DE2153479C3 - - Google Patents
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Description
Zähleinrichtung fälschlicherweise als Zelle gezählt werden könnten. Weiterhin besteht keine Gefahr, daß irgendwelche Niederschläge oder Ausfällungen den Kanal verstopfen könnten, durch den die Suspension mit den fixierten, gefärbten Zellen auf ihrem Weg zu einer Zähleinrichtung strömt.Counter could be mistakenly counted as a cell. Furthermore, there is no risk that any precipitate or precipitate could clog the conduit through which the suspension passes with the fixed, stained cells on their way to a counter.
Das als Fixiermittel benutzte Monoaldehyd bewirkt keine Ausfällung der löslichen Bestandteile, die normalerweise in einer die Zellen umgebenden Lösung vorhanden sind, und bewahrt die Morphologie der Zellen, so daß die katalytischen Enzyme innerhalb der Zellen bleiben und auch die klassischen Identifiziereigenschaften der Zellen praktisch nicht verloren gehen. Wenn Gesamtblut analysiert werden soll, kann man entweder vor oder nach der Zugabe des Substrats und des pH-Puffers einen Hämolyseschritt vorsehen, um die in dem Gesamtblut vorhandenen roten Blutzellen zu zerbrechen und ihren Hämoglobingehalt in die Lösung zu entlassen. Nachdem die besondere Leukozytenart gefärbt ist, wird die Lösung mit den Leukozyten durch die fotometrische Zähleinrichtung geschickt, die selbsttätig die Anzahl der vorhandenen gefärbten Zellen zählt. Die Ausbildung eines starken Farbstoffniederschlags in der ausgewählten Zellenart ermöglicht es dem fotometrischen Zähler, diese Zellen von anderen in der Lösung befindlichen Zellen zu unterscheiden.The monoaldehyde used as a fixative does not cause any precipitation of the soluble components that normally occur in a solution surrounding the cells and preserves the morphology of the Cells, so that the catalytic enzymes stay inside the cells and also the classic identification properties of the cells are practically not lost. If whole blood is to be analyzed, can a hemolysis step is provided either before or after the addition of the substrate and the pH buffer, to break up the red blood cells present in whole blood and reduce their hemoglobin content to dismiss the solution. After the particular type of leukocyte is stained, the solution is mixed with the Leukocytes sent through the photometric counter, which automatically counts the number of them stained cells counts. The formation of a strong precipitate of dye in the selected cell type allows the photometric counter to count these cells from other cells in the solution differentiate.
Da sehr viele Zellenzyme sehr leicht beschädigt oder bereits bei der geringsten Handhabung von den Zellen freigegeben werden, ist es notwendig, daß das als Fixiermittel zugegebene Monoaldehyd die metabolischen Vorgänge bzw. Stoffwechselvorgänge unterbricht, also die Zellen tötet, und die in den Zellen befindlichen interessierenden Enzyme immobilisiert, ohne daß dabei die katalytische Wirksamkeit der Enzyme in einem hohen Maß nachteilig beeinträchtigt wird. Dies sind dieselben Anforderungen wie bei der cytologischen Fixierung in der klassischen Enzymcytochemie. Hierzu wird beispielsweise auf die folgenden Druckschriften verwiesen: A. Wachtel et al, J. Histochem, and Cytochem., Band 7, S. 291 (1959) und B. J. D a ν i s et al, J. Histochem. and Cytochem., Band 7, S. 291 und 292 (1959).Since very many cell enzymes are easily damaged or even with the slightest handling of the Cells are released, it is necessary that the added as a fixative monoaldehyde the metabolic Processes or metabolic processes interrupts, i.e. kills the cells, and those in the cells The enzymes of interest are immobilized without affecting the catalytic effectiveness of the Enzymes are adversely affected to a high degree. These are the same requirements as the cytological fixation in classical enzyme cytochemistry. For example, refer to the following References to publications: A. Wachtel et al, J. Histochem, and Cytochem., Vol. 7, p. 291 (1959) and B. J. D a ν i s et al, J. Histochem. and Cytochem., Volume 7, pp. 291 and 292 (1959).
Darüber hinaus genügt das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Monoaldehyd der Forderung, daß die Fixierlösung irgendwelche der zuvor löslichen Bestandteile in der extracellulären Lösung nicht ausfällt. Diese Eigenschaft des nach der Erfindung verwendeten Fixiermittels steht im Gegensatz zu den Forderungen bei den klassischen histologischen Fixierverfahren, bei denen eine maximale Menge an intra- und extracellulären Substanzen unlöslich gemacht werden soll. Die bekannten cytologischen Fixiermittel, beispielsweise Aceton, kommen daher bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht in Frage.In addition, the monoaldehyde used in the process according to the invention is sufficient Requirement that the fixing solution contain any of the previously soluble ingredients in the extracellular Solution does not fail. This property of the fixative used according to the invention is in contrast to the requirements of the classic histological fixation methods, in which a maximum Amount of intra- and extracellular substances to be made insoluble. The well-known cytological Fixing agents, for example acetone, are therefore not used in the process according to the invention Ask.
