DE2202613A1

DE2202613A1 - Verfahren zur herstellung von peptiden

Info

Publication number: DE2202613A1
Application number: DE19722202613
Authority: DE
Inventors: Rolf Dipl-Chem Dr Geiger; Wolfgang Dipl-Chem Dr Koenig; Hans Dipl-Chem Dr Wissmann
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1972-01-20
Filing date: 1972-01-20
Publication date: 1973-08-30
Also published as: US3872074A; DE2202613B2; DE2202613C3

Description

FARBWERKE HOECHST AG

vormals Meister Lucius & Brüning 9?fl9R 1

Aktenzeichen: HOE 72/F 016

Datum 19. Januar 1972 Dr.HG/ka

Verfahren zur Herstellung von Peptiden

Zur Herstellung von Peptiden werden oft mit gutem Erfolg die stark aktivierten Ester von N-Acylaniinosäuren, wie z. B. N-Hydroxysuccinimid- (j. Amer. Chem. Soc. 86^ (19^4), Seite 1839), l-Hydroxybenzotriazol- (Chem. Ber. 103, (197O), Seite 788) oder 3-Hydroxy-^-oxo-3.4-dihydrobenzotriazinester (Chem. Ber. IO3 (1970), Seite 2034) verwendet. Diese stark aktivierten Ester lassen sich jedoch nicht in allen Fällen kristallin und in der geforderten Reinheit herstellen. Auch sind sie relativ unbeständig und können oft nicht lange gelagert werden. Bessere Kristallisationseigenschaften und auch größere Stabilität haben negativ substituierte Phenylester, wie ζ. B. ρ-Nitrophonylester (Chem. u. Ind. 1955> Seite I517), 2.4.5-Trichlorphcnylester (HeIv: Chim. Acta h6_ (1963), Seite I609), Pentachlorphenylester (Roczniki Chem . JJ5, ('!961), Seite I533) oder auch 2.6~Dxchlor-4-nitro-pheriyles ter (Aust. J. Chem. 2_1 (1968), Seite 477). Diese Ester haben jedoch den Nachteil, daß bei der Synthese sterisch gehinderter Peptide die Reaktionsgeschwindigkeit stark zurückgeht und daraus oft tagelange Reaktionszeiten rosullieren. In extremen Fällen kommt es zu keiner Peptidbi idnjig.

Schon seit längerer Zeit wurde versucht, durch Zusätze verschiedener Art die etwas reaktionsträgen Ester zu katalysieren. So wurden z. B. Imidazol (Angew. Chem. Tk (1962), Seite 904, 2£ (1963), Seite 209), 2-Hydroxypyridin, 1.2.4-Triazol oder Pyrazolderivate (Proc. Chem. Soc. 1963»Seite 266; Rec. Trav. chini. Pays-Bas 84. (1965), Seite 213) zur Esterkatalyse herangezogen.

Zwar verlief) bis auf Imidazol bei den genannten Katalysatoren die Aminolyse der aktivierten Ester ohne Racemisierung, doch die Reaktionsgeschwindigkeit konnte nicht so erhöht werden, daß sich auch stark sterisch gehinderte Peptide glatt bilden.

Ea handelt sich hier also um schwache Katalysatoren, deren Wirkung schon von polaren, basischen Lösungsmitteln wie z. B. Dimethylformamid erreicht wird. Das hat zur Folge, daß sie gerade in den bei der Synthese höherer Peptide meist verwendeten Lösungsmitteln keine weitere Reaktionsbeschleunigung mehr bewirken.

Eine Verbesserung brachte die Katalyse mit 2-Hydroxypyridin-Natriumsalz (DOS 2 03I 826). Schon nach einer knappen Stunde kann man auch bei sterisch gehinderten Peptiden gute Ausbeuten erzielen. Das Natriumsalz des 2-Hydroxypyridins hat jedoch den Nachteil, daß es stark basisch reagiert und bei den empfindlichen Peptidmolekülen Racemisierung bewirken kann. So konnte an Hand eines gaschromatographisehen Racemisierungstests tatsächlich gefunden werden, daß das Natriumsalz des 2-Hydroxypyridins racemisierend wii"kt.

Es wurde nun gefunden, daß die Aminolyse der aktivierten Ester vorn Phenylestertyp durch Zugabe saurer heterocyclischer N-Hydroxyverbindungen mit einem pK Wert zwischen 3,7 und 4,2 extrem beschleunigt wird, so daß Peptidsynthesen, die sonst; tagelange Reaktionszeiten benötigen, in wenigen Minuten beendet sind,

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■■■ — - '* ^-y

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Der Vergleich der Halbwertszeiten bei der Synthese von Z-Val-cyclohexylamid aus molaren Mengen Z-VaI-ONp und Cyclohexylamin unter Zusatz der verschiedenen N-Hydrcxyverbindungen mit den pK-Werten dieser Verbindungen zeigt die vom pK-Wert abhängige katalytische Wirkung der ?T-IIydroxyverbindungen besonders gut (siehe Tab. 1, experimenteller Teil).

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine geschützte Aminosäure oder ein geschütztes Peptid der Formel II

HYO HTQ

-(A-OK-ö-)_m iü-cH-d-o-R (ii)

in der V eine in der Peptidchemie übliche Aminoschutzgruppe oder den Pyroglutamylrest, Y einen niederen Alkylrest, der gegebenenfalls verzweigt und/oder durch erforderlichenfalls zweckmäßig geschützte OH-, NH₂-, SH, COOH-, CONH₂, Guanidino-,Aryl-, Imidazoyl- oder Indolylreste substituiert sein kann, bedeuten, wobei die Gruppe -NII-CHY- auch den Pyrrolidinyl-Rest bedeuten kann, R einen Di-, Tri-, Tetra- oder Pentachlorphenyl-, einen Nitrophenyl- oder einen Chlor-nitr»phenyl-rest darstellt und m.. für eine Zahl von etwa 0-10 steht, unter Zusatz einer Verbindung■der allgemeinen Formel (I)

in der X die Gruppen ^: C=O, C=S oder -N = bedeutet und in der X und N Glieder eines, ggf. an einen Benzolkern anellierten und/oder 1 oder 2 weitere Heteroatome enthaltenden 5- bis 6-gliedrigen ggf. substituierten heterocyclischen Ringes sind, und deren pK Wert in 0,5 m Lösung in einem Gemisch von 6 Teilen Diäthylenglykoldimethyläther und Ί Teilon Vlasser*.zwischen 3,7 und h, 2 liegt, mit gogobencnrnlls goschützten Aminosäuren oder Peptiden der allgemeinen Formel (III),

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HYOHYO Ι-Ν-ΟΗ-C- (N-CH-C-) W (Hl)

in der Y und der -NII-CHY-Rest die obige Bedeutung haben und m_ für die Zahlen 0 bis größenordnungsmäßig 500 steht und V" eine Hydroxygruppe, O-Alkyl, 0-Aralkyl, eine gegebenenfalls durch Alkyl, Aralkyl oder Aryl substituierte Aminogruppe oder einen ester- oder amidartig gebundenen polymeren Träger bedeutet, umsetzt und aus dem erhaltenen geschützten Peptid der Formel IV

HYOHYOHYO -N-CH-C-N-CH-C¹- (N-OH-(J-) W (iv)

HCNCC (NOH(J) ι

gegebenenfalls die Schutzgruppen ganz oder teilweise in an sich bekannter Weise abspaltet.

Der pK-Vert der Zusatzstoffe ist entscheidend für das Gelingen des erfindungsgemäßon Verfahrens. Die pK-Messung ist, wie im experimentellen Teil beschrieben, durchzuführen. Ist der pK - Wert der Verbindungen der Formel I in dem genannten System höher(wie beim N-Hydroxypiperidin) oder tiefer^ (wie beim l-Hydroxy-6-nitro-benzotriazol), so sinkt die katalytische Wirkung stark ab.

Man arbeitet im allgemeinen mit Mengen von 0,1 bis etwa 1 Äquivalent N-Hydroxylverbindung, kann jedoch auch geringere oder größere Mengen einsetzen.

Zur Katalyse geeignete Verbindungen sind unter anderem 1-Hydroxybenzotriazole, wie z. B. l-Hydroxy-5·6-dimethylbenzotriazol, l-Hydroxy-5-niethyl-benzotriazol, l-Hydroxy-6-niethylbonzotriazol, l-Hydroxy-S-methoxy-benzotriazol, 1-IIydroxy- ^-methyl-bcnzotriazol, l-IIydroxy-o-brom-benzotriazol, 1-IIydroxy-6-chlor-benzotriazol, l-Hydroxy-5-chlor-benzotriuzol, cyclische Hydroxamsäuren, wie z. B. Pyridone/l-IIydroxy-2-py.ri-

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don, l-Hydroxy-Jf-niethyl-2-pyridon (U.S. 25*10218), 1-Hydroxy-J*.6-dimethyl-2-pyridon, l-Hydroxy-3. k. 6-trimethyl-2-pyridon (BeIg. 738288) , l-Hydroxy-3· 5-dichlor-4. 6-di'methyl-2-pyridon, N-Hydroxysuccinimid oder 1-Hydroxy-2-oxo-2.3-dihydroindole wie l-Hydroxy-o-chlor^-oxo^^-dihydro-indol (j.Amer. chein. Soc. 2ÜL> Seite 222, (1956) cyclische Hydroxamsäuren mit Stickstoff als Heteroatom im Ring, wie z. B. 3-Hydroxy-4-oxo-3. U-dihydrochinazolin, 3-Hydroxy-2-methyl-4-oxo-3. '4-dihydrochinazolin, 3-Hydroxy-4~oxo-3. '4-dihydro-1.2.3-benzotriazin 3-Hydroxy-4-oxo-2-phenyl-3· 4-dihydrocliinazolin ( J. Chem. Soc. I960, Seite 2157-2160), cyclische Hydroxamsäuren mit Sauerstoff oder Schweföl als Heteroatom im Ring, wie z. B. geeignet substituierte 4-Hydroxy-3.-^-dihydro-3-oxo- 1 . h. 2-benzooxazine u. 4-Hydroxy-3·4-dihydro-3-oxo-1.k.2-benzothiazine.oder

Cyclische Thiohydroxamsäuren, wie z. B. 3-Hydroxy-4-methyl-2.3-dihydro-thiazol-2-thion können ebenfalls venvendet werden.

Als Substituenten der Verbindungen der Formel I kommen Alkyl- oder Alkoxy-reste mit 1-2 C-Atomen, Halogenatome , insbesondere ChIο r, infrage.

Die Aminokomponente III kann entweder frei oder als Salz von Mineralsäuren bzw. starken oder schwachen organischen Säuren wie z. B. p-Toluolsulfonsäure, Trifluoressigsäure oder Essigsäure eingesetzt werden. Liegt Salzbildung mit starken Säuren vor, muß zur Freisetzung der Aminogruppe eine tertiäx"e organische Base wio Triäthylamin oder N-Äthylmorpholin zugesetzt werden. Auch ein Zusatz eines Salzes dieser N-Hydroxyverbindungen, wie ss. B. das 1-Hydroxybenzotriazol-Natrium-Salz ist möglich. Hierbei wird gleichzeitig die Aminogruppe far-ei ge setzt (Na-Salz-Bildung) und die zur Katalyse notwendige 1-Hydroxyverbindung der Formel I gebildet.

Als Schutzgruppe V kommen die in der Peptidchemie gebräuchlichen N-Schutzgruppen infrage (vgl. Schröder-Lübke, The Peptides, New Yox°k und London 1965/66), Bevorzugt verwendet man Ax^alkyloxycarbonylwie z. B. Benssyloxycarbonyl- oder tex-L. -Alkyloxy-

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carbonyl- wie ζ. B. tert-Butyloxycarbonyl-Reste.

