DE20220351U1 - Arteriosklerose-Chip - Google Patents

Arteriosklerose-Chip

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DE20220351U1 DE20220351U DE20220351U DE20220351U1 DE 20220351 U1 DE20220351 U1 DE 20220351U1 DE 20220351 U DE20220351 U DE 20220351U DE 20220351 U DE20220351 U DE 20220351U DE 20220351 U1 DE20220351 U1 DE 20220351U1
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Description

Die Erfindung betrifft einen Genchip zum Bestimmen der genetischen Prädisposition für das Ausbilden arteriosklerotischer Erkrankungen.
Erkrankungen des Herzkreislaufsystems stellen weltweit eine der häufigsten Todesursachen dar. In der Mehrzahl der Fälle sind solche Erkrankungen auf eine Verkalkung der großen und mittelgroßen Schlagader (Arteriosklerose) zurückzuführen. Von besonderer Bedeutung ist eine Arteriosklerose der Herzkranzgefäße und der Halsschlagader, da diese zum Herzinfarkt oder Schlaganfall führen kann. In Deutschland erleiden jährlich derzeit etwa 250.000 Menschen einen Herzinfarkt, der in der Hälfte der Fälle tödlich endet. Oftmals führt der Herzinfarkt bei den überlebenden Patienten zu erheblichen Folgeschäden und Behinderungen. Die Häufigkeit des Schlaganfalls liegt in Deutschland etwa bei der Hälfte der Herzinfarktfälle; es verlaufen etwa ein Viertel aller Fälle tödlich. Die Folgeschäden sind oft verheerender als beim Herzinfarkt.
Bei der Arteriosklerose handelt es sich um ein komplexes Krankheitsbild, das auf multifaktorielle Ursachen zurückgeht. Dabei werden vornehmlich chemische und mechanische Schädigungen der Gefäße beispielsweise durch anhaltenden Nikotinkonsum, Stoffwechselstörungen wie z.B. Diabetes mellitus oder zu Adrenalin- oder Noradrenalin-Ausschüttungen führende psy-
t 9 «
-2-
chosomatische Einflüsse als wesentliche Ursachen diskutiert. Daneben spielen ein anhaltender Bluthochdruck und ein hoher Cholesteringehalt im Blut eine maßgebliche Rolle.
Darüber hinaus wurde bereits vor über 100 Jahren erkannt, daß sich innerhalb einiger Familien Herzinfarkte und Schlaganfälle häuften, so daß der Vererbung eine wichtige Rolle bei der Ausbildung der Arteriosklerose beigemessen wurde. Erst in den letzten 10 bis 15 Jahren hat man jedoch begonnen, die Gründe für die familiäre Häufung dieser Erkrankungen auf molekularer Basis zu verstehen.
Innerhalb der medizinischen Diagnostik kommt der Erfassung der Risikofaktoren zur Bestimmung des Artenoskleroserisikos ein hoher Stellenwert zu. Dazu werden biochemische Analysen beispielsweise der Cholesterin- bzw. der Fettwerte im Blut durchgeführt und der Patient wird nach Lebensgewohnheiten sowie nach in der Familie häufig vorkommenden Krankheiten befragt. Sofern überhaupt die genetischen Risikofaktoren erfaßt werden, erfolgt dies über eine vollständige Sequenzierung der entsprechenden Nukleotidsequenz des relevanten Gens oder durch eine Darstellung der betroffenen Genabschnitte beispielsweise mittels der allelspezifischen PoIymerasekettenreaktion, Restriktionslängenpolymorphismen oder der single stand conformation polymorphism-MeXhoae (SSCP).
Nachteilig an diesen Methoden zur Erfassung der genetischen Disposition ist, daß sie in der Regel nur einzelne Sequenzveränderungen, allenfalls einzelne Gene erfassen. Darüber hinaus sind sie oft sehr arbeitsintensiv und erfordern Spezialkenntnisse sowohl bei der Durchführung als auch bei der Interpretation. Daher eignen sie sich nicht für die Untersuchung einer Vielzahl möglicherweise betroffener Personen.