Eine bevorzugte cytologische Fixierlösung ist eine 0,2- bis 40°/nige wäßrige Lösung aus einem Monoaldehyd, beispielsweise Formaldehyd, Butyralaldehyd, Propionalaldehyd oder Acetaldehyd. Di-Aldehyde sind nicht geeignet, da sie Querverbindungen eingehen und extra-zelluläre Niederschläge bilden. Acetone, Säuren und die meisten Alkohole sind aus ähnlichen Gründen ebenfalls nicht geeignet. Die Konzentration des Monoaldehyds muß hoch genug sein, um die Zellen zu töten, ohne jedoch die Wirksamkeit der Enzyme zu beeinträchtigen. Bei geringen Konzentrationen und tiefen Temperaturen benötigt man zusätzliche Zeit, um diese Funktion durchzuführen, im Vergleich zu hohen Konzentrationen und hohen Temperaturen. So benötigt beispielsweise eine 2%ige Formaldehydkonzentration in der Lösung bei 40C 12 Stunden, während eine 4°/oige Konzentration bei 5O0C 2 Minuten benötigt. Da man im allgemsinen gleiche Volumen der Körperflüssigkeit und der Monoaldehydlösung mischt, beträgt die Stärke der Aldehydlösung das Doppelte der Konzentration beim Fixier-Zeitpunkt des Aldehyds in der Lösung. Die folgenden Formalinlösungen liefern gute Ergebnisse:A preferred cytological fixing solution is a 0.2 to 40 ° / n aqueous solution of a monoaldehyde, such as formaldehyde, Butyralaldehyd, Propionalaldehyd or acetaldehyde. Di-aldehydes are not suitable because they form cross-links and form extra-cellular precipitates. Acetones, acids, and most alcohols are also unsuitable for similar reasons. The concentration of monoaldehyde must be high enough to kill the cells without affecting the effectiveness of the enzymes. At low concentrations and low temperatures, additional time is required to perform this function compared to high concentrations and high temperatures. For example, a 2% strength formaldehyde required concentration in the solution at 4 0 C for 12 hours, while a 4 ° / o sodium concentration at 5O 0 C requires 2 minutes. Since in general the same volume of the body fluid and the monoaldehyde solution are mixed, the strength of the aldehyde solution is twice the concentration at the time of fixation of the aldehyde in the solution. The following formalin solutions give good results:
Lösung ISolution I.
(20% Formalin)(20% formalin)
(pH-Wert = 7,2)(pH value = 7.2)
Na2HPO4 6,5 gNa 2 HPO 4 6.5 g
NaH2PO4 4,0 gNaH 2 PO 4 4.0 g
Formalin-Stammlösung 200 mlFormalin stock solution 200 ml
Diesen Mengen wird Wasser zugegeben, bis dasWater is added to these amounts until the
endgültige Volumen 1000 ml beträgt. Dieses Reagenz wird zum Bestimmen des Gehalts an Eosinophilen und Neutrophilen durch Peroxidasefärbung benutzt.final volume is 1000 ml. This reagent is used to determine the content of eosinophils and neutrophils used by peroxidase staining.
Lösung IISolution II
(20% Formalin)
(pH-Wert = 7,2)(20% formalin)
(pH value = 7.2)
KCl i,i gKCl i, i g
1/15-molares KH2PO4 5,0 ml1/15 molar KH 2 PO 4 5.0 ml
1/15-molares K2HPO4 32,0 ml1/15 molar K 2 HPO 4 32.0 ml
Formalin-Stammlösung 20,0 mlFormalin stock solution 20.0 ml
H2O 43,0 ml H 2 O 43.0 ml
100,0 ml100.0 ml
Die folgenden Stammlösungen werden benutzt, urr die obigen Formalin-Arbeitslösungen herzustellenThe following stock solutions are used to prepare the above formalin working solutions
1/15-molares KH2PO4 (einfachbasisch): etwa 9,07 g KH2PO4 aufgelöst in 11 destilliertem Wasser.1/15 molar KH 2 PO 4 (monobasic): about 9.07 g of KH 2 PO 4 dissolved in 1 liter of distilled water.
1/15-molares K2HPO4 (zweifachbasisch): etwa 11,61 g K2HPO4 aufgelöst in 11 destillierteir Wasser.1/15 molar K 2 HPO 4 (doubly basic): about 11.61 g of K 2 HPO 4 dissolved in 11% of distilled water.
Formalin-Stammlösung: Eine 37°/oige handeis
übliche Formaldehydlösung.
50 Formalin stock solution: A 37 ° / o strength handeis conventional formaldehyde solution.
50
Wenn die Körperflüssigkeit, die die weißen BlutWhen the body fluid that the white blood
zellen enthält, Gesamtblut ist, müssen die roten Blut zellen hämolysiert werden, da die Gefahr besteht daß der gleichzeitige Durchtritt von zwei oder mehre ren roten Blutzellen durch eine fotometrische Zähl einrichtung irrtümlicherweise als eine gefärbte weißcells, is whole blood, the red blood cells must be hemolyzed as there is a risk that the simultaneous passage of two or more ren red blood cells through a photometric count set up mistakenly as a colored white
Blutzelle oder abnormale Zelle verstanden werdei könnte. Die Gefahr des gleichzeitigen DurchtrittBlood cell or abnormal cell could be understood. The risk of simultaneous passage
könnte man dadurch vermindern, daß die Lösui.:could be diminished by the fact that the Lösui .:
verdünnt wird. Dies führt jedoch zu einer geringereiis diluted. However, this leads to a decrease
Zählgeschwindigkeit. Es wird daher bevorzugt, di roten Blutzellen durch Zugabe eines Reagenzes zu deCounting speed. It is therefore preferred to de-red blood cells by adding a reagent
Zellensuspension zu hämolysieren, so daß die roteiHemolyse cell suspension so that the rotei
Blutzellen lediglich aufbrechen und ihren Inhalt beispielsweise Hämoglobin, in die Lösung abgeberBlood cells only break open and their contents, for example hemoglobin, are released into the solution
Das hämolysierende Reagenz darf die suspendierte!The hemolyzing reagent may be the suspended!
