DE2202613A1 - Verfahren zur herstellung von peptiden - Google Patents
Verfahren zur herstellung von peptidenInfo
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Description
FARBWERKE HOECHST AG
vormals Meister Lucius & Brüning 9?fl9R 1
Aktenzeichen: HOE 72/F 016
Datum 19. Januar 1972 Dr.HG/ka
Zur Herstellung von Peptiden werden oft mit gutem Erfolg die stark aktivierten Ester von N-Acylaniinosäuren, wie z. B.
N-Hydroxysuccinimid- (j. Amer. Chem. Soc. 86^ (19^4), Seite
1839), l-Hydroxybenzotriazol- (Chem. Ber. 103, (197O), Seite
788) oder 3-Hydroxy-^-oxo-3.4-dihydrobenzotriazinester
(Chem. Ber. IO3 (1970), Seite 2034) verwendet. Diese stark
aktivierten Ester lassen sich jedoch nicht in allen Fällen kristallin und in der geforderten Reinheit herstellen. Auch
sind sie relativ unbeständig und können oft nicht lange gelagert
werden. Bessere Kristallisationseigenschaften und auch größere Stabilität haben negativ substituierte Phenylester,
wie ζ. B. ρ-Nitrophonylester (Chem. u. Ind. 1955>
Seite I517), 2.4.5-Trichlorphcnylester (HeIv: Chim. Acta h6_ (1963),
Seite I609), Pentachlorphenylester (Roczniki Chem . JJ5, ('!961),
Seite I533) oder auch 2.6~Dxchlor-4-nitro-pheriyles ter (Aust.
J. Chem. 2_1 (1968), Seite 477). Diese Ester haben jedoch den
Nachteil, daß bei der Synthese sterisch gehinderter Peptide die Reaktionsgeschwindigkeit stark zurückgeht und daraus oft
tagelange Reaktionszeiten rosullieren. In extremen Fällen kommt
es zu keiner Peptidbi idnjig.
Schon seit längerer Zeit wurde versucht, durch Zusätze verschiedener
Art die etwas reaktionsträgen Ester zu katalysieren. So wurden z. B. Imidazol (Angew. Chem. Tk (1962),
Seite 904, 2£ (1963), Seite 209), 2-Hydroxypyridin, 1.2.4-Triazol
oder Pyrazolderivate (Proc. Chem. Soc. 1963»Seite
266; Rec. Trav. chini. Pays-Bas 84. (1965), Seite 213) zur
Esterkatalyse herangezogen.
Zwar verlief) bis auf Imidazol bei den genannten Katalysatoren die Aminolyse der aktivierten Ester ohne Racemisierung,
doch die Reaktionsgeschwindigkeit konnte nicht so erhöht werden, daß sich auch stark sterisch gehinderte Peptide
glatt bilden.
Ea handelt sich hier also um schwache Katalysatoren, deren Wirkung schon von polaren, basischen Lösungsmitteln wie
z. B. Dimethylformamid erreicht wird. Das hat zur Folge,
daß sie gerade in den bei der Synthese höherer Peptide meist verwendeten Lösungsmitteln keine weitere Reaktionsbeschleunigung
mehr bewirken.
Eine Verbesserung brachte die Katalyse mit 2-Hydroxypyridin-Natriumsalz
(DOS 2 03I 826). Schon nach einer knappen Stunde
kann man auch bei sterisch gehinderten Peptiden gute Ausbeuten erzielen. Das Natriumsalz des 2-Hydroxypyridins hat
jedoch den Nachteil, daß es stark basisch reagiert und bei den empfindlichen Peptidmolekülen Racemisierung bewirken kann.
So konnte an Hand eines gaschromatographisehen Racemisierungstests
tatsächlich gefunden werden, daß das Natriumsalz des 2-Hydroxypyridins racemisierend wii"kt.
Es wurde nun gefunden, daß die Aminolyse der aktivierten Ester vorn Phenylestertyp durch Zugabe saurer heterocyclischer
N-Hydroxyverbindungen mit einem pK Wert zwischen 3,7 und 4,2 extrem beschleunigt wird, so daß Peptidsynthesen, die
sonst; tagelange Reaktionszeiten benötigen, in wenigen Minuten
beendet sind,
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■■■ — - '* ^-y
2202513
Der Vergleich der Halbwertszeiten bei der Synthese von Z-Val-cyclohexylamid aus molaren Mengen Z-VaI-ONp und
Cyclohexylamin unter Zusatz der verschiedenen N-Hydrcxyverbindungen
mit den pK-Werten dieser Verbindungen zeigt die vom pK-Wert abhängige katalytische Wirkung der ?T-IIydroxyverbindungen
besonders gut (siehe Tab. 1, experimenteller Teil).
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
man eine geschützte Aminosäure oder ein geschütztes Peptid der Formel II
HYO HTQ
-(A-OK-ö-)m iü-cH-d-o-R (ii)
in der V eine in der Peptidchemie übliche Aminoschutzgruppe
oder den Pyroglutamylrest, Y einen niederen Alkylrest, der
gegebenenfalls verzweigt und/oder durch erforderlichenfalls
zweckmäßig geschützte OH-, NH2-, SH, COOH-, CONH2, Guanidino-,Aryl-,
Imidazoyl- oder Indolylreste substituiert sein kann, bedeuten, wobei die Gruppe -NII-CHY- auch den Pyrrolidinyl-Rest
bedeuten kann, R einen Di-, Tri-, Tetra- oder Pentachlorphenyl-, einen Nitrophenyl- oder einen Chlor-nitr»phenyl-rest
darstellt und m.. für eine Zahl von etwa 0-10
steht, unter Zusatz einer Verbindung■der allgemeinen Formel
(I)
in der X die Gruppen : C=O, C=S oder -N = bedeutet
und in der X und N Glieder eines, ggf. an einen Benzolkern anellierten und/oder 1 oder 2 weitere Heteroatome enthaltenden
5- bis 6-gliedrigen ggf. substituierten heterocyclischen
Ringes sind, und deren pK Wert in 0,5 m Lösung in einem
Gemisch von 6 Teilen Diäthylenglykoldimethyläther und Ί Teilon
Vlasser*.zwischen 3,7 und h, 2 liegt, mit gogobencnrnlls goschützten
Aminosäuren oder Peptiden der allgemeinen Formel (III),
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HYOHYO Ι-Ν-ΟΗ-C- (N-CH-C-) W (Hl)
in der Y und der -NII-CHY-Rest die obige Bedeutung haben und
m_ für die Zahlen 0 bis größenordnungsmäßig 500 steht und V"
eine Hydroxygruppe, O-Alkyl, 0-Aralkyl, eine gegebenenfalls
durch Alkyl, Aralkyl oder Aryl substituierte Aminogruppe oder einen ester- oder amidartig gebundenen polymeren Träger
bedeutet, umsetzt und aus dem erhaltenen geschützten Peptid der Formel IV
HYOHYOHYO
-N-CH-C-N-CH-C1- (N-OH-(J-) W (iv)
HCNCC (NOH(J) ι
gegebenenfalls die Schutzgruppen ganz oder teilweise in an
sich bekannter Weise abspaltet.
Der pK-Vert der Zusatzstoffe ist entscheidend für das Gelingen des erfindungsgemäßon Verfahrens. Die pK-Messung ist,
wie im experimentellen Teil beschrieben, durchzuführen. Ist der pK - Wert der Verbindungen der Formel I in dem genannten
System höher(wie beim N-Hydroxypiperidin) oder tiefer^ (wie beim l-Hydroxy-6-nitro-benzotriazol), so sinkt die katalytische
Wirkung stark ab.
Man arbeitet im allgemeinen mit Mengen von 0,1 bis etwa 1
Äquivalent N-Hydroxylverbindung, kann jedoch auch geringere
oder größere Mengen einsetzen.
Zur Katalyse geeignete Verbindungen sind unter anderem 1-Hydroxybenzotriazole,
wie z. B. l-Hydroxy-5·6-dimethylbenzotriazol,
l-Hydroxy-5-niethyl-benzotriazol, l-Hydroxy-6-niethylbonzotriazol,
l-Hydroxy-S-methoxy-benzotriazol, 1-IIydroxy-
^-methyl-bcnzotriazol, l-IIydroxy-o-brom-benzotriazol, 1-IIydroxy-6-chlor-benzotriazol,
l-Hydroxy-5-chlor-benzotriuzol,
cyclische Hydroxamsäuren, wie z. B. Pyridone/l-IIydroxy-2-py.ri-
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don, l-Hydroxy-Jf-niethyl-2-pyridon (U.S. 25*10218), 1-Hydroxy-J*.6-dimethyl-2-pyridon,
l-Hydroxy-3. k. 6-trimethyl-2-pyridon
(BeIg. 738288) , l-Hydroxy-3· 5-dichlor-4. 6-di'methyl-2-pyridon,
N-Hydroxysuccinimid oder 1-Hydroxy-2-oxo-2.3-dihydroindole
wie l-Hydroxy-o-chlor^-oxo^^-dihydro-indol (j.Amer. chein.
Soc. 2ÜL> Seite 222, (1956) cyclische Hydroxamsäuren mit Stickstoff
als Heteroatom im Ring, wie z. B. 3-Hydroxy-4-oxo-3.
U-dihydrochinazolin, 3-Hydroxy-2-methyl-4-oxo-3. '4-dihydrochinazolin,
3-Hydroxy-4~oxo-3. '4-dihydro-1.2.3-benzotriazin
3-Hydroxy-4-oxo-2-phenyl-3· 4-dihydrocliinazolin ( J. Chem. Soc.
I960, Seite 2157-2160), cyclische Hydroxamsäuren mit Sauerstoff
oder Schweföl als Heteroatom im Ring, wie z. B. geeignet
substituierte 4-Hydroxy-3.-^-dihydro-3-oxo- 1 . h. 2-benzooxazine
u. 4-Hydroxy-3·4-dihydro-3-oxo-1.k.2-benzothiazine.oder
Cyclische Thiohydroxamsäuren, wie z. B. 3-Hydroxy-4-methyl-2.3-dihydro-thiazol-2-thion
können ebenfalls venvendet werden.
Als Substituenten der Verbindungen der Formel I kommen Alkyl-
oder Alkoxy-reste mit 1-2 C-Atomen, Halogenatome , insbesondere ChIο r, infrage.
Die Aminokomponente III kann entweder frei oder als Salz von
Mineralsäuren bzw. starken oder schwachen organischen Säuren wie z. B. p-Toluolsulfonsäure, Trifluoressigsäure oder Essigsäure
eingesetzt werden. Liegt Salzbildung mit starken Säuren vor, muß zur Freisetzung der Aminogruppe eine tertiäx"e organische
Base wio Triäthylamin oder N-Äthylmorpholin zugesetzt
werden. Auch ein Zusatz eines Salzes dieser N-Hydroxyverbindungen, wie ss. B. das 1-Hydroxybenzotriazol-Natrium-Salz ist
möglich. Hierbei wird gleichzeitig die Aminogruppe far-ei ge setzt
(Na-Salz-Bildung) und die zur Katalyse notwendige 1-Hydroxyverbindung
der Formel I gebildet.
Als Schutzgruppe V kommen die in der Peptidchemie gebräuchlichen
N-Schutzgruppen infrage (vgl. Schröder-Lübke, The Peptides,
New Yox°k und London 1965/66), Bevorzugt verwendet man Ax^alkyloxycarbonylwie
z. B. Benssyloxycarbonyl- oder tex-L. -Alkyloxy-
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carbonyl- wie ζ. B. tert-Butyloxycarbonyl-Reste.
Die OH-Funktion bei Serin, Threonin oder Tyrosin kann ungeschützt
bleiben. Sie kann aber auch durch geeignete Gruppen, wie z. B. tert.-Butyl- oder Benzylgruppen geschützt werden.
Zur Herstellung von Cystein- und Cystinpeptiden muß die SH-Funktion des Cysteins durch die in der Peptidchemie
gebräuchlichen SH-Schutzgruppen geschützt werden, oder man führt die Reaktion an symmetrischen oder asymmetrischen
Cystinpeptiden durch, die dann gegebenenfalls zu Cysteinpeptiden
reduziert werden können.