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Der Erfindung liegt daher das Problem zugrunde, eine Diagnosemöglichkeit bereitzustellen, die eine schnelle und aussagekräftige Diagnose über die genetische Prädisposition zur Erkrankung an der Arteriosklerose erlaubt.
Dieses Problem wird gelöst mit einem Nukleotidträger gemäß dem Hauptanspruch. Vorteilhafte Weiterentwicklungen sind Gegenstand entsprechender Unteransprüche.
Der Erfindung liegt dabei der Gedanke zugrunde, eine geeignete Auswahl von für das genetische Arterioskleroserisiko relevanten Nukleotidsequenzen (bzw. die dazu komplementäre Sequenzen) sowie deren funktionell charakterisierte Mutationen auf einen Träger (nachfolgend auch Genchip) zu bringen, diese Nukleotidsequenzen mit einer Nukleotidsequenzprobe eines Patienten zu hybridisieren und die Hybridisierung multifaktoriell auszuwerten. Die Nukleotidsequenzen stellen dabei Sonden für sog. Referenzsequenzen dar, deren indirekter oder direkter funktioneller Zusammenhang mit der Arteriosklerose bekannt ist oder vermutet wird. Sofern eine Sonde auf dem Träger mit Oligonukleotiden aus der Patientenprobe hybridisiert, ist der Nachweis für das Vorhandensein der entsprechenden Referenzsequenz bei dem Patienten erbracht.
Mit dieser simultanen Erfassung und multifaktoriellen Analyse einer Vielzahl von für das Arterioskleroserisiko relevanten mutierten Sequenzen geht der besondere Vorteil einher, daß etwaige Synergieeffekte zwischen verschiedenen Mutationen erkannt und dargestellt werden können. So ist es möglich, daß einzelne Mutationen für sich allein genommen kein erhebliches Risiko darstellen, treten sie jedoch in Kombination mit anderen - wiederum für sich allein genommen wenig bedeutsamen - Mutation auf, kann sich daraus ein beachtliches genetisches Risiko ergeben, das deutlich das Risiko aus der Summe der Einzelmutationen übersteigt. Dies gilt insbesondere auch für Mutationen, die im Zusammenhang mit der Arteriosklerose
-A-
202 20 351.4 17. Juli 2003
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diskutiert werden, ohne daß ihnen jedoch derzeit eine konkrete Funktion zugewiesen werden kann (sog. Kandidatenmutationen).
Der erfindungsgemäße Nukleotidträger erlaubt damit eine genauere Diagnose des Arterioskleroserisikos, insbesondere dann, wenn die Diagnose mit der Erfassung der konventionellen Risikofaktoren kombiniert wird. Eine genauere Diagnose ist eine wichtige Voraussetzung für neue Behandlungsmethoden, die eine spezifische Behandlung genetischer Defekte in naher Zukunft erlauben werden, wie zum Beispiel die Gentherapie.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung liegt darin, daß eine Vielzahl relevanter Mutationen der ausgewählten Referenzsequenzen in nur einem Arbeitsgang erfaßt werden können, dessen Durchführung keiner Spezialkenntnisse bedarf. Die Nukleotidträger eignen sich darüber hinaus für die Automatisierung und somit für die rasche Bearbeitung umfangreicher Probenserien. Somit wird erfindungsgemäß die gleichzeitige Erfassung relevanter Genveränderungen kostengünstig, schnell und zuverlässig möglich.
Die erfindungsgemäßen Nukleotidträger eignen sich aber nicht nur für die klinische Diagnostik sondern insbesondere auch als Hilfsmittel für die wissenschaftliche Forschung. So können damit z.B. Bevölkerungsstudien, die zum Ziel haben, den Zusammenhang zwischen genetischen Veränderung und dem Risiko für Herzinfarkt oder Schlaganfall zu präzisieren, erleichtert werden, da eine im Vergleich zu herkömmlichen Studien sehr viel höhere Anzahl von Studienteilnehmern erfaßt werden kann.
