange disulfide bonds in a protein statistical arrangement of the disulfide bonds determined » 5β Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Protein mit statischer Anordnung der Disulfid-Bindungen eine inaktive, ungezielt oxydierte Ribonuclease verwendet und deren Aktivität nach Umlagerung der Disulfid-Bindungen bestimmt»5β Method according to claim 4, characterized in that a protein with a static arrangement of the disulfide bonds is an inactive, non-specifically oxidized ribonuclease used and their activity determined after rearrangement of the disulfide bonds » 209-8 44/1221 OFHGtNAL inspected209-8 44/1221 OFHGtNAL inspected 6β Verfahren nach Anspruch 4 und 5_f dadurch gekennzeichnet, dass man die Aktivität der Ribonuclease aufgrund ihrer Fähigkeit zur Hydrolyse.von Cytidin-2¹,3'-phosphat .; in ■ Cytidin-3.' -phosphat bestimmt ο . '6β Method according to claim 4 and 5 _f, characterized in that the activity of the ribonuclease due to its ability to hydrolyze.von cytidine-2 ¹ , 3'-phosphate.; in ■ cytidine-3. ' -phosphate determined ο. ' 7ο Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man Standardwerte für- die Rearrangase-Aktivität mittels bekannter carcinogener Substanzen bestimmt und damit das Verhalten carcinogen-verdächtiger Substanzen mittels Standardverfahren vergleicht.7ο method according to claim 1 to 6, characterized in that that one standard values for rearrangase activity by means of known carcinogenic substances and thus the behavior of carcinogenic substances by means of Standard procedure compares. 8. Untersuchungs-Ausstattung zur Durchführung des Bestimmungs-Verfahrens nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Reag'entien enthält :8. Examination equipment for carrying out the determination procedure according to claim 1 to 7, characterized in that it contains the following reagents: (a) Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat oder eine(a) Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate or a diese Verbindung lieferndes Material,material providing this connection, (b) .Sucrose-MgCl-gKCl-Tris-Pufferlösung(b) .Sucrose-MgCl-gKCl-Tris buffer solution (c) Protein mit statistischer Verteilung der Disulfid-Bindungen, welches durch Einwirkung von Rearrangase in eine enzymatisch aktive Form umgelagert wird,(c) protein with statistical distribution of disulfide bonds, which is rearranged into an enzymatically active form by the action of rearrangase, (d) 2-Mercaptoäthanol oder ein äquivalent wirkendes Thiol,(d) 2-mercaptoethanol or an equivalent thiol, (e) Substrat zur Bestimmung des Ausmasses der enzymatischen Aktivität des in die aktive Form umgelagerten Proteins gemäss (c)(e) Substrate for determining the extent of the enzymatic activity of the protein rearranged into the active form according to (c) 2098U/1221 «.,„„,-2098U / 1221 «.," ", - ORIGINAL INSPECTEDORIGINAL INSPECTED 9· Untersuchungs-Ausstattung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine detaillierte Gebrauchsanleitung zur Durchführung der folgenden Massnahmen enthält :9. Examination equipment according to claim 8, characterized in that that it contains detailed instructions for use for carrying out the following measures: 1) Herstellung einer ersten Lösung durch Zusatz der zu untersuchenden Substanz zu Reagenz (a);1) Preparation of a first solution by adding the to test substance to reagent (a); 2) Zusatz von Reagenz (b) zu der Lösung nach 1) und wexte-rer Zusatz von isolierten Zellmembranen mit maskierter Rearrangase-Aktivität;2) Adding reagent (b) to the solution according to 1) and wexte-rer Addition of isolated cell membranes with masked rearrangase activity; 3) Herstellung einer zweiten Lösung durch Zusatz von Reagenz (c) zu einem Elektrolyten und Einstellung den pH-Wertes mittels einer Base auf einen vorher bestimmten Wert und weiteren Zusatz von Reagenz (b)j3) Preparation of a second solution by adding reagent (c) to an electrolyte and adjusting the pH value to a previously determined by means of a base Value and further addition of reagent (b) j 4) Herstellung einer dritten Lösung durch Zusatz von Reagenz (e) zu einem Elektrolyten;4) preparation of a third solution by adding reagent (e) to an electrolyte; 5) Zusatz einer Probe der ersten Lösung zu einem vorher bestimmten Zeitpunkt zu einer Probe der zweiten Losung;5) adding a sample of the first solution to a previously specific point in time at a sample of the second solution; 6) Zusatz einer Probe" der Mischung von Stufe (5) zu einem vorher bestimmten Zeitpunkt zu einer Probe der dritten Lösung}6) Adding a "sample" of the mixture from step (5) at a predetermined time to a sample of the third Solution} 7) Bestimmung und Verfolgung einer Eigenschaftsänderung dieser Mischung, welche auf den Grad der Aktivierung des Proteins gemäss (c) durch die Rearrangase anspricht}7) Determination and monitoring of a change in properties of this mixture, which affects the degree of activation of the protein according to (c) responds by the rearrangase} 8) Auswertung des Ausmassee der Degranulierung der rauhen Microsomal-Membran.8) Evaluation of the degree of degranulation of the rough Microsomal membrane. 209 844 / 1221209 844/1221 10« Untersuchungs-Ausstättung nach Anspruch 8 und 9» dadurch gekennzeichnet, dass sie ausserdem isolierte Zellmembran-Präparate mit maskierter Rearrangase-Aktivität enthält <r10 «examination equipment according to claim 8 and 9» thereby characterized that they also isolated cell membrane preparations with masked rearrangase activity contains <r ο Untersuchungs-Ausstattung nach Anspruch 8 bis 1O,'dadurch gekennzeichnet, dass sie als Protein (c) ungezielt oxydierte ßibonuclease und als Substrat (e) Cytidin-2·,3•-cyclische Phosphorsäure oder ein davon abgeleitetes Salz enthält_o ο examination equipment according to claim 8 to 1O, 'characterized in that it contains as protein (c) non-specifically oxidized ßibonuclease and as substrate (e) cytidine-2 ·, 3 · cyclic phosphoric acid or a salt derived therefrom _o 12o Untersuchungs-AvAüC;tattung nach Anspruch 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Elektrolyt Kaliumchlorid oder eine äquivalent wirkende Verbindung und als Base Borax oder eine äquivalent wirkende Verbindung enthält.12o examination AvAüC; model according to claims 8 to 11, characterized characterized in that they are used as the electrolyte potassium chloride or an equivalent acting compound and as the base borax or contains an equivalent acting compound. 209844/1221209844/1221