DE2061934A1 - Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis katalasehaltiger Bakterien - Google Patents
Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis katalasehaltiger BakterienInfo
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Description
Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis katalasehaltiger
Bakterien
Herkömmliche bakteriologische Kulturverfahren zum Nachweis
von Bakterien sind zeitraubend, da sie eine Mindestzeit von 24 Stunden erfordern, sie sind wegen der aufgewandten Arbeitsleistung
kostspielig und sie sind nicht so genau, wie es zu wünschen wäre.
Es sind bereits Untersuchungen zur Aktivität des Katalase- ·
Enzyms durchgeführt worden. Bei solchen Untersuchungen wurden die Bakterien mit Wasserstoffperoxid zusammengebracht, und es
wurde dadurch eine Reaktion zwischen den in der Katalase vorhandenen Bakterien ausgelöst, wodurch Sauerstoff freigesetzt
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wurde. Der freigesetzte Sauerstoff trat in das freie Volumen oberhalb der Wasserstoffperoxidlösung ein und verursachte eine
Erhöhung des Gasdruckes. Es sind auch Versuche zur Messung dieser Änderung des Gasdruckes (z. B. mit einem Manometer)
gemacht worden; die Ansprechgeschwindigkeit dieser Methode hat jedoch eindeutige Grenzen, welche die dynamische überwachung
der sehr schnell verlaufenden Reaktion zwischen Katalase und Wasserstoffperoxid verhindern. Ferner spricht der von
Natur aus vorliegende Mangel an Empfindlichkeit dieser Meßart gegen ihre Verwendung für die quantitative Messung der Katalaseaktivität.
Die Katalaseaktivität ist ebenfalls quantitativ gemessen worden
durch Titration des verbleibenden Wasserstoffperoxids nach einer vorgewählten Reaktionsdauer. Diese Methode ist jedoch
umständlich und unbequem, und es würde sehr schwierig sein, sie für die dynamische überwachung zu verwenden. Sie gibt
keine Möglichkeit zur fortlaufenden Aufzeichnung der Reaktion.
Es besteht eine fortdauernde und dringende Notwendigkeit für einen empfindlichen, quantitativen Bakteriendetektor mit
schneller Ansprechgeschwindigkeit zur Verwendung bei der Bestimmung pathologischer Zustände, in der Unterä&hung
der Wasserverschmutzung, in der Verarbeitung von Nahrungsmitteln, in der Abwehr biologischer Kriegsführung und bei
der Regelung von Umgebungsbedingungen. Weiterhin besteht ein Bedarf an Mitteln zur dynamischen und kontinuierlichen
Beobachtung und Aufzeichnung der Reaktion zwischen Katalase und Peroxid. Diese Erfordernisse werden durch die verschiedenen
Ausgestaltungen der hier beschriebenen Erfindung erfüllt.
Die meisten pathogenen Bakterien, welche durch Flüssigkeit
oder durch die Atmosphäre übertragen werden, sind aerobisehe oder fakultativ anaorobische Bakterien, welche mit 3ehr wenigen
Ausnahmen das Enzym-Katalase enthalten. Auf ähnliche Weise ist die Katalase in den meisten tierischen Zellen vorhanden,
beispielsweise in Hautzellen, Erythrozyten, Leber- und Nierenzellen. Daher können Urin und andere Körperflussig-
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keiten Katalase enthalten, wenn Zellen, Bakterien oder Produkte
der Zerstörung von Zellen, welche Katalase enthalten, vorhanden sind. Somit würde die Anwesenheit von wesentlichen
Katalasemengen anzeigen, daß irgendeine ungewöhnliche Zerstörung von katalasehaltigen Zellen auftritt oder in dem Körper
aufgetreten ist oder daß bedeutende Bakterienmengen vorhanden sind. Es ist bereits bekannt, daß dieses Enzym äußerst spezifisch
ist in seiner Fähigkeit zur Disproportionierung von Wasserstoffperoxid. Der Katalasegehalt von Bakterien wird
beispielsweise angegeben mit etwa 1 bis 2 % des ßesamtproteingehaltes,
was einer Menge von etwa ICr bis 10 Katalasemolekülen
pro Organismus äquivalent ist.
Es wurde gefunden, daß eine polarographische Membranzelle
(eine Anode und eine Kathode bilden über einem geeigneten
Elektrolyten einen elektrischen Kreis miteinander, wobei die Kathode einer dünnen Außenwand aus einem für Sauerstoff durchlässigen
Material benachbart ist) erfolgreich angewendet werden kann, um.eine Erhöhung in einer Wasserstoffperoxidlösung
14 3
von sogar weniger als 10 Molekülen pro cirr Sauerstoff quantitativ
zu bestimmen, wenn die vorliegende Erfindung verwendet wird. Die Erhöhung des Partialdruckes des Sauerstoffes würde
sich erfindungsgemäß als der Disproportionierung einer Wasserstoffperoxidlösung
durch die Zumischung einer Flüssigkeitlergeben,
welche Katalasemoleküle enthält. Es wurde ermittelt,
daß die Genauigkeit dieser Messung durch die polarographische Zelle nicht durch die Anwesenheit der Wasserstoffperoxidlösung
(oder einer Wasserstoffperoxid erzeugenden Lösung) beeinträchtigt wird, die mit einer richtig ausgewählten permeablen
Membran in Kontakt ist. Eine derartige Membran sollte für
Wasserstoffperoxid undurchlässig, nicht porös sein und einen Durchlässigkeitskoeffizienten für Sauerstoff haben, der
gleich oder größer als
5 x ΙΟ"11 B
at cm sek
ist. Die Zersetzung des Wasserstoffperoxids in Sauerstoff
und Wasser in Anwesenheit von Katalase, wie beispielsweise
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von Bakterien oder verschiedenen tierischen Zellen, verläuft sehr schnell. Der Sauerstoff-Partialdruck der Wasserstoffperoxidlösung
selbst erhöht sich schnell mit einer Geschwindigkeit, die der Menge des vorhandenen Katalase-Enzyms und dessen Aktivität
proportional ist. Im Falle der Bakterienbestimmung wird angenommen, daß diese Erhöhung im Sauerstoff-Par.tialbruch der
Zahl der in der Wasserstoffperoxidlösung vorhandenen Bakterien proportional ist, wenn bekannt ist, daß keine andere Katalasequelle
in Betracht gezogen werden muß. Es wurde gefunden, daß die Durchlässigkeit von Sauerstoff durch eine selektiv permeable
Membran, welche mit einer Peroxidlösung in Kontakt ist, dem Lösungspartialdruck
von Sauerstoff in der Peroxidlösung selbst linear proportional ist. Das Sauerstoffgas, welches durch die
i| sauerstoffdurchlässige Membran eintritt und mit der Kathode der polarographischen Zelle in Kontakt kommt, erzeugt einen
Zellenstrom, der gemessen und aufgezeichnet werden kann.
Der Nachweis bzw. die Bestimmung des durch eine derartige Zersetzung von·Wasserstoffperoxid erzeugten Sauerstoffes wird
durch die Zuführung der Reaktionsmittel (vorgewählte Volumina einer Flüssigkeitsprobe (Reagenz) und Wasserstoffperoxid (Substrat))
in eine Reaktionskammer herbeigeführt,wo diese mit der
freiliegenden Membran einer polarographischen Zelle in Berührung kommen. Die Freisetzung und Bestimmung von Sauerstoff ermöglicht
eine Messung der Reaktionsgeschwindigkeit.
' Wenn die Reaktionsmittel zugeführt worden sind, wird das Volumen
der Reaktionskammer idealerweise vollständig gefüllt, verschlossen und nicht-expandierbar gemacht worden sein. Eine
derartige Anordnung sorgt für einen großen dynamischen Bereich der Reaktionsgeschwindigkeitsmessung. Dies folgt aus
der Tatsache, daß das Flüssigkeitsmedium, welches das Reagenz und das Substrat umfaßt, in steigendem Maße mit Sauerstoff
übersättigt wird, wenn die Reaktion fortschreitet, und, wenn das Systemvolumen nicht ausdehnbar ist, kann eine Blasenbildung
des Sauerstoffgases bereits bei einer Sauerstoffübersättigung von 0,3 Atmosphären über dem Sauerstoffdruck in der Umgc-
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- 5 bungsatmosphäre
auftreten.
Bei einer nicht ganz idealen Anordnung (wie im Falle von
Einschränkungen bei den Schließventilen) kann das Auftreten einer sehr kleinen Fläche an der Flüssigkeit-Luft-Zwischenphase infolge des unvollständigen Verschlusses der Reaktionskammer
in Kauf genommen werden, solange die Messung der Reaktionsgeschwindigkeit durchgeführt wird, bevor die Sauerstoff
Übersättigung einen Druck von etwa 0,3 Atmosphären Über dem atmosphärischen überschreitet.
Diese Einschränkung hinsichtlich der Zeit für die Messung bildet wiederum eine Beschränkung hinsichtlich der zulässigen
Mischzeit, und es ist wichtig, eine möglichst vollständige
und gleichförmige Mischung der Reaktionsmittel zu haben, um eine wahre Reaktionsgeschwindigkeit in der Grenzschicht über
der Zellmembran zu erzielen. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel dieser Erfindung wird deshalb die Anfangsmischung des
Reagenz und des Substratslunmittelbar vor der Einführung dieser Materialien in die Reaktionskammer durchgeführt, und an diese
anfängliche Mischung schließt sich ein weiteres Rühren innerhalb
der Reaktionskammer an.
Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Beschreibung und
der beigefügten Zeichnungen näher erläutert.
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung einer Betriebseinheit
für die Katalase-Bestimmung in Körperflüssigkeiten, wie z. B. Urin für die Bestimmung und/oder überwachung
pathologischer Zustände*
Fig. 2 und 3 zeigen schematisch andere Ausfuhrung3formen der
in Fig. 1 dargestel'lten Vorrichtung.