Da der erfindungsgemäße Nukleotidträger die Identifikation von Interaktionen zwischen Mutationen bzw. Mutationskombinationen sowie zwischen Mutationen und konventionellen Risikofaktoren beispielsweise aus der
-4a-
Familienanamnese, dem Stoffwechsel oder dem Blutcholesterinspiegel erlaubt, kann er zum besseren Verständnis der Entstehung arteriosklerotischer
5-
Erscheinungen beitragen. Er weist somit eine besondere Eignung als Forschungsreagenz auf.
Der Einsatz des erfindungsgemäßen Nukleotidträgers beruht auf der Hybridisierung der auf dem Träger aufgebrachten Nukleotidsequenzen mit komplementären Nukleotidsequenzen aus Proben material des Patienten. Da die ausgewählten Nukleotidsequenzen Sonden für funktionell für das Ausbilden der Arteriosklerose relevanten Referenzsequenzen bestimmter Gene darstellen, können mittels der Hybridisierung einzelne Gene oder Teile davon in einer Präparation genomischer DNA oder das Transkriptionsprodukt eines Genes (mRNA) nachgewiesen werden. [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed., vol. 2, 1989, Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 13.96-97; Constanzi C, GiIIespie D: Fast blots: immobilization of DNA and RNA from cells. In: Guide to molecular cloning techniques. Edited by Berger SR and Kimmel AR, Academic Press Inc., San Diego: Methods in Enzymology 1987, 152: p582-87; Schena M et al.: Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 1995; 270: p467-470].
Die Hybridisierung kann mit einer Nachweisreaktion und anschließender Identifizierung einer Nukleinsäuresequenz kombiniert werden. Dazu kann ein Nukleinsäurestrang beispielsweise durch Farbstoffe, Radioaktivität oder chemolumineszierende oder fluoreszierende Moleküle markiert werden, während der zweite an einem festen Träger beispielsweise aus Kunststoff oder Glas gebunden ist. Die Markierung der Nukleotidsequenz erfolgt dabei vorzugsweise bei der Synthese der Sequenz aus der Patientenprobe. Auf den Träger können mehrere tausend Oligonukleotide als Sonden aufgebracht werden. Die sich anschließende Hybridisierung auf dem Träger kann vorteilhafterweise über einen Scanner ausgewertet werden, so daß sich die Auswertung weitgehend automatisieren läßt.
Im Kontext dieser Anmeldung werden die nachfolgenden Begriffe wie folgt verwendet:
Der Begriff "Hybridisierung" schließt jede Form der Paarung oder Aneinanderlagerung von Nukleotidsequenzen ein. Die Hybridisierung kann sowohl unter stringenten als auch unter relaxierten Bedingungen erfolgen.
Der Begriff "Nukleotidsequenz" bezieht sich auf jede oligomere oder polymere Sequenz aus Ribonukleotiden oder Desoxyribonukleotiden oder aus einer Kombination daraus. Ebenso sind davon Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide mit Basenanaloga erfaßt. Nukleotidsequenzen können synthetischen oder natürlichen Ursprungs sein sowie auf rekombinante Verfahren zurückgehen.
Der Begriff "Arterioskleroserisiko" bezieht sich auf jede Erhöhung (oder Erniedrigung) der Wahrscheinlichkeit zur Ausbildung einer Artehosklerose. Die Wahrscheinlichkeit bemißt sich an der Durchschnittswahrscheinlichkeit in der gesamten Bevölkerung. Sofern das Arterioskleroserisiko auf genetische Ursachen zurückzuführen ist, wird der Begriff genetisches Arterioskleroserisiko bzw. genetische Prädisposition oder nur Disposition verwendet.
Unter "Mutationen" werden alle Formen der Veränderung der genetischen Informationen einer Nukleotidsequenz im Vergleich mit der Wildtypsequenz auch native Sequenz - verstanden. Dabei kann es sich beispielsweise um Substitutionen, Insertionen oder Deletionen handeln. Ebenso sind komplexere Mutationen wie Inversionen und Indels möglich.