Zellen nicht zur Klumpenbildung anregen und darDo not stimulate cells to clump and represent
nachfolgende histochemische Reaktionen nicht störersubsequent histochemical reactions are not disruptive
es darf also beispielsweise mit irgendeiner der Substanzen, die in späteren Schritten zum Färben der Zellen benutzt werden, nicht reagieren. Ferner darf das hämolysierende Reagenz nicht bewirken, daß die interessierenden Enzyme der weißen Blutzellen in die Lösung austreten und daß sich lösliche Substanzen in dem extrazellulären Medium niederschlagen.For example, it may use any of the substances that are used in later steps to stain the cells are used, do not respond. Furthermore, the hemolyzing reagent must not cause the White blood cell enzymes of interest leak into the solution and that soluble substances are in precipitate in the extracellular medium.
Der Hämolyseschritt wird entweder vor oder nach der Färbereaktion ausgeführt. Falls er nach dem Färben vorgenommen wird, darf er weder den Farbstoff, noch die gefärbten oder ungefärbten weißen Biutzellen ändern.The hemolysis step is carried out either before or after the staining reaction. If after the Dyeing is undertaken, he may not use the dye, nor the dyed or uncolored whites Change blood cells.
Bei dem vorliegenden Verfahren wird die Entfernung der roten Blutzellen durch Hämolyse gegenüber einer mechanischen Entfernung bevorzugt, da die Verwendung eines Hämolysereagenzes sicherstellt, daß sich der gesamte Vorgang einfach abspielt. Bei der Verwendung eines solchen Reagenzes ist es nämlich lediglich erforderlich, sowohl beim kontinuierlichen Strömungsverfahren als auch beim diskontinuierlichen Einzelbearbeitungsverfahren dem ursprünglichen Blutvolumen ein zusätzliches Lösungsvolumen zuzugeben.In the present method, the removal of red blood cells by hemolysis is opposed to a mechanical removal is preferred as the use of a hemolysis reagent ensures that the whole process just plays. When using such a reagent it is only required, both in the continuous flow process and in the discontinuous one Single processing procedure to add an additional volume of solution to the original blood volume.
Der Hämolyseschritt kann dadurch ausgeführt werden, daß der Lösung, die die roten und weißen Blutzellen enthält, eine wäßrige Lösung aus einer aliphatischen Säure mit einem pKa-Wert von etwa 3,0 bis 5,5 zugegeben wird. Essig-, Propion-, Butteroder Milchsäure in einer Konzentration von etwa 1 bis 10% reichen aus. Eine Essigsäurelösung mit einer Konzentration von etwa 7% wird bevorzugt. Die Lösung kann man in einem Temperaturbreich von etwa 37 ° C für 10 Minuten und bis etwa 55° C für 1 Minute erhitzen, um die Katalyseenzyme zu inaktivieren, die pseudoperoxidase Wirksamkeit des Hämoglobins zu vermindern und die Hämolyse zu beschleunigen. Bei niedrigen Temperaturen benötigt man eine längere Reaktionszeit. Höhere Temperaturen inaktivieren die Peroxidaseenzyme und fördern ein Verklumpen nach der Zugabe des Hämolysereagenzes.The hemolysis step can be carried out by adding an aqueous solution of an aliphatic acid having a pK a of about 3.0 to 5.5 to the solution containing the red and white blood cells. Acetic, propionic, butyric or lactic acid in a concentration of about 1 to 10% are sufficient. An acetic acid solution at a concentration of about 7% is preferred. The solution can be heated in a temperature range of about 37 ° C for 10 minutes and up to about 55 ° C for 1 minute in order to inactivate the catalytic enzymes, to reduce the pseudoperoxidase activity of the hemoglobin and to accelerate the hemolysis. A longer reaction time is required at low temperatures. Higher temperatures inactivate the peroxidase enzymes and promote clumping after the addition of the hemolysis reagent.
Bei den Färbeschritten handelt es sich um enzymatische Färbungen, bei denen die morphologisch unzerstörte Zelle für die Erzeugung der Farbe direkt verantwortlich ist. Das Substrat und das Kopplungsreagenz werden innerhalb der Zelle durch eines der in der Zelle vorkommenden Enzyme in einen unlöslichen Farbstoff umgewandelt. Eine derartige Färbung erfordert eine schnelle Kopplung mit dem gespaltenen Substrat und bedingt auch ein unlösliches Erzeugnis innerhalb der Zelle. Bezüglich dieser Kriterien wird verwiesen auf: Lehrer, G. M., et al, J- Biophysic. and Biochem. Cytol., Band 6, Nr. 3, S. 399 bis 404 (1959)· Davis, B. J., et al, J. Histochem. and Cytochem., Band 7, S. 297 ff. (1959); und Davis, B. J., Proc. Soc. Exp. Biol. & Med., Band 101, S. 90 ff. (1959).The dyeing steps are enzymatic dyeings in which the morphologically undestroyed Cell is directly responsible for producing the color. The substrate and the coupling reagent are applied within the cell by one of the in The enzymes found in the cell are converted into an insoluble dye. Such coloring requires rapid coupling with the cleaved substrate and also implies an insoluble product inside the cell. With regard to these criteria, reference is made to: Lehrer, G. M., et al, J-Biophysic. and Biochem. Cytol., Vol. 6, No. 3, pp. 399-404 (1959) Davis, B.J., et al, J. Histochem. and Cytochem., Volume 7, pp. 297 ff. (1959); and Davis, B. J., Proc. Soc. Exp. Biol. & Med., Volume 101, pp. 90 ff. (1959).
