DE2120426A1

DE2120426A1 - Varicellavaccine

Info

Publication number: DE2120426A1
Application number: DE19712120426
Authority: DE
Inventors: Maurice Ralph Lafayette Hill; Buynak Eugene Bernard North Wales; Pa. Hilleman (V.St.A.)
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1970-04-28
Filing date: 1971-04-26
Publication date: 1971-11-11
Also published as: HU163131B; AT303965B; BE766333A; IL36649A0; FR2092100B1; GB1293310A; FR2092100A1; ZA712711B; ES390603A1; NL7103524A; AU2788871A

Description

Die Erfindung betrifft eine Vaccine gepeη das Varicellavirus, insbesondere eine abgeschwächte Varicella-Lebendvirusvaccine, und ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Vaccine, insbesondere durch Reihenvermehrung des Varicellavirus in Zellkultur sy st einen.The invention relates to a Vaccine gepeη the varicella virus, in particular an attenuated live varicella virus vaccine, and a method for producing such a vaccine, in particular by serial multiplication of the varicella virus in cell culture sy st a.

Varicella oder Windpocken sind eine stark übertragbare Krankheit hauptsächlich des Kindes. Für die Krankheit kennzeichnend sind typischerweise Fieber und das Entstehen eines makulösen Ausschlags, der sich unter Durchlaufen der Stufen der Papel- und Bläschenbildung rasch entwickelt. Die Genesung verläuft gewöhnlieh ohne Zwischenfälle, aber die Erkrankung führt selbst in ihrer leichten Form zur Unansehnlichkeit und kann eine beträchtliche Narbenbildung auf Grund geplatzter Bläschen mit sich bringen. In diesem oder jenem Fall kann die Erkrankung dadurch recht stark sein, dass beim Kind oder Erwachsenen primäre Varicellapneumonie auftreten kann. Der Varicella-Infektion vorausgehen, sie begleiten oder ihr folgen können Zentralnervensystem-Komplikationen, wie von Zittern begleiteteVaricella or chickenpox is a highly communicable disease mainly of the child. Characteristic of the disease are typically fever and the development of a macular rash that spreads through the steps of the papular and blistering develops rapidly. Recovery is usually going on without incident, but the disease, even in its mild form, is unsightly and can be considerable Bringing scarring due to burst blisters. In this or that case, the disease can be quite severe because primary varicella pneumonia can occur in children or adults. The varicella infection may precede, accompany, or follow central nervous system complications such as those accompanied by tremors

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akute, zerebellare Ataxie und Muskelhypotonie. Auch kann, wenngleich auch seltener, eine generalisierte Affektion des Zentralnervensystems mit Blutung, perivaskulärer Rundzellinfiltration und Demyelinisierung eintreten. Neuritis und Myelitis können ebenfalls auftreten. Auch die Hautaffektion kann unter Inerscheinungtreten von hämorrhagischen, knol]igen oder brandigen Läsionen unangenehm sein.acute cerebellar ataxia and muscle hypotension. Also can, albeit also more rarely, a generalized affection of the central nervous system with bleeding, perivascular round cell infiltration and demyelination occur. Neuritis and myelitis can also occur. The skin affection can also appear be uncomfortable with hemorrhagic, bulbous, or gangrenous lesions.

Eine Verhinderung der Erkrankung zur Ausschliessung solcher Fälle· durch Vaccination ist somit gerechtfertigt, und die vorliegende Erfindung bezweckt die Schaffung einer sicheren, attenuierten Varicella-Lebendvirusvaccine für diesen Zweck wie auch die Verfüg bar mac hung eines Verfahrens zu deren Herstellung.A prevention of the disease to exclude such cases by vaccination is thus justified, and the present invention aims to provide a safe, attenuated Live varicella virus vaccines for this purpose as well as the availability of a method for their production.