W bedeutet in der Carboxyl-Komponente der allgemeinen Formel
III auch einen polymeren Träger, der ester- oder amidartig mit der Carboxylgruppe verbunden ist. Als geeignete Polymere
kommen in Frage ein mit 1-2 $> Divinylbenzol vernetztes Polystyrol,
vernetzte Phenol-Formaldehydkondensationsprodukte vernetzte Phenoläther-Formaldehydkondensationsprodukte, mit
chemisch gebundenem Polystyrol beschichtete Kunststoffoberflächen,
Polybenzylharze oder phenylsubstituierte Glasoberflächen. Als geeignete Haftgruppen sind z. B. möglich:
Halogenmethyl-, Halogenacetyl- oder Aminobenzhydrylgruppen.
Die Kondensation wird zweckmäßig in Lösungsmitteln wie beispielsweise
Dimethylformamid, Dirne tliylacetamid, Tetramethylharnstoff
oder Phosphorsäure-tris-dimethylamid, gegebenenfalls,
unter Zusatz von etwas Wasser durchgeführt. Die Reaktionstemperatur liegt vorteilhaft bei O - kO , bevorzugt bei
Raumtemperatur.
Die Aufarbeitung gestaltet sich einfach, da die erfindungsgemäßen N-Hydroxyverbindungen der allgemeinen Formel I, wie
1-Hydroxybenzotriazol oder 3-Hydroxy-4~oxo-3·^-dihydrochinazolin
sich mit Natrium- oder Kaliumbicarbonat oder mit Sodalösung vollständig ausschütteln lassen. Andere Verbindungen,
wie z. B. l-Hydroxy-2-pyridon oder 3-Hydroxy-^-methyl-2.3-dihydro-thiazol-2-thion
lösen sich bereits in Wasser und
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lassen sich dadurch besonders leicht"entfernen. Aus
schwer löslichen Peptidderivaten kann man auch mit Isopropanol,
Alkohol, Methanol, Tetrahydrofuran oder heißem Wasser die N-Hydroxyverbindungen extrahieren. Die bei der Umsetzung
entstehenden Phenole haben ähnliche Lösungseigenschafton
wie dio N-Hydroxyverbindungen und werden in der Regel zusammen mit diesen entfernt.
Die weitere Reinigung erfolgt in üblicher Weise, bei niederen Peptiden z. B. durch Verteilung zwischen einer organischen
und einer wäßrigen Phase, durch Umfallen oder Umkristallisieren aus einem geeigneten Lösungsmittel, oder durch
Chromatographie, z. B. an "Sephadex LH-20" (vernetztes, teilweise
.veräthertes Dextran-Gel) in einem organischen Lösungsmittel
oder einem organisch-wäßrigen Lösungsmittelgemisch, gegebenenfalls auch als Verteilungschromatographie in nur
teilweise mischbaren Lösungsmittel-Komponenten.
Bei höheren Peptiden oder Proteinen kann es vorteilhaft sein, die Reinigung erst nach Abspaltung der Schutzgruppon vorzunehmen,
z. B. durch isoelektrische Fällung, Kristallisation, Gegenstromverteilung, Verteilungschromatographie, Gelchroinatographie
oder präparative Elektrophorese.
Die Abspaltung der Schutzgruppen hängt von deren Natur ab und muß die Stabilität der Reaktionsprodukte der allgemeinen
Formel III bzw. der diesen Verbindungen zugrunde liegenden Peptide berücksichtigen. Sie erfolgt in der aus
der Peptidchemie bekannten Weise (siehe Schröder-Lübke,
loc. ext.).
Bei N-Acyl-peptid-aktivestern bewirkt der Zusatz von N-Hydroxyverbindungen
der allgemeinen Formel I keine Steigerung der Racemisierung, wie an Hand des Racemisierungstestes, bekannt
aus Chom. Ber. 103 (197O), Seite 788, im experimentellen Teil
gezeigt wird (siehe Tab. 2, experimenbeller Teil). Sowohl
beim Nitrophonyl- als auch beim Trichlox'phonylester war
in diesem Racemisiorungstest mit und ohno Zusatz von N-lIydroxyverbindungen
keine Racemisierung zu sehen. Anders verhielt
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sich dagegen der Pentachlorphenylester, der ein zu etwa 80 ^
racemisiertes Tripeptid lieferte. Durch Zusatz von 1-Hydroxybenzotriazol
konnte dieser starke Racemisieruiigsgrad um 26 $>
auf 5h ^o gesenkt werden. Bei Zusatz von 2-Hydroxypyridin-Natriumsalz,
war, wie schon erwähnt, der umgekehrte Effekt zu sehen: Die Racemisierung wurde noch verstärkt.
Durch den Zusatz der erfindungsgemäßen N-Hydroxyverbindungen
der allgemeinen Formel I kann man die sterische Hinderung, die manche Umsetzung mit aktivierten Estern scheitern läßt,
überwinden, so z. B. bei der Umsetzung von Nps-Isoleucinaktivestern
mit H-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH. Die Umsetzung von Nps-Ile-OTcp mit H-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH in Dimethylformamid
läßt sich nicht zu Ende verfolgen. Nach 5 Wochen wurde der Versuch abgebrochen, da sich bereits neben Endprodukt und
Ausgangsinaterial mehrere Zersetzungsprodukte dünnschichtchromatographisch
nachweisen ließen. Wurde dagegen z. B. 1-Hydroxybenzotriazol, 3-Hydroxy-^-oxo-3·^-dihydrochinazolin
oder l-IIydroxy-2-pyridon zugesetzt, war die Reaktion schon
nach 15-20 Stunden beendet (siehe Tab. 3t experimenteller Teil)
Die enorme katalytische Kraft dieser N-Hydroxyverbindungen läßt sich auch in der Festkörperpeptidkondensationsmethode
nutzbar machen. Z. B. kann man nach J. Amer. Chem. Soc. 90
(1966), Seite 2953 aus N-geschützten Aminosäuren und einem Poly-4~hydroxy-3-nitro-styrol-harz die entsprechenden unlöslichen
Ester herstellen, die dann mit löslichen Aminoverbindungen zu den entsprechenden Amiden oder Peptiden reagieren.
Durch Anwendung der erfindungsgemäßen N-Hydroxyverbindungen
lassen sich die Reaktionszeiten stark verkürzen. Auch bei der abgewandelten Merrifield-Festkörper-Methode, bei der oft
N-geschützte Aminosäureaktivester wie z. B. Nitrophenylester eingesetzt werden, erhöhen die erfindungsgemäßen Zusätze
die Ausbeute und verkürzen die Reaktionszeit.
Gerade die Steigerung der Ausbeute ist bei der Festkörpermethode
für den Erfolg derartiger Synthesen ausschlaggebend.
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Bei der Synthese eines sterisch stark gehinderten Pentapeptids aus der Sequenz der Insuliii-A-Kette zeigt sich
der Vorteil des erfindungsgemäßen Zusatzstoffe(vgl. Beispiel
1o). Damit wurde erstmals eine Methode gefunden, durch welche
die bei der Festkörpersynthese besonders hervortretende sterische Hinderung überwunden werden kann.
Das neue Verfahren ist nicht nur bei kleineren Peptiden von Vorteil. Auch große Peptide, wie das N^ ',N^ ^-Bis-Boc-Insulin
(Hoppe-Seyler«s Z. physiol. Chem. 352 (1971),
7), ein kompliziertes Peptid aus 5I Aminosäuren, lassen
sich in wenigen Minuten glatt mit N-Acylaminosäure- und N-Acylpeptidaktivestern
zu den entsprechenden N^ '-N-Acylaminosäure
bzw. Nv '-N-Acylpeptid-N ', Nv ^'-Bis-Boc-Insulinen
umsetzen.
Verbindungen der allgemeinen Formel III können auch Proteine sein, deren freie Aminogruppen ganz oder teilweise mit den
Verbindungen der allgemeinen Formel II reagieren. Bei extrem ungünstigen Löslichkeitsverhältnissen bewährt sich z. B.
wässriges Dimethylformamid sehr gut. Geeignete Proteine sind
z. B. Gelatine, die teilweise abgebaut sein kann, Serumalbuinin oder Casein.
Nach Abspaltung der Schutzgruppen besitzen z. B. Reaktionsprodukte
aus Verbindungen der allgemeinen Formel II mit N , N^ '-Bis-Boc-Insulin bei hoher biologischer Wirkung
veränderte physikalisch-chemisch und immunologische Eigenschaften,
die für die Herstellung neuer Insulin-Zubereitungen vorteilhaft sind. Reaktionsprodukte aus Verbindungen der
allgemeinen Formel II mit Proteinen können gegebenenfalls nach
Abspaltung der Schutzgruppen zur Erzeugung von Antigenen gegenüber den diesen Verbindungen der Formel II zugrunde liegenden
Aminosäuren oder ^eptiden dienen.
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Als Bausteine der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellten Peptide kommen alle in natürlich vorkommenden
Peptiden anzutreffenden Aminosäuren in ihrer L- oder D-Form infrage. A11Ci1 d±e Verwendung von ß-Aminosäuren, wie z. ^.
ß-Alanin, oder andere nur synthetisch oder halbsynthetisch
zugängliche Aminosäuren, z. B. c£-Methylalanin,^-Methyl-3·^-
dioxy-L-phenylalanin oder ß-Chloralanin ist möglich.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders vorteilhaft. Die langen Raktionszeiten, die bisher in vielen Fällen erforderlich
waren, werden auf wenige Minuten herabgesetzt. Dies gilt z. B. als besonderer Vorteil für die Nitrophenylestermethode,
die eine der meist verwendeten Peptidkondensationsmethoden darstellt.
Vor allem bei der industriellen Herstellung von Peptiden bedeutet das erfindungsgemäße Verfahren einen großen Fortschritt,
da die in der Zeiteinheit durchgesetzte Menge außerordentlich stark erhöht werden kann.
Es ist ferner einbesonderer Vorteil des erfindungsgemäßen
Verfahrens, daß die Katalyse durch die erfindungsgemäßen
N-Hydroxyverbindungen vor allem in den oben genannten stark polaren Lösungsmitteln voll zur Geltung kommt, die wegen
ihrer guten Lösungseigenschaften allein für die Synthese
höherer Peptide infrage kommen.
Die nach diesem Verfahren hergestellten Peptide können nach Abspaltung der Schutzgruppen als Therapeutica Verwendung
finden oder als Z\\rischenprodukte zur Herstellung anderer
therapetitisch wertvoller Peptide, wie z. B. Oxytocin, Vasopressin,
Glucagon, Secretin, ACTH, Thyrocalcitonin, Gastrin, TRH, LR oder Insulin eingesetzt werden.
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- ΛΛ -
In der Beschreibung und in den Beispielen werden die Aminosäuren
nach den international gültigen Regeln abgekürzt. Außerdem werden folgende Abkürzungen verwendet:
Bo c | tert.-Butyloxycarbonyl- |
Z | Benzyloxycarbonyl- |
Np s | o-Nitrophenylsulfenyl- |
OBu* | tert t-Butylester |
OMe | Methylester |
OBzI | Benzylester |
ONp | p-Nitrophenylester |
OTcp | 2.h.5-Trichlorphenylester |
OPcp | Pentachlorphenylester |
OSu | N-Hydroxysuccinimidester |
Trt | Trityl- |
Bu* | tert.-Butyl- |
Mbh | k.kx -Dimethox3'-benzhydryl |
CHA | Cyclohexylamin |
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Beispiel 1:
Ermittlung der Halbwertszeit bei der Synthese von Z-VaI-cyclohexylamid
aus molaren Mengen Z-VaI-ONp und Cyclohexylamin unter Zusatz verschiedener N-Hydroxyverbindungen und
die Abhängigkeit der Halbwertszeit vom pK-Wert der N-Hydroxyverbindungen.
a) Festlegung der Halbwertszeit
Lösung I: O.5 nMol Cyclohexylamin, 0.5 nMol p-Nitrophenol
und 1.0 nMol N-Hydroxyverbindung pro ml Dimethylformamid.