Fig. 4 zeigt eine schematische Darstellung eines abgleichbaren,
doppolzolligon Bakteriendetektors, in dem die
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elektrischen Ausgangssignale der Zellen zueinander entgegengesetzt
gerichtet sind und der Differenzstrom ge- ■
messen wird.
Fig. 5 zeigt schematisch eine abgleichbare Zellenanordnung,
in der getrennte Reaktionskammern mit einer Doppelzelle verwendet werden, die in einen sicher dichtenden
Eingriff gegen den Basisteil der Behältereinheit gedrückt ist.
Fig. 6a, 6b und 6c sind schematische Darstellungen eines Folgedetektorsystems für Bakterien in der atmosphärischen
Umgebung (einschließlich einer Einrichtung zur Festlegung und Lokalisierung eines reproduzierbaren kleinen
Probe Volumens).
Fig. 7 zeigt eine Abänderung der in Fig. 6c gezeigten Vorrichtung,
wobei eine zweite Einrichtung zur Festlegung und Lokalisierung eines reproduzierbaren kleinen Probevolumens
unter Prüfbedingungen verwendet wird.
Fig. 8a, 8b und 8c geben verschiedene/für Kathodenkonfigurationen
an und zeigen das erforderliche Verhältnis von Länge zu Breite der freiliegenden Kathodenoberfläche.
Die hier gezeigten verschiedenen Ausführungsbeispiele dieser Erfindung unterscheiden sich hauptsächlich darin, a) wie die
Probe während der Prüfung hinsichtlich der Anwesenheit von Katalase verarbeitet wird, b) wie groß eine für die Prüfung
dor Probe erforderliche Reaktionskammer ist und c) welche Empfindlichkeit der Anzeige angestrebt wird. Diese Faktoren
hängen wiederum zu einem großen Teil vom Zweck ab, für den die Abschätzung dor Katalaeeaktivität durchgeführt wird.
Gegenwärtig liegt die Hauptanwendung dieser Erfindung in der
Bestimmung und Überwachung pathologischer Zustände, die für die medizinische Praxis, wie z. B. die Untersuchung von Urin-
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proben, von Interesse sind. Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel
zur schnellen und wirksamen Durchführung derartiger Untersuchungen ist in Fig. 1 gezeigt.
Ein Paar Injektionsspritzen 11, 12, welche vorgewählte Mengen
eines Reagenz (beispielsweise eine Körperflüssigkeit wie Urin)
aus der Injektionsspritze 11 und ein Substrat (Wasserstoffperoxid) aus der Injektionsspritze 12 liefern, sind so ausgelegt,
daß sie durch ein gemeinsames Betätigungsglied 13 synchron verschoben
werden, das für eine vorgewählte Strecke entlang einer geraden Linie bewegbar ist. "Diese Linie wird durch die Bewegung
eines an dem Betätigungsglied befestigten Führungsstab es 1*1
durch ein Führungsrohr 16 in einer Führung 17 hindurch bestimmt. Die Führung 17 haltert auch die herausnehmbaren Injektionsspritzen
11, 12. Die unterschiedlichen Durchmesser der Zylinder der Injektionsspritze 11, 12 und die gemeinsame Hublänge der
Kolben jeder Injektionsspritze ermöglichen eine zweckmäßige Proportionierung der Mengen für jede verwendete Flüssigkeit.
Ein typisches Verhältnis ist 10 Teile Reagenz auf ein Teil
Wasserstoffperoxid. Die Konzentration des Wasserstoffperoxides wird so gewählt, daß nach der Verdünnung durch die Mischung mit
dem Reaktionsmittel die dabei entstehende Lösung für die Reaktion
eine Wasserstoffperoxid-Konzentration im Bereich von 0,01 bis 1 Mol pro Liter hat.
Die Katalase-H202-Reaktion ist sehr spezifisch, aber es muß
nicht eine Wasserstoffperoxidlösung per se verwendet werden. Das Wasserstoffperoxid kann auch durch den Zusatz von Agentien,
wie beispielsweise NaBQp*3HpO-H2O2, Natriumperborat zu Wasser
oder der Flüssigkeitsprobe in situ, erzeugt werden.
Das Ventil 18 wird so eingestellt, daß das Reaktionsmittel
von der Injektionsapritze 11 über eine Leitung 19 zur Leitung
fließt, wenn das Betätigungsglied 13 niedergedrückt ist. Zur gleichen Zeit fließt das Substrat bei geöffnetem Ventil 22 von
der Injektionsspritze 12 über die Leitung 21. Die Leitungen 20 und 21 münden in gegenüberliegende Enden des Schenkels 23 yon(
einem T-Stück 24, wo das Reaktionsmittel und das Substrat vor-
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gemischt werden und durch den Schenkel 25 in die Reaktionskammer
26 fließen. Das Volumen der in die Reaktionskammer eingeführten Lösung ist so bemessen, daß bei geschlossenem
Ventil 27 und geöffnetem Ventil 28 etwas Lösung überfließt und aus dem Überflußrohr 29 austritt.
Nachdem die Lösung in die Kammer 26 eingetreten ist, wird sie kontinuierlich durch eine Rühreinrichtung 30 gemischt. Diese
wird vorzugsweise von einem magnetischen Rührarm gebildet, der durch einen motorgetriebenen Magneten 31 betätigt wird.
Die gerührte Lösung sollte eine vollständige Mischung in der Grenzschicht an der Membran 32 (ζ. B. Polyäthylen) der membranartigen,
sauerstoffbestimmenden polarographischon Zelle 33 darstellen.
Die Zelle 33 ist eine elektrolytische Vorrichtung zur Verwendung bei chemischen Analysen und ist seiner Art nach in
dem US Patent 2 913 386 beschrieben. Auf dieses Patent wird
hiermit Bezug genommen. Die Anode 3^ und die Kathode 36 der
Zelle 33 sind elektrisch über einen "eingefangenen" Elektrolyten oder eine einen Elektrolyten bildende Substanz 37 verbunden,
die vor Turbulenz geschützt und physikalisch getrennt und elektrisch isoliert ist, gegenüber der Flüssigkeitsprobe,
die durch die nicht-poröse Membran 32 analysiert werden soll, welche für Sauerstoff, aber nicht für Wasserstoffperoxid
durchlässig ist. Zweckmäßigerweise ist ein Einfülloch 38
vorgesehen, um eine nach Wunsch vorzunehmende Auswechselung des Elektrolyten zu ermöglichen. Als ein Beispiel ist dieses
Loch mit einem Mattglasstopfen abgedichtet; es können jedoch auch andere Anordnungen vorwendet werden. Die Membran
32 erstreckt sich über und ist gegen die Oberfläche der Platinkathode
36 gespannt, die von einem Stab aus Kunststoff oder Glas gehalten wird und in diesen eingebettet ist, wobei ein
spezifischer Kathodenbereich gemäß der verbesserten Konstruktion dieser Erfindung am körperfornen Ende dos isolierenden
Elektrodenhalterungsstabs freiliogt.
Die wesentlichen Unterschiede zwischen dem Aufbau der früheren polarographischcn Zellen (die typenmäßig durch
die in der US Patentschrift 2 913 386 beschriebene Vor-
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richtung angegeben sind) und der Konstruktion der bevorzugten Zelle für die Durchführung der vorliegenden Erfindung, sind
die Ausbildung des freiliegenden Teiles der Kathode und die Maßnahmen, die zur Sicherstellung einer Abdichtung zwischen
der polarographischen Zelle und der Konstruktion der Reaktionszelle ergriffen sind. Diese beiden Aspekte werden in der folgenden
Beschreibung im einzelnen erörtert»
Falls in der Probe eine.Bakterienkatalase vorhanden ist, tritt
eine sehr schnelle Zersetzung (in Sauerstoff und Wasser) des Wasserstoffperoxides auf, und der Partialdruck des Sauerstoffes
in der Peroxidlösung steigt schnell (in etwa 1/4 bis
5 Minuten) mit einer Geschwindigkeit an, die der Menge des vorhandenen Katalase-Enzyms und seiner Aktivität proportional
ist. Das Maß der Diffusion dieses Sauerstoffes durch die Membran 32 hindurch in die Zelle 33 ist linear proportional zum
Sauerstoffpartialdruck in der benachbarten Wasserstoffperoxidlösung, und der nach Erreichen der Kathode eintretende Sauerstoff
erzeugt einen Zellenstrom, der gemessen und dann durch einen Stromverstärker 39 verstärkt wird für eine direkte Anzeige
der Katalaseaktivität und/oder eine endgültige Aufzeichnung einer graphischen Darstellung des Sauerstoffpartialdruckos
als Punktion der Zeit auf einem Potentiometerschreiber und/oder digitalen Steigungsdetektor 41. Die Katalasoaktivität
wird in Katalaseaktivitäts-Einheiten ausgedrückt. Eine derartige Einheit wird beispielsweise als diejenige Größe der Katalaseaktivität
definiert, welche 1 Mikro-Mol Wasserstoffperoxid pro Minute bei einer bestimmten Temperatur und Wasserstoffperoxidkonzentration
zersetzt. Die oben erwähnten Bedingungen können beispielsweise 37 C und 0,1 Mol pro Liter Wasserstoffperoxidkonzentration
sein.