Der Färbeschritt erfordert eine sorgfältige Auswahl der Reagenzien. Zwei klassische hystochemische Substrate für Peroxidaseenzyme sind beispielsweise Benzidin und Paraphenylendiamin. Hierzu wird verwiesen auf Pear se in Histochemistry: Theoretical and Applied sowie auf L. O r η s t e i η in J. Histochem. and Cytochem., Band 16, S. 504 (1968). Diese Reagenzien sind jedoch als cytochemische Substrate für das erfindungsgemäße Verfahren nicht geeignet, da sie äußerst schnell mit dem als Fixiermittel dienenden Monoaldchyd reagieren und Verbindungen hervorrufen, die sich niederschlagen und die nicht als Peroxidüscsubsirate für die Farbcrzcugunc dienen können. Zur Verwendung als cytochemisches Substrat in dem erfindungsgemäßen Verfahren ist beispielsweise eine Mischung aus einem anorganischen oder organischen Peroxid und aus 4-Chlor-l-naphthol geeignet, und zwar um eine Peroxidase enthaltende Zelle zu färben, beispielsweise ein Eosinophil oder Neutrophil. Das Peroxid und 4-Chlor-l-naphthol dienen als Enzymsubstrate, und das 4-Chlor-l-naphthol wird darüber hinaus als Kopplungsreagenz verwendet.The staining step requires careful selection of reagents. Two classic hystochemicals Examples of substrates for peroxidase enzymes are benzidine and paraphenylenediamine. Reference is made to this to Pear se in Histochemistry: Theoretical and Applied and to L. O r η s t e i η in J. Histochem. and Cytochem., Vol. 16, p. 504 (1968). However, these reagents are considered cytochemical substrates not suitable for the method according to the invention, since it is extremely fast with that used as a fixative Monoaldchyd react and create compounds that precipitate and that are not considered Peroxidus subsirates are used for the coloring be able. For use as a cytochemical substrate in the method according to the invention, for example a mixture of an inorganic or organic peroxide and 4-chloro-l-naphthol suitable, to stain a cell containing peroxidase, such as an eosinophil or neutrophil. The peroxide and 4-chloro-l-naphthol serve as Enzyme substrates, and the 4-chloro-1-naphthol is also used as a coupling reagent.
ίο Ohne Zugabe eines getrennten Chromogene ausfällenden Kopplungsreagenzes erzeugt das 4-Chlorl-naphthol innerhalb der Peroxidase enthaltenden Zelle einen blauschwarzen Farbstoffniederschlag. Eine Mischung aus o-Tolidin und 4-Chlor-l-naphthol kann man ebenfalls verwenden, um einen verschiedenartigen purpurroten Farbstoff zu erzeugen, wenn das beim Fixierschritt benutzte Formaldehyd inaktiviert wird.ίο Precipitating without adding a separate chromogen Coupling reagent generates the 4-chloro-naphthol within the peroxidase containing Cell a bluish-black precipitate of dye. A mixture of o-tolidine and 4-chloro-l-naphthol can can also be used to produce a various purple-red dye if that is the case Fixing step used formaldehyde is inactivated.
Um einen wahren selektiven Färbevorgang zu erhalten, wird der pH-Wert der Lösung gesteuert. Wenn der pH-Wert der Lösung unter 3,0 liegt, werden schwere FarbstofTniederschläge nur in Eosinophilen gebildet. Wenn der pH-Wert in der Lösung innerhalb eines Bereichs von 3,0 bis 5,0 liegt, werden schwere Farbstoff niederschläge nur in Eosinophilen und mittelmäßige Farbstoffniederschläge nur in Neutrophilen erzeugt. Wenn der pH-Wert auf einen Bereich zwischen 5,0 und 7,0 gepuffert ist, entstehen schwere Farbstoffniederschläge nur in Eosinophilen und Neutrophilen.In order to obtain a truly selective staining process, the pH of the solution is controlled. If the pH of the solution is below 3.0, heavy dye precipitates will only appear in eosinophils educated. If the pH in the solution is within a range of 3.0 to 5.0, it becomes severe Dye precipitates only in eosinophils and moderate dye precipitates only in neutrophils generated. If the pH is buffered between 5.0 and 7.0, heavy dye precipitate will result only in eosinophils and neutrophils.
Wenn lipasehaltige Zellen, d. h. Monozyten, gefärbt werden sollen, wird nach der Erfindung vorzugsweise eine Kombination aus einem Naphtholester, beispielsweise 1-Naphthylacetat oder 1-Naphthylbutyrat, und aus einem Diazoniumsalz, beispielsweise Hexazoniumpararosanilin, verwendet, bei dem es sich um ein Chromogene ausfällendes Kupplungsreagenz handelt. Der optimale pH-Wert für diese Farbreaktion beträgt etwa 5,5 bis 6,5, vorzugsweise etwa 6,0. Bei einem solchen pH-Wert werden lediglich in Monozyten schwere Farbstoffniederschläge gebildet.When cells containing lipase, i.e. H. Monocytes to be stained is preferred according to the invention a combination of a naphthol ester, for example 1-naphthyl acetate or 1-naphthyl butyrate, and from a diazonium salt, e.g. Hexazoniumpararosaniline, which is a Chromogenic precipitating coupling reagent acts. The optimal pH for this color reaction is about 5.5 to 6.5, preferably about 6.0. At such a pH value only in monocytes heavy dye deposits formed.