Die OH-Funktion bei Serin, Threonin oder Tyrosin kann ungeschützt bleiben. Sie kann aber auch durch geeignete Gruppen, wie z. B. tert.-Butyl- oder Benzylgruppen geschützt werden.

Zur Herstellung von Cystein- und Cystinpeptiden muß die SH-Funktion des Cysteins durch die in der Peptidchemie gebräuchlichen SH-Schutzgruppen geschützt werden, oder man führt die Reaktion an symmetrischen oder asymmetrischen Cystinpeptiden durch, die dann gegebenenfalls zu Cysteinpeptiden reduziert werden können.

W bedeutet in der Carboxyl-Komponente der allgemeinen Formel III auch einen polymeren Träger, der ester- oder amidartig mit der Carboxylgruppe verbunden ist. Als geeignete Polymere kommen in Frage ein mit 1-2 $> Divinylbenzol vernetztes Polystyrol, vernetzte Phenol-Formaldehydkondensationsprodukte vernetzte Phenoläther-Formaldehydkondensationsprodukte, mit chemisch gebundenem Polystyrol beschichtete Kunststoffoberflächen, Polybenzylharze oder phenylsubstituierte Glasoberflächen. Als geeignete Haftgruppen sind z. B. möglich: Halogenmethyl-, Halogenacetyl- oder Aminobenzhydrylgruppen.

Die Kondensation wird zweckmäßig in Lösungsmitteln wie beispielsweise Dimethylformamid, Dirne tliylacetamid, Tetramethylharnstoff oder Phosphorsäure-tris-dimethylamid, gegebenenfalls, unter Zusatz von etwas Wasser durchgeführt. Die Reaktionstemperatur liegt vorteilhaft bei O - kO , bevorzugt bei Raumtemperatur.

Die Aufarbeitung gestaltet sich einfach, da die erfindungsgemäßen N-Hydroxyverbindungen der allgemeinen Formel I, wie 1-Hydroxybenzotriazol oder 3-Hydroxy-4~oxo-3·^-dihydrochinazolin sich mit Natrium- oder Kaliumbicarbonat oder mit Sodalösung vollständig ausschütteln lassen. Andere Verbindungen, wie z. B. l-Hydroxy-2-pyridon oder 3-Hydroxy-^-methyl-2.3-dihydro-thiazol-2-thion lösen sich bereits in Wasser und

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lassen sich dadurch besonders leicht"entfernen. Aus schwer löslichen Peptidderivaten kann man auch mit Isopropanol, Alkohol, Methanol, Tetrahydrofuran oder heißem Wasser die N-Hydroxyverbindungen extrahieren. Die bei der Umsetzung entstehenden Phenole haben ähnliche Lösungseigenschafton wie dio N-Hydroxyverbindungen und werden in der Regel zusammen mit diesen entfernt.

Die weitere Reinigung erfolgt in üblicher Weise, bei niederen Peptiden z. B. durch Verteilung zwischen einer organischen und einer wäßrigen Phase, durch Umfallen oder Umkristallisieren aus einem geeigneten Lösungsmittel, oder durch Chromatographie, z. B. an "Sephadex LH-20" (vernetztes, teilweise .veräthertes Dextran-Gel) in einem organischen Lösungsmittel oder einem organisch-wäßrigen Lösungsmittelgemisch, gegebenenfalls auch als Verteilungschromatographie in nur teilweise mischbaren Lösungsmittel-Komponenten.

Bei höheren Peptiden oder Proteinen kann es vorteilhaft sein, die Reinigung erst nach Abspaltung der Schutzgruppon vorzunehmen, z. B. durch isoelektrische Fällung, Kristallisation, Gegenstromverteilung, Verteilungschromatographie, Gelchroinatographie oder präparative Elektrophorese.

Die Abspaltung der Schutzgruppen hängt von deren Natur ab und muß die Stabilität der Reaktionsprodukte der allgemeinen Formel III bzw. der diesen Verbindungen zugrunde liegenden Peptide berücksichtigen. Sie erfolgt in der aus

der Peptidchemie bekannten Weise (siehe Schröder-Lübke, loc. ext.).

Bei N-Acyl-peptid-aktivestern bewirkt der Zusatz von N-Hydroxyverbindungen der allgemeinen Formel I keine Steigerung der Racemisierung, wie an Hand des Racemisierungstestes, bekannt aus Chom. Ber. 103 (197O), Seite 788, im experimentellen Teil gezeigt wird (siehe Tab. 2, experimenbeller Teil). Sowohl beim Nitrophonyl- als auch beim Trichlox'phonylester war in diesem Racemisiorungstest mit und ohno Zusatz von N-lIydroxyverbindungen keine Racemisierung zu sehen. Anders verhielt

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sich dagegen der Pentachlorphenylester, der ein zu etwa 80 ^ racemisiertes Tripeptid lieferte. Durch Zusatz von 1-Hydroxybenzotriazol konnte dieser starke Racemisieruiigsgrad um 26 $> auf 5h ^o gesenkt werden. Bei Zusatz von 2-Hydroxypyridin-Natriumsalz, war, wie schon erwähnt, der umgekehrte Effekt zu sehen: Die Racemisierung wurde noch verstärkt.

Durch den Zusatz der erfindungsgemäßen N-Hydroxyverbindungen der allgemeinen Formel I kann man die sterische Hinderung, die manche Umsetzung mit aktivierten Estern scheitern läßt, überwinden, so z. B. bei der Umsetzung von Nps-Isoleucinaktivestern mit H-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH. Die Umsetzung von Nps-Ile-OTcp mit H-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH in Dimethylformamid läßt sich nicht zu Ende verfolgen. Nach 5 Wochen wurde der Versuch abgebrochen, da sich bereits neben Endprodukt und Ausgangsinaterial mehrere Zersetzungsprodukte dünnschichtchromatographisch nachweisen ließen. Wurde dagegen z. B. 1-Hydroxybenzotriazol, 3-Hydroxy-^-oxo-3·^-dihydrochinazolin oder l-IIydroxy-2-pyridon zugesetzt, war die Reaktion schon nach 15-20 Stunden beendet (siehe Tab. 3t experimenteller Teil)

Die enorme katalytische Kraft dieser N-Hydroxyverbindungen läßt sich auch in der Festkörperpeptidkondensationsmethode nutzbar machen. Z. B. kann man nach J. Amer. Chem. Soc. 90 (1966), Seite 2953 aus N-geschützten Aminosäuren und einem Poly-4~hydroxy-3-nitro-styrol-harz die entsprechenden unlöslichen Ester herstellen, die dann mit löslichen Aminoverbindungen zu den entsprechenden Amiden oder Peptiden reagieren. Durch Anwendung der erfindungsgemäßen N-Hydroxyverbindungen lassen sich die Reaktionszeiten stark verkürzen. Auch bei der abgewandelten Merrifield-Festkörper-Methode, bei der oft N-geschützte Aminosäureaktivester wie z. B. Nitrophenylester eingesetzt werden, erhöhen die erfindungsgemäßen Zusätze die Ausbeute und verkürzen die Reaktionszeit.

Gerade die Steigerung der Ausbeute ist bei der Festkörpermethode für den Erfolg derartiger Synthesen ausschlaggebend.

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Bei der Synthese eines sterisch stark gehinderten Pentapeptids aus der Sequenz der Insuliii-A-Kette zeigt sich der Vorteil des erfindungsgemäßen Zusatzstoffe(vgl. Beispiel 1o). Damit wurde erstmals eine Methode gefunden, durch welche die bei der Festkörpersynthese besonders hervortretende sterische Hinderung überwunden werden kann.

Das neue Verfahren ist nicht nur bei kleineren Peptiden von Vorteil. Auch große Peptide, wie das N^ ',N^ ^-Bis-Boc-Insulin (H_oppe-Seyler«s Z. physiol. Chem. 352 (1971), 7), ein kompliziertes Peptid aus 5I Aminosäuren, lassen

sich in wenigen Minuten glatt mit N-Acylaminosäure- und N-Acylpeptidaktivestern zu den entsprechenden N^ '-N-Acylaminosäure bzw. N^v '-N-Acylpeptid-N ', N^v ^'-Bis-Boc-Insulinen umsetzen.

Verbindungen der allgemeinen Formel III können auch Proteine sein, deren freie Aminogruppen ganz oder teilweise mit den Verbindungen der allgemeinen Formel II reagieren. Bei extrem ungünstigen Löslichkeitsverhältnissen bewährt sich z. B. wässriges Dimethylformamid sehr gut. Geeignete Proteine sind z. B. Gelatine, die teilweise abgebaut sein kann, Serumalbuinin oder Casein.

Nach Abspaltung der Schutzgruppen besitzen z. B. Reaktionsprodukte aus Verbindungen der allgemeinen Formel II mit N , N^ '-Bis-Boc-Insulin bei hoher biologischer Wirkung veränderte physikalisch-chemisch und immunologische Eigenschaften, die für die Herstellung neuer Insulin-Zubereitungen vorteilhaft sind. Reaktionsprodukte aus Verbindungen der allgemeinen Formel II mit Proteinen können gegebenenfalls nach Abspaltung der Schutzgruppen zur Erzeugung von Antigenen gegenüber den diesen Verbindungen der Formel II zugrunde liegenden Aminosäuren oder ^eptiden dienen.

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Als Bausteine der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Peptide kommen alle in natürlich vorkommenden Peptiden anzutreffenden Aminosäuren in ihrer L- oder D-Form infrage. A₁₁Ci₁ d±_e Verwendung von ß-Aminosäuren, wie z. ^. ß-Alanin, oder andere nur synthetisch oder halbsynthetisch zugängliche Aminosäuren, z. B. c£-Methylalanin,^-Methyl-3·^- dioxy-L-phenylalanin oder ß-Chloralanin ist möglich.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders vorteilhaft. Die langen Raktionszeiten, die bisher in vielen Fällen erforderlich waren, werden auf wenige Minuten herabgesetzt. Dies gilt z. B. als besonderer Vorteil für die Nitrophenylestermethode, die eine der meist verwendeten Peptidkondensationsmethoden darstellt.

Vor allem bei der industriellen Herstellung von Peptiden bedeutet das erfindungsgemäße Verfahren einen großen Fortschritt, da die in der Zeiteinheit durchgesetzte Menge außerordentlich stark erhöht werden kann.

Es ist ferner einbesonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß die Katalyse durch die erfindungsgemäßen N-Hydroxyverbindungen vor allem in den oben genannten stark polaren Lösungsmitteln voll zur Geltung kommt, die wegen ihrer guten Lösungseigenschaften allein für die Synthese höherer Peptide infrage kommen.

Die nach diesem Verfahren hergestellten Peptide können nach Abspaltung der Schutzgruppen als Therapeutica Verwendung finden oder als Z\\rischenprodukte zur Herstellung anderer therapetitisch wertvoller Peptide, wie z. B. Oxytocin, Vasopressin, Glucagon, Secretin, ACTH, Thyrocalcitonin, Gastrin, TRH, LR oder Insulin eingesetzt werden.

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- ΛΛ -

In der Beschreibung und in den Beispielen werden die Aminosäuren nach den international gültigen Regeln abgekürzt. Außerdem werden folgende Abkürzungen verwendet:

Bo c	tert.-Butyloxycarbonyl-
Z	Benzyloxycarbonyl-
Np s	o-Nitrophenylsulfenyl-
OBu*	tert t-Butylester
OMe	Methylester
OBzI	Benzylester
ONp	p-Nitrophenylester
OTcp	2.h.5-Trichlorphenylester
OPcp	Pentachlorphenylester
OSu	N-Hydroxysuccinimidester
Trt	Trityl-
Bu*	tert.-Butyl-
Mbh	k.k^x -Dimethox3'-benzhydryl
CHA	Cyclohexylamin

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Beispiele

Beispiel 1:

Ermittlung der Halbwertszeit bei der Synthese von Z-VaI-cyclohexylamid aus molaren Mengen Z-VaI-ONp und Cyclohexylamin unter Zusatz verschiedener N-Hydroxyverbindungen und die Abhängigkeit der Halbwertszeit vom pK-Wert der N-Hydroxyverbindungen.

a) Festlegung der Halbwertszeit

Lösung I: O.5 nMol Cyclohexylamin, 0.5 nMol p-Nitrophenol und 1.0 nMol N-Hydroxyverbindung pro ml Dimethylformamid.