Lösung II: 1.0 nMol p-Nitrophenol pro ml Dimethylformamid
Lösung III: 1.0 nMol N-Hydroxyverbindung pro ml Dimethylformamid.
Die UV-Kurven (Bereich 330-300 m) der Lösungen I, II und III
werden miteinander verglichen, um die günstige Wellenlänge für die Messung des p-Nitrophenols herauszufinden. Bei
dieser Wellenlänge wird die Extinktion gemessen. Zu dem von Lösung I erhaltenen Wert werden 50 $ dei" Extinktion
einer Lösung von 1 nMol Z-VaI-ONp und 1 nMol Triäthylamin pro ml Lsgm. bei der oben gewählten Wellenlänge addiert.
Die Summe dieser beiden Extinktionen repräsentiert die Extinktion bei der sich die Hälfte des Z-VaI-ONp mit dem
Cyclohexylamin umgesetzt hat.
Die UV-Kurven wurden an einem '-'Beckmann TK 1A"-Apparat bei 21 gemessen. Die Substanzen waren in Dimethylformamid gelöst
.
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b) Messung der Halbwertszeit
Zur kinetischen Messung der Halbwertszeit t 1/2 wird eine Lösung von 1 nMol Z-VaI-ONp, InMoI Cyclohexylamin und 1
nMol N-Hydroxyverbindung pro ml Lösungsmittel bei der unter
a) bestimmten Wellenlänge gemessen. Die Zeit, in dem die unter a) festgelegte Extinktionshöhe erreicht wird, entspricht
der Halbwertszeit der Reaktion.
c) Messung der pK-Werte in 0.5 m Lösung (Diäthylenglykoldi-
methyläther/Vasser wie 6;
h)
bei 30
0.5 mMol Substanz werden in einer Mischung aus 6 ml Diäthylenglykoldimethyläther,
2.5 ml O.ln NaOH und 1.5 ml Wasser gelöst und im Thermostat auf 30 erwärmt. Mittels einer
EinStab-Glaselektrode wird potentiometrisch der pH-Wert gemessen. Nach der Näherungsformel pH - pK = Ig <ii/l-ct ist für
ot= 0.5: pK = pH.
Der oben gemessene pH-Wert stellt also den pK-Wert dieser
Verbindung dar.
d) Tabelle 1:
Vergleich der Halbwertszeiten bei der Synthese von Z-VaI-cyclohexylamid
aus molaren Mengen Z-VaI-ONp und Cyclohexylamin mit den pK-Werten der zugesetzten N-Hydroxyverbindungen.
Verbindung pK t /„(Min.)
ohne Zusatz
l-IIydroxy-'l-methyl~6-isopropyl-2-pyridon
3- Hydroxy -2 -methyl- h -oxo- 3· 'f—dihydrochinazolin
3-IIydroxy-'l-oxo-3. 'i-dihytlroxy-chinazolin
l-lIydroxy-3. h . 6- triinethyl-2-pyx*:idon
l-\\yuroxy ~h. 6-diinethyl-2-pyrJ don
l-llydroxy-.-'l-methyl-2-pyridon 1 --Hydroxy- '.'_ -pyi- idoi>
3-llydroxy-'l-mo thy 1-2 . 3-d:L}iydroxy-tli Lazo J -
309835/1
— | 112.0 |
5.9 | 125.0 |
h.ik | 19.0 |
i|.11 | 1.9 |
^t. 10 | ca.0.25 |
^. 09 | 1-Ί.8 |
4.09 | 5.9 |
h.O8 | 3.2 |
k . 08 | 1.3 |
^i. 08 | 1.5 |
Verbindung pK t^ ^2(Min.)
2-thi.oji
l-HydroxyOö-dichlor-^t.o-dimethyl- 4.05 4.0
2-pyridon
l-Hydroxy-2-oxo-2.3-dihydro-6-chlor- 4.05 1-5
indol
Essigsäure (zum Vergleich) 4.05 6θ.Ο
N-Hydroxysuccinimid 4.04 4.8
l-Hydroxy-5·6~dimethyl-benzotriazol 4.02 2.1
l-Hydroxy-5-methyl-benzotriazol 4.02 2.8
l-Hydroxy-6-methoxy-benzotriazol 4.00 2.0
l-Hydroxy~5-niethoxy-beiizotriazol 4.00 "},6
l-Hydroxy-4-methyl-benzotriazol 4.00 3.0
1-Hydroxy-benzotriazol 4.00 3·5
3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3- 4.00 18.0
benzotriazin
l-Hydroxy-6-broDi-benzotriazol 3· 91 8.9
l-llydroxy-ö-chlor-benzotriazol 3« 90 10.6
l-Hydroxy-5-chlor-benzotriazol 3.89 I3.Q
l-Hydroxy-6-trifluormethyl-benzotriazol 3· 72 39.0
l-Hydroxy-5.6-dichlorbenzotriazol 3· 7 35.0
l-Hydroxy-6-nitro-benzotriazol 3*51 sehr lang
sam
309835/ 1133
Beispiel 2;
Gaschromatοgraphiseher Kacemisierungstest nach. F. ¥eygand
et. al.(Chem. Ber. 22. (^966), Seite 1^51-1^60; Chem. Ber.
103 (1970), Seite 788-798)
a) HBr»H-Phe-0Np
k.2 g Z-Phe-ONp werden in 10 ml Eisessig suspendiert. Dazu
gibt man 10 ml ges. HBr/Eisessig und rührt eine Stunde bei
Raumtemp. Danach fällt man das Hydrobromid mit viel Äther
aus und wäscht gut mit Äther nach. Ausb. 3· 5 g» Schmp. 216-219°.
b) HBr«H-Phe-OPcp
5.^7 e Z-Phe-OPcp werden analog Ia behandelt.
Ausb. 4.1 g, Schmp. 205° u. Zers.
c) HBr'H-Phe-OTcp
g Z-Phe-OTcp werden analog Ia behandelt. Ausbeute h,2 g, Schmp. 220 u. Zers.
d) Boc-Leu-Phe-ONp
2.^9 g Boc-Leu-OH·1 HpO werden in Essigester gelöst. Der
Essigester wird mit Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und
der Rückstand am Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wird in 20 ml absolutem Tetrahydrofuran gelöst und die Lösung auf
-10 abgekühlt. Unter Rühren läßt man nun bei Eiskühlung 1.2 ml N-Ätnylmorpholin und anschließend eine Lösung von 1.27 g
Chlorameisensäureisobutylester in wenig kaltem Tetrahydrofuran zutropfen. Man rührt 10 Minuten bei -10 , gibt dann
3.35 e HBr'H-Phe-ONp zu und läßt langsam eine Lösung von
1.2 ml N-Ätbylniorpholin in 5 ml Tetrahydrofuran zutropfen.
Man läßt noch 1 Stunde bei 0 und 1 Stunde bei Raumtemperatur nachrühren, saugt vom Niederschlag ab, engt das Filtrat
ein und verreibt dan Rückstand mit Isopropanol. Ausb. 3·77 g»
Schmp. 15O~152 . Nach Umkristallisation aus Isopropanol:
309835/1 133
Ausbeute 3.10 g, Schmp. 152-153°, Δ^ζ = -32.2° (c = 1,
in Dimethylacetamid).
e) Boc-Leu-Phe-OPcp
Aus 1.97 g Boc-Leu-OH·1 HO, 0.93 ml N-Äthylmorpholin und
1,0 g Chlorameisensäureisobutylester wurde analog Id das gemischte Anhydrid hergestellt, das analog Id mit 3*55 g
HBr*H-Phe-OPcp und 0.93 ml N-Äthylmorpholin umgesetzt wurde.
Ausb. 3·35 Bt Schmp. 1^5-1^7-· Nach Umkristallisation aus
Isopropanol: Ausb. 2.11 g, Schmp. 163-16^°, £oC_J-q = -29.1°
(c = 1, in Dimethylacetamid)
f) Boc-Leu-Phe-OTcp
Aus 2.3 g Boc-Leu-OH'l HO, 1,1 ml N-Äthylmorpholin und
1*17 g Chlorameisensäureisobutylester wurde analog Id das
gemischte Anhydrid hergestellt, das analog Id mit 3.6 g HBr«H-Phe-OTcp und 1.1 ml N-Äthylmorpholin umgesetzt wurde.
Ausb. 3*7 g» Schmp. 1^3-1^5 · Nach Umkristallisation aus
Isopropanol: Ausb. 3.2 g, Schmp. 150-151°, /~a£_7 = - ^8.4°
(c = 1, in Dimethylacetamid)
t
VaI-OBu aus den Boc-Leu-Phe-Aktivestern
VaI-OBu aus den Boc-Leu-Phe-Aktivestern
Zu einer Lösung von 105 mg (0.5 mMol) HClΊΙ-Val-OBu in
2.5 ml 0.2 m N-Äthylmorpholin/Dimethylacetamid-Lösung gibt
man den katalysierenden Zusatz (l-Hydroxybenzotriazol oder
2-Hydroxy-pyridin-Natriumsalz) und 0.5 mMol des entsprechenden
Boc-Leu-Phe-Aktivesters (25Ο mg Boc-Leu-Phe-ONp,
313 mg Boc-Leu-Phe-OPcp,279 mg Boc-Leu-Phe-OTcp). Man läßt
die in Tabelle 2 angegebene Zeit stehen, verdünnt mit 50 ml
Essigester, schüttelt die Essigesterlösung mit NaIiCO -Lösung, KHSO.-Lösung, NaHCO -Lösung und NaCl-Lösung aus, trocknet
mit Natriumsulfat und engt ein.
30S835/1133
Der Rückstand wird analog Chem. Ber. 103 (197O), Sexte
788-798 und Chem. Ber. <?£ (1966), Seite I.45I-1U6O partialhydrolysiert,
trifluoracetyliert und gaschromatographiert, Die Ergebnisse der gaschromatograpliischen Racemisierungs.
ermittlung sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.
Racemisierungsuntersuchungen bei der Synthese von Boc-Leu-Phe-Val-OBu*
aus Boc-Leu-Phe-Aktiv-
estern und H-VaI-OBu unter dem Einfluß von Acylierungskatalysatoren
Mol-Äquiv. Reaktions-
Aktivester | Katalysator | Katalysator | zeit | % D-Phe-L-Val |
ONp | 70 Stdn. | < 2 <$> | ||
ONp | 2-Hydroxy- pyridin-Na |
1.0 | 1 Stdn. | 3.7 # |
ONp | 1-Hydroxy- benzotriazol |
1.0 | 5 Min. | <2 i |
ONp | 1-IIydroxy- benzotriazol |
0.1 | 5 Min. | {2 <$> |
OTcp | 70 Stdn. | <2 * | ||
OTcp | 2-Hydroxy- Pyridin-Na |
- | 1 Stde. | <2 $> |
OTcp | 1-Hydroxy- benzotriazol |
1.0 | 5 Min. | |
OPcp | 70 Stdn. | ho <fo | ||
OPcp | 2-Hydroxy- pyridin |
1.0 | 1 Stde. | ko io |
OPcp | 2-IIydroxy- beiizotriazol |
1.0 | 5 Min. | 27 $> |
OTcp | 3. ^-dihydro- chin a ζ ο Hn |
oxo-1.0 | JO Min. | <** |
OTcp | 3-IIydroxy-?- uio lh y 1 -- Ί - ο χ ο |
1.0 | 10 Min. |
309835/1133
Mol-Äquiv. Reaktions- t^U/D I J
Aktivester Katalysator Katalysator zeit $ D-Phe-L-Val
3.4-dihydrochinazolin
OTcp l-Hydroxy-2- 1.0 10 Min. <2
pyridon ι
Beispiel 3;
Synthese von Np.s~Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-0H
a) Herstellung der Nps,-Ile-aktivester
Rückstand wird aus Isopropanol umkristallisiert.