Die normalerweise bei der klassischen Esteraselipasehis'cochemie verwendeten Substrate sind geringfügig unlöslich. Damit innerhalb einer kurzen Zeit, beispielsweise 5 Minuten, eine hinreichende Farbentwicklung auftritt, soll die Konzentration des Substrats in der endgültigen Inkubationslösung etwa 0,5 mg/ml übersteigen. Naphthol-AS-Ester und ihre Derivate sowie 1-Naphthylbutyrate haben jedoch eine Löslichkeit von weniger als 0,5 mg/ml. Dieses Problem wird vorzugsweise durch Zugabe bis zu einem Viertel des endgültigen Volumens von 2,2'-Oxydiäthanol (Diäthylenglycol) oder anderen wasserartigen Alkoholer oder Estern, beispielsweise Äthylenglykol, Propylenglycol, Dimethyläther von Diäthylenglycol und Diäthylcarbitol, überwunden. Wenn man in dieser Weis« vorgeht, kann man 1-Naphthylbutyrat und 1-Naphthylacetat bis zu einer Konzentration von nahezu 1 mg/m lösen. Auch andere Substrate können gelöst werden beispielsweise «-Naphthylchloracetat, Indoxylester beispielsweise Indoxylacetat, Indoxylpropionat unc Indoxylbutyrat, 8-Hydrochinolinester, beispielsweisf 8-Hydrochinolinacetat, 8-Hydrochinolinpropionat unc 8-Hydrochinolinbutyrat. Unter denselben Bedingungei kann man nur 0,1 mg/ml Naphthol-AS-Acetat lösen so daß sich eine wesentlich geringere Farbentwicklunj ergibt. Die anderen Ester der Naphthol-AS-Derivati lösen sich in einem noch geringeren Mali.Usually in the classical esterase lipase chemistry substrates used are slightly insoluble. So within a short time, For example, 5 minutes, a sufficient color development occurs, the concentration of the substrate should in the final incubation solution exceed about 0.5 mg / ml. Naphthol AS esters and their derivatives however, as well as 1-naphthylbutyrate have solubility less than 0.5 mg / ml. This problem is preferably alleviated by adding up to a quarter of the final volume of 2,2'-oxydiethanol (diethylene glycol) or other water-like alcohols or esters, for example ethylene glycol, propylene glycol, Dimethyl ether of diethylene glycol and diethyl carbitol. If you are in this way going on, one can use 1-naphthyl butyrate and 1-naphthyl acetate Dissolve up to a concentration of almost 1 mg / m. Other substrates can also be solved for example «-naphthyl chloroacetate, indoxyl ester, for example indoxylacetate, indoxyl propionate unc Indoxyl butyrate, 8-hydroquinoline ester, for example 8-hydroquinoline acetate, 8-hydroquinoline propionate, unc 8-hydroquinoline butyrate. Only 0.1 mg / ml of naphthol AS acetate can be dissolved under the same conditions so that there is much less color development. The other esters of the naphthol AS derivatives dissolve in an even lower Mali.
Die fnlL'iMiden Beispiele sind typische Re.iccn/ienThe fnll'iMid examples are typical references
9 109 10
die zum Färben von Monozyten, Eosinophilen und Die obigen Substanzen werden für etwa 1 Minutethose used to stain monocytes, eosinophils and the above substances are used for about 1 minute
Neutrophilen bevorzugt verwendet werden: gemischt und dann gegeben inNeutrophils are preferably used: mixed and then given in
Reagenzien für Eosinophile und Neutrophile 0,1-molares K2HPO4 (StammlösungReagents for eosinophils and neutrophils 0.1 molar K 2 HPO 4 (stock solution
c. ... , — um den pH-Wert auf 5,8 bis 6,2 c . ..., - to bring the pH to 5.8 to 6.2
Stammlosungen: 5 einzustellen) p 17>0 ml Stock solutions: 5 to be set) p 17> 0 ml
0,003% und 0,006% Gewichtsteile von H2O2 Insgesamt ... 18^m"0.003% and 0.006% parts by weight of H 2 O 2 Total ... 18 ^ m "
in Wasser, 6 in water, 6
°'5ß TOn .^'or-l-naphthol in 25ml VOn Die Menge des benutzten basischen Fuchsins hat° '5ß TOn . ^' Or-l-naphthol in 25ml of the amount of basic fuchsin used
' xLXy ,I n ·' „ ™ eine endgültige Konzentration von 0,001 bis 0,01 %.'xL Xy , I n ·' “™ a final concentration of 0.001 to 0.01%.
0,1-Normaless.gsaure. Bdm B Färb e en def Monozyten werden bei einem 0.1 normal acid. Bdm B Färb e s def monocytes are at an
Arbeitslösungen: bevorzugten strömungstechnischen Ausführungsbeispiel etwa 0,32 ml/min formalinfixierte Probe, etwaWorking solutions: preferred fluidic embodiment about 0.32 ml / min formalin fixed sample, approx
Färbelösung für Eosinophile (pH-Wert^ 2,5): 0,42 ml/min «-Naphthylbutyrat und etwa 0,42 ml/minStaining solution for eosinophils (pH value ^ 2.5): 0.42 ml / min «-naphthyl butyrate and about 0.42 ml / min
0,1-Normalessigsäure 40 ml 15 Hexazoniumpararosanilin zugegeben. Beim Färben0.1 normal acetic acid 40 ml of 15 hexazonium pararosaniline were added. When dyeing
2,2'-Oxydiäthanol (100%) 20 ml der Eosinophilen werden etwa 0,60 ml/min Eosinophil-2,2'-Oxydiethanol (100%) 20 ml of the eosinophils are about 0.60 ml / min eosinophil
4-Chlor-l-naphthol (Stammlösung) .. 8 ml färbelösung und etwa 0,10 ml/min 0,O6°/oiges H2O2 4-chloro-l-naphthol (stock solution) .. 8 ml staining solution and about 0.10 ml / min 0, O6 ° / o strength H 2 O 2
konzentrierte Essigsäure 3,4 ml zu etwa 0,42 ml/min der formalinfixierten, hämoly-concentrated acetic acid 3.4 ml at about 0.42 ml / min of the formalin-fixed, haemoly-
sierten Probe zugegeben. Beim Färben der Eosino-added sample. When staining the eosin
Färbelösung für Eosinophile und Neutrophile 20 phjlen und Neutrophiien werden etwa 0,32 ml/min Phjlen staining solution for eosinophils and neutrophils 20 and Neutroph ii en who to about 0.32 ml / min
(pH-Wert 2: 3,3): Eosinophil-Neutrophil-Färbelösung, etwa 0,10 ml/min(pH 2: 3.3): eosinophil neutrophil staining solution, about 0.10 ml / min
0,1-Normalessigsäure 40 ml 0,03°/oiges Wasserstoffperoxid und etwa 0,23 m!/min0.1 normal acetic acid 40 ml of 0.03 ° / o hydrogen peroxide and about 0.23 m! / Min
2,2'-Oxydiäthanol (100%) 20 ml der formalinfixierten, hämolysierten Probe zusammen-2,2'-Oxydiethanol (100%) 20 ml of the formalin-fixed, hemolyzed sample together
4-Chlor-l-naphthol (Stammlösung) .. 13 ml gebracht.4-chloro-l-naphthol (stock solution) .. 13 ml brought.