Man hat schon verschiedentlich eine Vaccination empfänglicher, freiwilliger Versuchspersonen versucht, wobei sich jedoch variierende Ergebnisse bezüglich des "Angehens" und weitgehende Meinungsverschiedenheiten bezüglich der Wirksamkeit des Schutzes ergaben. Trotz des Umstandes, dass diese Vaccinationsversuche bei empfänglichen Freiwilligen mit voll virulentem Virus in väsikulärer Flüssigkeit von Varicella-Zoster-Fällen erfolgten, blieben jedoch wesentliche, ungünstige Auswirkungen aus.One has already had a vaccination more susceptible on various occasions, Tried volunteer subjects, but varying "Approach" results and wide disagreement over the effectiveness of protection revealed. Despite the fact that these vaccination attempts in susceptible volunteers with fully virulent virus in vesicular fluid from varicella-zoster cases, however, there were no material, adverse effects.

Im Stand der Technik ist die Vermehrung von Varicellavirus in verschiedenen Zellkultursysternen, wie menschlichem Arnnion, menschlichen Embryofibroblasten, HeLa-Zellen und menschlicher Thyreoidea, berichtet, aber bisher bestand allgemein die Ansicht, dass die einzige Quelle für ampullenfähiges, zellenfreies Varicellavirus von der vesikulären Flüssigkeit gebildet wird. Caunt u. a. haben im "Journal of Hygiene", 62, 413 bis 424 (1964), die Isolierung von zellenfreiem Virus von Thyreoideagewebe des Menschen berichtet, und Brunell hat in "Virology", ;51, 73? bis 7?4 (1967)s die Isolierung von zellenfreiem Virus von Embryofibroblasten des Menschen beschrieben. Die vesikuläre Flüssigkeit ist aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit und der Virulenz offensichtlich eine ungeeignete Lebendvirus-Quelle für die Erzeugung einer Vaccine. Das Thyreoideagewebe des Menschen ist ein primäres menschliches Zellgewebe und infolgedessen als Gewebekultursystem für die Vermehrung und Attenuie-The prior art has reported the proliferation of varicella virus in various cell culture systems such as human amnion, human embryo fibroblasts, HeLa cells, and human thyroid gland, but it has been generally believed that the only source of ampouleable, cell-free varicella virus is formed from the vesicular fluid will. Caunt et al. Have reported the isolation of cell-free virus from human thyroid tissue in "Journal of Hygiene", 62, 413 to 424 (1964), and Brunell has in "Virology",; 51, 73? to 7? 4 (1967) s described the isolation of cell-free virus from human embryo fibroblasts. The vesicular fluid is obviously an unsuitable source of live virus for the production of a vaccine because of its limited availability and virulence. The thyroid tissue of humans is a primary human cell tissue and as a result acts as a tissue culture system for reproduction and attenuation

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rune ^von Viran zur Erzeugung von Lebendvirusvaccinen nicht akzeptabel. Die Isolierung von zellenfreier Virus von Embryof:i broblar.ton des Menschen, wie von Brunell berichtet, hat eine Peschallung der Zellsuspension erfordert, und ein solcher Prozess ist für die Vaccineherstellung im grossen Massstab impraktikabel. rune ^of Viran not acceptable for the generation of live virus vaccines. Isolation of cell-free virus from Embryof: i broblar.ton of humans, as reported by Brunell, has required panning of the cell suspension and such a process is impractical for large-scale vaccine manufacture.

Im Ergebnis ist keine der bisher berichteten Quellen für zcllfreierj Varicellavirus vom Herstellerstandpunkt aus gangbar. As a result, none of the previously reported sources is for zcllfreierj varicella virus viable from the manufacturer's point of view.

überraschenderweise wurde nunr.ehr gefunden, dass eine zellfroie Passafe in zweckentsprechenden Gewebekulturpräparationen erreicht, ein extrazellulares, lebendes Varicellavirus in gror.ner Menge gewonnen und hieraus eine Varicella-Lebendvirusvaccine hergestellt werden kann.Surprisingly, it has now been found that a cell free Passafe achieved in appropriate tissue culture preparations, an extracellular, live varicella virus in A large amount was obtained and from this a varicella live virus vaccine can be produced.