,o
Molare Mengen Nps-Isoleucin und Trichlorphenol bzw. N-Hydroxysuccinimid
werden in Essigester bei 0 mit einem leich1
Überschuß Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) umgesetzt. Man läßt eine Stunde bei 0 , dann 3 Stdn. bei Raumtemperatur rühren,
saugt den Niederschlag ab und engt das Filtrat ein. Der Rückstand wird aus Isoprop;
Nps-Ile-OTcp, Schmp. 95-97*
Nps-Ile-OSu, Schmp. 105-108°
Nps-Ile-OTcp, Schmp. 95-97*
Nps-Ile-OSu, Schmp. 105-108°
b) Nps-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH
2.9 S (5 niMol) H-Cys(Trt)-Ser-Leu-0H'H20 (hergestellt nach
Chem. Ber. 103 (197O), Seite 2039) und 8I5 mg (5 mMol) 1-Hydroxy-5.ö-dimethyl-benzotx'iazol
werden in 25 ml Dimethylformamid gelöst. Dazu gibt man 2.32 g (5 mMol) Nps-Ile-OTcp
und läßt 15 Stunden bei Raumtemperatur stehen. (Nach dieser
Zeit konnte das Ausgangstripeptid nicht mehr dünnsichtchromatographisch nachgewiesen werden). Das Dimethylformamid
wird im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit Natriumbicarbonatlösung
verrieben. Der Niederschlag wird abgesaugt und das Filtrat verworfen. Der Niederschlag" wird im Essigester
gelöst und mit KHSOi-Lösung und Wasser ausgeschüttelt, mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand
wird mit Äter· verrieben. Das Produkt ist amorph. Ausb. 3.6 g (82 %) , rcLj^- -23.5° (c-1, in D iniei hylacetamid)
309835/1133
c) Dünnschichtchromatofcraphische Überprüfung der Synthese
von Nps-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH aus Nps-Ile-OTcp bzw.Nps-
lle— OSu und H-Cys(Trt)-Ser-Leu-0H unter Verwendung verschiedener N-Hydroxyverbindungen als Katalysator
Zu einer Lösung von 116,3 mg (0.2 mMol) H-Cys(Trt)-Ser-Leu-
ΟΗ·Η2Ο in 2 ml Dimethylformamid gibt man 0.2 mMol der N-Hydroxyverbindung
und 111 mg (0.22) Nps-Ile-OTcp bzw. 89«2 mg (0.2*1 mMol) Nps-Ile-OSu. In verschiedenen Zeitabständen wird
ein Tropfen der Reaktionslösung auf eine Dünnschicht-Kieselgelplatte (Merck, "Kieselgel F 25^") aufgetragen. Man läßt
in einer* Mischung Methylenchlorid/Methanol wie 8:2 laufen und entwickelt mit Ninhydrin. In der Tabelle 3 sind die Ergebnisse
dieser Untersuchung zusammengefaßt.
309835/1133
d) Tabelle 3:
Synthese von Nps-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH aus Nps-Tle-OTcp
bzw. Nps-Ile-OSu und H-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH unter Verwendung
verschiedener N-Hydroxyverbindungen als Katalysatoren
Ester N -Hydroxyverbindung
Ende der Reaktion (Reaktionszeit)
OTcp OTc ρ OTcp OTcp OTcp OTcp OTcp
OTcp OTcp
3-Hydroxy-^-oxo-3.4-dihydrochinazolin
1-Hydroxybenzotriazol
3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydrochinazolin
nach 5 Wochen abgebrochen, da noch keine vollständige
Umsetzung festzustellen war.
ca. 15 Stunden ca. 15 Stunden
3-Hydroxy-2-methyl-4-oxo-3.^- ca. 7 Tage
dihydro-chinazolin
3-Hydroxy-4-oxo-2-phenyl--3. h- ca. 7 Tage
dihydro-chinazolin
l-Hydroxy-5.6-dimethyl-benzo- ca. 20 Stunden
triazol
l-Hydroxy-2-pyridon
ca. 20 Stunden
l-Hydroxy-4-methyl-2-pyridon ca. 20 Stunden
l-IIydroxy^.^-dimetliyl^- ca. k Tage
pyridon
309335/1133
a. Mit einem Äquivalent l-Hydroxybenzotriazol und Z-Phe-OPcp
Zu einer Lösung von 0.92 g (5.5 mMol) HClΉ-Val-OMe, O.72 ml
N-Äthylmorpholin und 675 mg (5 mMol) 1-Hydroxybenzotrlazol
in 10 ml Dimethylformamid gibt man 2.75 g (5 mMol) Z-Phe-OPcp,
Man rührt 5 Minuten, engt im Hochvakuum ein, verteilt den Rückstand zwischen Essigester und 2n Sodalösung, schüttelt
ein mal mit KHSO.-Lösung, drei mal mit 2n Sodalösung und ein mal mit Wasser aus, trocknet mit Natriumsulfat, engt ein und
verreibt den Rückstand mit Petroläther. Ausb. 2.08 g, Schmp. 99-104 . Nach Umkristallisation aus Essigester/Petroläther:
Ausb. 1.7 g (83 #), Schmp. 112-114°.
b. Mit 0.1 Äquivalent l-Hydroxybenzotriazol und Z-Phe-OTcp
Zu einer Lösung von 0.92 g (5.5 mMol) HCl·H-VaI-OMe, 0.72 ml
N-Äthylmorpholin und 67·5 mg (0.5 mMol) 1-Hydroxybeiizotriazol
in 10 ml Dimethylformamid gibt man 2.4 g (5 mMol) Z-Phe-OTcp.
Man rührt 5 Minuten und arbeitet wie bei a) auf Ausb. 1.66 g (81 %), Schmp. 112-114°.
c. Mit einem Äquivalent 1-Hydroxybenzotriazol-Natriunisalz
und Z-Phe-ONp
Zu einer Lösung von O.92 g (5.5 mMol) HCl-H-VaI-OMe in 10 ml
Dimethylformamid gibt man 865 mg (5·5 mMol) l-Hydroxybenzotriazol-Natriumsalz
und 2.1 g (5 mMol) Z-Phe-ONp. Man rührt 5 Minuten und arbeitet wie bei Versuch a) auf Ausb. I.65 g
(80 %), Schmp. 116°.
Zu einer Lösung von 0.92 g (5.5 mMol) HCl·H-VaI-OMe in 10 ml
Dimethylformamid gibt man 865 mg (5·5 mMol) 1-Hyd.roxybenzotriazol-NatrJumsalü
und 1.87 g (5 mMol) Z-VaI-ONp. Man rührt
5 Minuten und arbeitet wie bei. Hei.spiel '1I z\ auΓ. Ausb. 1.66 g
(91 ί'), Schmp. 108-110°.
309835/1133
Synthese von Z-Leu-GlufORu*)-Asn(Mbh)-Tyr (B^) -OH
(Sequenz aus der Insulin-A-Kette)
Zu einer Lösung von 1»53 S (2 mMol) H-GIu(OBu )-Asn(Mbh)-Tyr
(Du )-OH und 27O mg 1-Hydroxybenzotriazol (2 mMol) in 5 ml
Dimethylformamid gibt man 1.5 g Z-Leu-OPcp (2.2 mMol), läßt 10 Minuten stehen und engt im Hochvakuum ein. Der Rückstand
wird mit 2n Sodalösung verrieben. Die Sodalösung wird abdekantiert und der Rückstand mit Wasser verrieben. Nun wird
abgesaugt und das Filtergut zwischen einer 2.5-proz. KHSO.-Lösung und Essigester verteilt.· Die Essigesterlösung wird
getrocknet, und eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther/ Petroläther (l:l) verrieben und abgesaugt. Ausb. 1.8 g (89 $)
Schmp. 17^-176°.
Diese Verbindung ist dünnschichtchromatographisch identisch mit einer Probe, die analog mit Z-Leu-OSu hergestellt worden
war. Die Reaktionszeit war Zk Stunden und die Ausbeute 8^ ^.
Zum gleichen Ergebnis gelangt man bei Verwendung von
a) 3-Hydroxy-'f-oxo-3 > ^-dihydrochinazolin
b) 1-Hydroxy-5>6-dimethyl -benzotriazol oder
c) von 1-Hydroxy-pyridon an Stelle des oben verwendeten 1-Hydroxybenzotriazols.
IJ. Herstellung der Ausgangssubstanz H-GIu(OBu )-Asn(Mbh)-Tyr(Bu^)-OH
a) Z-Asn(Mbh)-TyrfBi^)-OH
100 g Z-Asn(Mbh)-Tyr(But)-OMe (0.I38 Mol) (Chein. Ber. 103,
O97O), Seiten 20^ll-205l) werden in einer Mischung aus 770 ml
Dioxan und 200 ml Wasser suspendiert. Bei 37 läßt man langsam
138 ml In NaOlI zutropfen (Thymolphthalein als Indikator).
Nach beendeter Reaktion säuert man mit 300 ml 2n Zitronensäure
an. Das ausfallende Produkt wJ rd abgesaugt und mit. Wasser
gewä sehen. Aus Metlianol/lVassor wird umgefüllt. Ausb. H8g
(90 "/o) Snliinp. 212-213°, /j^Jj = + 7.6° (c =: 1, in DimetliyJ-
309835/1133
f ormamid) .
b) H-Asn(Mbh)-Tyr(Bu t)-OH
Durch eine Lösung von 87.5 g (O.I23 Mol) Z-Asn(Mbli)-Tyr
(Bu )-OH in Eisessig, der etwas Pd(OH) ,,/BaSOr-Katalysator
zugesetzt wird,gleitet man so lange Wasserstoff bis keine COp-Entwicklung feststellbar ist. Man engt ein und verreibt
den Rückstand gründlich mit gesättigter Natriumacetat-Lösung. Maxi saugt ab, trocknet über P„0_ und fällt aus Tetrahydrofuran/Petroläther
um. Ausb. 63.5 g (90 $>) , Schmp, 207-209°,
£*ij-^ = + 11·1 (c = 1, in Eisessig).
c) Z-GIu(OBut)-Asn(Mb)Q-Tyr(But)-OH
Zu einer Lösung von 63 g (O.IO9 Mol) H-Asn(Mbh)-Tyr(Bu )-0H
in 25Ο ml Dimethylformamid gibt man bei Räumtemperatur
k-J.h g (O.IO9 Mol) Z-GIu (OBu1)-OSu und läßt 20 Stunden bei
Raumtemperatur stehen. Danach wird die Substanz mit Wasser ausgefällt über P?0 getrocknet und aus Essigester/Petroläther
umgefällt. Ausb. 75.5 g (77 $) , Schnip. 166-170°,
2f^_7T) = + 1.8 (c = 1, in Dimethylformamid).
d) H-GIu(03ut)-Asn(Mbh)-Tyr(Bu t)-OH
7^.7 g (83.3 mMol) Z-Glu(OBut)-Asn(Mbh)-Tyr(But)-OII werden
in einer Mischung aus 4θΟ ml Eisessig und hOO ml Methanol gelöst
und wie bei b_) katalytisch hydriert und aufgearbeitet.
Zur Reinigung wird die Substanz einmal mit Wasser aufgekocht, abgesaugt und getrocknet. Durch Aufkochen mit Essigester kann
die Substanz noch weiter gereinigt werden. Ausb. 53·^ g
(81* i>), Schnip. 221-223°, C^J? Ώ = + 33-1° (c = 1, in Eisessig)
Synthese von Z-Gln-Glv-Leu-Val-MI
(Sequenz aus Secretin)
303835/1133
-Zk-
a) Z-LeU-VaI-NH2
Zu einer Lösung von 13 g HBr*H-VaI-NH (66 mMol) in 180 ml
Dimethylformamid gibt man 8.91 S 1-Hydroxybenzotriazol,
8.6 ml N-Äthylmorpholin und 30.8 g (60 mMol) Z-Leu-OPcp.
Man rührt 10 Minuten bei Raumtemperatur und engt anschließend im Hochvakuum ein. Der Rückstand wird nacheinander
mit 2n Sodalösung, Wasser 2.5-proz. KHSOjL-Lösung und Wasser
verrührt, abgesaugt und bei 50 über P.O getrocknet.