25 Eine Reihe von Komponenten in Gesamtblutproben25 A range of components in whole blood samples
In Verbindung mit den oben erwähnten 4-Chlor- stört sowohl das Peroxidase- als auch das Monozyten-In connection with the above-mentioned 4-chlorine disrupts both the peroxidase and the monocyte
1-naphthol-Lösungen werden Wasserstoffperoxidlö- färbeverfahren.1-naphthol solutions are used in a hydrogen peroxide bleaching process.
sungen verwendet Zahlreiche andere organische und Wenn die Peroxidasereaktion durchgeführt wird,solutions used numerous other organic and When the peroxidase reaction is carried out,
inorganische Peroxide können benutzt werden. Als kann Serumkatalyse die granulocytische Peroxidaseinorganic peroxides can be used. As serum catalysis can granulocytic peroxidase
Beispiele werden angeführt: Natriumperborattetrahy- 3° überwältigen und dabei das Substrat aufbrauchen,Examples are given: Overpower sodium perborate tetrahy- 3 ° and use up the substrate in the process,
drat, Natriumcarbonatperoxid, Natriumpyrophosphat- Katalase ist wärmeunbeständig bei etwa 50cC,drat, sodium carbonate peroxide, sodium pyrophosphate catalase is not heat-resistant at around 50 c C,
peroxid, Äthylhydroperoxid, tertiäres Butylhydroper- während Peroxidase bis zu etwa 80° C stabil ist. Demzu-peroxide, ethyl hydroperoxide, tertiary butyl hydroper- while peroxidase is stable up to about 80 ° C. In addition
oxid und Harnstoffperoxid. Alle diese Stoffe können mit folge v/ird die Katalase vorzugsweise durch Erhitzenoxide and urea peroxide. All of these substances can be processed with the catalase, preferably by heating
einer endgültigen Konzentration von 0,1 bis 0,0001 Ge- auf eine Temperatur von 37°C für 10 Minuten bzw.a final concentration of 0.1 to 0.0001 Ge at a temperature of 37 ° C for 10 minutes or
wichtsprozent verwendet werden. 35 auf 550C für 1 Minute oder dazwischenliegendeweight percentage can be used. 35 to 55 0 C for 1 minute or in between
Das 4-Chlor-l-naphthol wird mit einer endgültigen Temperatur- und Zeitwerte inaktiviert. BesondersThe 4-chloro-l-naphthol is inactivated with a final temperature and time value. Especially
Konzentration von 0,001 bis 0,06 Gewichtsprozent bevorzugt wird eine Erwärmung auf 50° C für 3 Mi-Concentration of 0.001 to 0.06 percent by weight, heating to 50 ° C for 3 minutes is preferred
benutzt. nuten. Eine Verdünnung des Bluts verstärkt dasused. grooves. Thinning of the blood exacerbates this
Reagenzien für Monozyten Verhältnis der intrazellulären PeroxidasewirksamkeitReagents for monocytes Ratio of intracellular peroxidase activity
40 in bezug auf die restliche Katalasasekonzentration.40 with respect to the residual catalasase concentration.
Stammlösungen: Wenn die Katalasekonzentration auf einen PunktStock solutions: When the catalase concentration reaches a point
1. «-Naphthylbutyrat — 1 Gewichtsprozent in vermindert ist, bei dem sie erfolgreich mit der Neutro-2,2'-Oxydiäthanol, philäeroxidase konkurriert, wird das aktivere Eosino-1. «-Naphthylbutyrate - 1 percent by weight is reduced in which it is successful with the neutro-2,2'-oxydiethanol, When it competes with philäeroxidase, the more active eosin
2. 1/15-molares KH2PO4 (zweifachbasisch) — etwa philperoxid immer noch stark gefärbt.2. 1/15 molar KH 2 PO 4 (doubly basic) - for example, peroxide still strongly colored.
9,07 g/l, 45 Beim Erhitzen der Blutlösung wird auch die Pseudo-9.07 g / l, 45 When the blood solution is heated, the pseudo-
3. 1/15-molares K2HPO4 (zweifachbasisch) — etwa peroxidasewirksamkeit des Hämoglobins zerstört.
11,61 g/l, Die störende Komponente während der Monozyten-3. 1/15 molar K 2 HPO 4 (doubly basic) - about the peroxidase effectiveness of the hemoglobin destroyed.