Nach dem Verfahren gemäss der Erfindung erfolgt eine Reihenpassage von virulentem Varicellavirus in einem Gewebekultursystem. Das Gewebekultursystem kann jegliches für Vaccineerzeugunc {',eeignetes und das Viachsen des Virus tragendes System sein, wie Diploidzellstämme vom Menschen und auf den Affen zurückgehende Prinärzellen. Die bevorzugten Systeme werden von Affenhodengewcbo und Diploddlungenpewebe des menschlichen Fötus (WI-.58) geliefert, wobei die Herstellung nach bekannten Methoden erfolgt.According to the method according to the invention, a series passage takes place of virulent varicella virus in a tissue culture system. The tissue culture system can be anything for vaccine production {', a suitable system that carries the virus against growth like diploid cell strains dating back to humans and monkeys Primary cells. The preferred systems are from Monkey testicle tissue and diploma lung tissue of the human fetus (WI-.58), the production according to known methods he follows.

Die Kultur wird 10 bis etwa 20 Tage bei "50 bis 3'I C, vorzugsweise bei 32 C, inkubiert. Die tatsächliche Inkubationszeit variiert und wird durch Mehrfachernten bestimmt, die man in Abständen von 2 bis 3 Tagen sammelt, wobei das Inoculum für die nächste Passage aus der bzw. den Ernte (n) gewählt wird, Vielehe die maximale Infektionskraft zeigt bzw. zeigen. Das Inoculum kann eine infizierte Zellsuspension, Ernteflüssigkeit oder filtrierte Ernteflüssigkeit sein.The culture is 10 to about 20 days at "50 to 3 ° C, preferably incubated at 32 ° C. The actual incubation period varies and is determined by multiple harvests that one takes at intervals collects from 2 to 3 days, choosing the inoculum for the next passage from the crop (s), polygamy shows or shows the maximum infectious force. The inoculum can be an infected cell suspension, harvest fluid, or filtered Be harvest liquid.

Nach 5 bis etwa 20 solcher Passagen vereinigt man die gewählten Ernten von der Endpassage, behandelt mit einem zweckentsprechenden Stabilisator, wie Rohrzucker, Albumin, Glutamin-After 5 to about 20 such passages, the selected ones are combined Harvesting from the final passage, treated with an appropriate stabilizer, such as cane sugar, albumin, glutamine

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phosphat oder dergleichen, filtriert durch ein sterilisierendes Filter und verteilt auf Einzeldosis-Rehälter für den Vertrieb als Vaccine. Die Dosis kann etwa 0,1 bis 2,0 ml mit einem Gehalt von 100 bis etwa 1000 TCID_ro (TCID = Tissue Culture Infectivity Dose) in flammverschlossenen Ampullen betragen oder als gefriergetrocknetes Produkt in verstöpselten Fläschchen für, die Rekonstitution in keimfreiem Wasser bereitstehen. Die Verabreichung kann durch Skarifizierung (Mehrfachpunktur), intradermal oder subcutan erfolgen.phosphate or the like, filtered through a sterilizing filter and divided into single-dose containers for sale as vaccines. The dose can be about 0.1 to 2.0 ml with a content of 100 to about 1000 TCID _ro (TCID = Tissue Culture Infectivity Dose) in flame-sealed ampoules or as a freeze-dried product in capped vials for reconstitution in sterile water. Administration can be by scarification (multiple puncture), intradermal or subcutaneous.

Das Impfvirus für den obigen Prozess wird in der Bläschenflüssigkeit von einem klinischen .Windpockenfall isoliert und in Kalbsinfusionsbrühe bei -70 C aufbewahrt.The vaccine virus for the above process gets in the vesicle fluid isolated from a clinical case of chickenpox and stored in veal infusion broth at -70 ° C.

Beispiel 1 Example 1

Herstellung von Varicella-Lebendvirusvaccine durch 20 Reihenpassapen.in Wl-38 Production of varicella live virus vaccines by 20 serial passages in Wl-38

Nach den nachfolgend beschriebenen Techniken erfolgten 19 Keihenpassagen von Varicellavirus in Wl~38-Gewebeku3tür. Unter Einsatz der vereinigten Ernten des 17. und 20. Tages von der 19. Passage als Impfvirus wurde eine Varicella-Lebend-Vaccine wie folgt hergestellt:19 Keihen passages were carried out using the techniques described below of varicella virus in Wl ~ 38 tissue door. Under Using the combined harvests of the 17th and 20th day from the 19th passage as the vaccine virus became a varicella live vaccine manufactured as follows:

Die Wl-38-Zellkulturen wurden in 1850-ml-Flascheri unter Verwendung von EBME, einer Handelspräparation des Mediums nach Eagle in Earle-Basissalzlösung mit einem Gehalt von 10 % an nicht erhitztem Kalbsfötusserum als Wachstumsmedium hergestellt. Vier Tage nach dem Einbringen wurde das Wachstumsmedium verworfen, und die Flaschenkulturen wurden mit jeweils 15 ml in 1:2-Verdünnung inoculiert. Das Inoculum wurde 2 Std. bei 3?^c C adsorbiert, worauf wieder 60 ml EBME mit einem Gehalt von 2 % an inaktiviertem, von der 7^K-Globulin-Komponente freiem Kalbs-.serum zugeführt wurden. Die Inkubation erfolgte bei 32° C in einer Drehapparatur. Vier Tage nach der Beimpfung wurden die Flaschenkulturen viermal mit je 100 ml Hanks-BSS-Lösung gewaschen, worauf zu jeder Flasche 70 ml Medium 199 (Medium, das Aminosäuren, Vitamine, NucleinsäurenbestandteiIe und verschiedene Salze enthält) mit einem Gehalt von 10 % anThe Wl-38 cell cultures were prepared in 1850 ml bottles using EBME, a commercial preparation of the medium according to Eagle in Earle's saline solution containing 10 % of unheated fetal calf serum as the growth medium. Four days after the introduction, the growth medium was discarded and the bottle cultures were inoculated with 15 ml each in a 1: 2 dilution. The inoculum was 2 hours at 3? ^c C adsorbed, whereupon 60 ml of EBME with a content of 2 % of inactivated calf serum free of the 7 ^K -globulin component were added. The incubation took place at 32 ° C. in a rotating apparatus. Four days after the inoculation, the bottle cultures were washed four times with 100 ml of Hanks BSS solution each time, whereupon 70 ml of medium 199 (medium containing amino acids, vitamins, nucleic acid components and various salts) with a content of 10 % was added to each bottle

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Stabilisator hinzugefügt wurden und die Inkubation bei 32° C fortgesetzt wurde. Dem Wachs-, Wasch- und Erhaltungsmedium wurde Neomycin in einer Konzentration von 5 x W g/ml einverleibt. In Abständen von 2 bis 3 Tagen erfolgte die Sammlung von Mehrfachernten und eine Wiederzuführung von frischern, stabilisatorhaltigem Erhaltungsmedium zu den Kulturen. In Primärhumanamnionzellkulturen erfolgten Titrationen jeder Ernte auf die Infektionskraft. Jede Ernte wurde in keimfreien Behältern gesammelt, von denen zur Prüfung auf Mikrobenfrenheit Proben genommen wurden, während der Rest im Pläschchen, das in einem Trockeneis-Alkohol-Kältebad umläuft, an dessen Wandung gefroren wurde. Bis zur Wahl zufriedenstellender Ernten für die Vaccine wurden die virushaltigen Fluide bei -70 C aufbewahrt.Stabilizer was added and incubation at 32 ° C was continued. Neomycin was incorporated into the wax, washing and maintenance medium at a concentration of 5 × W g / ml. At intervals of 2 to 3 days, multiple harvests were collected and fresh, stabilizer-containing maintenance medium to the cultures. In Primary human amniotic cell cultures were titrated from each harvest on the power of infection. Each crop was collected in aseptic containers from which to check for microbial friability Samples were taken while the remainder was in the small pellet, which circulates in a dry ice-alcohol cold bath, on its wall was frozen. Until satisfactory harvests were chosen for the vaccines, the fluids containing the virus were kept at -70 ° C kept.