Lösung II: 1.0 nMol p-Nitrophenol pro ml Dimethylformamid Lösung III: 1.0 nMol N-Hydroxyverbindung pro ml Dimethylformamid.

Die UV-Kurven (Bereich 330-300 m) der Lösungen I, II und III werden miteinander verglichen, um die günstige Wellenlänge für die Messung des p-Nitrophenols herauszufinden. Bei dieser Wellenlänge wird die Extinktion gemessen. Zu dem von Lösung I erhaltenen Wert werden 50 $ dei" Extinktion einer Lösung von 1 nMol Z-VaI-ONp und 1 nMol Triäthylamin pro ml Lsgm. bei der oben gewählten Wellenlänge addiert. Die Summe dieser beiden Extinktionen repräsentiert die Extinktion bei der sich die Hälfte des Z-VaI-ONp mit dem Cyclohexylamin umgesetzt hat.

Die UV-Kurven wurden an einem '-'Beckmann TK 1A"-Apparat bei 21 gemessen. Die Substanzen waren in Dimethylformamid gelöst .

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b) Messung der Halbwertszeit

Zur kinetischen Messung der Halbwertszeit t 1/2 wird eine Lösung von 1 nMol Z-VaI-ONp, InMoI Cyclohexylamin und 1 nMol N-Hydroxyverbindung pro ml Lösungsmittel bei der unter a) bestimmten Wellenlänge gemessen. Die Zeit, in dem die unter a) festgelegte Extinktionshöhe erreicht wird, entspricht der Halbwertszeit der Reaktion.

c) Messung der pK-Werte in 0.5 m Lösung (Diäthylenglykoldi- methyläther/Vasser wie 6; h) bei 30

0.5 mMol Substanz werden in einer Mischung aus 6 ml Diäthylenglykoldimethyläther, 2.5 ml O.ln NaOH und 1.5 ml Wasser gelöst und im Thermostat auf 30 erwärmt. Mittels einer EinStab-Glaselektrode wird potentiometrisch der pH-Wert gemessen. Nach der Näherungsformel pH - pK = Ig <ii/l-ct ist für ot= 0.5: pK = pH.

Der oben gemessene pH-Wert stellt also den pK-Wert dieser Verbindung dar.

d) Tabelle 1:

Vergleich der Halbwertszeiten bei der Synthese von Z-VaI-cyclohexylamid aus molaren Mengen Z-VaI-ONp und Cyclohexylamin mit den pK-Werten der zugesetzten N-Hydroxyverbindungen.

Verbindung pK t /„(Min.)

ohne Zusatz

N-IIydroxypiperidin

l-IIydroxy-'l-methyl~6-isopropyl-2-pyridon 3- Hydroxy -2 -methyl- h -oxo- 3· 'f—dihydrochinazolin

3-IIydroxy-'l-oxo-3. 'i-dihytlroxy-chinazolin l-lIydroxy-3. h . 6- triinethyl-2-pyx*:idon l-\\yuroxy ~h. 6-diinethyl-2-pyrJ don l-llydroxy-.-'l-methyl-2-pyridon 1 --Hydroxy- '.'_ -pyi- idoi> 3-llydroxy-'l-mo thy 1-2 . 3-d:L}iydroxy-tli Lazo J -

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—	112.0
5.9	125.0
h.ik	19.0
i\|.11	1.9
^t. 10	ca.0.25
^. 09	1-Ί.8
4.09	5.9
h.O8	3.2
k . 08	1.3
^i. 08	1.5

Verbindung pK t^ ^₂(Min.)

2-thi.oji

l-HydroxyOö-dichlor-^t.o-dimethyl- 4.05 4.0 2-pyridon

l-Hydroxy-2-oxo-2.3-dihydro-6-chlor- 4.05 1-5 indol

Essigsäure (zum Vergleich) 4.05 6θ.Ο

N-Hydroxysuccinimid 4.04 4.8

l-Hydroxy-5·6~dimethyl-benzotriazol 4.02 2.1

l-Hydroxy-5-methyl-benzotriazol 4.02 2.8

l-Hydroxy-6-methoxy-benzotriazol 4.00 2.0

l-Hydroxy~5-niethoxy-beiizotriazol 4.00 "},6

l-Hydroxy-4-methyl-benzotriazol 4.00 3.0

1-Hydroxy-benzotriazol 4.00 3·5

3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3- 4.00 18.0 benzotriazin

l-Hydroxy-6-broDi-benzotriazol 3· 91 8.9

l-llydroxy-ö-chlor-benzotriazol 3« 90 10.6

l-Hydroxy-5-chlor-benzotriazol 3.89 I3.Q

l-Hydroxy-6-trifluormethyl-benzotriazol 3· 72 39.0

l-Hydroxy-5.6-dichlorbenzotriazol 3· 7 35.0

l-Hydroxy-6-nitro-benzotriazol 3*51 sehr lang sam

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Beispiel 2;

Gaschromatοgraphiseher Kacemisierungstest nach. F. ¥eygand et. al.(Chem. Ber. 22. (^966), Seite 1^51-1^60; Chem. Ber. 103 (1970), Seite 788-798)

I. Herstellung der Ausgangsprοdukte

a) HBr»H-Phe-0Np

k.2 g Z-Phe-ONp werden in 10 ml Eisessig suspendiert. Dazu gibt man 10 ml ges. HBr/Eisessig und rührt eine Stunde bei Raumtemp. Danach fällt man das Hydrobromid mit viel Äther aus und wäscht gut mit Äther nach. Ausb. 3· 5 g» Schmp. 216-219°.

b) HBr«H-Phe-OPcp

5.^7 e Z-Phe-OPcp werden analog Ia behandelt. Ausb. 4.1 g, Schmp. 205° u. Zers.

c) HBr'H-Phe-OTcp

g Z-Phe-OTcp werden analog Ia behandelt. Ausbeute h,2 g, Schmp. 220 u. Zers.

d) Boc-Leu-Phe-ONp

2.^9 g Boc-Leu-OH·1 HpO werden in Essigester gelöst. Der Essigester wird mit Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und der Rückstand am Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wird in 20 ml absolutem Tetrahydrofuran gelöst und die Lösung auf -10 abgekühlt. Unter Rühren läßt man nun bei Eiskühlung 1.2 ml N-Ätnylmorpholin und anschließend eine Lösung von 1.27 g Chlorameisensäureisobutylester in wenig kaltem Tetrahydrofuran zutropfen. Man rührt 10 Minuten bei -10 , gibt dann 3.35 e HBr'H-Phe-ONp zu und läßt langsam eine Lösung von 1.2 ml N-Ätbylniorpholin in 5 ml Tetrahydrofuran zutropfen. Man läßt noch 1 Stunde bei 0 und 1 Stunde bei Raumtemperatur nachrühren, saugt vom Niederschlag ab, engt das Filtrat ein und verreibt dan Rückstand mit Isopropanol. Ausb. 3·77 g» Schmp. 15O~152 . Nach Umkristallisation aus Isopropanol:

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Ausbeute 3.10 g, Schmp. 152-153°, Δ^ζ = -32.2° (c = 1, in Dimethylacetamid).

e) Boc-Leu-Phe-OPcp

Aus 1.97 g Boc-Leu-OH·1 HO, 0.93 ml N-Äthylmorpholin und 1,0 g Chlorameisensäureisobutylester wurde analog Id das gemischte Anhydrid hergestellt, das analog Id mit 3*55 g HBr*H-Phe-OPcp und 0.93 ml N-Äthylmorpholin umgesetzt wurde. Ausb. 3·35 Bt Schmp. 1^5-1^7-· Nach Umkristallisation aus Isopropanol: Ausb. 2.11 g, Schmp. 163-16^°, £oC_J-q = -29.1° (c = 1, in Dimethylacetamid)

f) Boc-Leu-Phe-OTcp

Aus 2.3 g Boc-Leu-OH'l HO, 1,1 ml N-Äthylmorpholin und 1*17 g Chlorameisensäureisobutylester wurde analog Id das gemischte Anhydrid hergestellt, das analog Id mit 3.6 g HBr«H-Phe-OTcp und 1.1 ml N-Äthylmorpholin umgesetzt wurde. Ausb. 3*7 g» Schmp. 1^3-1^5 · Nach Umkristallisation aus Isopropanol: Ausb. 3.2 g, Schmp. 150-151°, /~a£_7 = - ^8.4° (c = 1, in Dimethylacetamid)

II. Allgemeine Vorschrift zur Herstellung von Boc-Leu-Phe-

t
VaI-OBu aus den Boc-Leu-Phe-Aktivestern

Zu einer Lösung von 105 mg (0.5 mMol) HClΊΙ-Val-OBu in 2.5 ml 0.2 m N-Äthylmorpholin/Dimethylacetamid-Lösung gibt man den katalysierenden Zusatz (l-Hydroxybenzotriazol oder 2-Hydroxy-pyridin-Natriumsalz) und 0.5 mMol des entsprechenden Boc-Leu-Phe-Aktivesters (25Ο mg Boc-Leu-Phe-ONp, 313 mg Boc-Leu-Phe-OPcp,279 mg Boc-Leu-Phe-OTcp). Man läßt die in Tabelle 2 angegebene Zeit stehen, verdünnt mit 50 ml Essigester, schüttelt die Essigesterlösung mit NaIiCO -Lösung, KHSO.-Lösung, NaHCO -Lösung und NaCl-Lösung aus, trocknet mit Natriumsulfat und engt ein.

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Der Rückstand wird analog Chem. Ber. 103 (197O), Sexte 788-798 und Chem. Ber. <?£ (1966), Seite I.45I-1U6O partialhydrolysiert, trifluoracetyliert und gaschromatographiert, Die Ergebnisse der gaschromatograpliischen Racemisierungs. ermittlung sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

III. Tabelle 2;

Racemisierungsuntersuchungen bei der Synthese von Boc-Leu-Phe-Val-OBu* aus Boc-Leu-Phe-Aktiv-

estern und H-VaI-OBu unter dem Einfluß von Acylierungskatalysatoren

Mol-Äquiv. Reaktions-

Aktivester	Katalysator	Katalysator	zeit	% D-Phe-L-Val
ONp			70 Stdn.	< 2 <$>
ONp	2-Hydroxy- pyridin-Na	1.0	1 Stdn.	3.7 #
ONp	1-Hydroxy- benzotriazol	1.0	5 Min.	<2 i
ONp	1-IIydroxy- benzotriazol	0.1	5 Min.	*{2 <$>*
OTcp			70 Stdn.	<2 *
OTcp	2-Hydroxy- Pyridin-Na	-	1 Stde.	<2 $>
OTcp	1-Hydroxy- benzotriazol	1.0	5 Min.
OPcp			70 Stdn.	*ho <fo*
OPcp	2-Hydroxy- pyridin	1.0	1 Stde.	*ko io*
OPcp	2-IIydroxy- beiizotriazol	1.0	5 Min.	27 $>
OTcp	3. ^-dihydro- chin a ζ ο Hn	oxo-1.0	JO Min.	<**
OTcp	3-IIydroxy-?- uio lh y 1 -- Ί - ο χ ο	1.0	10 Min.