11.61 g / l, the disruptive component during monocyte
4. Basisches Fuchsin (beispielsweise Matheson, CoIe- färbung ist der C l'-Esteraseinhibitor, eine gut bekannte man & Bell) 1 g in 25 ml von 2 n-HCl, Komponente des Serums, die die Cl'-Esterase inaktiv4. Basic fuchsine (e.g. Matheson, CoIe stain is the C1 'esterase inhibitor, a well known one man & Bell) 1 g in 25 ml of 2 n-HCl, component of the serum that makes the Cl'-esterase inactive
5. 2,2'-Oxydiäthanol, 5o hält. Die Wirkung des Cl'-Esteraseinhibitors kann5. 2,2'-Oxydiethanol, 50 holds. The effect of the Cl'-esterase inhibitor can
6. 0,1-molares K2HPO4, man in mannigfacher Weise blockieren. Ein Wej6. 0.1 molar K 2 HPO 4 , you block in a variety of ways. A Wej
7. 1 g Natriumnitrit in 25 ml H2O. besteht darin, eine Mischung aus Heparin (ein Anti·7. 1 g of sodium nitrite in 25 ml of H 2 O. consists of a mixture of heparin (an anti ·
. koagulat) und Cl'-Esterase der Probe zuzugeben. coagulate) and Cl'-esterase to the sample
Arbeitsreagenzien: um den Inhjbjtor zu binden. Dies wird jedoch nichiWorking Reagents: to bind the Inh j b j tor. However, this will not be the case
Λ-Naphthylbutyrat: 55 bevorzugt, da Cl'-Esterase sehr teuer ist. Statt desserΛ-naphthyl butyrate: 55 preferred because Cl'-esterase is very expensive. Instead of this
«-Naphthyrbutyrat(Stammlösune).. 2,0ml £ann man eine Kombination von Heparin und«-Naphthyrbutyrat (stock solution) .. 2.0ml £ can be a combination of heparin and
2,2'-Oxydiäthanol 6,0 ml Streptokinase zugeben Eine wenig aufwendige AnAdd 2,2'-oxydiethanol 6.0 ml streptokinase
1/15-molares KHoPO 8,0 ml besteht dann, die Probe mit einer Kaliumsalzlösuni1/15 molar KHoPO 8.0 ml then consists of the sample with a potassium salt solution
(einfachbasisch) * ' zu verdunQen- Normalerweise benötigt man eins (simple-basic ) * 'to diminish - Usually you need one
60 50fache Verdünnung. Dadurch wird jedoch die Zähl·60 50-fold dilution. However, this reduces the count
Insgesamt ... 16,0ml geschwindigkeit erheblich herabgesetzt. Ein bevorOverall ... 16.0ml speed significantly reduced. A before
zugtes Verfahren besteht darin, 2,2'-OxydiäthanoI deiApproved method consists in 2,2'-OxydiäthanoI dei
Die obige Lösung sollte täglich neu aufbereitet fixierten Blutprobe in Konzentrationen von 10 bi:The above solution should be prepared daily, fixed blood sample in concentrations of 10 bi:
werden. 30 % zuzusetzen. Dadurch wird der Inhibitor in einen will. Add 30%. This turns the inhibitor into a
Hexazoniumpararosanilin-Kuppler: '5 hö T herfn Maße geschädigt als die MonozytenlipaseHexazoniumpararosanilin couplers: '5 hö forth T f n dimensions damaged than the Monozytenlipase
F 1^ In den F 1 g. 1 und 2 ist eine Vorrichtung dargestellt F 1 ^ In the F 1 g. 1 and 2 an apparatus is shown
Basises Fuchsin (Stammlösung) 0,8 ml mit der man die verschiedenen Reagenzien der ProbeBasic fuchsin (stock solution) 0.8 ml with which the various reagents of the sample
Natriumnitrit (Stammlösung) 0,8 ml zugeben kann. Die in cer F i g. 1 dargestellte Anord-Sodium nitrite (stock solution) can add 0.8 ml. The in cer F i g. 1 shown arrangement
nung dient zum Bestimmen und Zählen der Eosinophilen und Neutrophilen, während die in der F i g. 2 dargestellte Anordnung zum Bestimmen des Monozytgehalts in einer Probe verwendet wird. Diese Anordnungen sind einer von Skeggs, L. T., Am. J. Clinical Path., Band 28, S. 311 (1957), beschriebenen Vorrichtung ähnlich, die früher zur klinisch-chemischen Analyse verwendet wurde.tion is used to determine and count the eosinophils and neutrophils, while those shown in FIG. The arrangement shown in FIG. 2 for determining the monocyte content is used in a sample. These arrangements are one of Skeggs, L. T., Am. J. Clinical Path., Vol. 28, p. 311 (1957), described device similar to those previously used for clinical-chemical Analysis was used.
Bei der Darstellung nach der F i g. 1 wird eine Probe von einem Probennehmer 1 durch eine Leitung 2 geführt und mit einer Formalinlösung gemischt, die in einem Kühler 46 gekühlt wird. Es werden Luftblasen zugegeben, um den Flüssigkeitsstrom in Schübe zu unterteilen, um eine Durchmischung der aufeinanderfolgenden Proben zu verhindern. Das Proben-Formalin-Gemisch wird durch eine Mischschi ange 3, eine geheizte Mischschlange 4 und eine weitere Mischschlange 5 geleitet, die in einem Kühler 6 mit Eiswasser gekühlt wird. Über eine Leitung 7 wird der fixierten Probe für die Hämolyse Essigsäure zugeführt. Dieses Gemisch wird durch eine Mischschlange 8 und eine geheizte Mischschlange 9 geleitet und von dort einem Stromteiler 10 zugeführt, in dem Probenüberschüsse und Blasen über eine Leitung 11 abgegeben werden und der Probenstrom aufgeteilt wird. Die aufgeteilten Ströme werden von Leitungen 12 bzw. 13 geführt. Dem Strom in der Leitung 13 wird ein Gemisch aus einem Eosinophilfärbemittel und Wasserstoffperoxid über Leitungen 15 bzw. 16 zugegeben. Weiterhin wird der Strom durch über eine Leitun ■ 14 zugeführte Luft erneut in Schüde unterteilt. Das gemisch wird durch Mischschlangen 17 und 18 geleitet. Weiterhin strömt das Gemisch durch Mischschlangen 20, 21 und 22 und gelangt in einen Eosinphilzellenzähler 23, an den ein Schreiber 24 angeschlossen ist.In the illustration according to FIG. 1 takes a sample from a sampler 1 through a line 2 and mixed with a formalin solution, which is cooled in a cooler 46. Air bubbles are added to divide the flow of liquid into batches to mix the successive To prevent rehearsals. The sample-formalin mixture is passed through a mixing shaft 3, a heated one Mixing coil 4 and another mixing coil 5 passed, which are cooled in a cooler 6 with ice water will. Acetic acid is fed to the fixed sample for hemolysis via a line 7. This mixture is passed through a mixing coil 8 and a heated mixing coil 9 and from there a flow divider 10 supplied, in which excess sample and bubbles are discharged via a line 11 and the Sample stream is divided. The divided currents are carried by lines 12 and 13, respectively. The stream in line 13 is a mixture of an eosinophil stain and hydrogen peroxide via lines 15 or 16 added. Furthermore, the current is broken down again by air supplied via a line 14 divided. The mixture is passed through mixing coils 17 and 18. The mixture continues to flow through Mixing snakes 20, 21 and 22 and arrives in an eosin phil cell counter 23, to which a writer 24 connected.