Der Begriff "Referenzsequenz" bezieht sich auf bestimmte Nukleotidsequenzen ausgewählter Gene, wobei ein Gen eine Vielzahl von Referenzsequenzen einschließen kann. Die Referenzsequenzen können nativ, d.h. in der Wildtypformung, oder mutiert sein. Ein Zusammenhang zwischen den Muta-
tionen und dem Arterioskleroserisiko ist bekannt oder wird vermutet, d.h. die Mutation ist funktionell charakterisiert bzw. relevant.
Der Begriff "Sonde" bezieht sich auf spezifische Oligonukleotidabschnitte einer Referenzsequenz bzw. dazu komplementärer Sequenzen. Damit erlaubt die Hybridisierung einer Oligonukleotidprobe mit einer Sonde den Nachweis der Referenzsequenz in dem Ursprungsgewebe der Probe. Die Sonden werden auf dem Nukleotidträger aufgebracht.
Auf dem Träger sind Sonden für Referenzsequenzen der in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgeführten Gene aufgebracht, deren Mutationen zu einer Erhöhung des genetischen Arterioskleroserisikos direkt oder indirekt beitragen. Alternativ können auch Sonden von zu den Referenzsequenzen komplementären Sequenzen verwendet werden (nachfolgend auch Komplementärsequenzen). Die Gene werden sowohl über ihre Codenummer aus der GenBank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) als auch über das für sie verwendete Symbol spezifiziert. Des weiteren enthält die Tabelle Angaben über die Häufigkeit genetischer Veränderungen dieser Gene und die Anzahl bekannter Mutationen.
Tabelle 1
Gene Gen-
Symbol 		Häufigkeit der Genverän-
derungen in der allg.
Bevölkerung (soweit
bekannt) 		Krankheitsbild
Fettstoffwechselgene
Apolipoprotein B 3500 APOB 1:600 (bindungsdefektes Apolipoprotein B)
erhöhter LDL-Cholesterin-Spiegel
Apolipoprotein E APOE ApoE2: 10% der Bevölke
rung; ApoE4: 20% der
Bevölkerung		 bei Homozygotie für ApoE2: Hyperlipidämie,
Träger eines ApoE4-Alleis haben ein erhöhtes
Risiko nicht nur für Herzinfarkt sondern auch
für die Alzheimer-Krankheit.
Cholesterinester-Trans-
ferprotein		 CETP weniger als 1:10.000, außer
in Japan		 erhöhte HDL-Cholesterinwerte; möglicher
Schutz gegen Arteriosklerose.
Cholesterin 7-alpha
Hydroxylase		 CYP7A1 seltenes Allel bei ca. 40%
der Bevölkerung		 Hohe Lipidspiegel. Möglicherweise Assozia
tion mit Koronarsklerose
Lipoprotein Lipase LPL seltenes Allel bei ca. 8%
der Bevölkerung		 Erhöhung des Bluttriglyzeridspiegels. ggf.
leichte Erhöhung des Herzinfarktrisikos. Bei
sehr hohen Bluttriglyzeridwerte kann es zu
einer schweren, manchmal lebensberohlichen
Entzündung der Bauchspeicheldrüse kommen.
Homocystein-Stoffwechsel MTHFR variabel, einige Polymor-
pismen sehr häufig		 hoher Homocystein-Spiegel, erhöhtes Risiko
fur Arteriosklerose der Koronararterien.
Methyltetrahydrofolat-
Homocystein Methyltrans-
ferase Reductase
Gerinnung PAIl seltenes Allel bei ca. 12%
der Bevölkerung		 Möglicherweise erhöhtes Risiko für Herzin
farkt.
Plasminogen-Aktivator
Inhibitor-1		 ITGB3 seltenes Allel bei 15% der
Bevölkerung		 verändertes Aggregationsverhalten der Throm-
bozyten; mögliche Korrelation mit erhöhtem
Arteriosklerose-Risiko
Glycoprotein IHa
Sonstige PONl seltenes Allel bei ca. 40%
der Bevölkerung		 Assoziation mit einer Verminderung der anti-
oxidativen Wirkung von HDL und einem
erhöhten Arteriosklerose-Risiko
Paraoxonase 1
Die einzelnen Referenzsequenzen dieser Gene sind Gegenstand der Tabelle 2. Die Referenzsequenzen sind wiederum über ihre Codenummern der GenBank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) identifizierbar (nachfolgend auch GenBank).