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Mol-Äquiv. Reaktions- t^U/D I J Aktivester Katalysator Katalysator zeit $ D-Phe-L-Val

3.4-dihydrochinazolin

OTcp l-Hydroxy-2- 1.0 10 Min. <2 pyridon ι

Beispiel 3;

Synthese von Np.s~Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-0H

a) Herstellung der Nps,-Ile-aktivester

Rückstand wird aus Isopropanol umkristallisiert.

,o

Molare Mengen Nps-Isoleucin und Trichlorphenol bzw. N-Hydroxysuccinimid werden in Essigester bei 0 mit einem leich¹ Überschuß Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) umgesetzt. Man läßt eine Stunde bei 0 , dann 3 Stdn. bei Raumtemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab und engt das Filtrat ein. Der Rückstand wird aus Isoprop;
Nps-Ile-OTcp, Schmp. 95-97*
Nps-Ile-OSu, Schmp. 105-108°

b) Nps-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH

2.9 S (5 niMol) H-Cys(Trt)-Ser-Leu-0H'H₂0 (hergestellt nach Chem. Ber. 103 (197O), Seite 2039) und 8I5 mg (5 mMol) 1-Hydroxy-5.ö-dimethyl-benzotx'iazol werden in 25 ml Dimethylformamid gelöst. Dazu gibt man 2.32 g (5 mMol) Nps-Ile-OTcp und läßt 15 Stunden bei Raumtemperatur stehen. (Nach dieser Zeit konnte das Ausgangstripeptid nicht mehr dünnsichtchromatographisch nachgewiesen werden). Das Dimethylformamid wird im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit Natriumbicarbonatlösung verrieben. Der Niederschlag wird abgesaugt und das Filtrat verworfen. Der Niederschlag" wird im Essigester gelöst und mit KHSOi-Lösung und Wasser ausgeschüttelt, mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird mit Äter· verrieben. Das Produkt ist amorph. Ausb. 3.6 g (82 %) , rcLj^- -23.5° (c-1, in D iniei hylacetamid)

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c) Dünnschichtchromatofcraphische Überprüfung der Synthese von Nps-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH aus Nps-Ile-OTcp bzw.Nps- lle— OSu und H-Cys(Trt)-Ser-Leu-0H unter Verwendung verschiedener N-Hydroxyverbindungen als Katalysator

Zu einer Lösung von 116,3 mg (0.2 mMol) H-Cys(Trt)-Ser-Leu- ΟΗ·Η₂Ο in 2 ml Dimethylformamid gibt man 0.2 mMol der N-Hydroxyverbindung und 111 mg (0.22) Nps-Ile-OTcp bzw. 89«2 mg (0.2*1 mMol) Nps-Ile-OSu. In verschiedenen Zeitabständen wird ein Tropfen der Reaktionslösung auf eine Dünnschicht-Kieselgelplatte (Merck, "Kieselgel F 25^") aufgetragen. Man läßt in einer* Mischung Methylenchlorid/Methanol wie 8:2 laufen und entwickelt mit Ninhydrin. In der Tabelle 3 sind die Ergebnisse dieser Untersuchung zusammengefaßt.

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d) Tabelle 3:

Synthese von Nps-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH aus Nps-Tle-OTcp bzw. Nps-Ile-OSu und H-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH unter Verwendung verschiedener N-Hydroxyverbindungen als Katalysatoren

Ester N -Hydroxyverbindung

Ende der Reaktion (Reaktionszeit)

OTcp OTc ρ OTcp OTcp OTcp OTcp OTcp

OTcp OTcp

3-Hydroxy-^-oxo-3.4-dihydrochinazolin

1-Hydroxybenzotriazol

3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydrochinazolin

nach 5 Wochen abgebrochen, da noch keine vollständige Umsetzung festzustellen war.

ca. 15 Stunden ca. 15 Stunden

3-Hydroxy-2-methyl-4-oxo-3.^- ca. 7 Tage dihydro-chinazolin

3-Hydroxy-4-oxo-2-phenyl--3. h- ca. 7 Tage dihydro-chinazolin

l-Hydroxy-5.6-dimethyl-benzo- ca. 20 Stunden triazol

l-Hydroxy-2-pyridon

ca. 20 Stunden

l-Hydroxy-4-methyl-2-pyridon ca. 20 Stunden

l-IIydroxy^.^-dimetliyl^- ca. k Tage pyridon

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Synthese von Z-Phe-Val-OMe

a. Mit einem Äquivalent l-Hydroxybenzotriazol und Z-Phe-OPcp

Zu einer Lösung von 0.92 g (5.5 mMol) HClΉ-Val-OMe, O.72 ml N-Äthylmorpholin und 675 mg (5 mMol) 1-Hydroxybenzotrlazol in 10 ml Dimethylformamid gibt man 2.75 g (5 mMol) Z-Phe-OPcp, Man rührt 5 Minuten, engt im Hochvakuum ein, verteilt den Rückstand zwischen Essigester und 2n Sodalösung, schüttelt ein mal mit KHSO.-Lösung, drei mal mit 2n Sodalösung und ein mal mit Wasser aus, trocknet mit Natriumsulfat, engt ein und verreibt den Rückstand mit Petroläther. Ausb. 2.08 g, Schmp. 99-104 . Nach Umkristallisation aus Essigester/Petroläther: Ausb. 1.7 g (83 #), Schmp. 112-114°.

b. Mit 0.1 Äquivalent l-Hydroxybenzotriazol und Z-Phe-OTcp

Zu einer Lösung von 0.92 g (5.5 mMol) HCl·H-VaI-OMe, 0.72 ml N-Äthylmorpholin und 67·5 mg (0.5 mMol) 1-Hydroxybeiizotriazol in 10 ml Dimethylformamid gibt man 2.4 g (5 mMol) Z-Phe-OTcp. Man rührt 5 Minuten und arbeitet wie bei a) auf Ausb. 1.66 g (81 %), Schmp. 112-114°.

c. Mit einem Äquivalent 1-Hydroxybenzotriazol-Natriunisalz und Z-Phe-ONp

Zu einer Lösung von O.92 g (5.5 mMol) HCl-H-VaI-OMe in 10 ml Dimethylformamid gibt man 865 mg (5·5 mMol) l-Hydroxybenzotriazol-Natriumsalz und 2.1 g (5 mMol) Z-Phe-ONp. Man rührt 5 Minuten und arbeitet wie bei Versuch a) auf Ausb. I.65 g (80 %), Schmp. 116°.

Beispiel ^r)i Synthese von Z-Val·-VaI-OMe

Zu einer Lösung von 0.92 g (5.5 mMol) HCl·H-VaI-OMe in 10 ml Dimethylformamid gibt man 865 mg (5·5 mMol) 1-Hyd.roxybenzotriazol-NatrJumsalü und 1.87 g (5 mMol) Z-VaI-ONp. Man rührt 5 Minuten und arbeitet wie bei. Hei.spiel '¹I z\ auΓ. Ausb. 1.66 g (91 ί'), Schmp. 108-110°.

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Synthese von Z-Leu-GlufORu*)-Asn(Mbh)-Tyr (B^) -OH (Sequenz aus der Insulin-A-Kette)

I. Z-Leu-Glu(O]3u^t)-Asn(Mbh)-Tyr(Bu^t)-0H

Zu einer Lösung von 1»53 S (² mMol) H-GIu(OBu )-Asn(Mbh)-Tyr (Du )-OH und 27O mg 1-Hydroxybenzotriazol (2 mMol) in 5 ml Dimethylformamid gibt man 1.5 g Z-Leu-OPcp (2.2 mMol), läßt 10 Minuten stehen und engt im Hochvakuum ein. Der Rückstand wird mit 2n Sodalösung verrieben. Die Sodalösung wird abdekantiert und der Rückstand mit Wasser verrieben. Nun wird abgesaugt und das Filtergut zwischen einer 2.5-proz. KHSO.-Lösung und Essigester verteilt.· Die Essigesterlösung wird getrocknet, und eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther/ Petroläther (l:l) verrieben und abgesaugt. Ausb. 1.8 g (89 $) Schmp. 17^-176°.

Diese Verbindung ist dünnschichtchromatographisch identisch mit einer Probe, die analog mit Z-Leu-OSu hergestellt worden war. Die Reaktionszeit war Zk Stunden und die Ausbeute 8^ ^.

Zum gleichen Ergebnis gelangt man bei Verwendung von

a) 3-Hydroxy-'f-oxo-3 > ^-dihydrochinazolin

b) 1-Hydroxy-5>6-dimethyl -benzotriazol oder

c) von 1-Hydroxy-pyridon an Stelle des oben verwendeten 1-Hydroxybenzotriazols.

IJ. Herstellung der Ausgangssubstanz H-GIu(OBu )-Asn(Mbh)-Tyr(Bu^)-OH

a) Z-Asn(Mbh)-TyrfBi^)-OH

100 g Z-Asn(Mbh)-Tyr(Bu^t)-OMe (0.I38 Mol) (Chein. Ber. 103, O97O), Seiten 20^ll-205l) werden in einer Mischung aus 770 ml Dioxan und 200 ml Wasser suspendiert. Bei 37 läßt man langsam 138 ml In NaOlI zutropfen (Thymolphthalein als Indikator). Nach beendeter Reaktion säuert man mit 300 ml 2n Zitronensäure an. Das ausfallende Produkt wJ rd abgesaugt und mit. Wasser gewä sehen. Aus Metlianol/lVassor wird umgefüllt. Ausb. H8g (90 "/o) Snliinp. 212-213°, /j^Jj = + 7.6° (c =: 1, in DimetliyJ-

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f ormamid) .

b) H-Asn(Mbh)-Tyr(Bu ^t)-OH

Durch eine Lösung von 87.5 g (O.I23 Mol) Z-Asn(Mbli)-Tyr (Bu )-OH in Eisessig, der etwas Pd(OH) ,,/BaSOr-Katalysator zugesetzt wird,gleitet man so lange Wasserstoff bis keine COp-Entwicklung feststellbar ist. Man engt ein und verreibt den Rückstand gründlich mit gesättigter Natriumacetat-Lösung. Maxi saugt ab, trocknet über P„0_ und fällt aus Tetrahydrofuran/Petroläther um. Ausb. 63.5 g (90 $>) , Schmp, 207-209°, £*ij-^ = + 11·1 (c = 1, in Eisessig).

c) Z-GIu(OBu^t)-Asn(Mb)Q-Tyr(Bu^t)-OH

Zu einer Lösung von 63 g (O.IO9 Mol) H-Asn(Mbh)-Tyr(Bu )-0H in 25Ο ml Dimethylformamid gibt man bei Räumtemperatur k-J.h g (O.IO9 Mol) Z-GIu (OBu¹)-OSu und läßt 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Danach wird die Substanz mit Wasser ausgefällt über P_?0 getrocknet und aus Essigester/Petroläther umgefällt. Ausb. 75.5 g (77 $) , Schnip. 166-170°, 2f^_7_T) = + 1.8 (c = 1, in Dimethylformamid).

d) H-GIu(03u^t)-Asn(Mbh)-Tyr(Bu ^t)-OH

7^.7 g (83.3 mMol) Z-Glu(OBu^t)-Asn(Mbh)-Tyr(Bu^t)-OII werden in einer Mischung aus 4θΟ ml Eisessig und hOO ml Methanol gelöst und wie bei b_) katalytisch hydriert und aufgearbeitet. Zur Reinigung wird die Substanz einmal mit Wasser aufgekocht, abgesaugt und getrocknet. Durch Aufkochen mit Essigester kann die Substanz noch weiter gereinigt werden. Ausb. 53·^ g (81* i>), Schnip. 221-223°, C^J^? _Ώ = + 33-1° (c = 1, in Eisessig)

Beispiel 7;

Synthese von Z-Gln-Glv-Leu-Val-MI

(Sequenz aus Secretin)

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-Zk-

a) Z-LeU-VaI-NH₂

Zu einer Lösung von 13 g HBr*H-VaI-NH (66 mMol) in 180 ml Dimethylformamid gibt man 8.91 S 1-Hydroxybenzotriazol, 8.6 ml N-Äthylmorpholin und 30.8 g (60 mMol) Z-Leu-OPcp. Man rührt 10 Minuten bei Raumtemperatur und engt anschließend im Hochvakuum ein. Der Rückstand wird nacheinander mit 2n Sodalösung, Wasser 2.5-proz. KHSOjL-Lösung und Wasser verrührt, abgesaugt und bei 50 über P.O getrocknet. Ausb. 21.3 g (98 $>).