Ausb. 21.3 g (98 $>).
Zum gleichen Ergebnis gelangt man bei Verwendung von
a) 3-Hydroxy-U-oxo-3» 4-dihydrochinazolin
b) 1-Hydroxy-5»6-dimethyl -benzotrlazol oder
c) von 1-Hydroxy-pyridon an Stelle des oben verwendeten
1-HydroKybenzotriazols.
b) HCl-H-LeU-VaI-NH2
Zu einer Suspension von 21 g (57.8 mMol Z-LeU-VaI-NH2 in
einer Mischung aus 200 ml Dimethylformamid und 200 ml Methanol
gibt man Pd(0H)2/BaS0.- Katalysator. Unter Rühren leitet
man durch diese Reaktionsmischung Wasserstoff, wobei durch Zutropfen von In methanolischer HCl-Lösung mit Hilfe eines
Autotitrators pH 5 gehalten wird. Nachdem keine HCl-Lösung mehr aufgenommen wird, wird der Katalysator abgesaugt und
das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben, abgesaugt und bei 50 getrocknet. Ausb. 15.4 g (lOO %),
Schmp. 138-l4O . Dünnschichtchromatographisch einheitlich.
c) Z-Gly-Leu-Val-NH2
15·^ g (57.8 mMol) HCl'H-LeU-VaI-NH2 werden mit 7.52 ml
N-Äthylmorpholin und 7«88 g 1-Hydroxybenzotriazol in 120 ml
Dimethylformamid gelöst. Dazu gibt man 22.5 g Z-Gly-OTcp,
läßt 5 Minuten stehen und engt im Hochvakuum ein. Der Rückstand wird mit 2n Sodalösung verrieben, abgesaugt und gut
mit Wasser gewaschen. Man trocknet über V~0 und kocht dann
mit Essigester auf. Zur Reinigung kann aus Tetrahydrofuran/
Petroläther uingefällt werden. Ausb. 21.8 g (90 $>) , Schmp.
309835/1133
18^-186°, /"cc 7 = -12.8 (c = 1, in Dimethylacetamid)
d) HCl*H-Gly-Leu-Val-NH2
20.Ö g (47.6 mMol) Z-Gly-Leu-Val-NH werden wie bei b) in
200 ml einer Methanol/Dimethylformamid-Mischung (l : l)
katalytisch hydriert und aufgearbeitet. Die Substanz ist etwas hygroskopisch und wird zur Reinigung aus Methanol/
Xther umgefällt. Getrocknet wird über P2 0E und Para:fflnschnitzel.
Ausb. 13·5 g (88 #), Schmp. 209-211°.
β) Z-Gln-Gly-Leu-Val-NH
Zu einer Lösung von 3.23 g (lO mMol) HCl'H-Gly-Leu-Val-NH2,
1.3 ml N-Äthylmorpholin und I.35 g (lO mMol) 1-Hydroxybenzotriazol
in 20 ml Dimethylformamid gibt man h g (lO mMol)
Z-GIn-ONp und läßt 10 Minuten stehen. Es fällt eine Gallerte aus. Mit Xther wird verdünnt und die ausgefallene Substanz
abgesaugt. Nun wird kurz getrocknet und mit 2n Sodalösung verrührt. Mit Wasser, KHSO.-Lösung und Wasser wird gewaschen,
über P2 0E getrocknet und mit Essigester aufgekocht. Man
läßt auf Raumtemperatur abkühlen, saugt ab und wäscht mit Essigester und Petroläther nach. Bei 40-50 wird über P2 0-
und Paraffinschnitzel getrocknet. Ausb. 5 S (91 $)1 Schmp.
242°-2^4°, ßQ^ = -25.2° (c = 1, in Eisessig)
Zum gleichen Ergebnis gelangt man bei Verwendung von
a) 3-Hydroxy-4-oxo-3iU-dihydrochinazolin
b) 1-Hydroxy-5,6- dimethyl-benzotriazol oder
c) von 1-Hydroxy-pyridon an Stelle des oben verwendeten 1-Hydroxybenzotriazols.
Synthese von Z-Pro-Ile-Gly-NH«
a) Z-IIe-GIy-NH2
hk.k s (O.l Mol) Z-Ile-OTcp und 11 g (O.l Mol) HClTI-GIy-NH2 worden zusammen mit 1.6 g (lO mMol) 3~Hydroxy-*l~oxo-3. *f-dihydrochinazolin
und I30 ml N-Äthylmorpholin in 7ΟΟ-8ΟΟ ml
309835/1133
Dimethylformamid gelöst. Danach wird im Hochvakuum eingeengt
und der Rückstand mit Natriumbicarbonat-Lösung verrieben,
abgesaugt, mit Wasser gewaschen, getrocknet und zur weiteren Reinigung in Dimethylformamid gelöst und mit einer
Mischung aus Äther/Petroläther (l:l) gefällt. Ausb. 28.5 g, Schmp. 202°, /=L/D = +8.1° (c=l, Dimethylacetamid)
C16H2 N3O2+ (321.4) Ber. C 59.80 H 7.21 N I3.O8
Gef. 59.6 7.2 12.8
b) Z-Pro-Ile-Gly-NH2
Zu einer Lösung von 20 g (62.2 mMol) Z-IIe-GIy-NH0 in
600 ml Methanol/Dimethylformamid (3^^) gibt man etwas
Pd(OH)2/BaSO^-Katalysator. Unter Rühren leitet man durch
diese Reaktionsmischung Wasserstoff, wobei durch Zutropfen von In methanolischer HCl mit Hilfe eines Autotitrators
pH Ί.5 gehalten wird. Nachdem keine HCl-Lösung mehr aufgenommen
wird, wird der Katalysator abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird in 100 ml Dimethylformamid
gelöst. Dazu gibt man 23 g (62 mMol) Z-Pro-ONp, 8.1 ml N-Äthylmorpholin und I.5 g (9·^ mMol) 3-Hydroxy-4-oxo-3·4-dihydrochinazolin.
Man rührt I5 Minuten und engt anschließend am Hochvakuum ein. Der Rückstand wird mit Essigester aufgenommen
und gekühlt. Es fällt ein Niederschlag aus, der abgesaugt und nacheinander mit Natriumbicarbonat-Lösung, 2n HCl
und Wasser verrieben wird. Nun wird getrocknet und zur weiteren Reinigung gut mit Essigester verrieben, abgesaugt
und getrocknet. Ausb. 20.7 E (8o #)t Schmp. 182-18U ,
= -63.2° (c = 1, Methanol)
Zum gleichen Ergebnis gelangt man bei Verwendung von
a) 1-Hydroxy-4-methyl-2-pyridoii
b) 1-Hydroxy-6-methoxy-benzbtriazol oder
c) 1-Hvdroxy-5-methyl-benzotriazol an Stelle des oben verwendeten
Chinazolin-derivates.
309835/1133
Synthese von
Z-Asp(OBu )-PIie-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr
■:. Trr>-Leu-Ile-Asn-Thr(Bu )-0Bu
a) Z-Asn-Thr(But)-OBut
U2.85 g (16I mMol) Z-Asn-OH, 43 g (I6I mMol) öliger
HCl·H-Thr(Bu )-0Bu (gewonnen durch katalytische Hydrierung von Z-Thr(Bu )-OBu unter Zugabe von methanolischer HCl bei einem pH von h.$) und 21.75 S
(161 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol werden in 325 ml
Dimethylformamid gelöst. Dazu gibt man 21 ml N-Äthylmorpholin und bei 0 eine kalte Lösung von 35·^5 S
Dicyclohexylcarbodiimid in 80 ml Dimethylformamid.
Man läßt 1 Stde. bei 0 und 1 Stde. bei Raumtemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab und engt das
Filtrat im Hochvakuum ein. Der Rückstand wird zwischen Essigester und NaH^O,,-Lösung verteilt. Die organische
Phase wird mit 2.5-proz. KHSO.—Lösung, ges, NaIIC(X-
Lösung und Wasser ausgeschüttelt, tu Ί t Nat x'itim sulfat
getrocknet und eingeengt. Mit Petrolätlit-r wij?d verrieben
und abgesaugt. Ausb. 65·8 g, Schmp« 110-115* . Aus
Essigester/Petroläther wird umkristallisiert. Ausb. 52 Λ s (68 #) , Schmp. 120-122°, /öoj^ - - 7.6°
(c = 1, Methanol)
b) HCltH-Asn-Thr(But)-OBut
Zu einer Lösung von kh.J g (93.2 mMol) Z-Asn-Thr(Bu )-
OBu* in 3OO ml Methanol gibt man etwas Pd(O1O2/1361801*-
Katalysator. Unter Kühren leitet man durch diese
Reaktionsmischung Wasserstoff, wobei durch ^utropfen
von In methanolischer salzsäitre mit Hilfe eines -^utctitratoi's
pH h. 5 gehalten wird. Nachdem keine ^'l-Lüsung
mehr aufgenommen wird, wird der Katalysator abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wizxl in Ather
gelöst, von venig UnIOs].ichem filtriert und über
309835/1133
Nacht in den Eisschrank gestellt.
Anderntags wird der ausgefallene Niederschlag abgesaugt
und mit Äther gewaschen. Ausb. 33«65 g (95·6 $),
Schmp. 11°-113°, LyL_/^ = -2.6° (c = 1, Methanol)
C16H32N3°5C1 (382)Ber. C 50.32 H 8.^5 N 11.Ol
5O.O 9.O 1O.9
c) Z-ile-Asn-Thr(But)-OBut
Zu einer Lösung von 21.8 g (82 mMol) Z-IIe-OH, 31,3 E
(82 mMol) Hci«H-Asn-Thr(But)-OBut, 11.1 g 1-Hydroxybenzotriazol
und 10.7 ml N-Äthylmorpholin in I50 ml
Dimethylformamid gibt man bei 0 eine kalte Lösung
von I8.I g Dicyclohexylcarbodiimid in 70 ml Dimethylformamid.
Man läßt 1 ^tde. bei 0 und eine S^de. bei
Raumtemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab und engt das ^iltrat ein. Man arbeitet wie bei a. auf. Das
resultierende Produkt wird in I50 ml Essigester gelöst,
von Unlöslichem filtriert und in 75^ ml etroläther
eingerührt. Ausb. ^2«27 g (67 #) ,
Sclimp. M-lk6°, loLJ\ - -2O.50 (c = 1, Methanol)
C3OH48N4°8 (592.75) Ber. C 60,82 H 8,15 N 9.^6
Gef. 6O.9 8.4 9.2
d) HC1.H-He-Asn-Thr (But ) -OBu*
38.6 g (65.2 mMol) Z-1Ie-ASn-^lIr(3U*J-OBu* werden wie
bei b in ^ethanol katalytisch hydriert, ^ie Substanz ist
ätherlöslich .und ergibt am Hochvakuum ein amorphes Produkt. Ausb. 33.2 g (1OO #) , Jj*~J^ = +5.9° (c = 1,
Methanol)
C22H213ClN4O6 (495.O7) Ber. C 53.37 H 8.76 N 11.31
Gef. 53.0 9.O IO.9
e) Z-Leu-Ile-Asn-Thr(Bu*)-OBu*
Zu einer Lösung von l6.h g (6I.8 mMol) Z-Leu-OH,
3O.6 g (6I.8 niMol) HCl'II-Ile-Asn-Thr(Bu*)-OBut,
8.34 g 1-Hydroxybenzotriazol und 8.1 ml N-Äthylmorpholin
in 150 ml Dimethylformamid gibt man bei 0 eine kalte
Lösung von 13.6 g Dicyclohexylcarbodiimid in 60 ml Di-
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methylformamid. Man läßt 1 Stde. bei 0° und eine Stde. bei
Raumtemperatur rühren und arbeitet vie bei a auf. Die Substanz wird mit Petroläther verrieben und abgesaugt.