Eine Platinelektrode (ein in Kunststoff eingebetteter Draht mit einem Durchmesser von 0,5 mm bzw. 0,02 Zoll) ist an seinem
oberen Ende gewunden und verläuft im wesentlichen parallel zur Membran 32. Der Kunststoff und ein Teil des Metalles ist abgeschliffen,
um eine ebene, lange, dünne Kathodonflache von etwa
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0,05 x 1,61J mm (0,002 χ O,O625 Zoll) freizulegen. Diese
Kathode 36 ist eng anliegend überdeckt mit einer 0,025 mm
(0,001 Zoll) dicken Polyäthylen-Membran (Membran 32), die den Kaliumchlorid-Elektrolyton (0,3 - 3 molar) in der Zelle
33 festhält. Sowohl die Kathode 36 als auch die Silber-Silberchloridanode
31* sind elektrisch mit dem Stromverstärker 39
verbunden und liegen auf einem vorbestimmten elektrischen Potential , das von einer Leistungsquelle wie beispielsweise
der Batterie 42 angelegt wird. Die vereinfachte Gesamtreaktion ist folgende:
Ie"+ 1/2 O2 + H2O + 2 KCl + 2 Ag ->
2AgCl + 2 KOH + 4 e".
In der Zelle 33 ist ein relativ großes Volumen des Elektrolyten vorgesehen, um die Wirkung einer Elektrolytänderung möglichst
klein zu halten. Derartige Zellen arbeiten stabil für gut ein Jahr. Die der Prüfvorrichtung anhaftende Empfindlichkeit beträgt
wenigstens 2,71 x 10 ' A/at Sauorstoffpartialdruck.
Die spontane Zersetzung von Wasserstoffperoxid kann durch Verwendung eines genügend sauboren Systems vermieden werden.
Auf Wunsch kann jedoch auch ein gepufferter Stabilisator zur Lösung zugesetzt werden, wie z. B. Azetanilid, die leicht
sauer (pH 6,8) gepuffert wurde mit einem 0,1 molaren Phosphatpuffer.
Die Empfindlichkeit der Zelle 33 bei der Bestimmung des gelösten Sauerstoffgehaltes in der Wasserstoffporoxidlösung
wird im Prinzip sowohl durch die Permeabilitäteigenschaften tier Membran 32 relativ zu Sauerstoff als auch durch die Abmessungen
der Oberfläche der Kathode 36 bestimmt, die gegenüber
dom durch die Membran 32 hindurchtretenden Sauerstoff
froiliegt. Wenn man von dem oberen Ende der Kathodenstruktur
nach unten blickt, erscheint die Elektrode als eine im wesentlichen lange, dünne, gerade oder gekrümmte Fläche mit einem
Verhältnis von Länge zu Breite von wenigstens 25 : 1 und vorzugsweise 100 : 1, wobei die Breite weniger als etwa 0,127 mm
(0,005 Zoll) und vorzugsweise weniger als 0,05 mm (0,002 Zoll) beträgt. Obwohl die bevorzugt verwendete Membran 32 aus Polyäthylen
ist, kann jedes Membranmaterial verwendet werden, das
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als eine dichte (nicht poröse) sehr dünne Membran hergestellt werden kann, gegenüber HwO2 undurchlässig ist und einen Sauerstoff
durchlässigkeit skoeffizlenten aufweist, der gleich oder größer ist als 5 χ ΙΟ"11 .
Die Vormisch vorrichtung '(beispielsweise das T-Stück. 24), durch
die die Reaktionsmittel hindurchtreten und sich mischen, bevor sie in die Reaktionskammer 26 eintreten, sollte so nahe wie
praktisch durchführbar an der Reaktionskammer angeordnet sein,
so daß die schnell nachfolgende Reaktion nicht zu weit fortschreitet,
bevor die Messungen durchgeführt werden können. Diese Messungen müssen selbstverständlich erfolgen, wenn
sich die Lösung tatsächlich in der Reaktionskammer 26 befindet, wobei eine fortgesetzte Mischung durch die Rühreinrichtung
30 erfolgt.
Für eine noch höhere Genauigkeit bei der Messung der Reaktionsgeschwindigkeit
können Vormischgeräte verwendet werden,
die die Strömungen des Substrates und der Flüssigkeitsprobe unmittelbar vor ihrem Mischkontakt noch vollständiger voneinander
trennen.
Vorzugsweise sind zwar alle Ventile 18, 22, 27 und 28 geschlossen,
sobald die Reaktionskammer 26 gefüllt ist, um für ein
vollständig gefülltes, abgeschlossenes, nicht expandierbares Reaktionsvolumen zu sorgen. Einschränkungen bei der Konstruktion
und der Arbeitsweise des Ventils können jedoch erfordern, daß das letzte Ventil, das geschlossen werden muß (Ventil 28),
geöffnet bleibt. Alle Leitungen 20, 21, 29 und die Abflußleitung 43 sind normalerweise Röhren mit einem sehr kleinen Durchmesser
(große Länge in Bezug auf den Durchmesser). Wenn deshalb das Überlaufventil 28 zur Atmosphäre (alle anderen Leitungen
sind geschlossen) offenbleibt, so entsteht dadurch nur eine
sehr kleine Flüssigkeit-Luft-Zwischenphase (beispielsweise ein Durchmesser von weniger als 2,5 mm bzw. 0,1 Zoll). Diese
Größe der Flüssigkeit-Luft-Zwischenphase kommt nur in Betra-cht wegen des Verlustes äes dynamischen Meßbereiches, wenn Proben
mit einer derartig hohen Katalaseaktivität auftreffen, daß der
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Sauerstoffpartialbruch den Nukleationswert überschreitet, bevor
die Messung durchgeführt werden kann. Der Wert von Bedeutung liegt gegenwärtig bei etwa 3 Einheiten der Katalaseaktivität.
Die Montage und Demontage der Vorrichtung wird durch Schraubstücke
44 und 46 erleichtert, Das Schraubstück 46 drückt das membranbedeckte Ende der Zelle 33 über eine Ringdichtung 49
in einen abdichtenden Eingriff mit der Ausnehmung 47 dos Gehäuses
48.
Andere Anordnungen der Reaktionskammer in Verbindung mit Sauerstoffbestimmungszellen
sind in den Figuren 2 und 3 gezeigt. In dem in Fig. 2 gezeigten Aufbau ist das Gehäuse 51 durch
Befestigungsmittel wie z. B. Schrauben 53 lösbar an dem Basisteil 52 befestigt, um ein Reaktionsvolumen 54 zu bilden, das
mit einer Sauerstoffzelle 56 über eine Membran 57 verbunden
ist, welche einen Teil der das Volumen 54 umgrenzenden Wandfläche
bildet. Mit Ventilen versehene Verbindungen (58, 59, 61)
sind mit dem Innenraum des Volumens 54 in Vorbindung stehend
gezeigt. Diese entsprechenden Verbindungen werden verwendet a) zur Zuführung der H2O2-LÖsung (sowohl für die Katalasc-HpCL-Reaktion
als auch zum Ausspülen des Volumens 54 zwischen den Prüfungen) von der H2O2-Lösungsquelle 62, b) zur Zuführung
der Flüssigkeitsprobe (beispielsweise Urin, Synovialflüssigkeit usw.) von einer Probenquelle 63, c) zur Luftabgabe
(um eine Flüssigkeit-Luft-Zwischenphasc zu vermeiden) und d) zum Ausspülen des Reaktionsproduktes aus dom Überlaufrohr
64. Als zweckmäßige Mittel zur Einführung der Flüssigkeitsprobe und der HpCU-Lösung nach den jeweiligen Erfordernissen
sind Injektionsspritzen dargestellt. Die Abdichtung des Volumens 54 wird durch eine deformierbare Ringdichtung
sichergestellt, und eine Dränage des ReaktionsVolumens wird
durch eine Abflußleitung 67 und ein Ventil 68 erleichtert.
In der in Fig. 3 gezeigten Anordnung wird das Reaktionsvolumen 71 für die Probe durch ein Gehäuse 72 gebildet, durch
dessen Wände mit Ventile versehene Verbindungen 73, 74, 76
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und 77 und eine kleine Rührwelle 78 hindurchführen. Obwohl
die Rühreinrichtung als eine Wellen-Propellerkombination gezeigt ist, wird vorteilhaft eine Rühreinrichtung magnetischer
Art verwendet, wie sie in Fig. 1 dargestellt ist. Diese erfordert
keine Durchstoßung der Wandung des Gehäuses 72. Ein verformbares
Dichtmaterial wird zwischen dem Gehäuse 72 und dem
Basisteil 81 angeordnet, die beispielsweise durch Schrauben 82
lösbar miteinander verbunden sind. Die BLCU-Lösung wird auf
Anforderung von einer Quelle 83 in das Volumen 71 eingegeben,
und die auf die Katalaseaktivität zu untersuchende Flüssigkeitsprobe
wird von einer Quelle 84 in das Volumen 71 eingeführt, wenn dies erforderlich ist. Im Falle der in Fig. 1 gezeigten
Vorrichtung sind die Volumina der Quelle der Probe und des Substrates so proportioniert, daß das Volumen des Substrates
vorzugsweise weniger als etwa 10 Volumen % der Probe beträgt. Dies ist jedoch keine unbedingte Forderung. Erforderlichenfalls
wird eine Waschflüssigkeit von einer Quelle 86 in das Gehäuse 72 gedrückt. Alle Quellen 83, 84 und 86 sind zweckmäßigerweise
als Injektionsspritzen dargestellt. Die Flüssigkeiten, welche
in das Volumen 71 für die Reaktionsprobe eingegeben werden,
werden je nach Erfordernis durch einen Rührer 87 gerührt, um einen Konzentrationsgradienten in der Flüssigkeit möglichst
klein zu halten oder vollständig zu vermeiden. Ferner wird ein Überfluß 74 zur Elimination von Luft (und dadurch Elimination
einer Flüssigkeit-Luft-Zwischenphase) verwendet. Zur Abführung der Inhalte des Volumens 7I während der Ausspülung ist eine Abflußleitung
88 vorgesehen. Die membranbedeckte Zelle 89 zur Sauerstoffbestimmung ist so angeordnet, daß sie mit dem Volumen
71 für die Reaktionsprobe in gleicher Weise zusammenarbeitet, wie die Zelle 56 bezüglich dos Volumens 51 in Fig. 2.