Zum gleichen Ergebnis gelangt man bei Verwendung von

a) 3-Hydroxy-U-oxo-3» 4-dihydrochinazolin

b) 1-Hydroxy-5»6-dimethyl -benzotrlazol oder

c) von 1-Hydroxy-pyridon an Stelle des oben verwendeten 1-HydroKybenzotriazols.

b) HCl-H-LeU-VaI-NH₂

Zu einer Suspension von 21 g (57.8 mMol Z-LeU-VaI-NH₂ in einer Mischung aus 200 ml Dimethylformamid und 200 ml Methanol gibt man Pd(0H)₂/BaS0.- Katalysator. Unter Rühren leitet man durch diese Reaktionsmischung Wasserstoff, wobei durch Zutropfen von In methanolischer HCl-Lösung mit Hilfe eines Autotitrators pH 5 gehalten wird. Nachdem keine HCl-Lösung mehr aufgenommen wird, wird der Katalysator abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben, abgesaugt und bei 50 getrocknet. Ausb. 15.4 g (lOO %), Schmp. 138-l4O . Dünnschichtchromatographisch einheitlich.

c) Z-Gly-Leu-Val-NH₂

15·^ g (57.8 mMol) HCl'H-LeU-VaI-NH₂ werden mit 7.52 ml N-Äthylmorpholin und 7«88 g 1-Hydroxybenzotriazol in 120 ml Dimethylformamid gelöst. Dazu gibt man 22.5 g Z-Gly-OTcp, läßt 5 Minuten stehen und engt im Hochvakuum ein. Der Rückstand wird mit 2n Sodalösung verrieben, abgesaugt und gut mit Wasser gewaschen. Man trocknet über V~0 und kocht dann mit Essigester auf. Zur Reinigung kann aus Tetrahydrofuran/ Petroläther uingefällt werden. Ausb. 21.8 g (90 $>) , Schmp.

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18^-186°, /"cc 7 = -12.8 (c = 1, in Dimethylacetamid)

d) HCl*H-Gly-Leu-Val-NH₂

20.Ö g (47.6 mMol) Z-Gly-Leu-Val-NH werden wie bei b) in 200 ml einer Methanol/Dimethylformamid-Mischung (l : l) katalytisch hydriert und aufgearbeitet. Die Substanz ist etwas hygroskopisch und wird zur Reinigung aus Methanol/ Xther umgefällt. Getrocknet wird über P₂ ⁰E ^{und Para:ffln}schnitzel. Ausb. 13·5 g (88 #), Schmp. 209-211°.

β) Z-Gln-Gly-Leu-Val-NH

Zu einer Lösung von 3.23 g (lO mMol) HCl'H-Gly-Leu-Val-NH₂, 1.3 ml N-Äthylmorpholin und I.35 g (lO mMol) 1-Hydroxybenzotriazol in 20 ml Dimethylformamid gibt man h g (lO mMol) Z-GIn-ONp und läßt 10 Minuten stehen. Es fällt eine Gallerte aus. Mit Xther wird verdünnt und die ausgefallene Substanz abgesaugt. Nun wird kurz getrocknet und mit 2n Sodalösung verrührt. Mit Wasser, KHSO.-Lösung und Wasser wird gewaschen, über P₂ ⁰E getrocknet und mit Essigester aufgekocht. Man läßt auf Raumtemperatur abkühlen, saugt ab und wäscht mit Essigester und Petroläther nach. Bei 40-50 wird über P₂ ⁰- und Paraffinschnitzel getrocknet. Ausb. 5 S (91 $)1 Schmp. 242°-2^4°, ßQ^ = -25.2° (c = 1, in Eisessig)

Zum gleichen Ergebnis gelangt man bei Verwendung von

a) 3-Hydroxy-4-oxo-3iU-dihydrochinazolin

b) 1-Hydroxy-5,6- dimethyl-benzotriazol oder

c) von 1-Hydroxy-pyridon an Stelle des oben verwendeten 1-Hydroxybenzotriazols.

Beispiel 8t

Synthese von Z-Pro-Ile-Gly-NH«

a) Z-IIe-GIy-NH₂

hk.k s (O.l Mol) Z-Ile-OTcp und 11 g (O.l Mol) HClTI-GIy-NH₂ worden zusammen mit 1.6 g (lO mMol) 3~Hydroxy-*l~oxo-3. *f-dihydrochinazolin und I30 ml N-Äthylmorpholin in 7ΟΟ-8ΟΟ ml

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Dimethylformamid gelöst. Danach wird im Hochvakuum eingeengt und der Rückstand mit Natriumbicarbonat-Lösung verrieben, abgesaugt, mit Wasser gewaschen, getrocknet und zur weiteren Reinigung in Dimethylformamid gelöst und mit einer Mischung aus Äther/Petroläther (l:l) gefällt. Ausb. 28.5 g, Schmp. 202°, /=L/_D = +8.1° (c=l, Dimethylacetamid)

C₁₆H₂ N₃O₂₊ (321.4) Ber. C 59.80 H 7.21 N I3.O8

Gef. 59.6 7.2 12.8

b) Z-Pro-Ile-Gly-NH₂

Zu einer Lösung von 20 g (62.2 mMol) Z-IIe-GIy-NH₀ in 600 ml Methanol/Dimethylformamid (3^^) gibt man etwas Pd(OH)₂/BaSO^-Katalysator. Unter Rühren leitet man durch diese Reaktionsmischung Wasserstoff, wobei durch Zutropfen von In methanolischer HCl mit Hilfe eines Autotitrators pH Ί.5 gehalten wird. Nachdem keine HCl-Lösung mehr aufgenommen wird, wird der Katalysator abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird in 100 ml Dimethylformamid gelöst. Dazu gibt man 23 g (62 mMol) Z-Pro-ONp, 8.1 ml N-Äthylmorpholin und I.5 g (9·^ mMol) 3-Hydroxy-4-oxo-3·4-dihydrochinazolin. Man rührt I5 Minuten und engt anschließend am Hochvakuum ein. Der Rückstand wird mit Essigester aufgenommen und gekühlt. Es fällt ein Niederschlag aus, der abgesaugt und nacheinander mit Natriumbicarbonat-Lösung, 2n HCl und Wasser verrieben wird. Nun wird getrocknet und zur weiteren Reinigung gut mit Essigester verrieben, abgesaugt und getrocknet. Ausb. 20.7 E (^8o #)t Schmp. 182-18U , = -63.2° (c = 1, Methanol)

Zum gleichen Ergebnis gelangt man bei Verwendung von

a) 1-Hydroxy-4-methyl-2-pyridoii

b) 1-Hydroxy-6-methoxy-benzbtriazol oder

c) 1-Hvdroxy-5-methyl-benzotriazol an Stelle des oben verwendeten Chinazolin-derivates.

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Synthese von Z-Asp(OBu )-PIie-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr

I. Herstellung der Aus gangs sub stanz CH COOH'H-Phe-Val-Gln-

■:. Trr>-Leu-Ile-Asn-Thr(Bu )-0Bu

a) Z-Asn-Thr(Bu^t)-OBu^t

U2.85 g (16I mMol) Z-Asn-OH, 43 g (I6I mMol) öliger HCl·H-Thr(Bu )-0Bu (gewonnen durch katalytische Hydrierung von Z-Thr(Bu )-OBu unter Zugabe von methanolischer HCl bei einem pH von h.$) und 21.75 S (161 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol werden in 325 ml Dimethylformamid gelöst. Dazu gibt man 21 ml N-Äthylmorpholin und bei 0 eine kalte Lösung von 35·^5 S Dicyclohexylcarbodiimid in 80 ml Dimethylformamid. Man läßt 1 Stde. bei 0 und 1 Stde. bei Raumtemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab und engt das Filtrat im Hochvakuum ein. Der Rückstand wird zwischen Essigester und NaH^O,,-Lösung verteilt. Die organische Phase wird mit 2.5-proz. KHSO.—Lösung, ges, NaIIC(X- Lösung und Wasser ausgeschüttelt, tu Ί t Nat x'itim sulfat getrocknet und eingeengt. Mit Petrolätlit-r wij?d verrieben und abgesaugt. Ausb. 65·8 g, Schmp« 110-115* . Aus Essigester/Petroläther wird umkristallisiert. Ausb. 52 Λ s (68 #) , Schmp. 120-122°, /öoj^ - - 7.6° (c = 1, Methanol)

b) HCl^tH-Asn-Thr(Bu^t)-OBu^t

Zu einer Lösung von kh.J g (93.2 mM_ol) Z-Asn-Thr(Bu )- OBu* in 3OO ml Methanol gibt man etwas Pd(O¹O₂/^1361801*- Katalysator. Unter ^Kühren leitet man durch diese Reaktionsmischung Wasserstoff, wobei durch ^utropfen von In methanolischer ^salzsäitre mit Hilfe eines -^utctitratoi's pH h. 5 gehalten wird. Nachdem keine ^'l-Lüsung mehr aufgenommen wird, wird der Katalysator abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wizxl in ^Ather gelöst, von venig U_nIOs].ichem filtriert und über

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Nacht in den Eisschrank gestellt.

Anderntags wird der ausgefallene Niederschlag abgesaugt und mit Äther gewaschen. Ausb. 33«65 g (95·6 $), Schmp. 11°-113°, LyL_/^ = -2.6° (c = 1, Methanol) ^C16^H32^N3°5^C1 (382)Ber. C 50.32 H 8.^5 N 11.Ol

5O.O 9.O 1O.9

c) Z-ile-Asn-Thr(^Bu^t)-OBu^t

Zu einer Lösung von 21.8 g (82 mM_ol) Z-IIe-OH, 31,3 E (82 mMol) Hci«H-Asn-Thr(Bu^t)-OBu^t, 11.1 g 1-Hydroxybenzotriazol und 10.7 ml N-Äthylmorpholin in I50 ml Dimethylformamid gibt man bei 0 eine kalte Lösung von I8.I g Dicyclohexylcarbodiimid in 70 ml Dimethylformamid. M_an läßt 1 ^tde. bei 0 und eine S^de. bei Raumtemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab und engt das ^iltrat ein. Man arbeitet wie bei a. auf. Das resultierende Produkt wird in I50 ml Essigester gelöst, von Unlöslichem filtriert und in 75^ ^ml etroläther eingerührt. A_usb. ^2«27 g (67 #) ,

Sclimp. M-lk6°, loLJ\ - -2O.5⁰ (c = 1, Methanol) ^C3O^H48^N4°8 (592.75) ^Ber. C 60,82 H 8,15 N 9.^6

Gef. 6O.9 8.4 9.2

d) HC₁.H-He-Asn-Thr (Bu^t ) -OBu*

38.6 g (65.2 m^Mol) Z-¹Ie-ASn-^lIr(³U*J-OBu* werden wie bei b in ^ethanol katalytisch hydriert, ^ie Substanz ist ätherlöslich .und ergibt am Hochvakuum ein amorphes Produkt. Ausb. 33.2 g (1OO #) , Jj*~J^ = +5.9° (c = 1, Methanol)