Die Behälter mit den Ernten des 10. und 12. Tages wurden aus der Gefriervorrichtung entnommen und die Flüssigkeiten aufgetaut und keimfrei in einer keimfreien ^J!-1-Flasche vereinigt. Zur Kontrolle und Sicherheitsprüfung wurde eine f]50-ml-Probe (Vor-Klärungs-Probe) genommen. Zu den restlichen Flüssigkeiten wurde dann weiterer Stabilisator auf eine Stabilisator-Endkonzentration von 25 % zugesetzt. Die Vaccine wurde durch Filtrieren durch eine 2,5 χ 20,3 cm Glasfritte-Filt'erkerze von mittlerer Porosität (15 Mikron) geklärt und in einer keimfreien, vorgekühlten Jj-l-Flasche gesammelt. Das Filter wurde vor seiner Anwendung mit 1 1 serumlosem, 25 % Stabilisator enthaltenden Medium 199 für den Einsatz*vorbereitet. Für Sicherheitsprüfungen am Affen wurden I60 ml als Nach-Klärungs-Probe genommen.The containers with the harvests of the 10th and 12th day were removed from the freezer and the liquids thawed and combined aseptically in a sterile ^J ! -1 bottle. A 50 ml sample (pre-clearing sample) was taken for control and safety testing. Further stabilizer was then added to the remaining liquids to a final stabilizer concentration of 25 %. The vaccine was clarified by filtering through a 2.5 × 20.3 cm fritted glass filter candle of medium porosity (15 microns) and collected in a sterile, pre-cooled Jj-1 bottle. Before use, the filter was prepared for use * with 1 liter of serumless medium 199 containing 25% stabilizer. For safety tests on monkeys, 160 ml was taken as a post-clearing sample.

Die Flüssigkeiten wurden in 1,0-ml-Mengen in Ampullen abgefüllt und diese mit der Flamme verschlossen, in einem Trockeneis-Alkohol-Bad gefroren und bei -70 C aufbewahrt.The liquids were dispensed into ampoules in 1.0 ml quantities and this closed with the flame, frozen in a dry ice-alcohol bath and stored at -70 C.

Beispiel 2 Example 2

Herstellung von Varicella-Lebend-Vaccine durch 15 Reihenpassagen in V/l-38 Production of varicella live vaccine by 15 serial passages in V / l-38

Es wurde eine Varicella-Lebend-Vaccine unter Anwendung im wesentlichen der Arbeitsweise von Beispiel 1 mit der AbänderungA live varicella vaccine was established using essentially the procedure of Example 1 with the modification

- 5 ... _{ J09846/ 1 845- 5 ... _{ J09846 / 1 845

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hergestellt, dass insgesamt 15 Passagen in VJl-38-Gewebekul tür erfolgten.Manufactured that a total of 15 passages in VJl-38-Gewebekul door took place.

Beisoiel 3Example 3

Herstellung von Varicella-Lebend-Vaceino durch 10 Reihenpassagen in VfI-38 Production of varicella live vaceino by 10 rows in Vf I-38

Es wurde eine Varicella-Lebend-Vaccine unter Anwendung .in- wcsentliehen der Arbeitsweise von Beispiel 1 mit der Abänderung hergestellt, dass insgesamt 10 Passagen in Vil-38-Gewebekultur erfolgten.A varicella live vaccine was borrowed using in-wcs the procedure of Example 1 with the modification made that a total of 10 passages in Vil-38 tissue culture took place.

Beispiel ^Example ^

Herstellung von Varicella-Lebend-Vaecine 5 Reihenpassagen in Wl-38 Production of varicella live vaecins 5 series passages in Wl-38

Es wurde eine Varicella-Lebend-Vaccine unter Anwendung ir. wesentlichen der Arbeitsweise von Beispiel 1 mit der Abänderung hergestellt, dass insgesamt 5 Passagen in Wl-38-Gewebekultur erfolgten.A varicella live vaccine using ir. Essential the procedure of Example 1 with the modification that a total of 5 passages in Wl-38 tissue culture took place.

Beispiel 5 Example 5

Herstellung von Varicella-Lebend-Vaccine durch 5 Reihenpassagen in Affenhodenzellgewebeicultur Production of varicella live vaccine by 5 serial passages in monkey testes cell tissue culture

Es wurde eine Varicella-Lebend-Vaecine unter Anwendung in wesentlichen der Arbeitsweise von Beispiel 1 mit der Abänderung hergestellt, dass unter "Anwendung von insgesamt 5 Reihenpassage η anstelle des Wi-38-Kultursystems eine bekannte Affenhodenzellgewebekultur eingesetzt wurde.It became a live varicella vaecine using essentially the procedure of Example 1 with the modification that under "Use of a total of 5 row passages η instead of the Wi-38 culture system, a well-known monkey testicular cell tissue culture was used.