Anordnungen für eine weitere Systemunterscheidung sind schematisch
in den Figuren 4 und 5 gezeigt. In der Vorrichtung gemäß
Fig. 4 werden zwei membranartige Sauerstoffzollen 91, 92 verwendet. Die elektrischen Ausgangssignale der Zellen 91 und
92 sind in der dargestellten elektrischen Anordnung gogonsinnig zueinander gerichtet und der Difforonzstrom wird gemessen. Durch
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Einstellung des Potentiometers 93 und des variablen Widerstandes 9^>
so daß die Anzeige des Schreibers 96 vor der Durchführung
von Bestimmungen hinsichtlich der Katalaseaktivität auf ^uIl steht, werden die Effekte aller Parameter, die die
Zellen 91 und 92 auf ähnliche V/eise beeinflussen, zu null gemacht. Danach geben die Stromausgangssignale von den Zellen
91 und 92 während gleichzeitiger Bestimmungen der Sauerstoffgaserzeugung
die Differenz in den Stromausgangssignalon aus diesen zwei Zellen wieder. Obwohl die Zellen 91, 92 in der
Weise dargestellt sind, daß sie mit der gleichen Kammer in Verbindung stehen, können auch getrennte Kammern (eine für
jede Sauerstoffbestimmungszelle, wie es in Fig. 5 dargestellt ist) verwendet werden, solange ein guter thermischer Kontakt
zwischen den Zellen besteht, so daß identische Temperaturbedingungen gewahrt bleiben.
Auf diese Weise sind diejenigen Variablen (Temperatur und absoluter
Wert des Sauerstoffdruckes in der Flüssigkeit) aufgehoben,
die beide Zellen in gleicher Weise beeinflussen. Ferner erlaubt diese Anordnung die Durchführung einer Differenzprüfung,
in der zwei identisch eingesammelte Bakterienproben mit der gleichen Grundverunreinigung unterschiedlich behandelt
werden können. Somit kann beispielsweise eine Probe, die auf einer Filterscheibe 97 abgetrennt ist, wie es im folgenden
in Verbindung mit den Fig. 6 und 7 noch beschrieben werden wird, behandelt werden, um ihren Katalascgehalt durch Erwärmung
oder den Zusatz von Chemikalien zu inaktivieren, welche speziell der Katalase entgegenwirken, während die auf ähnliche
Weise auf der Filterscheibe 98 abgetrennte Probe unbehandclt
bleibt. Unter der Annahme, daß das Inaktivierungsmittel nicht andere möglicherweise vorhandene katalytischo Mittel für die
HpOp-Zcrsctzung (beispielsweise Eisenoxide) inaktiviert, zersetzen
diese katalytischen Mittel eine gleiche Menge von HpOp
in beiden Filterscheiben (97 und 98), Diese Ausgangssignale gleichen sich aus, während die inaktivierte Katalase keine
Hp0o-Zcrsetzung erzeugt, um die Ho0„-Zersetzung der nicht veränderten
Katalaso auszugleichen. Dadurch entsteht ein Differenzausgangs signal, welches durch ein Mikrovoltmotcr 99 meßbar ist
1 0 9 8 2 B / 1 B 8 8
- 15 und durch einen Schreiber 96 aufgezeichnet werden kann.
Die Filterscheiben 97 und 98 werden durch die Federlast der
Filterhalter 103, 104 sicher gegen die Membranen 101 und
der Sauorstoffzellen 91 bzw, 92 gedrückt. Die federbelastoten Filterhalter 103 und 104 sind in einer Platte 106 befestigt,
welche eine Kammer 107 in einer Behältereinheit 108 überdeckt. Die Wände der Bchältcrcinheit 108 können aus Glas oder Kunststoff hergestellt sein. Vorzugsweise sind sie aber aus einem
transparenten Material wie z. B. Plexiglas. Die Wasserstoffperoxidlösung
wird entweder vor dem Filtereinsatz oder durch eine Leitung 109 von einem nicht-gezeigten Wasserstoffperoxid-Reservoir
in die Kammer 107 eingegeben.
Die Sauerstoffbestimmungszellen gemäß dieser Erfindung sind
an ihren Oberteilen mit einer bestimmten Form versehen, um eine Abdichtung zwischen der Sauerstoffzelle und der Behältereinheit
zu erleichtern. In jedem der gezeigten Ausführungsbeispiele ist der obere membranbedeckte Teil der Sauerstoffbestimmungszelle
in der Form eines Kegelstumpfes hergestellt. Dieser befindet sich aufgrund der Anordnung der Membran in
dichtendem Eingriff mit einer passenden versenkten Ausnehmung, die durch den die Reaktionskammer bildenden Unterteil der Vorrichtung
hindurchfüh'rt.
Aus dieser Verwendung abgeglichener Sauerstoffzellen ergibt sich eine verbesserte Bestimmbarkeit des Sauerstoffpartialdruckes,
da es mit dieser Anordnung möglich ist, das Stromausgangssignal mit einer größeren Empfindlichkeit zu messen.
So liefert beispielsweise bei einem atmosphärischen Sauerstoffpartialdruck
(0,21 Atmosphären) eine einzige Sauerstoffzelle der hier beschriebenen Art einen Ausgangsstrom von etwa
5,7 x ΙΟ" A. Bei Verwendung einer einzigen Zelle ist die für
die Strommessung jzur Verfügung stehende Empfindlichkeit notwendigerweise
auf diese Größenordnung beschränkt. Bei zwei ge-.· gensinnig arbeitenden Zellen ist die verwertbare Empfindlichkeit
nur durch die Größe des Grundrauschens des Systems begrenzt.
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Anstelle der zweiten Zolle gemäß Fig. 4 könnte auch eine konstante
Quelle für eine Gegenspannung verwendet werden, aber diese Anordnung würde nur die Möglichkeit bieten, teilweise
die Temperatur und den Absolutwert des Sauerstoffpartialdruckes zu kompensieren, und sie bietet nicht die Möglichkeit für eine
Differenz- oder Vergleichsmessung.
Eine doppelte Sauerstoffbestimmungszelle 121 in einem einzigen
Gehäuse 122 für eine elektrische Verbindung in gegensinniger Reihenschaltung ist in Fig. 5 gezeigt. Es sind zwei benachbarte
Reaktionskammern 123, 124 vorgesehen, die für die Sauerstoffbestimmung
jeweils mit einer der Kathoden 126, 127 in gezeigter Weise in Verbindung stehen. Die Kathoden 126, 127 sind elektrisch
über ein gemeinsames Reservoir 130 des Elektrolyten mit einer "
gemeinsamen Anode 128 (die mit dem positiven Pol der Batterie 129 in Verbindung steht) verbunden. Eine mit dem Basisteil
verschraubbare Hülse 131 drückt die Zelle 121 fest in einen
abdichtenden Eingriff mit dem Basisteil 132 in den Ausnehmungen 133» 134. Das Basisteil ist vorzugsweise aus einem Material hergestellt,
das ein guter Wärmeleiter ist, um dazu beizutragen, daß die Kathodenschenkel der Zelle 121 auf der gleichen Temperatur
gehalten werden. Die Wände 136 und das Oberteil 137 bestehen vorzugsweise aus einem transparenten nicht-metallischen
Material, das gegenüber Oxidation inert ist.
Das Reservoir 138 nimmt die flüssige Testprobe auf, die durch eine Pumpe 139 gleichzeitig über die gezeigten, mit Ventilen
versehenen Leitungen in beide Reaktionskammern 123, 121I
gepumpt werden kann. Das Reservoir I1Il enthält die I^Og-Lösung,
die ebenfalls gleichzeitig durch eine Pumpe 142 über die gezeigten
mit Ventilen versehenei Leitungen in beide Reaktionskammern 123, 124 gepumpt werden kann. Die Reaktionskammern 123, 124
werden durch entsprechende mit Ventilen versehene Leitungen 143, 144 entlüftet, und das Reservoir 146 kann einen katalasehemmenden
Stoff, wie beispielsweise 2 % H2SO1J, enthalten, der
erforderlichenfalls durch die Pumpe 147 in die Kammer 123 eingeführt werden kann.
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- - 17 -
Im Betrieb .werden gleiche Anteile einer Urinprobe in die Reaktionskammern
123, 121I eingegeben, welche den größten Teil
deren Volumens ausfüllen. Eine kleine Menge Hommungsmittel wird eingeleitet, um die Katalaseaktivität in der Reaktionskammer
zu unterdrücken/Das Potentiometer 148 wird für eine Nullanzeige des Schreibers 149 eingestellt, und die elektrischen Ausgangssignale der Kathoden 126, 127 sind gegensinnig in Reihe geschaltet.
Anschließend, wenn die HpC^-Lösung gleichzeitig in die
Reaktionskammern 123, 124 eingeführt wird, gibt die gemessene
Erhöhung des Sauerstoffpartialdruckes genau die Katalaseaktivität wieder, die für die Temperatur und den Sauerstoffblindgehalt
richtig kompensiert ist.