C₂₂H₂₁₃ClN₄O₆ (495.O7) Ber. C 53.37 H 8.76 N 11.31

Gef. 53.0 9.O IO.9

e) Z-Leu-Ile-Asn-Thr(Bu*)-OBu*

Zu einer Lösung von l6.h g (6I.8 mMol) Z-Leu-OH,

3O.6 g (6I.8 niMol) HCl'II-Ile-Asn-Thr(Bu*)-OBu^t, 8.34 g 1-Hydroxybenzotriazol und 8.1 ml N-Äthylmorpholin in 150 ml Dimethylformamid gibt man bei 0 eine kalte Lösung von 13.6 g Dicyclohexylcarbodiimid in 60 ml Di-

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methylformamid. Man läßt 1 Stde. bei 0° und eine Stde. bei Raumtemperatur rühren und arbeitet vie bei a auf. Die Substanz wird mit Petroläther verrieben und abgesaugt. Ausb. 39.3 g, Schmp. 173-176°. Aus Essigester/Petroläther wird umgefälltj Ausbeute 37·5 g (86 $), Schmp. 173-176°, JjkJ^* = -3^-3° (c = 1, Methanol)
C₅H₉N O₉ (705.9) Ber. C 6I.26 H 8.^2 N 9·92

Gef. 61Λ 8.7 9.9 f) HCl'H-Leu-Ile-Asn-Thr(Bu^t)-0Bu^t

35.2 g (50 mMol) Z-Leu-Ile-Asn-Thr(Bu^t)-OBu^t werden wie bei b katalytisch in Methanol hydriert. Die Substanz kristallisiert beim Verreiben mit Äther, Ausb. 28.5 g (9k $>) Schmp. I92-I93⁰ Zers. , ^.7^° = -17-9° (c = 1, Methanol) CggH ^ClN 0 (608.2) Ber. C 55.26 H 8.96 N II.5I

Gef. 55.3 9.0 11.4

s) Z-Trp-Le-n-Ile-Asn-ThrfBu )-QBu

Zu einer Lösung von 26.2 g (hj.l mMol) HCl'H-Leu-Ile-Asn-' Bu*)-OBu*, 14.6 g (43.I mMol) Z-Trp-OH, 5.82 g 1-Hy-

droxybenzotriazol und 5»6 ml N-Äthylmorpholin in 150 ml Dimethylformamid gibt man bei 0 eine kalte Lösting von 9·5 Β Dicyclohexylcarbodiimid in 60 ml Dimethylformamid. Man läßt 1 Stde. bei 0 und 1 Stde. bei Raumtemperatur rühren, saugt' vom Niederschlag ab und engt das Piltrat ein. Der Rückstand wird mit NaHCO_-Lösuiig verrieben und abgesaugt und getrocknet. Aus Isopropanol wird umkristallisiert.

Ausb. 33.8 g (88 $,), Schmp. 228-229°, Z"^7_D = -39.5° (c = 1, Methanol)

C₄₇H₅₉N₇O₁₀ (892.1) Ber. C 63.28 H 7.79 N 10.99

Gef. 63.O 7.8 10.7

h) H Cl'H-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr(Bu^t)-OBu^t 3I.2 g (35 mMol) Z-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr(Bu )-0Bu werden in 200 ml Dimethylformamid/Methanol (l:l)wie bei b_ katalytisch hydriert. Der Rückstand wird mit Äther verrieben. Ausb. 27.2 g (98 $), Schmp. 215° Zers. ^O _ _28.0° (c = 1, Methanol) D

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Eine Probe wurde aus Methanol/Äther umgefällt: Schmp. 217°

Zers., /=*£_7q° = -28.4° (c = 1, Methanol^) C₃₉H₅^N₇O₈Cl (794.^5) Ber. C 58.97 H 8.12 N 12.3

Gef. 57.2 8.2 11.8

i) Z-Phe-Val-OH

10.7 e Z-Phe-Val-OMe werden in 200 ml Dioxan/Wasser 68:2) gelöst. Mit insgesamt 27 ml In NaOH wird gegen Thymolphthalein titriert. Mit 2n HCl wird neutralisiert und die Lösung eingeengt. Der Rückstand wird zwischen Essigester und 2n HCl verteilt. Die Essigesterphase wird mit Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und abgesaugt.

Ausb. 9.45 g (92 i>), Schmp. 148-149°.

Aus Essigester/Petroläther wird umgefällt; Ausb. 9·2 g, Schmp. 148-150°, /^.7^° = -8.8° (c = 1,Methanol) C₂₂H₂₆N₃O (398.5) Ber. C 66.32 H 6.58 N 7-02

Gef. 66.6 6.7 7.2

k) Z-Phe-Val-Gln-OBu^t

Zu einer Lösung von 8.0g (20 mMol) Z-Phe-Val-OH, 4.8 g HCl»H-Gln-OBu , 2.7 g 1-Hydroxybenzotriazol und 2.6 ml N-Äthylmorpholin in 40 ml Dimethylformamid gibt man bei 0 eine kalte Lösung von 4.2 g Dicyclohexylcarbodiimid. Man läßt 1 Stde. bei 0 und 1 Stde. bei Raumtemperatur rühren, saugt vom Niederschlag ab und engt das Filtrat ein. Der Rückstand wird mit NaIiCO--: abgesaugt und mit Wasser gewaschen.

ein. Der Rückstand wird mit NaHCO_-Lösung verrieben,

Ausb. II.65 g (100 $), Schmp.219-221° Zers. ^ = -35.7° (c = 1, Methanol)
₂N^O₇ (582.7) Ber. C 63.9I H 7.27 N 9.6O

Gef. 64.2 7.7 9.7

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l) Z-Phe -VaI -GIn-OH 2/02613

11.1 g (19 mMol) Z-Phe-VaI-GIn-OBu werden in 30 ml Trifluoressigsäure gelöst. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wird eingeengt und der Rückstand mit Äther verrieben und abgesaugt. Das Produkt wix-d zur weiteren Reinigung mit Essigester aufgekocht, mit Petroläther versetzt, abgesaugt und getrocknet. Ausb. 8.45 g (85 /^) Schmp. 225-227°, ß^J²^= -10.7° (c = 1 ,Dimethylacetamid) C H ^N^O (526.6) Ber. C 6l. 59 H 6.5I N 10.6h

Gef. 61.6 6.7 10. h

m) Z-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr(Bu^t)-OEu^t Zu einer Lösung von 7.95 g (10 mMol) HCl.H-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr(Bu )-0Bu* und 5.27 g (10 mMol) Z-Phe-Val-GIn-OH in 100.ml Dimethylformamid gibt man I.3 ml N-Athylmorpholin, 1«35 S 1-Hydroxybenzotriazol und bei 0 unter Rühren eine kalte Lösung von 2.2 g Dicyclohexylcarbodiimid in 20 ml Dimethylformamid. Man läßt 1 Stde. bei 0 und 1 Stde. bei Raumtemperatur rühren. Der Niederschlag wird abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird mit NaHCO„-Lösung verrieben und abgesaugt. Der Filterrückstand wird mit 1 1 Äthanol aufgekocht. Schwerlöslicher Rückstand 5.6 g, Schmp. 253-255° Zers. , /*£7γ_}° = -15-3° (c = 1, Dimethylacetamid). Aus dem Alkohol kristallisierten noch 2.8 g aus: Schmp. 251-25^° Zers. Gesamtausbeute 8.4 g (66.5 $)

^C66^H95^N11°i4 (¹²⁶⁶·⁶) ^Ber· ^{c 62}·^{6 H} 7·56 Ν 12.16

Gef. 62.2 7.9 11.9

n) CH COOH*H-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr(Bu^t)-OBu^t

Durch eine Lösung von 7·6 g (6mMol) Z-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr(Bu )-0Bu in 25Ο ml Eisessig, der etwas Pd(OH)„/BaSO.-Katalysator zugesetzt wird, leitet man so lange Wasserstoff, bis sich kein C0„ mehr entwickelt. Der Katalysator wird abgesaugt, das Filtrat eingeengt und der Rückstand mit Äther verrieben. Ausb. 7·^ g> Schmp. 2^7-250 Zers. Das Produkt wird mit Essigestet¹ ausgekocht und kalt abgesaugt. Ausb. 6.78 g (95 $>) » Schmp. 2*18-251° Zers.

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II. Z-Asp(OBu^t)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr(:Bu*)^OTJ^ln^ '^ Zu einer Suspension von 6.32 g (5-3 mMol) CH COOH'H-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr(Bu*J-OBu* in I50 ml Dimethyl formamid gibt man 0.86 g (5· 3 mMol) 3-Hydroxy-4-oxo-3·4-dihydrochinazolin und 2.66 g (5.3 mMol) Z-Asp(OBu )-OTcp Nach 5 Minuten Rühren wird eingeengt und der Rückstand mit 2n Sodalösung verrieben, abgesaugt und mit Wasser gewaschen. Der Filterrückstand wird mit Methanol ausgekocht. Schwerlöslicher Rückstand: 5.3 g, Schmp. 246-248° Zers.; aus dem Filtrat: O.5 g, Schmp. 244-246° Zers., /^J²⁵ = -15,0°

(c = 1, Dimethylacetamid).
Gesamtausbeute 5.8 g (76.4 $>)

₁₂O₁₇ (1437.7) Ber. C 61.8 H 7·57 Ν 11.69

Gef. 6I.I 7.6 II.7

Zum gleichen Ergebnis gelangt man bei Verwendung von

a) 1 -Hydroxy^-methyl^-pyridon,

b) 1-Hydroxy-6-methoxy-benzotriazol oder

c) 1-Hydroxy-5-methyl-benzotriazol

an Stelle des oben verwendeten Chinazolin-derivates

Beispiel TO: Synthese von Z-Phe-Val-OMe

2 g nach J. Amer. Chem. Soc. £0 (1966), Seite 2953 hergestellten Z-Phenylalanin-poIy-4-hydroxy-3-nitrostyrolharzes (enthält 3mMol Z-Phenylalanin) werden in 5 ml Dimethylformamid suspendiert und mit 162 mg (l mMol) 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydrochinazolin, I68 mg (l mMol) HCl'H-Val-OMe und 0.I3 ml N-Äthylmorpholin versetzt. Man läßt 15 Minuten rühren, saugt ab, wäscht mit Dimethylformamid nach, engt das Filtrat ein und verteilt den Rückstand zwischen Essigester und Natriumbicarbonatlösung. Die Essigesterphase wird mit 2n HCl, Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet

309835/1133 original inspected

und eingeengt. Der Rückstand wird mit Petroläther verrieben, abgesäugt und getrocknet. Ausb. 390 mg (95 i>) Schmp. 115°.

Beispiel 11:

Z-Tyr-Poinsulin -(31-63)-triacontatripeptid ^O mg (lOyuMol) Triacontatripeptid-trifluoracetat, hergestellt nach Z. Naturforsch. 2k b (1969), Seite 999, werden in 1.8 ml 90-proz. Dimethylformamid mit 26 mg (60 mMol) Z-Tyr-ONp in Anwesenheit von 1.35 ^mS (lO piiol) 1-Hydroxybenzotriazol umgesetzt. Nach I5 Min. fällt man mit Äther und filtriert den Niederschlag ab. Nach Waschen mit Äther und Methylenchlorid erhält man 36 mg Reaktionsprodukt. Tyrosingehalt It. Aminosäureanalyse: 1.1 Moll. R_: O.72 in n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser (30:6:20: 2k), Papierchromatographie, aufsteigend. R„ des Triacontapeptids: 0.22.

Beispiel T2:

KT^B1 ' -(Boc-Leu-Phe)-n'^A1', N^^B29^-Bis-Boc-Insulin 120 mg Boc.-Insulin (20 «Mol), hergestellt nach Hoppe-Sey- ler· s Z. physiol. Chem. 3^2 (1971 ), Seite 7, werden in 2 ail Dimethylformamid mit I6.7 mg (30 uMol) Boc-Leu-Phe-OTcp und 2.7 mg (20 uMol) 1-Hydroxybenzotriazol versetzt. Man rührt 10 Minuten bei Raumtemperatur, fällt mit Äther, filtriert den Niederschlag ab und wäscht ihn mit Äiher. Ausb. 117 mg.