Ausb. 39.3 g, Schmp. 173-176°. Aus Essigester/Petroläther wird umgefälltj Ausbeute 37·5 g (86 $), Schmp. 173-176°,
JjkJ^* = -3^-3° (c = 1, Methanol)
C5H9N O9 (705.9) Ber. C 6I.26 H 8.^2 N 9·92
C5H9N O9 (705.9) Ber. C 6I.26 H 8.^2 N 9·92
Gef. 61Λ 8.7 9.9 f) HCl'H-Leu-Ile-Asn-Thr(But)-0But
35.2 g (50 mMol) Z-Leu-Ile-Asn-Thr(But)-OBut werden wie
bei b katalytisch in Methanol hydriert. Die Substanz kristallisiert beim Verreiben mit Äther, Ausb. 28.5 g
(9k $>) Schmp. I92-I930 Zers. , ^.7^° = -17-9° (c = 1,
Methanol) CggH ^ClN 0 (608.2) Ber. C 55.26 H 8.96 N II.5I
Gef. 55.3 9.0 11.4
s)
Z-Trp-Le-n-Ile-Asn-ThrfBu
)-QBu
Zu einer Lösung von 26.2 g (hj.l mMol) HCl'H-Leu-Ile-Asn-'
Bu*)-OBu*, 14.6 g (43.I mMol) Z-Trp-OH, 5.82 g 1-Hy-
droxybenzotriazol und 5»6 ml N-Äthylmorpholin in 150 ml
Dimethylformamid gibt man bei 0 eine kalte Lösting von
9·5 Β Dicyclohexylcarbodiimid in 60 ml Dimethylformamid.
Man läßt 1 Stde. bei 0 und 1 Stde. bei Raumtemperatur rühren, saugt' vom Niederschlag ab und engt das Piltrat
ein. Der Rückstand wird mit NaHCO_-Lösuiig verrieben und
abgesaugt und getrocknet. Aus Isopropanol wird umkristallisiert.
Ausb. 33.8 g (88 $,), Schmp. 228-229°, Z"^7D = -39.5°
(c = 1, Methanol)
C47H59N7O10 (892.1) Ber. C 63.28 H 7.79 N 10.99
Gef. 63.O 7.8 10.7
h) H Cl'H-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr(But)-OBut
3I.2 g (35 mMol) Z-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr(Bu )-0Bu werden
in 200 ml Dimethylformamid/Methanol (l:l)wie bei b_ katalytisch
hydriert. Der Rückstand wird mit Äther verrieben. Ausb. 27.2 g (98 $), Schmp. 215° Zers.
^O _ _28.0° (c = 1, Methanol)
D
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Eine Probe wurde aus Methanol/Äther umgefällt: Schmp. 217°
Zers., /=*£_7q° = -28.4° (c = 1, Methanol^)
C39H5^N7O8Cl (794.^5) Ber. C 58.97 H 8.12 N 12.3
Gef. 57.2 8.2 11.8
i) Z-Phe-Val-OH
10.7 e Z-Phe-Val-OMe werden in 200 ml Dioxan/Wasser
68:2) gelöst. Mit insgesamt 27 ml In NaOH wird gegen
Thymolphthalein titriert. Mit 2n HCl wird neutralisiert und die Lösung eingeengt. Der Rückstand wird zwischen
Essigester und 2n HCl verteilt. Die Essigesterphase wird mit Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet
und eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und abgesaugt.
Ausb. 9.45 g (92 i>), Schmp. 148-149°.
Aus Essigester/Petroläther wird umgefällt; Ausb. 9·2 g,
Schmp. 148-150°, /^.7^° = -8.8° (c = 1,Methanol)
C22H26N3O (398.5) Ber. C 66.32 H 6.58 N 7-02
Gef. 66.6 6.7 7.2
k) Z-Phe-Val-Gln-OBut
Zu einer Lösung von 8.0g (20 mMol) Z-Phe-Val-OH, 4.8 g
HCl»H-Gln-OBu , 2.7 g 1-Hydroxybenzotriazol und 2.6 ml
N-Äthylmorpholin in 40 ml Dimethylformamid gibt man bei
0 eine kalte Lösung von 4.2 g Dicyclohexylcarbodiimid. Man läßt 1 Stde. bei 0 und 1 Stde. bei Raumtemperatur
rühren, saugt vom Niederschlag ab und engt das Filtrat ein. Der Rückstand wird mit NaIiCO--:
abgesaugt und mit Wasser gewaschen.
ein. Der Rückstand wird mit NaHCO_-Lösung verrieben,
Ausb. II.65 g (100 $), Schmp.219-221° Zers.
^ = -35.7° (c = 1, Methanol)
2N^O7 (582.7) Ber. C 63.9I H 7.27 N 9.6O
2N^O7 (582.7) Ber. C 63.9I H 7.27 N 9.6O
Gef. 64.2 7.7 9.7
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l) Z-Phe -VaI -GIn-OH 2/02613
11.1 g (19 mMol) Z-Phe-VaI-GIn-OBu werden in 30 ml Trifluoressigsäure
gelöst. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur
wird eingeengt und der Rückstand mit Äther verrieben und abgesaugt. Das Produkt wix-d zur weiteren Reinigung
mit Essigester aufgekocht, mit Petroläther versetzt, abgesaugt und getrocknet. Ausb. 8.45 g (85 /^)
Schmp. 225-227°, ß^J2^= -10.7° (c = 1 ,Dimethylacetamid)
C H ^N^O (526.6) Ber. C 6l. 59 H 6.5I N 10.6h
Gef. 61.6 6.7 10. h
m) Z-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr(But)-OEut
Zu einer Lösung von 7.95 g (10 mMol) HCl.H-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr(Bu
)-0Bu* und 5.27 g (10 mMol) Z-Phe-Val-GIn-OH
in 100.ml Dimethylformamid gibt man I.3 ml N-Athylmorpholin,
1«35 S 1-Hydroxybenzotriazol und bei 0 unter Rühren
eine kalte Lösung von 2.2 g Dicyclohexylcarbodiimid in 20 ml Dimethylformamid. Man läßt 1 Stde. bei 0 und
1 Stde. bei Raumtemperatur rühren. Der Niederschlag wird abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird
mit NaHCO„-Lösung verrieben und abgesaugt. Der Filterrückstand
wird mit 1 1 Äthanol aufgekocht. Schwerlöslicher Rückstand 5.6 g, Schmp. 253-255° Zers. , /*£7γ}° = -15-3°
(c = 1, Dimethylacetamid). Aus dem Alkohol kristallisierten noch 2.8 g aus: Schmp. 251-25^° Zers.
Gesamtausbeute 8.4 g (66.5 $)
Gef. 62.2 7.9 11.9
n) CH COOH*H-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr(But)-OBut
Durch eine Lösung von 7·6 g (6mMol) Z-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr(Bu
)-0Bu in 25Ο ml Eisessig, der etwas Pd(OH)„/BaSO.-Katalysator zugesetzt wird, leitet man so
lange Wasserstoff, bis sich kein C0„ mehr entwickelt.
Der Katalysator wird abgesaugt, das Filtrat eingeengt und der Rückstand mit Äther verrieben. Ausb. 7·^ g>
Schmp. 2^7-250 Zers. Das Produkt wird mit Essigestet1
ausgekocht und kalt abgesaugt. Ausb. 6.78 g (95 $>) »
Schmp. 2*18-251° Zers.
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II. Z-Asp(OBut)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr(:Bu*)^OTJln^ '^
Zu einer Suspension von 6.32 g (5-3 mMol) CH COOH'H-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr(Bu*J-OBu*
in I50 ml Dimethyl formamid gibt man 0.86 g (5· 3 mMol) 3-Hydroxy-4-oxo-3·4-dihydrochinazolin
und 2.66 g (5.3 mMol) Z-Asp(OBu )-OTcp
Nach 5 Minuten Rühren wird eingeengt und der Rückstand mit 2n Sodalösung verrieben, abgesaugt und mit Wasser
gewaschen. Der Filterrückstand wird mit Methanol ausgekocht. Schwerlöslicher Rückstand: 5.3 g, Schmp. 246-248°
Zers.; aus dem Filtrat: O.5 g, Schmp. 244-246° Zers., /^J25 = -15,0°
(c = 1, Dimethylacetamid).
Gesamtausbeute 5.8 g (76.4 $>)
Gesamtausbeute 5.8 g (76.4 $>)
12O17 (1437.7) Ber. C 61.8 H 7·57 Ν 11.69
Gef. 6I.I 7.6 II.7
Zum gleichen Ergebnis gelangt man bei Verwendung von
a) 1 -Hydroxy^-methyl^-pyridon,
b) 1-Hydroxy-6-methoxy-benzotriazol oder
c) 1-Hydroxy-5-methyl-benzotriazol
an Stelle des oben verwendeten Chinazolin-derivates
2 g nach J. Amer. Chem. Soc. £0 (1966), Seite 2953 hergestellten
Z-Phenylalanin-poIy-4-hydroxy-3-nitrostyrolharzes
(enthält 3mMol Z-Phenylalanin) werden in 5 ml
Dimethylformamid suspendiert und mit 162 mg (l mMol) 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydrochinazolin, I68 mg (l mMol)
HCl'H-Val-OMe und 0.I3 ml N-Äthylmorpholin versetzt.
Man läßt 15 Minuten rühren, saugt ab, wäscht mit Dimethylformamid nach, engt das Filtrat ein und verteilt den Rückstand
zwischen Essigester und Natriumbicarbonatlösung. Die Essigesterphase wird mit 2n HCl, Natriumbicarbonatlösung
und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet
309835/1133 original inspected
und eingeengt. Der Rückstand wird mit Petroläther verrieben, abgesäugt und getrocknet. Ausb. 390 mg
(95 i>) Schmp. 115°.
Z-Tyr-Poinsulin -(31-63)-triacontatripeptid
^O mg (lOyuMol) Triacontatripeptid-trifluoracetat, hergestellt
nach Z. Naturforsch. 2k b (1969), Seite 999, werden in 1.8 ml 90-proz. Dimethylformamid mit 26 mg (60 mMol)
Z-Tyr-ONp in Anwesenheit von 1.35 mS (lO piiol) 1-Hydroxybenzotriazol
umgesetzt. Nach I5 Min. fällt man mit Äther und filtriert den Niederschlag ab. Nach Waschen mit Äther
und Methylenchlorid erhält man 36 mg Reaktionsprodukt.
Tyrosingehalt It. Aminosäureanalyse: 1.1 Moll.
R_: O.72 in n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser (30:6:20:
2k), Papierchromatographie, aufsteigend. R„ des Triacontapeptids:
0.22.
KTB1 ' -(Boc-Leu-Phe)-n'A1', N^B29^-Bis-Boc-Insulin 120 mg Boc.-Insulin (20 «Mol), hergestellt nach Hoppe-Sey-
ler· s Z. physiol. Chem. 3^2 (1971 ), Seite 7, werden in 2 ail
Dimethylformamid mit I6.7 mg (30 uMol) Boc-Leu-Phe-OTcp
und 2.7 mg (20 uMol) 1-Hydroxybenzotriazol versetzt. Man
rührt 10 Minuten bei Raumtemperatur, fällt mit Äther, filtriert den Niederschlag ab und wäscht ihn mit Äiher.
Ausb. 117 mg.
Aminosäurealyse: Leu Ber. 7> Gef. 6.98
Phe Ber. 4, Gef. 3.96
Vanderungsstrecke in der Papierelektrophorese bei pH 2.2:
O.76 χ Insulin (BoCp-Insulin: Oe84 x Insulin).
Nach Abspaltung der Schutzgruppen durch einstündiges Behandeln mit Trifluoressigsäure und Fällen mit Äther wandert
die Verbindung in der Papierelektrophorese wie Insulin. Die Reaktionszeit ohne Zusatz von 1-Hydroxybenzotriazol
beträgt 3 Stunden und führt teilweise zur Quervernetzung.