Eine Anordnung für die atmosphärische Bakterienbestimmung ist in den Figuren 6a, b und c dargestellt, in denen die Bakterien
aus der Umgebung auf eine Filterscheibe 161 aufschlagen, die auf einem Filterhalter 162 befestigt ist, indem Luft aus der
Atmosphäre durch eine großvolumige Aufprallöffnung 162 hindurch
mit einer Pumpe 164 angesaugt wird. Nach einer gegebenen Betriebsdauer wird der Filterhalter I62 aus dem Gehäuse 166
entfernt, eine katalasefreie Flüssigkeit, wie z. B. steriles Wasser, wird der Filterscheibe I6I zugeführt und dann wird die
nasse Filterscheibe Ultraschallenergie ausgesetzt. Dies geschieht dadurch, daß sie mit einem Ultraschallwandler I67 in
Kontakt gebracht wird, um die Bakterienzellwände zu zerreißen. t
Dabei nimmt der Wandler I67 Leistung von einem Ultraschallgenerator
168 auf. Es können auch andere Mittel zum Zerreißen der Zellen und zur Freisetzung der löslichen Komponenten verwendet
werden, wie z. B. Detergentien oder auflösende Enzyme. Durch diesen auflösenden Vorgang wird das intrazellulare Katalaseenzym
wirksam freigelegt. Bei den meisten Bakterientypen tritt die Durchdringung der unaufgelöeten Bakterienzelle durch
H2O2 leicht auf und dieser Auflösungsschritt kann dann fortgelassen werden.
Der Filterhalter 162 mit der von diesem gehaltenen bearbeiteten
Filterscheibe I6I wird dann in die Kammer I69 des Gehäuses
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eingesetzt, wobei die Filterscheibe l6l in engem Kontakt mit der Polyäthylen-Membran 171 der membranartigen polarographischen
Zelle 172 für die Sauerstoffbestimmung angeordnet wird.
Auf Wunsch kann anstelle des direkten Aufschiagens der Bakterien
auf die Filterscheibe 161 das Aufschlagen in einer Flüssigkeit durchgeführt werden, und die Bakterien können dann auf eine
Filterscheibe übertragen werden, indem die Flüssigkeit durch diese hindurchgefiltert wird.
Wenn es erwünscht ist, sehr kleine Zahlen (beispielsweise etwa 100 oder weniger) von Bakterien oder anderer Zellen mit meßbarem
Partialdruckanstieg zu bestimmen, ist es wichtig, daß das Volumen der mit dem Reaktionsmittel in tatsächlichem Kontakt
befindliche Wasseratoffperoxidlösung sehr klein gehalten wird,
vorzugsweise weniger als 0,1 el. Eine sehr wirksame Einrichtung zur Festlegung eines derartigen reproduzierbaren kleinen Reaktionsvolumens,
welches effektiv der Sauerstoffelektrode 173 benachbart angeordnet werden kann, liegt in der Verwendung
eines kleinen Körpers eines Zelluloseacetat- oder zellulosenitratartigen Filtermaterials oder eines ähnlichen porösen
Materials für die Scheibe 161. In der Vorrichtung gemäß Fig. 6c ist die Filterscheibe l6l zwischen die die Elektrode 173 (Kathode)
überdeckende Membran 171 und die sauerstoffundurchlässige Halterung IJh geschichtet, die direkt hinter der Filterscheibe 161
angeordnet ist und diese in der Kammer I69 in der richtigen Lage hält.
Die Wasserstoffperoxidlösung wird vorsichtig durch eine kleine öffnung 175 in die Kammer I69 eingespritzt, so daß Organismen,
die auf oder in der Filterscheibe I6I vorhanden sein können,
nicht entfernt werden. Ähnliche Ergebnisse können herbeigeführt werden, indem die Wasserstoffperoxidlösung den Boden der Kammer
169 vor dem Einsetzen des Filterhalters I62 und der Scheibe I61
in die Kammer I69 überdeckt. In diesem Falle wird die Filterscheibe
161 während des recht raschen Eintauchens naß.
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Wenn die Filterscheibe I6l einmal naß ist, wird eine konvektive
Mischung zwischen dem durch die Scheibe 161 gebildeten Volumen
und der umgebenden Wasserstoffperoxidlösung wirksam eingeschränkt, aber die molekulare Diffusion in die Filterscheibe
aus der umgebenden Peroxidlösung bleibt etwa die gleiche wie im , Falle einer freien Flüssigkeit. Folglich ist der seitliche
Diffusionspfad für entwickeltes Sauerstoffgas, um aus dem Volumen
der Filterscheibe 161 auszutreten, relativ lang, während
der Diffusionspfad zur Sauerstoffelektrode 173 vergleichsweise kurz ist. Somit ist der Sauerstoffpartialdruck, der durch die
Anwesenheit von Bakterien (oder einer anderen Katalasequelle)
mit der daraus resultierenden Wasserstoffperoxid-Zersetzung
erzeugt wurde, auf wirksame Weise nahe der sauerstoffempfindlichen
Elektrode 173 innerhalb des Filterscheibenvolumens eingeschlossen und kann auf relativ hohe Werte aufgebaut werden.
Ferner kann diese hohe Sauerstoffübersättigung, die in dem Bereich
von etwa 0,01 bis wenigstens eine Atmosphäre, was von der Menge der vorhandenen Katalase abhängt, für lange Zeiträume aufrecht
erhalten werden. Jeder erzeugte Zellstrom wird direkt
durch ein Amperemeter 176 gemessen, und dieser gemessene Strom,
der durch einen Verstärker 177 verstärkt wird, kann auf Wunsch auf einem Potentiometerschreiber 178 aufgezeichnet werden.
Eine unterschiedliche Anordnung für das reproduzierbare kleine Probevolumen ist in Fig. 7 gezeigt. Eine Filterscheibe 181 ist
in eine Ausnehmung in der lösbaren Halterung 182 eingesetzt, die in der Kammer I83 in dem Behältergehäuse 186 gezeigt ist.
Diese Anordnung, liefert eine größere Abtrennung für das Volumen der bearbeiteten Probe. Der Aufbau der Sauerstoffmembranzelle
ist im wesentlichen der gleiche wie der der anderen polarographischen Zellen, außer,daß eine unterschiedliche Einrichtung
zur Zuführung eines Elektrolyten (Zufuhrungsrohr 188)
vorgesehen ist. Die Wasserstoffperoxidlösung wird vorsichtig über einen Kanal 189, der durch den Filterhalter I90 hindurchführt,
in die Kammer I83 eingebracht. Obwohl eine Einrichtung
dafür nicht dargestellt ist, kann das Wasserstoffperoxid auch in die Kammer I83 eingebracht werden, bevor die Filterscheibe
181 und die Halterung 182 eingesetzt werden. Das in dem Reak-
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tionsvolumen der Filterscheibe 181 erzeugte Sauerstoffgas
tritt durch die Membran 191 hindurch, und, nachdem es in die Zelle I87 eingetreten ist, sich zur Kathode 192 bewegt und
Elektronen aufgenommen hat, wird ein Strom erzeugt, der durch den Mikro-Mikro-Stromverstärkcr 193 mit niedriger Eingangsimpedanz
gemessen durch einen Potentiometerschreiber aufgezeichnet wird.
Um die Nachweisempfindlichkeit darzustellen, die mit dom
kleinen reproduzierbaren Probevolumen gemäß dieser Erfindung (ob dieses nun durch ein poröses Material oder durch eine positive
Trennung der Katalase-Peroxidreaktion gebildet wird) erzielt werden kann, sei eine praktische Filterscheibe mit
150 Mikron Dicke und einem Durchmesser von 0,5 cm (odor 0,196 cm
Fläche) betrachtet, die etwa 80 % Poren aufweist. Dies führt zu einem Probevolumen oder einem Lösungsvolumeη von 2,38x10 ^cm _
in der Filterscheibe. Es wird folgende Beziehung verwendet:
N = 2,68 χ 1O19Vv(PO2) (1)
Hier ist N die Anzahl der Sauerstoffmoleküle in einem gegebenen Volumen (V in cirr) eines wässrigen
Lösungsmittels;
pOp = Sauerstoffpartialdruck in Atmosphären, der durch diese N Moleküle erzeugt ist;
pOp = Sauerstoffpartialdruck in Atmosphären, der durch diese N Moleküle erzeugt ist;
V = Absorptionskoeffizient für Sauerstoff. Dies würde das Säuerstoffvolumen (reduziert auf 0° C und
760 mm Quecksilber) sein, das durch ein cnr der Testlösung absorbiert ist, wenn der Druck des
Sauerstoffes ohne Wasserspannung 760 mm Quecksilber beträgt.
Wenn der Absorptionskoeffizient (V) für Sauerstoff in der verdünnten Wasserstoffperoxidlösung mit 0,028 bei 20° C angenommen
wird, dann ist
N = 7,5 x 1O17V(PO2). (2)
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" ■ - 21 -
" N-
Un-ter der Annahme, daß eine Gesamtzahl von/Molekülen Sauerstoff
durch eine gegebene Anzahl (n) Bakterien erzeugt wird, von denen jedes im wesentlichen die gleiche Zahl ((V) Moleküle
Sauerstoff während der Katalase-Peroxid-Reaktion in der Zelle erzeugt, erhält die oben angegebene Beziehung die Form:
na. = 7,5 x 1O17V(PO2). (3)
Wie in dem Artikel "Crystalline Bacterial Catalase" von
D. Herbert und J. Pinsent (Biochem, 1O, 1948) berichtet wird,
7
werden 1,9 χ 10' Moleküle H0O0 pro Katalasemolekül pro Sekunde
werden 1,9 χ 10' Moleküle H0O0 pro Katalasemolekül pro Sekunde
3 4
zersetzt, wobei 10 - 10 Katalasemoleküle durch jedes aerobische Bakterium zur Verfügung gestellt werden. Wenn man die Reaktion für 100 Sekunden laufen läßt, würde die Säuerstoffproduktion
zersetzt, wobei 10 - 10 Katalasemoleküle durch jedes aerobische Bakterium zur Verfügung gestellt werden. Wenn man die Reaktion für 100 Sekunden laufen läßt, würde die Säuerstoffproduktion
12
pro Bakterium größer als 10 Sauerstoffmoleküle sein. Unter
pro Bakterium größer als 10 Sauerstoffmoleküle sein. Unter
Verwendung dieses Wertes (10 ) für &· und mit 2,38 χ 10~·^ cm^
als Wasserstoffperoxid-Lösungsvolumen ergibt die obige Gleichung
(3) einen Wert von 5,6 χ 10*" Atmosphären Sauerstoff, der pro Bakterium freigesetzt wird. Dieser bezeichnend hohe
Sauerstoffpartialbruch für ein einziges Bakterium ermöglicht
unter Verwendung der verbesserten, hier beschriebenen Zellkonstruktion
die quantitative Bestimmung der Anwesenheit von weniger als 100 Bakterien in einem Strömungsmittel.