B eispiel 6 Example 6

Herstellung von Varicella-Lebend-Vaccine durch 10 Reihenpassagen in Affenhodenzel!gewebekultur Production of varicella live vaccine by 10 serial passages in monkey testes cell tissue culture

Es wurde eine Varicella-Lebend-Vaccine unter Anwendung in wesentlichen der Arbeitsweise" von Beispiel 1 mit der Abänderung hergestellt, dass unter Anwendung von insgesamt 10 Reihenpas-'sagen anstelle des V/l-38-Kultursystems eine bekannte Affen-A varicella live vaccine has been used to a large extent the procedure "of Example 1 with the modification that using a total of 10 series passages instead of the V / l-38 culture system, a well-known monkey

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BÄÖ ORlOtNALBÄÖ ORlOtNAL

Claims

PatentansprücheClaims

Verfahren zur Herstellung eines Varicella-Lebendvirus* das als Antigen in einer Vaccine geeignet ist, die beim Menschen ein Antikörper-Ansprechen auf virulentes Varicella-Virus ohne Hervorrufung der schweren klinischen Manifestationen der Krankheit herbeiführt, dadurch gekennzeichnet, dass man das virulente Virus einer Reihenpassage von der gewünschten Attenuierung des Virus entsprechender. Passagezahl bei 30 bis 3^ C in einer Gewebekulturpräparation aus der Gruppe Diploidzellstämme vom Menschen und Primärzellen vom Affen unterwirft.Method for producing a live varicella virus * das is suitable as an antigen in a vaccine, which in humans has an antibody response to virulent varicella virus without provoking the severe clinical manifestations of the disease, characterized by: that one the virulent virus of a series passage of the desired attenuation of the virus corresponding. Passage number at 30 to 3 ^ C in a tissue culture preparation to the group of diploid cell strains from humans and primary cells from monkeys.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man für die Gewebekulturpräparation Diploidzellstämme vom Menschen, insbesondere Fötuslungengewebe, einsetzt.2. The method according to claim 1, characterized in that diploid cell strains are used for tissue culture preparation by humans, especially fetal lung tissue.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man für die Gewebekulturpräparation auf den Affen zurückgehende Primärzellen, insbesondere Affenhodengewebe, einsetzt. 3. The method according to claim 1, characterized in that one goes back to the monkey for the tissue culture preparation Primary cells, especially monkey testicular tissue, uses.

^l\. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 bzw. 3* dadurch gekennzeichnet, dass man bei einer Inkubationstemperatur von 32° C arbeitet. ^l \. Process according to Claim 1 or 2 or 3 *, characterized in that an incubation temperature of 32 ° C is used.

5. Varicellavaccine, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer immunologischen Wirkmenge an attenuiertem Varicella-Lebendvirus, erhalten durch Reihenpassage des virulenten5. Varicella vaccine, characterized by a content of an immunologically active amount of attenuated varicella live virus, obtained by serial passage of the virulent

ο οο ο

Virus bei 30 bis 3²J C, insbesondere bei 32 C, in einer Gewebekulturpräparation aus der Gruppe Diploidzellstämme vom Menschen und auf den Affen zurückgehende Primärzellen, als wesentlichem Bestandteil.Virus at 30 to 3 ² JC, in particular at 32 C, in a tissue culture preparation from the group of diploid cell strains from humans and primary cells derived from monkeys, as an essential component.

6. Vaccine nach Anspruch 5> dadurch gekennzeichnet, dass6. Vaccine according to claim 5> characterized in that

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sie· unter Einsatz der Diploidzellstäirmie vom Menschen, insbesondere von Fötuslungenpewebe, hergestellt worden ist.using human diploid cellular disease, particularly of fetal lung tissue is.

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BAD OfUQtNAl.BAD OfUQtNAl.