Tabelle 2
Nr. 1. Symbol Gen GenBank Sequenz-Nummern
APOB Apolipoprotein B J02610,, J02630, J02775, J04838,
J05157, K03175, M10374, M12413,
2 . M12480,M12681
APOE Apolipoprotein E K00396, M10065, M12529,
NM_000041, XOOl 99, X92000,
3. Z70760
CETP Cholesterinester-Trans- AF027656, J02898, M30185,
ierprotein M32992, M32993, M32994, M32995,
4 . M32996, M32997, M32998
CYP7A1 Cholesterin 7-alpha L13460, M89803, M93133,
5. Hydroxylase NM 000780, X56088
LPL Lipoprotein Lipase AF050163, M15856, M29549,
M76722, M94221, M94222,
NM_000237, X14390, Xl 5736,
6. X54516
MTHFR 5,10-Methy len-Tetrahy- AF105977, AF105978, AF105979,
drofolat- Reductase AF105980, AF105981, AF105982,
AF105983, AF105984, AF105985,
7. AF105986, AF105987, U09806
PAIl Plasminogenaktivator- J03764, J03836, M14083, M16006,
Inhibitor-1 Ml8082, M22313, M22314, M22315,
M22316, M22317, M22318, M22319,
M22320, M22321, M33136, M91557,
X04429, X04729, X04731, X04744
• ·
4 «
8. ITGB3 Glycoprotein Ilia J02703 , J05427, L28832, M20311,
M25108, M32673, M32686,
M35999, M57494, NM000212
9. PONl Paraoxonase AC004022, D84371, M63012,
M63013, M63014, NM000446,
S64615, S64696,
U53784,U55885
Im folgenden wird die Erfindung anhand zweier Ausführungsbeispiele des näheren erläutert.
Beispiel 1:
Sonden der Komplementärsequenzen der in der Tabelle 2 aufgelisteten Referenzsequenzen werden als Oligonukleotide mit Hilfe von Standardtechniken (DE 19612356; US5837832) auf einen geeigneten Träger, beispielsweise mit Gold beschichtetes Glas, aufgebracht. Dabei werden 10- bis 25-mere Nukleotidsequenzen, vorzugsweise 15-mere, verwendet. Die Sequenzen werden dabei so gewählt, daß sie die funktioneilen Mutationen einschließen und die mutierte Komplementärsequenz (i.e. Komplementärsequenz zu der mutierten Referenzsequenz) relativ zu der nativen Komplementärsequenz (i.e. Komplementärsequenz zu der nativen Referenzsequenz) etwa in der Mitte liegt.
Die Oligonukleotidsonden werden so auf den Träger aufgebracht, daß sich auf den Feldern des Trägers jeweils nur eine Variante der Oligonukleotide befindet.
Die Tabelle 3 enthält Angaben über die Nukleinsäuresequenzen, deren komplementäre Sequenzen als Sonden auf den Genchip aufgebracht werden (zwecks besserer Übersichtlichkeit wird nur der zentrale Bereich der 10-bis 25-mere gezeigt, die Position mit Bezug auf die native Referenzsequenz
wird durch Angabe der Kodon-Nummer spezifiziert). Zu jeder Referenzsequenz wird an genau definierter Stelle auf dem Träger die komplementäre Sequenz der aus der dritten Spalte ersichtlichen nativen Referenzsequenz aufgebracht. Die angegebenen Kodon-Nummem beziehen sich auf die native Gensequenz.
Die Anzahl der benötigten Hybridisierungsstellen und diagnostizierbaren Erkrankungen ist aus Tabelle 1 herleitbar. Die bekannten funktionell relevanten Mutationen sind in der Tabelle 3 aufgeführt.