Experimente mit nicht-aufgelösten aerobisch gezüchteten
1Ω 1?
E.. coli haben λ -Werte im Bereich von 5 x 10 bis 2 χ 10
Moleküle Sauerstoff in 2 Minuten pro Bakterium bei Verwendung einer 0,1 molaren Wasserstoffperoxidlösung ergeben. Andere
Bakterien können ähnlich ausgewertet werden und zweifellos werden Unterschiede zwischen den verschiedenen Bakterien auftreten.
Beispielsweise wird der Katalasegchalt von E. coli als relativ
11 niedrig betrachtet. Ein W$rt. Von A>
größer als 10 Moleküle Sauerstoff pro unaufgelöstem Bakterium würde die Verwendung
auflösender Enzyme oder Ultraschallenergie unnötig machen, e3 sei denn, es wird erforderlich, eine sehr kloine Zahl
(kleiner als 100) Bakterien zu bestimmen. Für «--Werte von
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kleiner als 10 Moleküle Sauerstoff pro Bakterium wird jedoch eine Auflösung vorgezogen, und in diesem Falle macht die Filters
cheibenmethode zur Sammlung und Präsentierung die Anwendung von Ultraschallenergie (wie sie in Verbindung mit Fig. 6 beschrieben
wurde) für die Bakterien besonders bequem. Die angefeuchtete Filterscheibe braucht nur kurzzeitig mit einer ültraschallenergioquelle
in Berührung gebracht zu werden, um eine ausgezeichnete Energiekopplung auf die Bakterien zu erhalten.
Bei diesem Verfahren ist nur eine kurze Behandlungszeit für einen wirksamen AuflösungsVorgang erforderlich.
Es wird außerdem vorgeschlagen, diese Erfindung auf die automatische
quantitative Messung des Katalasegehaltes anzuwenden,
beispielsweise durch Verwendung eines sich bewegenden Gewebes oder Bandes (oder, wenn gewünscht, eines kontinuierlichen Bandes),
das der Reihe nach die Stufen der Probennahme, des Auf-Bsene,
der Reaktionsentwicklung und der Messung an aufeinanderfolgenden Stationen durchläuft. Das Band könnte eine dünne
Schicht eines dünnen porösen Mediums enthalten, wie beispielsweise Zelluloseacetat oder Agar, welche auf einer Unterlage
mit geringer Sauerstoffpermeabilität, beispielsweise einem relativ dicken (d. h. dicker als 0,5 mm bzw. 20 mils) plastischen
Material, gehalten wird. Obwohl eine kontinuierliche Bewegung des Bandes möglich ist, ist eine schrittweise Bewegung
des Bandes praktischer. Beispielsweise würde bei der Bestimmung des Bakteriengehaltes in der Atmosphäre in einem 5-Minutcn-Zyklus
ein diskreter Teil des porösen Mittels zuerst an einem ersten Platz während einer Zeitdauer von etwa 2 Minuten einer
Probennahme durch Aufprall unterzogen werden. Dieser diskrete Teil des Bandes würde dann vorwärtsbewegt werden, um die Probe
eine halbe Minute lang einer Auflösung mittels Ultraschallenergie an einer zweiten Station zu unterwerfen. Schließlich
würde das Band zu einer dritten Stelle bewogt werden, wo die Einleitung, die Messung und die Aufzeichnung und/oder Übermittlung
der Ergebnisse der Reaktion gemäß dieser Erfindung stattfinden würde.
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Die inhärente Empfindlichkeit, der bei dieser Erfindung angewendeten
Reaktion zwischen Katalase und Wasserstoffperoxid kann noch weiter verbessert werden, indem beispielsweise eine
kleine dünne Scheibe von Agar oder einem ähnlichen Material, das selektiv in den flüssigen Zustand überführt werden kann,
als Medium für die ursprüngliche Probennahme verwendet wird. Die Probennahme wird ursprünglich auf einer gegebenen Agar-Scheibe
vorgenommen. Diese erste Agar-Scheibe wird dann im flüssigen Zustand erhitzt, und die erhaltene Flüssigkeit wird
durch eine faserförmige Filterscheibe mit kleinerer Querschnittsfläche
als die Agar-Scheibe hindurchgefiltert, wodurch eine weitere Konzentration der gesammelten Bakterien
gegeben ist. Beispielsweise würde eine ursprünglich für die Probennahme verwendete Agarseheibe mit einem Durchmesser von
25 mm eine Konzentration von 25 : 1 liefern, indem man anschließend
das Agar erhitzt und die erhaltene Flüssigkeit, durch eine faserförmige Filterscheibe mit einem Durchmesser
von 5 mm filtert.
Wie bereits oben festgestellt wurde, besteht ein Merkmal dieser
Erfindung von beträchtlicher Wichtigkeit in der erhöhten
Empfindlichkeit, welche durch die Verwendung einer freiliegenden langen, dünnen Kathodenfläche, d. h. einer Fläche mit
einem Verhältnis von Länge zu Breite von 25 : 1, geboten
wird. In den Figuren 8a, 8b und 8c sind Beispiele für verschiedene brauchbare Ausgestaltungen gezeigt. Es sind
dies Ansichten der Oberfläche einer in Glas eingeschlossenen
Kathode 201, wie sie von der sauerstoffdurchlässigen Membran
aus "gesehen" wird. Eine Art zur Herstellung derartiger Kathodenflächen besteht darin, daß ein Endabschnitt 202 des
nach oben sich erstreckenden Kathodendrahtes (z. B. Platin, Gold) im rechten Winkel abgebogen wird. Die in den Figuren
8b, 8c gezeigten Ausgestaltungen erhält man, wenn diese Enden
in einem Bogen, in Zickzackform oder in einer anderen
Form gebogen wird und der ganze Draht in einer elektrisch nicht-leitenden Halterung, wie z. B. Glas oder Kunststoff', '·
eingekapselt wird. Danach wird durch Abschleifen der Halterung und eines Teils des Metalls eine Metallfläche von langer,
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schmaler Gestalt (203, 204, 206) freigelegt.
In den Fällen, in denen eine zeitliche Verzögerung zwischen der Probennahrae und der Messung in Kauf genommen werden kann,
kann die auf einer Filterscheibe gesammelte Bakterienprobe mit Nährstoffen imprägniert werden, um beispielsweise das
Wachstum der darin vorhandenen Bakterien zu fördern, oder es kann zur Erzielung der entgegengesetzten Wirkung ein
Hemmungsstoff zugefügt werden. Als Anwendung dieser Möglichkeit
kann beispielsweise eine von zwei gleichzeitig eingesammelten Proben (oder von 2 Teilen der gleichen Probe) durch
Anwendung von Antibiotika so behandelt werden, daß das Wachstum ihrer Bakterien gehemmt wird. Das Wachstum der nichtbehandelten
Probe wird die Katalaseaktivität erhöhen, und ein Vergleich zwischen der Katalaseaktivität der beiden Proben
wird anschließend eine schnelle Anzeige der Wirksamkeit des Angriffes des Antibiotikums auf die Bakterien ergeben. Eine
hohe Anzeige eines Differenzausgangsstromes zeigt eine hohe Empfindlichkeit der Bakterien gegenüber dem Antibiotikum an.
Hemmungsstoffe und Mittel, die selektiv eine bestimmte Spezies
von Bakterien hemmen oder fördern, können auch zur Identifizierung von Bakterien verwendet werden. Ein Langzeit-Wachstum
der Organismen (von wenigstens 2k Stunden), wie es für die Kolonieentwicklung in herkömmlichen mikrobiologischen Kulturen
erforderlich ist, ist für diese Empfindlichkeit- oder Identifizierungsprüfungen nicht erforderlich, da mit der
hohen Systemempfindlichkeit, die mit der erfindungsgemäßen
Sauerstoffmembranzelle zur Verfügung steht, eine einzige Verdopplung durch Bakterienwachstum während einer Zeit von 20
bis 60 Minuten leicht feststellbar und ausreichend sein sollte, um die Wirkung der Hemmung oder der Wachstumsverzögerung zu
beobachten.
Zusammenfassend sind Vorrichtungen und Verfahren zur Bestimmung der Katalaseaktivität dargelegt worden, welche quantitativ
und schnell unmittelbar in einer Wasserstoffperoxidlösung die Erhöhung des Sauerstoffpartialdruckes messen, wo der zugehörige
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Katalasegehalt von verschiedenen tierischen Zellen die schnelle
Zersetzung von Wasserstoffperoxid in Sauerstoff und Wasser verursacht. Die beschriebene Vorrichtung gibt die Möglichkeit zur
dynamischen und kontinuierlichen Beobachtung der Katalase-Wasserstoffperoxidreaktion
durch eine quantitative Messung der Katalaseaktivität.
Es wurden Vorrichtungen entwickelt und offenbart, um auf
Wunsch das effektive Probevolumen der Wasserstoffperoxidlösung (weniger als etwa 0,1 cc) in einem Meßgang zu begrenzen.
Die Einfachheit der hier angegebenen Geräte und die Schnelligkeit, mit der die quantitative Katalaseaktivität gemessen und
aufgezeichnet werden kann, machen diese Erfindung zu einem sehr nützlichen Werkzeug der Klinik. Beispielsweise ist es höchst
erwünscht, die Möglichkeit zu einer billigen, schnellen Massenuntersuchung
zur Diagnose von Infektionen der Harnausscheidungsorgane zu haben, bevor die Symptome der Infektion auftreten.