Aminosäurealyse: Leu Ber. 7> Gef. 6.98

Phe Ber. 4, Gef. 3.96

Vanderungsstrecke in der Papierelektrophorese bei pH 2.2: O.76 χ Insulin (BoCp-Insulin: O_e84 x Insulin). Nach Abspaltung der Schutzgruppen durch einstündiges Behandeln mit Trifluoressigsäure und Fällen mit Äther wandert die Verbindung in der Papierelektrophorese wie Insulin. Die Reaktionszeit ohne Zusatz von 1-Hydroxybenzotriazol beträgt 3 Stunden und führt teilweise zur Quervernetzung.

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Zum gleichen Ergebnis gelangt man bei Verwendung von

■ a) i-Hydroxy-^-methyl-S-pyridon,

b) 1-Hydroxy-6-methoxy-benzotriazol oder

c) 1 -Hydroxy-5-tnethyl-benzotriazol

anstelle des oben verwendeten t-IIydroxy-benzotriazols Beispiel 13:

Boc-ßAla-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu^t)-His-Phe-7lrg-Trp-Gly-OH.'4H^O 5.36 g ( 4 mMol) H-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu^t)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH.4H₂O, hergestellt nach Liebigs Ann. Chem. 726 (1969), Seite 183, werden in 5° ml Dimethylformamid mit 1.84 g (5 mMol) Boc-ß-Ala-OTcp in Anwesenheit von 5^0 mg ( h mMol) 1-Hydroxy- benzotriazol umgesetzt. Nach 15 Minuten fällt man mit Essigester/Äther ( 1 : 1) 5·^5 S (94 $) nahezu chromatographisch reines Reaktionsprodukt aus, das zur völligen Reinigung aus 200 ml 60-proz. Methanol umkristallisiert wird. Ausbeute 4.92 s (81 $)· Die Verbindung ist mit der nach loc. cit. ohne Zusatz von 1-Hydroxybenzotriazol erhaltenen identisch, die Reaktionszeit wurde jedoch von 20 Stunden auf I5 Minuten abgekürzt.

Beispiel Ik:

_N(aCi . fc¹5. fc26, £ kl , S^⁶)_p_enta_(_Leu.p_he)__Trypsin__Kallikrein„ Inhibitor

90 mg Trypsin-Kallikrein-Inhibitor aus Rinderorganen (siehe Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 350 (1969), Seite 1531) werden in 2 ml Dimethylformamid suspendiert. Dazu gibt man 56 mg Boc-Leu-Phe-OTcp und 13 mg 1-Hydroxybenzotriazol. Nun gibt man unter Rühren Wasser zu (insgesamt O.5I ml) bis alles gelöst ist. Man rührt noch I5 Minuten, engt im Hochvakuum ein und verreibt den Rückstand mit absolutem Tetrahydrofuran.

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Der Niederschlag wird abgesaugt und getrocknet. Ausbeute 110 mg.

95*7 mg der Substanz werden in 2 ml Trifluoressigsäure gelöst, Man läßt 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen, engt ein und verteilt den Rückstand zwischen Wasser und Äther, verrührt die wässrige Phase mit "Amberlite IR h$" (Acetat-form) und gefriertrocknet. Ausbeute 86 mg.
Aminosäureanalyse: Leu, Ber.7£ref. 7· 3

Phe, Ber.9»Gef.9.2

Beispiel Synthese von H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-OH (insulin A 1-5)

I. Herstellung nach der Festphase-Peptidsynthesemethode unter Verwendung von 3-Hydroxy-^-oxo~3·4-dihydrochinazolin

a) Nps-Gln(Mbh )-Polymerverbindung

Eine Lösung von 12.3 E NpS-GIn(MbIi)-OH und 3.2 ml Triäthylamin in 60 ml Dimethylformamid wurde zu 20 g eines nach Merrifield, Biochemistry _3_ 096^), Seite 1358 chlormethylierten, mit 2 $ Divinylbenzol vernetzten Polystyrolharzes gegeben, das einen Chlorgehalt von 1.15 Milliäquivalent/g aufwies. Die Mischung wurde Stunden bei 80 geschüttelt, dann wurde filtriert und das Harz mit Dimethylformamid, Äthanol und Methanol mehrfach gewaschen. Ausbeute nach Trocknen im Vakuum bei 80 C Über P„0, : 19.3 g· Der Aminosäuregehalt der so erhaltenen Acylaminsäurekunstharzverbindung betrug 1.15 Millimol/g

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36
b) Boc-Gly-Ile-VaI-GIu(OBzI)-Gin(Mbh)-Polymerverbindung

6 g Nps-Gln(Mbh)-Kunstharzverbindung wurden in einem Reaktionsgefäß mit Glasfritte nach Merrifield (siehe oben) dem folgenden Reaktionszyclus unterworfen: b₁: Waschen mit drei 50 ml-Portionen Eisessig b_: Abspaltung der N-Schutzgruppen durch halbstündiges Schütteln mit einer In Lösung von wasserfreiem HCl in Eisessig, Filtration.

b„: Waschen mit Eisessig, wie unter b₁ beschrieben. br: Dreimaliges Waschen mit je 50 ml Äthanol, b : Dreimaliges Waschen mit je 5° ml Dimethylformamid. X>s: Neutralisation der an den freigesetzten od-Aminogruppen des Harzes vorhandenen Hydrochloridgruppierung durch 10 Minuten Schütteln mit 50 ml einer 10^-igen Lösung von Triäthylamin in Dimethylformamid.

b_: Erneutes Waschen mit Dimethylformamid wie unter b_ 7 5

beschrieben.

bo: Zusatz der Dimethylformamidlösung von 3· 6 Millimol des entsprechenden Boc-Aminosäure-trichlorphenylesters in ko ml Dimethylformamid, zusammen mit 0.57 g (3.6 tnMol) 3-Hydroxy-U-oxo-3.4-dihydrochinazolin, und anschließendes zweistündiges Schütteln, dann Filtration.

b_: Waschen mit Dimethylformamid, wie unter b,. beschrieben.

b_1o!Waschen mit absolutem Äthanol wie bei b^ beschrieben.

Die vorstehend beschriebenen Waschoperationen dauern jeweils 3 Minuten. Danach wird das Lösungsmittel durch Druckfiltration (Druckluft, O.3 Atü) durch die Glasfritte des Reaktionsgefäßes entfernt.

Zur Anfügung einer Aminosäure wurde jeweils der vorstehend beschriebene Zyklus b - b₁₀ einmal durchgeführt. Dabei wurden nacheinander folgende Boc-Arainosäure-2.h.5-trichlorphenylester jeweils in der Stufe b„ des beschrie-

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benen Schemas eingesetzt: Boc-Glu(OBzl)-OTcp, Boc-Val-OTcp, Boc-Ile-OTcp und Boc-Gly-OTcp. Ausbeute an Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBzl}-Gln(Mbh)-Po-. lymerverbindung nach Trocknen über P„O im Hoch-

O f

vakuum bei 80 : 5·3 S mit einem Peptidgehalt von 8.2 % (durch saure Hydrolyse vmd quantitative Aminosäurebestimmung ermittelt).

c) Freisetzung des Peptids

3 g der nach b) hergestellten Acylpeptid-polymerverbindung werden in dem beschriebenen Reaktionsgefäß in 20 ml wasserfreier Trifluoressigsäure suspendiert, anschließend wird 90 Minuten lang unter Feuchtigkeitsausschluß ein langsamer Strom wasserfreier Bromwasserstoffsäure von unten durch die Glasfritte des Gefäßes und durch die darüber befindliche Suspension geleitet. Dann wird die Suspension filtriert und das Harz dreimal mit je 10 ml Trifluoressigsäure gewaschen. Die vereinigten Trifluoressigsäurefxltrate und Vaschlösungen werden im Vakuum eingeengt, der Rückstand wird zweimal unter Dekantieren mit je $0 ml absolutem Äther digeriert. Auswaage nach Trocknen im Hochvakuum über ΡρΟ_ : 396 mg,

ο ι— ·η 22 ■ ο /

Schmp. Zers. ab 225 C, oC I _D = -51.4 (c = 0.25, Wasser). Aus 200 mg dieses Rohproduktes werden durch Verteilungschromatographie an Sephadex LH 20 im Lösungsmittelsystem Butanol/Essigsäure/Wasser (2:1:1θ) 114 mg einer farblosen, amorphen Substanz erhalten. Schmp. (Zers.)fßl²² ='-71.4° (c= 0.25, Wasser).

- ^JD
Aminosäureanalyse: siehe Tabelle k

II.Herstellung nach der Festphasen-Peptidsynthesemethode ohne Zusatz von 3-Hydroxy-^-oxo-3.^-dihydrochinazolin

Bei diesem Kontrollversuch war das gesamte Herstellungsverfahren qualitativ und quantitativ identisch mit dem unter beschriebenen, der Zusatz von 3-Hydroxy-^-oxo-3.^-dihy-

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drochinazolin gemäß Stufe b_o unterblieb jedoch. Im Ein-

zelnen ergaben sich bei diesem Vergleichsversuch folgende Resultate: ₂₂

Rohausbeute: kZO mg, Schmp.: Zers. ab 96°,[oM_n -27° (c = 0.25, Wasser).

Durch Verteilungschromatographie an Sephadex LH 20 wurden aus 2O6 mg des Rohproduktes nur Qh mg eines Produktes init den physikalischen Daten Schmp.: Zers. ab I65 fjo6| -3^·9» (c = Ο.25» Wasser) erhalten. Es war dünnschichtchromatographisch nicht einheitlich. Aminosäureanalyse: siehe Tabelle h.

III.Herstellung nach konventionellen Methoden a) Boc-Gly-Ile-OH.CHA

Zu einer Lösung von 35 g (0.2 Mol) Boc-Gly-OH, 38.4 g (0.2 Mol) HCl.H-IIe-OMe und 27 g (0.2 Mol) 1-Hydroxybenzotriazol in 350 ml Dimethylformamid gibt man 26 ml N-Äthylmorpholin und bei 0 eine Lösung von kk g Dicyclohexylcarbodiimid in 50 ml eiskalten Dimethylformamid. Man läßt eine Stunde bei 0 und eine Stunde bei Raumtemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab und engt das Filtrat ein. Der Rückstand wird zwischen Essigester und Natriumbicarbonat-Lösung verteilt. Die Essigesterphase wird mit KHSOr-Lösung, NaHCO -Lösung und Wasser ausgeschüttelt, mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Ausbeute 6I.I g Öl.

Das Öl wird in Essigester gelöst und über eine Säule aus 185 g basischem AIpO (Woelm, Aktivstufe I") chroniatographiert. Das Essigestereluat wird eingeengt. Ausbeute 55.8 g.