309835/1133
Zum gleichen Ergebnis gelangt man bei Verwendung von
■ a) i-Hydroxy-^-methyl-S-pyridon,
b) 1-Hydroxy-6-methoxy-benzotriazol oder
c) 1 -Hydroxy-5-tnethyl-benzotriazol
anstelle des oben verwendeten t-IIydroxy-benzotriazols
Beispiel 13:
Boc-ßAla-Tyr-Ser-Met-Glu(OBut)-His-Phe-7lrg-Trp-Gly-OH.'4H^O
5.36 g ( 4 mMol) H-Tyr-Ser-Met-Glu(OBut)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH.4H2O,
hergestellt nach Liebigs Ann. Chem. 726 (1969),
Seite 183, werden in 5° ml Dimethylformamid mit 1.84 g (5 mMol)
Boc-ß-Ala-OTcp in Anwesenheit von 5^0 mg ( h mMol) 1-Hydroxy-
benzotriazol umgesetzt. Nach 15 Minuten fällt man mit Essigester/Äther
( 1 : 1) 5·^5 S (94 $) nahezu chromatographisch
reines Reaktionsprodukt aus, das zur völligen Reinigung aus 200 ml 60-proz. Methanol umkristallisiert wird. Ausbeute
4.92 s (81 $)· Die Verbindung ist mit der nach loc. cit. ohne
Zusatz von 1-Hydroxybenzotriazol erhaltenen identisch, die Reaktionszeit wurde jedoch von 20 Stunden auf I5 Minuten abgekürzt.
N(aCi . fc15. fc26, £ kl , S^6)_penta_(Leu.phe)_Trypsin_Kallikrein„
Inhibitor
90 mg Trypsin-Kallikrein-Inhibitor aus Rinderorganen (siehe
Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 350 (1969), Seite 1531)
werden in 2 ml Dimethylformamid suspendiert. Dazu gibt man 56 mg Boc-Leu-Phe-OTcp und 13 mg 1-Hydroxybenzotriazol. Nun
gibt man unter Rühren Wasser zu (insgesamt O.5I ml) bis alles
gelöst ist. Man rührt noch I5 Minuten, engt im Hochvakuum ein
und verreibt den Rückstand mit absolutem Tetrahydrofuran.
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Der Niederschlag wird abgesaugt und getrocknet. Ausbeute 110 mg.
95*7 mg der Substanz werden in 2 ml Trifluoressigsäure gelöst,
Man läßt 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen, engt ein und
verteilt den Rückstand zwischen Wasser und Äther, verrührt die wässrige Phase mit "Amberlite IR h$" (Acetat-form) und
gefriertrocknet. Ausbeute 86 mg.
Aminosäureanalyse: Leu, Ber.7£ref. 7· 3
Aminosäureanalyse: Leu, Ber.7£ref. 7· 3
Phe, Ber.9»Gef.9.2
I. Herstellung nach der Festphase-Peptidsynthesemethode unter Verwendung von 3-Hydroxy-^-oxo~3·4-dihydrochinazolin
a) Nps-Gln(Mbh )-Polymerverbindung
Eine Lösung von 12.3 E NpS-GIn(MbIi)-OH und 3.2 ml
Triäthylamin in 60 ml Dimethylformamid wurde zu 20 g eines nach Merrifield, Biochemistry _3_ 096^), Seite
1358 chlormethylierten, mit 2 $ Divinylbenzol vernetzten
Polystyrolharzes gegeben, das einen Chlorgehalt von 1.15 Milliäquivalent/g aufwies. Die Mischung wurde
Stunden bei 80 geschüttelt, dann wurde filtriert und das Harz mit Dimethylformamid, Äthanol und Methanol
mehrfach gewaschen. Ausbeute nach Trocknen im Vakuum bei 80 C Über P„0, : 19.3 g· Der Aminosäuregehalt der
so erhaltenen Acylaminsäurekunstharzverbindung betrug
1.15 Millimol/g
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36
b) Boc-Gly-Ile-VaI-GIu(OBzI)-Gin(Mbh)-Polymerverbindung
b) Boc-Gly-Ile-VaI-GIu(OBzI)-Gin(Mbh)-Polymerverbindung
6 g Nps-Gln(Mbh)-Kunstharzverbindung wurden in einem Reaktionsgefäß mit Glasfritte nach Merrifield (siehe oben)
dem folgenden Reaktionszyclus unterworfen: b1: Waschen mit drei 50 ml-Portionen Eisessig
b_: Abspaltung der N-Schutzgruppen durch halbstündiges
Schütteln mit einer In Lösung von wasserfreiem HCl in Eisessig, Filtration.
b„: Waschen mit Eisessig, wie unter b1 beschrieben.
br: Dreimaliges Waschen mit je 50 ml Äthanol,
b : Dreimaliges Waschen mit je 5° ml Dimethylformamid.
X>s: Neutralisation der an den freigesetzten od-Aminogruppen
des Harzes vorhandenen Hydrochloridgruppierung durch 10 Minuten Schütteln mit 50 ml einer
10^-igen Lösung von Triäthylamin in Dimethylformamid.
b_: Erneutes Waschen mit Dimethylformamid wie unter b_
7 5
beschrieben.
bo: Zusatz der Dimethylformamidlösung von 3· 6 Millimol
des entsprechenden Boc-Aminosäure-trichlorphenylesters
in ko ml Dimethylformamid, zusammen mit 0.57 g (3.6 tnMol) 3-Hydroxy-U-oxo-3.4-dihydrochinazolin,
und anschließendes zweistündiges Schütteln, dann Filtration.
b_: Waschen mit Dimethylformamid, wie unter b,. beschrieben.
b1o!Waschen mit absolutem Äthanol wie bei b^ beschrieben.
Die vorstehend beschriebenen Waschoperationen dauern jeweils 3 Minuten. Danach wird das Lösungsmittel durch
Druckfiltration (Druckluft, O.3 Atü) durch die Glasfritte des Reaktionsgefäßes entfernt.
Zur Anfügung einer Aminosäure wurde jeweils der vorstehend beschriebene Zyklus b - b10 einmal durchgeführt.
Dabei wurden nacheinander folgende Boc-Arainosäure-2.h.5-trichlorphenylester
jeweils in der Stufe b„ des beschrie-
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benen Schemas eingesetzt: Boc-Glu(OBzl)-OTcp, Boc-Val-OTcp,
Boc-Ile-OTcp und Boc-Gly-OTcp. Ausbeute an Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBzl}-Gln(Mbh)-Po-.
lymerverbindung nach Trocknen über P„O im Hoch-
O f
vakuum bei 80 : 5·3 S mit einem Peptidgehalt von 8.2 %
(durch saure Hydrolyse vmd quantitative Aminosäurebestimmung
ermittelt).
c) Freisetzung des Peptids
3 g der nach b) hergestellten Acylpeptid-polymerverbindung werden in dem beschriebenen Reaktionsgefäß in
20 ml wasserfreier Trifluoressigsäure suspendiert, anschließend wird 90 Minuten lang unter Feuchtigkeitsausschluß
ein langsamer Strom wasserfreier Bromwasserstoffsäure von unten durch die Glasfritte des Gefäßes
und durch die darüber befindliche Suspension geleitet. Dann wird die Suspension filtriert und das Harz dreimal
mit je 10 ml Trifluoressigsäure gewaschen. Die vereinigten Trifluoressigsäurefxltrate und Vaschlösungen werden
im Vakuum eingeengt, der Rückstand wird zweimal unter
Dekantieren mit je $0 ml absolutem Äther digeriert.
Auswaage nach Trocknen im Hochvakuum über ΡρΟ_ : 396 mg,
ο ι— ·η 22 ■ ο /
Schmp. Zers. ab 225 C, oC I D = -51.4 (c = 0.25, Wasser).
Aus 200 mg dieses Rohproduktes werden durch Verteilungschromatographie an Sephadex LH 20 im Lösungsmittelsystem
Butanol/Essigsäure/Wasser (2:1:1θ) 114 mg
einer farblosen, amorphen Substanz erhalten. Schmp. (Zers.)fßl22 ='-71.4° (c= 0.25, Wasser).
- JD
Aminosäureanalyse: siehe Tabelle k
Aminosäureanalyse: siehe Tabelle k
II.Herstellung nach der Festphasen-Peptidsynthesemethode ohne
Zusatz von 3-Hydroxy-^-oxo-3.^-dihydrochinazolin
Bei diesem Kontrollversuch war das gesamte Herstellungsverfahren qualitativ und quantitativ identisch mit dem unter
beschriebenen, der Zusatz von 3-Hydroxy-^-oxo-3.^-dihy-
309835/1133
drochinazolin gemäß Stufe bo unterblieb jedoch. Im Ein-
zelnen ergaben sich bei diesem Vergleichsversuch folgende Resultate: 22
Rohausbeute: kZO mg, Schmp.: Zers. ab 96°,[oMn -27°
(c = 0.25, Wasser).
Durch Verteilungschromatographie an Sephadex LH 20 wurden
aus 2O6 mg des Rohproduktes nur Qh mg eines Produktes init
den physikalischen Daten Schmp.: Zers. ab I65 fjo6| -3^·9»
(c = Ο.25» Wasser) erhalten. Es war dünnschichtchromatographisch
nicht einheitlich. Aminosäureanalyse: siehe Tabelle h.
III.Herstellung nach konventionellen Methoden
a) Boc-Gly-Ile-OH.CHA
Zu einer Lösung von 35 g (0.2 Mol) Boc-Gly-OH, 38.4 g
(0.2 Mol) HCl.H-IIe-OMe und 27 g (0.2 Mol) 1-Hydroxybenzotriazol
in 350 ml Dimethylformamid gibt man 26 ml
N-Äthylmorpholin und bei 0 eine Lösung von kk g Dicyclohexylcarbodiimid
in 50 ml eiskalten Dimethylformamid. Man läßt eine Stunde bei 0 und eine Stunde bei
Raumtemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab und engt das Filtrat ein. Der Rückstand wird zwischen Essigester
und Natriumbicarbonat-Lösung verteilt. Die Essigesterphase
wird mit KHSOr-Lösung, NaHCO -Lösung und Wasser ausgeschüttelt, mit Natriumsulfat getrocknet und
eingeengt. Ausbeute 6I.I g Öl.
Das Öl wird in Essigester gelöst und über eine Säule aus 185 g basischem AIpO (Woelm, Aktivstufe I") chroniatographiert.
Das Essigestereluat wird eingeengt. Ausbeute 55.8 g.
Das oben gewonnene Öl wird in 25Ο ml einer Mischung aus
Dioxan/Wasser (8:2) gelöst und mit wenig Thymolphthalein
versetzt. Nun wird mit einer In NaOH so lange titriert, bis die Lösung für längere Zeit blau bleibt. Verbrauch
179 ml In NaOH. Anschließend wird mit KIISO. -Lösung Jieu-
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tralisiert und die Reaktionsmiscliung eingeengt. Der
Rückstand wird nun in ¥asser gelöst. Mit Essigester wird ifcerschichtet und bei Eiskühlung wird mit 2n HpSO. auf
pH 2-3 angesäuert und gut gerührt. Die Essigesterphase wird abgetrennt, einmal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat
getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird in Äther gelöst und bis zur basischen Reaktion mit
Cyclohexylamin versetzt. Man stellt nun in Eis, saugt ab, wäscht mit Äther und trocknet.
Ausbeute 55.6g(71.8 $), Schmp. 198 - 200°C.
Zur weiteren Reinigung wird die Substanz in 100 ml Methanol gelöst und in 1.5 nil Äther eingerührt und ab-,'gekühlt.
Nach 1 Stunde wird abgesaugt. Ausbeute 45· 5 g
(59 #), Schmp. 204-205°C,M22 = +17. **° (c = 1 , Methanol).
b) Z-VaI-GIu (0But) -GIn(MbIl) -OH
65.2 g (81 mMol) des nach Chem. Ber. 103 (197O), Seite
2038 hergestellten Z-VaI-GIu(OBu*)-Gin(Mbh)-OMe werden
in etwa 400 ml Dioxatli/Wasser (8:2) suspendiert und mit
In NaOH gegen Thymolphthalein als Indikator titriert.
Nachdem die Lösung längere Zeit blau bleibt, wird mit KHSO.-Lösung angesäuert und der Niederschlag abgesaugt.