Insgesamt werden in diesem Ausführungsbeispiel 410 Hybridisierungsstellen für die Ermittlung der genetischen Prädisposition für die Arteriosklerose auf einem DNA-Chip verwendet. Die gemeinsame Präsenz dieser Oligonukleotidsonden auf einem Träger erlaubt die simultane Erfassung dieser Sequenzvariationen aus einer Patientenprobe. Deshalb eignet sich dieser DNA-Chip insbesondere für den Einsatz in epidemiologischen Studien, die das Ziel verfolgen, die relative Wertigkeit genetischer Faktoren für das Herzinfarktrisiko zu erforschen.
Die funktionell relevanten Mutationen der in Tabelle 1 aufgeführten Gene sind in der Tabelle 3 enthalten. Diese oder auch ihre Komplementärsequenzen werden auf einen Nukleotidträger aufgebracht. Der Übersichtlichkeit halber werden die Mutationen in verschiedenen "Typen" aufgeführt.
Tabelle 3:
A) Punktmutationen
Nr. Codon Sequenzmutation Aminosäure Gen
1 . 1306 tCGA-TGA Arg-Term ApoB
2 . 1424 GGT-GTT Gly-Val ApoB
3. 1450 aCAG-TAG Gln-Term ApoB
4. 1887 AAT-AGT Asn-Ser ApoB
(Jl 1896 CAT-CGT His-Arg ApoB
6. 2058 tCGA-TGA Arg-Term ApoB
-13-
7. 2153 aCAA-TAA Gln-Term ApoB
8. 2252 cCAG-TAG Gln-Term ApoB
9. 2486 cCGA-TGA Arg-Term ApoB
10. 2495 cCGA-TGA Arg-Term ApoB
11. 2712 CCA-CTA Pro-Leu ApoB
12 . 3371 GCT-GTT Ala-Val ApoB
13 . 3405 cGAA-CAA Glu-Gln ApoB
14 . 3500 CGG-CAG Arg-GIn ApoB
15. 3500 aCGG-TGG Arg-Trp ApoB
16. 3531 aCGC-TGC Arg-Cys ApoB
17. 3750 TCA-TAA Ser-Term ApoB
18. 3894 cGTA-ATA Val-Ile ApoB
19. 13 cGAG-AAG Glu-Lys ApoE
20 . 20 TGGc-TGA Trp-Term ApoE
21. 28 CTG-CCG Leu-Pro ApoE
22 . 112 gTGC-CGC Cys-Arg ApoE
23 . 127 GGC-GAC Gly-Asp ApoE
24 . 136 gCGC-TGC Arg-Cys ApoE
25. 136 CGC-CAC Arg-His ApoE
26. 136 gCGC-AGC Arg-Ser ApoE
27. 142 gCGC-TGC Arg-Cys ApoE
28 . 142 CGC-CTC Arg-Leu ApoE
• ·
t • *
-14-
29. 145 gCGT-TGT Arg-Cys ApoE
30. 145 CGT-CCT Arg-Pro ApoE
31. 146 tAAG-CAG Lys-Gln ApoE
32 . 146 tAAG-GAG Lys-Glu ApoE
33 . 158 gCGC-TGC Arg-Cys ApoE
34. 187 aCAG-GAG Gln-Glu ApoE
35. 210 TGG-TAG Trp-Term ApoE
36. 228 cCGC-TGC Arg-Cys ApoE
37. 57 TAT-TAG Tyr-Term CETP
38. 181 gGGA-TGA Gly-Term CETP
39. 442 GAC-GGC Asp-GIy CETP
40. 33 CTG-CCG Leu-Pro ITGB 3
41. 62 cCGA-TGA Arg-Term ITGB3
42. 117 TTG-TGG Leu-Trp ITGB 3