Das oben gewonnene Öl wird in 25Ο ml einer Mischung aus Dioxan/Wasser (8:2) gelöst und mit wenig Thymolphthalein versetzt. Nun wird mit einer In NaOH so lange titriert, bis die Lösung für längere Zeit blau bleibt. Verbrauch 179 ml In NaOH. Anschließend wird mit KIISO. -Lösung Jieu-

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tralisiert und die Reaktionsmiscliung eingeengt. Der Rückstand wird nun in ¥asser gelöst. Mit Essigester wird ifcerschichtet und bei Eiskühlung wird mit 2n HpSO. auf pH 2-3 angesäuert und gut gerührt. Die Essigesterphase wird abgetrennt, einmal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird in Äther gelöst und bis zur basischen Reaktion mit Cyclohexylamin versetzt. Man stellt nun in Eis, saugt ab, wäscht mit Äther und trocknet. Ausbeute 55.6g(71.8 $), Schmp. 198 - 200°C. Zur weiteren Reinigung wird die Substanz in 100 ml Methanol gelöst und in 1.5 nil Äther eingerührt und ab-,'gekühlt. Nach 1 Stunde wird abgesaugt. Ausbeute 45· 5 g (59 #), Schmp. 204-205°C,M²² = +17. **° (c = 1 , Methanol).

b) Z-VaI-GIu (0Bu^t) -GIn(MbIl) -OH

65.2 g (81 mMol) des nach Chem. Ber. 103 (197O), Seite 2038 hergestellten Z-VaI-GIu(OBu*)-Gin(Mbh)-OMe werden in etwa 400 ml Dioxatli/Wasser (8:2) suspendiert und mit In NaOH gegen Thymolphthalein als Indikator titriert. Nachdem die Lösung längere Zeit blau bleibt, wird mit KHSO.-Lösung angesäuert und der Niederschlag abgesaugt. Das Filtergut wird mit Aceton aufgekocht, atg;saugt und aus Dimethylformamid/Wasser umgefällt. Ausbeute 59 g (92 #) Schmp. 216-218°.

°42^Η5Λ°11 (79O.9) Ber. C 63.72 H 6.85 N 7.05

Gef. 63.3 7.1 8.1

c) H-Val-Glu(0Bu^t)-Gin(Mbh)-OH

Durch eine Suspension von 52 g (65.7 mMol) Z-Val-Glu (OBu )-GIn(Mbh)-OH und etwas Pd/BaSOr-Katalysator in 5OO ml Eisessig leitet man so lange Wasserstoff, bis kein C0„ mehr entweicht. Der Katalysator wird dann abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und abgesaugt. Der Niederschlag

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- Uo -

wird mit einer gesättigten Natriumacetatlösung ca. 5 Stunden gerührt, abgesaugt und getrocknet. Zum Schluß wird noch mit Methanol ausgekocht. Ausbeute 27 g (62.6 $>) Schmp. 226 - 228°C,j^]²² = +9.0° (c = 1, Eisess

ig).

^Ber· ^c 62.20 H 7O5 N 8.53 Gef. 61Λ 7.3 8.5

d) Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBu^t)-Gln(Mbh)-OH

7.8g (20 mMol) Boc-Gly-Ile-OH.CHA werden bei 0° C zwischen 100 ml Äther und k0 ml 2n Zitronensäure verrührt. Die ätherische Phase wird abgetrennt, mit Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Ausbeute 4.6 g Öl. Zu einer Lösung von 3«9 g der oben gewonnenen öligen Substanz (Boc-Gly-Ile-OH) in 35 ml Dimethylacetamid gibt man 2.09 g 3-Hydroxy-U-oxo-3.**-dihydro-1 .2.3-benzotriazin und bei 0° C 2.76 g Dicyclohexylcarbodiirnid. Man läßt 1 Stunde bei 0 und 1 Stunde bei Raumtemperatur rühren. Der ausgefallene Niederschlag wird abgesaugt und mit wenig Dimethylacetamid gewaschen. Zu dem Filtrat gibt man nun 5»85 g fein zerriebenes H-VaI-GIu(OBu*)-Gln(Mbh)-OH und rührt 5 Stunden bei Raumtemperatur. Dabei fällt ein dicker Niederschlag aus. Man läßt über Nacht stehen und fällt anderntags mit 3OO ml Wasser die Substanz vollständig aus. Die ausgefällte Substanz wird abgesaugt, mit Wasser gewaschen und mit 2oo ml Äthanol aufgekocht. Man läßt auf Raumtemperautr abkühlen und saugt ab. Mit Alkohol wird gut gewaschen. Ausbeute 6.7 g (81.3 $) Schmp. 253 - 255⁰CJ₀(I²² = -2.1O(c = 1, Dimethylacetamid)

(927.1) ^D Ber. C 6Ο.9Ο H 7.61 N 9.07 Gef. 61.0 7.6 9.2

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- k-i

e) H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-OH

200 mg BoC-GIy-IIe-VaI-GIu(OBu )-Mbh-0H und O.5 ml Anisol werden in 5 ^mx Trxfluoressigsäure gelöst und 10 Minuten im Rückfluß gekocht. Anschließend wird eingeengt,und der Rückstand mit Äther verrieben. Nun wird abgesaugt und der Rückstand in Wasser gelöst. Die wässrige Lösung wir mit "Amberlite IR ^5" (Acetatform) verrührt,bis pH 3 - h erreicht ist. Der Austauscher wird abgesaugt und das Filtrat mit Aktivkohle geklärt. Die klare wässrige Lösung wird gefriergetrocknet. Ausbeute 50 mgJ^l²² = -75°C (c = O.25, Wasser) Dünnschichtchromatographisch einheitlich. Aminosäureanalyse: siehe Tabelle h.

Tabelle

Vergleich der Aminosäureanalysen und physikalischen Daten des nach den Methoden I, II und III hergestellten H-GIy-He-VaI-Glu-Gln-OH

nach I (Fest- nach II (Fest- nach III körpermethode körpermethode (konvenmit 3-Hydroxy- wie bei I, nur tionelle 4-OXO-3·k-dl- ohne Katalysa- Methode) hydrochinazo- tor)

22

lin)

(c =0.25, Wasser) -71.5°C

-75.O

Zersetzungspunkt
DS-Chromatοgramm

Aminosäureanalyse (72 Stdn.
bei 110°ü)

ab

einheitlich und identisch mit III

GIu 2.6 GIy 1.0 VaI 0.9 He 0.87

ab 165 C

3 Flecken,
davon einer
identisch
mit III

GIu 2.7Ί

GIy 1.0

VaI O.hh5

He 0.33

.0.

ab 255 C einheitlich

GIu 2.2 GIy 1.0 VaI 0.9 EIe 0.9

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Die in Tabelle k aufgezeigten Ergebnisse zeigen deutlich
die Überlegenheit des erfindungsgemäßen Verfahrens auch
bei der Festkörpermethode. Nach der herkömmlichen Methode unter Verwendung von Trichlorphenylestern ohne Zusatz der erfindungsgemäßen Katalysatoren war es nicht möglich, ein auch nur annähernd einheitliches Material zu bekommen.

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Herstellung von einigen Katalysatoren 3-Hydroxy-^-methyl-2. 3-dihydro-th.iazol-2-th.ion ^a) 5-Thioxo-6-oxa-4-thia-2-octanon

Eine Lösung von I85 g (2 Mol) Chloraceton in 300 ml Methylenchlorid wird mit 3OO nrl Wasser überschichtet. Bei 10 - 20°C werden unter Rühren 320.5 g (2 Mol) CpH-O-CSSK portionsweise eingetragen. Man rührt noch 2 Stunden bei Raumtemperatur nach, trennt die Schichten, wäscht die organische Phase noch einmal mit 100 ml Wasser, trocknet mit Natriumsulfat und destilliert, Kp. 92-99°/O.O5 Torr, Ausbeute 3O5 g.

5~Thioxo-6-oga~4-thia-2-oetanonoxiin Yu einer Lösung von 56.0 g Hydroxylatninhydrochlorid in 400 ml Methanol gibt man 65.6 g Natriumacetat und 137 g des nach a) gewonnenen 5~Thioxo-6-oxa-4-thia-2-octanons. Nach 18-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, der Rückstand mit Wasser versetzt, mit Methylenchlorid extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet und vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wird in Diisopropyläther aufgenommen. Durch Abkühlen lassen sich daraus in mehreren Fraktionen insgesamt 101 g des Ox ims vom Schmelzpunkt 6k gewinnen.

c) 3-Hydroxy-4-methyl-2.3-dibydro-thiazol-2-thion

Zu einer Lösung von 10^1. k g NaOH in 200 ml Wasser tropft man unt*· Kühlen und gutem Rühren innerhalb von I5 Minuten 1^3.3 S des nach b) gewonnenen Oxims, gelöst in 3OO ml Methylenchlorid, rührt noch 5 Minuten nach, fügt noch 5°0 ml Wasser zu, trennt die Schichten, schüttelt die wässrige Phase zweimal mit je 100 ml Hexan aus und . säuert schließlich mit konzentrierter Salzsäure auf pH

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an. Man rührt eine Stunde im Eisbad nach, saugt den Niederschlag gut ab und wäscht ihn noch zweimal gründlich mit je 3°0 ml Wasser. Ausbeute 6I.5 g» Schmp. 90 C. Weitere 12 g des gleichen Produktes lassen sich durch Extraktion der wässrigen Lösung mit Methylenchlorid gewinnen.

Beispiel 18:

1-Hydroxy-^.6-dimethyl-3« 5~dichlor-2-pyridon

Man löst 20 g l-Hydroxy-4.6-dimethyl-2-pyridon in einer Mischung aus 75 «nl konzentrierter Salzsäure und 60 ml Wasser und leitet bei 10 - 15⁰C 21.6 g Chlor ein, rührt noch eine Stunde nach, saugt ab, wäscht mit Wasser und trocknet im Vakuum. Ausbeute 22.9 g_f Schmp. 213 C. Umkristallisieren aus Acetonitril erhöht den Schmelzpunkt auf 216°C.

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Claims

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Patentansprüche

Verfahren zur Herstellung von Peptiden,· dadurch gekennzeichnet, daß man eine geschützte Aminosäure oder ein geschütztes Peptid der "Formel II

V-(N-CH-C-) N-CH-C-O-R (II)

^ml

in der V eine in der Peptidchemie übliche Aminoschutzgruppe oder den Pyroglutamylrest, Y einen niederen Alkylrest, der gegebenenfalls verzweigt und/oder durch erforderlichenfalls zweckmäßig geschützte OH-, NH₂-, SH, COOH-, CONH₂, Guanidino-, Aryl-, Imidazoyl- oder Indolylreste substituiert sein kann, bedeuten, wobei die Gruppe -NH-CHY- auch den Pyrrolidinyl-Rest bedeuten kann, R einen Di-, Tri-, Tetra- oder Pentachlorphenyl-, einen Nitrophenyl- oder einen Chlor-nitrophenyl-rest darstellt und in. für eine Zahl von etwa 0-10 steht, unter Zusatz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I)

'"^,N-OH (I)

in der X die Gruppen C=O, C » S oder -N » bedeutet und in der X und N Glieder eines, ggf. an einen Benzolkern anellierten und/oder 1 oder 2 weitere Heteroatome enthaltenden 5- bis 6-gliedrigen ggf. substituierten heterocyclischen Ringes sind, und deren pK Wert zwischen 3.7 und 4,2 liegt, mit gegebenenfalls geschützten Aminosäuren oder Peptiden der allgemeinen Formel (III),

[_N-OH-C-(N-CH-C-)_m W (III)

H-

"'2

in der Y und der -NH-CHY-Rest die obige Bedeutung haben und m₂ für die Zahlen 0 bis großenordnungsmäßig 500 steht und W eine Hydroxygruppe, O-Alkyl, O-Aralkyl, eine gegebenenfalls durch Alkyl, Aralkyl oder Aryl substituierte

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Aminogruppe oder einen ester- oder amidartig gebundenen polymeren Träger bedeutet, umsetzt und aus dem erhaltenen geschützten Peptid der Formel IV

V-(N-OII-C) -N-CH-C-N-CH-0-(N-OH-C-) W (IV) ^ml ^m2

gegebenenfalls die Schutzgruppen ganz oder teilweise in an sich bekannter Weise abspaltet.
2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pK Wert der Katalysatoren der Formel I in 0.5 m Lösung im Lösungsmittelgemisch Diäthylenglykoldimethylather/ Wasser im Verhältnis 6:4 bei 30° gemessen wird.

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