Der Strom in der Leitung 12 wird mit einem Färbemittel für Eosinophile und Neutrophile und mit Wasserstoffperoxid zusammengeführt. Diese Substanzen werden über Leitungen 26 bzw. 27 zugegeben. Die über eine Leitung 25 zugeführte Luft dient wiederum zur Unterteilung des Stroms in Schübe. Dieses Gemisch wird durch eine Mischschlange 28 und eine auf 37 = C erhitzte Schlange 29 geschickt. Der die gefärbten Zellen enthaltende Strom wird durch eine Schlange 31 geleitet und von dort einem Zähler 32 zugeführt, der die Gesamtanzahl der Eosinophilen und Neutrophilen zählt. An den Zähler 32 ist ein Schreiber 33 angeschlossen.The current in line 12 is with a Stains for eosinophils and neutrophils and merged with hydrogen peroxide. These substances are added via lines 26 and 27, respectively. The air supplied via a line 25 is in turn used to divide the current into bursts. This mixture is through a mixing coil 28 and a Snake 29 heated to 37 = C sent. The current containing the stained cells is passed through a Snake 31 and fed from there to a counter 32, which shows the total number of eosinophils and neutrophil counts. A recorder 33 is connected to the counter 32.
Mit der beschriebenen Anordnung kann man die in einer Probe vorhandenen Eosinophilen und Neutrophilen zählen.With the arrangement described, one can detect the eosinophils and neutrophils present in a sample counting.
Mit der in der F i g. 2 gezeigten Anordnung kann man die Anzahl der Monocyten in einer Probe zählen.With the in FIG. 2 one can count the number of monocytes in a sample.
ίο Die Probe wird von einem Probennehmer 34 zugeführt und in einem ummantelten Eisbad 35 mit einem luftunterteilten Formalinstrom vereinigt, der zuvor in einer Schlange 36 gekühlt wird. Diesem Gemisch wird Λ-Naphthylbutyrat, Oxydiäthanol und Hexazoniumpararosanilin sowie Essigsäure zugeführt Zum Herstellen dieses Gesamtgemisches wird dei Strom durch Mischschlangen 37 bis 43 geleitet. Die die gefärbten weißen Blutzellen enthaltende Lösung wird einem fotometrischen Monozytenzellenzähler 44 zugeführt, an den ein Schreiber 45 angeschlossen ist Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete Zahl-Einrichtungen sind beispielsweise in den folgenden Literaturstellen beschrieben Kamensky, L. A., et al, Annals N. Y. Acad Sei., Band 157, Abhandlung 0, S. 310 ff. (1969) unc K a m e η s k y, L. A., et al, Proc. I. E. E. E., Band 57 S. 2007 (1969).ίο The sample is supplied by a sampler 34 and combined in a jacketed ice bath 35 with an air-divided formalin stream previously in a coil 36 is cooled. This mixture is Λ-naphthyl butyrate, oxydiethanol and hexazonium pararosaniline as well as acetic acid supplied To produce this total mixture, the dei Stream passed through mixing coils 37-43. The solution containing the colored white blood cells is fed to a photometric monocyte cell counter 44 to which a writer 45 is connected Payment devices suitable for carrying out the method according to the invention are, for example described in the following references Kamensky, L.A., et al, Annals N.Y. Acad Sci., Volume 157, Abhandlung 0, pp. 310 ff. (1969) and K a m e η s k y, L. A., et al, Proc. I. E. E. E., Volume 57 S. 2007 (1969).
Der Zähler beleuchtet die Lösung mit den suspendierten Zellen mit einem Lichtstrahl. Gefärbte Zeller entfernen eine gewisse Lichtmenge aus dem Strahl Diese entfernte Menge unterscheidet sich meßbar vor derjenigen Lichtmenge, die von nicht gefärbten Zeller oder von weniger stark gefärbten Zellen entfernt wird Infolge dieser Differenz kann man zwischen zwei odei mehreren Arten von Zellen unterscheiden und diesf Zellen genau zählen.The counter illuminates the solution with the suspended cells with a beam of light. Colored cells remove a certain amount of light from the beam. This removed amount differs measurably before that amount of light that is removed from unstained cells or from less strongly stained cells As a result of this difference, one can distinguish between two or more types of cells and this Count cells accurately.
In einem derartigen Zähler kann man die Zeller mit hohen Zählgeschwindigkeiten bestimmen, bei spielsweise 1000 bis 30 000 Zellen pro Minute unc pro Kanal. Die Blutproben von verschiedenen Patien ten werden aufeinanderfolgend zugeführt und sine durch kurze Waschflüssigkeitsschübe getrennt, di< eine Verseuchung der nachfolgenden Blutprobe! durch die vorangegangenen Proben verhindern.In such a counter, the cells can be determined at high counting speeds for example 1000 to 30,000 cells per minute unc per channel. The blood samples from different patients thes are supplied in succession and sine separated by short bursts of washing liquid, di < contamination of the subsequent blood sample! prevent by the previous samples.
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