Das Filtergut wird mit Aceton aufgekocht, atg;saugt und
aus Dimethylformamid/Wasser umgefällt. Ausbeute 59 g
(92 #) Schmp. 216-218°.
°42Η5Λ°11 (79O.9) Ber. C 63.72 H 6.85 N 7.05
Gef. 63.3 7.1 8.1
c) H-Val-Glu(0But)-Gin(Mbh)-OH
Durch eine Suspension von 52 g (65.7 mMol) Z-Val-Glu
(OBu )-GIn(Mbh)-OH und etwas Pd/BaSOr-Katalysator in
5OO ml Eisessig leitet man so lange Wasserstoff, bis
kein C0„ mehr entweicht. Der Katalysator wird dann abgesaugt
und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und abgesaugt. Der Niederschlag
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- Uo -
wird mit einer gesättigten Natriumacetatlösung ca.
5 Stunden gerührt, abgesaugt und getrocknet. Zum Schluß wird noch mit Methanol ausgekocht. Ausbeute 27 g
(62.6 $>) Schmp. 226 - 228°C,j^]22 = +9.0° (c = 1, Eisess
ig).
Ber· c 62.20 H 7O5 N 8.53
Gef. 61Λ 7.3 8.5
d) Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBut)-Gln(Mbh)-OH
7.8g (20 mMol) Boc-Gly-Ile-OH.CHA werden bei 0° C
zwischen 100 ml Äther und k0 ml 2n Zitronensäure verrührt.
Die ätherische Phase wird abgetrennt, mit Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt.
Ausbeute 4.6 g Öl. Zu einer Lösung von 3«9 g der
oben gewonnenen öligen Substanz (Boc-Gly-Ile-OH) in 35
ml Dimethylacetamid gibt man 2.09 g 3-Hydroxy-U-oxo-3.**-dihydro-1
.2.3-benzotriazin und bei 0° C 2.76 g Dicyclohexylcarbodiirnid. Man läßt 1 Stunde bei 0
und 1 Stunde bei Raumtemperatur rühren. Der ausgefallene Niederschlag wird abgesaugt und mit wenig Dimethylacetamid
gewaschen. Zu dem Filtrat gibt man nun 5»85 g fein zerriebenes H-VaI-GIu(OBu*)-Gln(Mbh)-OH und rührt
5 Stunden bei Raumtemperatur. Dabei fällt ein dicker Niederschlag aus. Man läßt über Nacht stehen und fällt
anderntags mit 3OO ml Wasser die Substanz vollständig
aus. Die ausgefällte Substanz wird abgesaugt, mit Wasser gewaschen und mit 2oo ml Äthanol aufgekocht. Man
läßt auf Raumtemperautr abkühlen und saugt ab. Mit Alkohol wird gut gewaschen. Ausbeute 6.7 g (81.3 $)
Schmp. 253 - 2550CJ0(I22 = -2.1O(c = 1, Dimethylacetamid)
(927.1) D Ber. C 6Ο.9Ο H 7.61 N 9.07
Gef. 61.0 7.6 9.2
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- k-i
e) H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-OH
200 mg BoC-GIy-IIe-VaI-GIu(OBu )-Mbh-0H und O.5 ml
Anisol werden in 5 mx Trxfluoressigsäure gelöst und
10 Minuten im Rückfluß gekocht. Anschließend wird eingeengt,und der Rückstand mit Äther verrieben. Nun wird abgesaugt
und der Rückstand in Wasser gelöst. Die wässrige Lösung wir mit "Amberlite IR ^5" (Acetatform) verrührt,bis
pH 3 - h erreicht ist. Der Austauscher wird abgesaugt und das Filtrat mit Aktivkohle geklärt. Die
klare wässrige Lösung wird gefriergetrocknet. Ausbeute 50 mgJ^l22 = -75°C (c = O.25, Wasser)
Dünnschichtchromatographisch einheitlich. Aminosäureanalyse: siehe Tabelle h.
Vergleich der Aminosäureanalysen und physikalischen Daten des nach den Methoden I, II und III hergestellten H-GIy-He-VaI-Glu-Gln-OH
nach I (Fest- nach II (Fest- nach III körpermethode körpermethode (konvenmit
3-Hydroxy- wie bei I, nur tionelle 4-OXO-3·k-dl- ohne Katalysa- Methode)
hydrochinazo- tor)
22
lin)
(c =0.25, Wasser) -71.5°C
-75.O
Zersetzungspunkt
DS-Chromatοgramm
DS-Chromatοgramm
Aminosäureanalyse
(72 Stdn.
bei 110°ü)
bei 110°ü)
ab
einheitlich
und identisch mit III
GIu 2.6 GIy 1.0
VaI 0.9 He 0.87
ab 165 C
3 Flecken,
davon einer
identisch
mit III
davon einer
identisch
mit III
GIu 2.7Ί
GIy 1.0
VaI O.hh5
He 0.33
.0.
ab 255 C einheitlich
GIu 2.2 GIy 1.0 VaI 0.9
EIe 0.9
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Die in Tabelle k aufgezeigten Ergebnisse zeigen deutlich
die Überlegenheit des erfindungsgemäßen Verfahrens auch
bei der Festkörpermethode. Nach der herkömmlichen Methode unter Verwendung von Trichlorphenylestern ohne Zusatz der erfindungsgemäßen Katalysatoren war es nicht möglich, ein auch nur annähernd einheitliches Material zu bekommen.
die Überlegenheit des erfindungsgemäßen Verfahrens auch
bei der Festkörpermethode. Nach der herkömmlichen Methode unter Verwendung von Trichlorphenylestern ohne Zusatz der erfindungsgemäßen Katalysatoren war es nicht möglich, ein auch nur annähernd einheitliches Material zu bekommen.
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Herstellung von einigen Katalysatoren 3-Hydroxy-^-methyl-2. 3-dihydro-th.iazol-2-th.ion
a) 5-Thioxo-6-oxa-4-thia-2-octanon
Eine Lösung von I85 g (2 Mol) Chloraceton in 300 ml Methylenchlorid wird mit 3OO nrl Wasser überschichtet.
Bei 10 - 20°C werden unter Rühren 320.5 g (2 Mol) CpH-O-CSSK portionsweise eingetragen. Man rührt noch
2 Stunden bei Raumtemperatur nach, trennt die Schichten, wäscht die organische Phase noch einmal mit 100 ml
Wasser, trocknet mit Natriumsulfat und destilliert, Kp. 92-99°/O.O5 Torr, Ausbeute 3O5 g.
5~Thioxo-6-oga~4-thia-2-oetanonoxiin
Yu einer Lösung von 56.0 g Hydroxylatninhydrochlorid in
400 ml Methanol gibt man 65.6 g Natriumacetat und 137 g
des nach a) gewonnenen 5~Thioxo-6-oxa-4-thia-2-octanons.
Nach 18-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird das
Lösungsmittel im Vakuum entfernt, der Rückstand mit Wasser versetzt, mit Methylenchlorid extrahiert, die organische
Phase mit Natriumsulfat getrocknet und vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wird in Diisopropyläther
aufgenommen. Durch Abkühlen lassen sich daraus in mehreren Fraktionen insgesamt 101 g des Ox ims vom
Schmelzpunkt 6k gewinnen.
c) 3-Hydroxy-4-methyl-2.3-dibydro-thiazol-2-thion
Zu einer Lösung von 10^1. k g NaOH in 200 ml Wasser tropft
man unt*· Kühlen und gutem Rühren innerhalb von I5 Minuten
1^3.3 S des nach b) gewonnenen Oxims, gelöst in
3OO ml Methylenchlorid, rührt noch 5 Minuten nach, fügt
noch 5°0 ml Wasser zu, trennt die Schichten, schüttelt
die wässrige Phase zweimal mit je 100 ml Hexan aus und
. säuert schließlich mit konzentrierter Salzsäure auf pH
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an. Man rührt eine Stunde im Eisbad nach, saugt den Niederschlag gut ab und wäscht ihn noch zweimal gründlich
mit je 3°0 ml Wasser. Ausbeute 6I.5 g» Schmp. 90 C.
Weitere 12 g des gleichen Produktes lassen sich durch Extraktion der wässrigen Lösung mit Methylenchlorid gewinnen.
1-Hydroxy-^.6-dimethyl-3« 5~dichlor-2-pyridon
Man löst 20 g l-Hydroxy-4.6-dimethyl-2-pyridon in einer
Mischung aus 75 «nl konzentrierter Salzsäure und 60 ml
Wasser und leitet bei 10 - 150C 21.6 g Chlor ein, rührt
noch eine Stunde nach, saugt ab, wäscht mit Wasser und trocknet im Vakuum. Ausbeute 22.9 gf Schmp. 213 C.
Umkristallisieren aus Acetonitril erhöht den Schmelzpunkt auf 216°C.
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Claims (2)
- - 45 -PatentansprücheVerfahren zur Herstellung von Peptiden,· dadurch gekennzeichnet, daß man eine geschützte Aminosäure oder ein geschütztes Peptid der "Formel IIV-(N-CH-C-) N-CH-C-O-R (II)mlin der V eine in der Peptidchemie übliche Aminoschutzgruppe oder den Pyroglutamylrest, Y einen niederen Alkylrest, der gegebenenfalls verzweigt und/oder durch erforderlichenfalls zweckmäßig geschützte OH-, NH2-, SH, COOH-, CONH2, Guanidino-, Aryl-, Imidazoyl- oder Indolylreste substituiert sein kann, bedeuten, wobei die Gruppe -NH-CHY- auch den Pyrrolidinyl-Rest bedeuten kann, R einen Di-, Tri-, Tetra- oder Pentachlorphenyl-, einen Nitrophenyl- oder einen Chlor-nitrophenyl-rest darstellt und in. für eine Zahl von etwa 0-10 steht, unter Zusatz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I)'"^,N-OH (I)in der X die Gruppen C=O, C » S oder -N » bedeutet und in der X und N Glieder eines, ggf. an einen Benzolkern anellierten und/oder 1 oder 2 weitere Heteroatome enthaltenden 5- bis 6-gliedrigen ggf. substituierten heterocyclischen Ringes sind, und deren pK Wert zwischen 3.7 und 4,2 liegt, mit gegebenenfalls geschützten Aminosäuren oder Peptiden der allgemeinen Formel (III),[_N-OH-C-(N-CH-C-)m W (III)H-"'2in der Y und der -NH-CHY-Rest die obige Bedeutung haben und m2 für die Zahlen 0 bis großenordnungsmäßig 500 steht und W eine Hydroxygruppe, O-Alkyl, O-Aralkyl, eine gegebenenfalls durch Alkyl, Aralkyl oder Aryl substituierte309835/1133Aminogruppe oder einen ester- oder amidartig gebundenen polymeren Träger bedeutet, umsetzt und aus dem erhaltenen geschützten Peptid der Formel IVV-(N-OII-C) -N-CH-C-N-CH-0-(N-OH-C-) W (IV) ml m2gegebenenfalls die Schutzgruppen ganz oder teilweise in an sich bekannter Weise abspaltet.
- 2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pK Wert der Katalysatoren der Formel I in 0.5 m Lösung im Lösungsmittelgemisch Diäthylenglykoldimethylather/ Wasser im Verhältnis 6:4 bei 30° gemessen wird.309835/1133
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-
1972
- 1972-01-20 DE DE2202613A patent/DE2202613C3/de not_active Expired
- 1972-06-20 US US264441A patent/US3872074A/en not_active Expired - Lifetime
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1085015A2 (de) * | 1999-09-01 | 2001-03-21 | Daicel Chemical Industries, Ltd. | Eine stickstoffhaltige heterocyclische Verbindung enthaltender Katalysator |
EP1085015A3 (de) * | 1999-09-01 | 2003-12-10 | Daicel Chemical Industries, Ltd. | Eine stickstoffhaltige heterocyclische Verbindung enthaltender Katalysator |
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Publication number | Publication date |
---|---|
US3872074A (en) | 1975-03-18 |
DE2202613B2 (de) | 1973-11-22 |
DE2202613C3 (de) | 1974-06-20 |
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C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 |