Wenn eine Untersuchung des Urins eines Patienten nach dem Verfahren und mit einer Vorrichtung gemäß der Erfindung eine bedeutende
Katalaseaktivität anzeigt, dann ist nur noch erforderlich, genauere Untersuchungen durchzuführen, um zu bestimmen,
ob die große Katalaseaktivität auf die Anwesenheit von Bakterien
zurückzuführen ist oder ob eine ungewöhnliche Zerstörung von katalasehaltigen Zellen auftritt oder innerhalb des Körpers
des Patienten aufgetreten ist.
Wenn bereits eine Infektion der Harnausscheidungsorgane diagnostiziert
worden ist, werden zunächst Bakterien und andere im Urin vorhandene Zellen ausgefiltert. Dann wird eine Untersuchungbzw.
Test zur Bestimmung der Katalaseaktivität des gefilterten Urins durchgeführt. Wenn dieser Test positiv ist,
ist dies ein Beweis dafür, daß in dem Körper die Zerstörung . von katalasehaltigen Zellen (beispielsweise eine Entzündung),
vorlegt..
Es wurde auch eine Anordnung mit einer im Gleichgewicht stehenden
oder abgeglichenen Doppelzelle angegeben, die eine
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empfindlichere Messung der Änderung des Sauerstoffpartialdruckes
in einer Wasserstoffperoxidlösung dadurch ergibt, daß jede Veränderung infolge von Effekten durch spontane
Zersetzung bzw. Selbstzersetzung des Wasserstoffperoxids
und der Temperatur aufgehoben, wird. Dies ist besonders wichtig aufgrund der Temperaturempflndlichkeit (etwa 5 %/° C) für Sauerstoffmeßzellen
der hier angegebenen Art.
Weiterhin wird die Verwendung eines Paares von gegensinnig in Reihe geschalteten Sauerstoffmembranzellen und die Bestimmung
des aus verschiedenen Flüssigkeiten in die Zellen eindringenden Sauerstoffes vorgeschlagen, von denen eine eine
von Katalascaktivität freie Bezugsflüssigkeit ist wie beispielsweise
V/asser. Indem sowohl die Zellen als auch der Plüssigkoitsgehalt den gleichen Temperaturbedingungen ausgesetzt
und dann der Potontiometorschreiber auf null eingestellt wird, bevor die HpO^-Lösung sowohl zur Flüssigkeitsprobe als auch zur Vergleichsflüssigkeit zugesetzt wird, werden
sowohl die Temperatur als auch der Blindsauerstoffgehalt als Variable eliminiert.
Weiterhin gestattet die Anordnung mit abgeglichener Zelle die Messung der Katalaseaktivität in Anwesenheit von anderen
möglichen Agontien zur Wasserstoffperoxidzorsetzung, welche
bei dem Vorgang der Probennahme eingesammelt worden können, indem die Messung an zwei gleichzeitig angesammelten Proben
durchgeführt wird, von denen eine zur Inaktivierung der Katalaso
ohne Veränderung der Aktivität anderer Wasserstoffperoxidkatalysatoren in der gleichen Probe selektiv behandelt
wird.
Desgleichen wird ein Verfahren zur Trennung von Bakterien aus der Atmosphäre beschrieben, indem diese auf einem kleinen
Filter abgelagert werden, wodurch in einem kurzen Zeitraum eine genügende Anzahl von Bakterien leicht angesammelt werden
kann, um in dem erfindungsgemäßen Sauerstoffperoxidsystem
eine feststellbare Anzeige zu liefern. Durch Verwendung einer kleinen Filterscheibe kann aus bakterienhaltigcn Flüssigkeiten
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bequem eine Probe entnommen werden und bietet zusätzlich
die Möglichkeit zur Konzentration von Bakterien zur Einführung
in ein kleines Reaktionsvolumen.
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Claims (1)
- Ansprüche- 28 -orrichtung zur schnellen quantitativen Messung der Katalaseaktivität, gekennzeichnet durch ein ein Reaktionsvolumen (26) umschließendes Gehäuse (48), eine Ausnehmung (47)» die durch die Gehäusewandung hindurchführt und mit dem Reaktionsvolumen (26) in Verbindung steht, eine SauerstoffbestimmungszeHe (33) mit einer Anode (34) und einer Kathode (36) sowie einem diese elektrisch verbindenden Elektrolyten (37), wobei die Sauerstoffbestimmungszelle (33) in die Ausnehmung (47) hineinragt und dabei gegenüber der Gehäusewandung abgedichtet ist, ferner eine mit dem Reaktionsvolumen (26) in Verbindung stehende Vorrichtung (11 - 25) zur geregelten Zuführung von Wasserstoffperoxid und einem auf den Katalasegehalt zu untersuchenden Material in das Reaktionsvolumen (26), eine Vorrichtung (28, 29) zur Entlüftung des ReaktionsVolumens (26) beim Eintritt des Wasserstoffperoxids und des zu untersuchenden Materials und eine mit der Sauerstoffbestimmungszelle (33) elektrisch verbundene Vorrichtung (39> 41) zur Messung von Änderungen des elektrischen Ausgangssignals der Sauerstoffbestimmungszelle (33)·2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Vorrichtung zur geregelten Zuführung von Wasserstoffperoxid und einem auf den Katalasegehalt zu untersuchenden Material eine Vorrichtung (24) zur Vormischung des Wasserstoffperoxids und des Materials aufweist, bevor diese in das Reaktionsvolumen (26) eintreten.3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Sauerstoffbestimmungszelle (33) eine Membran (32) aufweist, die für Wasserstoffperoxid undurchlässig ist und einen Sauerstoffdurchlässigkeitskoeffizienten von wenigstens etwa 5 x 10 j hat.109826/1588Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die gegenüber dem Elektrolyten (37) freiliegende Kathodenfläche ein Verhältnis von Länge zu Breite von mehr als etwa 25 : 1 und eine maximale Breite von etwa 0,127 mm (0,005 Zoll) aufweist.Vorrichtung zur schnellen quantitativen Messung der Katalaseaktivität, gekennzeichnet durch ein Gehäuse (51), das ein Reaktionsvolumen (51O umschließt und einen Basisteil (52) aufweist, eine Ausnehmung, die durch den Basisteil (52) hindurchführt und mit dem Reaktionsvolumen in Verbindung steht, eine Sauerstoffbestimmungszelle (56), die eine Anode und eine Kathode sowie einen diese elektrisch verbindenden Elektrolyten und eine einen Teil der Außenwandung bildende Memtran aufweist, die für Wasserstoffperoxid undurchlässig.,.ist und einen Sauerstoffdurchlässigkeitskoeffizienten von wenigsten etwa 5 χ 10*" j besitzt, wobei der Membranabschnitt der Wandung in die Ausnehmung hineinragt, den Basisteil abschließt und den Basisteil flüssigkeitsdicht macht, ferner eine strömungsmäßig mit dem Reaktionsvolumen (51O in Verbindung stehende Vorrichtung (62) zur geregelten Zuführung einer Wasserstoffperoxidlösung in das Reaktionsvolumen, eine zweite strömungsmäßig mit dem Reaktionsvolumen in Verbindung stehende Vorrichtung (63) zur geregelten Zuführung einer katalasehaltigen Lösung in das Reaktionsvolumen, eine strömungsmäßig mit dem Reaktionsvolumen in Verbindung stehende Vorrichtung (61, 64) zur Ableitung von Luft beim Eintritt der Lösungen in das Reaktionsvolumen, eine strömungsmäßig mit dem Reaktionsvolumen in Verbindung stehende Vorrichtung zur Zuführung einer Waschflüssigkeit in das Reaktionsvolumen über wenigstens eine der ersten und zweiten Zuführungsvorrichtungen (62, 63), ferner eine strö- mungsmäßig mit dem Reaktionsvolumen In Verbindung stehende Vorrichtung (67, 68) zur Ableitung von Flüssigkeit aus dem Reaktionsvolumen, eine elektrisch mit der Sauerstoffbeet immungszelie verbundene Vorrichtung zur Messung von109826/15 88Änderungen des elektrischen Ausgangssignals der Sauerstoffbestimmungszelle (56) und eine elektrisch mit der Meßvorrichtung verbundene Vorrichtung zur Aufzeichnung derartiger Änderungen in Katalaseaktivität-Einhelten.6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekenn zeichnet , daß die gegenüber den Elektrolyten freiliegende Kathodenfläche ein Verhältnis von Länge zu Breite von mehr als etwa 25 : 1 und eine maximale Breite von etwa 0,127 nun (0,005 Zoll) aufweist.7. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekenn zeichnet , daß der in die Ausnehmung hineinragende Abschnitt der Sauerstoffbestimmungszelle die allgemeine Form eines Kegelstumpfes aufweist und die Ausnehmung eine Innenfläche besitzt, die diese Form dicht schließend aufnimmt.8. Vorrichtung zur schnellen quantitativen Messung der Katalaseaktivität, gekenzeichnet durch ein Behältergehäuse (17Oj 186), eine Ausnehmung, die sich durch den Basisteil des Behältergehäuses hindurch erstreckt und mit dessen Innenraum in Verbindung steht, eine Sauerstoffbestimmungszelle (172; 187) mit einer Anode und einer Kathode sowie einem diese elektrisch verbindenden Elektrolyten, die als einen Teil ihrer Außenwand nahe der Kathode eine nicht-poröse Membran (171; 191) aufweist, die für Wasserstoffperoxid undurchlässig ist und einen Sauerstoff--11 durchlässigkeitskoeffizienten von wenigstens etwa 5 χ 10besitzt, wobei der Membranteil der Wandung inj clv ein seedie Ausnehmung hineinragt, die Ausnehmung abschließt und den Basisteil flüssigkeitsdicht macht, ferner ein Filterhalterungselement (172; 190), das von dem Behältergehäuse getragen ist und in dessen Innenraum hineinragt, wobei ein Endteil des Fi lterbalterungse lernen te s nahe dem Membranteil ( 101, 102) angeordnet ist, eine Filterscheibe (I6l; I8I), die zwischen dem Endteil des Filterhalterungselementes und109826/1588dem Membranteil angeordnet ist, und eine strömungsmäßig mit dem Innenraum in Verbindung stehende Vorrichtung zur geregelten Zuführung einer Flüssigkeit in das Behältergehäuse, wo diese mit der Filterscheibe in Kontakt kommt.9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß das Volumen der Filterscheibe weniger als etwa 0,1 el bzw. 1 cirr beträgt.10. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß die Filterscheibe (I8I) in einer Ausnehmung in der Oberfläche des nahe dem Membranabschnitt gelegenen Teils des Filterhalterungselementes (I90) angeordnet 1st.11. Vorrichtung nach Anspruch8, dadurch gekennzeichnet , daß die dem Elektrolyten ausgesetzte Kathodenfläche ein Verhältnis von Länge zu Breite von mehr als etwa 25 : 1 und eine maximale Breite von etwa 0,127 mm (0,005 Zoll) aufweist.12. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, , daß der in die Ausnehmung hineinragende Teil der Sauerstoffbestimmungszelle die Form eines Kegelstumpfes aufweist und die Ausnehmung eine Innenfläche besitzt, die diese Form abdichtend aufnimmt.13»Vorrichtung zur schnellen quantitativen Messung der Katalaseaktivität, gekennzeichnet durch ein Gehäuse, das ein Reaktionsvolumen einschließt und einen Basisteil aufweist, eine Ausnehmung, die durch den Basisteil hindurchführt und mit dem Reaktlonsvolumen in Verbindung steht, eine Sauerstoffbestimmungszelle mit einer Anode und einer Kathode sowie einem diese elektrisch verbindenden Elektrolyten, die als einen Teil ihrer Außenwand nahe der Kathode eine nicht-poröse Membran aufweist t die für Wasserstoffperoxid undurchlässig ist und einen Sauer-109826/1588etwa .. Stoffdurchlässigkeitskoeffizienten von wenigstens/ 5 χ 10 aufbist» Wobei der Membranteil der Wandung derart in die Ausnehmung hineinragt, daß ein Teil der das Reaktionsvolumen bildenden Fläche aus der Membran besteht, ferner ein strömungsmäßig mit dem Reaktionsvolumen in Verbindung stehendes Mischvolumen, eine erste, strömungsmäßig mit dem Mischvolumen in Verbindung stehende Vorrichtung zur geregelten Zuführung einer ersten Flüssigkeit zu dem Mischvolumen, eine zweite, strömungsmäßig mit dem Mischvolumen in Verbindung stehende Vorrichtung zur geregelten Zuführung einer zweiten Flüssigkeit zu dem Mischvolumen, eine strömungsmäßig mit dem Reaktionsvolumen in VerbindungP stehende Vorrichtung zur Entlüftung des Reaktionsvolumens, so daß die Luft aus diesem Reaktionsvolumen bei der Zuführung der Flüssigkeiten ablaßbar ist, ferner eine in dem Reaktionsvolumen angeordnete Vorrichtung zum Rühren der zugeführten Flüssigkeit, eine Vorrichtung zur Messung von Änderungen im elektrischen Ausgangssignal der Sauerstoffbestimmungszelle unter einem aufgedrückten elektrischen Potential, wobei diese Änderungen durch die Ionisierung des durch den Membranteil hindurchtretenden Sauerstoffes und eine anschließende chemische Reaktion zwischen diesen Sauerstoffionen und dem Elektrolyten hervorgerufen sind, und eine elektrisch mit der Meßvorrichtung verbundene Vor-fe . richtung zur Aufzeichnung dieser Änderungen in Katalaseaktivität-Einheiten.14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , daß der in die Ausnehmung hineinragende Teil der Sauerstoffbestimmungszelle die Form eines Kegelstumpfes aufweist und die Ausnehmung eine Innenfläche besitzt, die diese Form dicht abschließend aufnimmt.15., Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , daß die dem Elektrolyten ausgesetzte Kathodenfläche ein Verhältnis von Länge zu Breite von mehr als etwa 25 t 1 und eine maximale Breite von etwa109826/1588- 33 0,127 mm (0,005 Zoll) aufweist.16. Vorrichtung zur schnellen quantitativen Messung der Katalaseaktivität, gekennzeichnet durch ein Paar Kammern (123, 124), wobei jede dieser Kammern eine Ausnehmung (133» 13*0 aufweist, die durch eine Wandung der Kammer hindurchragt und mit dem Inneren des Gehäuses in Verbindung steht, erste und zweite Sauerstoffbestimmungszellen (91, 92), die jeweils eine Anode und eine Kathode umfassen, die über einen Elektrolyten elektrisch miteinander in Verbindung stehen, wobei die Sauerstoffbestimmungszellen mit ihren jeweiligen Kammerwandungen dicht schließend verbunden sind, ferner eine strömungsmäßig mit den Kammern in Verbindung stehende Vorrichtung (13.8, 139» l4i, 142) zur gleichzeitigen Zuführung, von Flüssigkeit in beide Kammern, strömungsmäßig mit den Kammern in Verbindung stehende Entlüftungsmittel (1-43» 144) und eine Vorzwei
richtung, die die/Sauerstoffbestimmungszellen (91, 92) elektrisch gegensinnig in Reihe schaltet.17. Verfahren zur klinischen Bestimmung der Kätalaseaktivität in katalasehaltigen Zellen in einer Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet , daß eine Menge der Körperflüssigkeit mit unbekanntem Katalasegehalt λ entnommen, ein vorbestimmtea Volumen der Körperflüssigkeit in ein Reaktionsvolumen eingeführt, eine vorbestimmte Menge Wasserstoffperoxid in das Reaktionsvolumen eingegeben wird, so daß die Volumina der Körperflüssigkeit und des Wasserstoffperoxides das Reaktionsvolumen vollständig ausfüllen, und der Zusatzanstieg im Sauerstoffpartialdruck elektrochemisch gemessen wird, der in einem gegebenen Zeitraum in der Wasserstoffperoxidlösung auftritt.18. Verfahren nach Anspruch 17, φ a d u r -e h gekennzeichnet , daß zur klinischen Bestimmung der Anwesenheit von katalasehaltigen Zellen in einer Körperflüs-; sigkeit das Volumen der zugeführten Waseerstoffperoxidlösung109826/1588- 31 -etwa 10 % des Volumens der Körperflüssigkeit nicht überschreitet.19. Verfahren zur Durchführung eine» schnellen quantitativen Bestimmung des Katalasegehaltes, dadurch gekennzeichnet , daß zwei im wesentlichen identische, gesonderte Mengen des Materials mit unbekanntem Katalasegehalt in Lösung, das bezüglich der Katalaseaktivitat zu untersuchen ist, getrennt werden, ein vorbestimmtes Volumen jeder Menge in ein erstes und zweites Reaktionsvolumen eingeführt, der Katalasegehalt der einen der beiden Mengen anders behandelt und ein vorbestimmtes Volumen identischer Wasserstoffperoxidlösung in beide Reaktionsvolumen eingeführt wird, so daß die Körperflüssigkeit und das Wasserstoffperoxid jedes Reaktionsvolumen vollständig ausfüllen, und die Differenz im Sauerstoffpartialdruck, die in der Wasserstoffperoxidlösung in dem ersten und zweiten Reaktionsvolumen in einem gegebenen Jfeltraum auftritt, mittels einer eine Sauerstoffmembran aufweisenden polarographischen Zelle gemessen wird, die gegensinnig in Reihe geschaltet ist.20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet , daß das Volumen der zugesetzten Wasserstoffperoxidlösung etwa IO % des für jede Menge verwendeten Volumens nicht überschreitet.21. Polarographische Zelle zur Messung von Gaspartialdrucken, in der eine erste und eine zweite Elektrode in einem vorbestimmten Abstand zueinander angeordnet sind und ein flüssiges Medium die Elektroden zur Bildung eines elektrischen Kreises elektrolytisch überbrückt, wobei ein Teil der Wandung der Zelle nahe der ersten Elektrode eine nicht-poröse, gasdurchlässige Trennschicht 1st, dadurch gekennzeichnet , daß ein langer dünner Bereich der ersten, dem flüssigen Medium ausgesetzten Elektrode109826/15882061974vorgesehen ist, dessen Verhältnis von Länge zu Breite größer als etwa 25 : 1 ist.22. Polarographische Zelle nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet , daß die maximale Breite etwa 0,127 mm (0,005 Zoll) beträgt.23. Polarographische Zelle zur Messung des Gaspartialdruckes, gekennzeichnet durch eine erste Elektrode, ein Paar zweiter Elektroden, eine Vorrichtung zur Halterung der Elektroden in der Zelle in einem vorbestimmten Abstand zueinander, ein die Elektroden elektro- i lytisch überbrückendes Medium zur Bildung zweier elektrischer Kreise und einer einzigen Umhüllung mit zwei Schenkelteilen, die die Elektroden und das Medium enthalten, wobei Jeder der Schenkelteile nahe seinem körperfernen Ende eine der zweiten Elektroden enthält und die Umhüllung am körperfernen Ende jedes Schenkelteils eine nicht-poröse, gasdurchlässige Trennschicht als Teil der Begrenzungswandfläche aufweist.2I. Polarographische Zelle nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet , daß die Fläche von jeder der dem Medium ausgesetzten Kathodenelektroden eine lange dünne Form mit einem Verhältnis von Länge zu Breite von mehr "als etwa 25 : 1 besitzt.109826/15 88Leerseite
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