43. 119 gGAC-TAC Asp-Tyr ITGB 3
44 . 162 TCA-TTA Ser-Leu ITGB 3
45. 214 CGG-CAG Arg-Gin ITGB 3
46. 214 aCGG-TGG Arg-Trp ITGB 3
47. 280 CAT-CCT His-Pro ITGB 3
48. 374 TGC-TAC Cys-Tyr ITGB3
49. 407 tCCC-GCC Pro-Ala ITGB 3
-15-
50. 542 gTGC-CGC Cys-Arg ITGB 3
51. 560 TGT-TTT Cys-Phe ITGB 3
52. 579 cGGC-AGC Gly-Ser ITGB 3
53 . 616 gGAG-TAG Glu-Term ITGB 3
54 . 636 cCGT-TGT Arg-Cys ITGB 3
55. 752 gTCT-CCT Ser-Pro ITGB 3
56. 9 cGAC-AAC Asp-Asn LPL
57. 43 AAT-AGT Asn-Ser LPL
58. 61 TATg-TAA Tyr-Term LPL
59. 64 TGG-TAG Trp-Term LPL
60. 69 tGTG-CTG VaI-Leu LPL
61. 73 TACa-TAA Tyr-Term LPL
62. 75 AGAg-AGC Arg-Ser LPL
63 . 86 cTGG-CGG Trp-Arg LPL
64. 86 cTGG-GGG Trp-Gly LPL
65. 98 cGCG-ACG Ala-Thr LPL
66. -14 TGGc-TGA Trp-Term LPL
67. 101 cACC-GCC Thr-Ala LPL
68. 106 aCAG-TAG Gln-Term LPL
69. 136 CAT-CGT His-Arg LPL
70. 139 tGGC-AGC Gly-Ser LPL
-16-
71. 142 GGA-GAA Gly-Glu LPL
72 . 154 tGGC-AGC Gly-Ser LPL
73. 156 CGAT-AAT Asp-Asn LPL
74. 156 GAT-GGT Asp-Gly LPL
75. 156 cGAT-CAT Asp-His LPL
76. 158 aGCT-ACT Ala-Thr LPL
77. 163 GAG-GGG Glu-Gly LPL
78. 172 TCT-TGT Ser-Cys LPL
79. 176 tGCA-ACA Ala-Thr LPL
80. 180 GACg-GAG Asp-Glu LPL
81. 183 CACa-CAG His-Gln LPL
82. 188 aGGG-AGG Gly-Arg LPL
83. 188 GGG-GAG Gly-Glu LPL
84 . 193 aAGC-CGC Ser-Arg LPL
85. 194 ATT-ACT Ile-Thr LPL
86. 195 GGA-GAA Gly-Glu LPL
87. 204 GACa-GAG Asp-Glu LPL
88. 205 ATT-AGT Ile-Ser LPL
89. 207 CCG-CTG Pro-Leu LPL
90. 216 aTGT-AGT Cys-Ser LPL
91. 225 ATT-ACT Ile-Thr LPL
• · * TJ
• « · ♦
-17-
92. 239 TGCt-TGA Cys-Term LPL
93. 243 gCGC-TGC Arg-Cys LPL
94 . 243 CGC-CAC Arg-His LPL
95. 244 cTCC-ACC Ser-Thr LPL
96. 249 ATC-ACC Ile-Thr LPL
97. 250 cGAC-AAC Asp-Asn LPL
98. 251 TCT-TGT Ser-Cys LPL
99. 252 CTG-CGG Leu-Arg LPL
100 252 tCTG-GTG Leu-Val LPL
101 259 AGTa-AGA Ser-Arg LPL
102 259 aAGT-GGT Ser-Gly LPL
103 261 gGCC-ACC Ala-Thr LPL
104 264 TGCa-TGA Cys-Term LPL
105 286 CTG-CCG Leu-Pro LPL
106 291 AAT-AGT Asn-Ser LPL
107 301 ATG-ACG Met-Thr LPL
* I
-18-
108 302 TACc-TAA Tyr-Term LPL
109 303 CTG-CCG Leu-Pro LPL
110 334 gGCC-ACC Ala-Thr LPL
111 365 CCTA-GTA Leu-Val LPL
112 382 TGGa-TGA Trp-Term LPL
113 410 aGAG-AAG Glu-Lys LPL
114 410 GAG-GTG Glu-Val LPL
115 418 TGT-TAT Cys-Tyr LPL
116 421 gGAG-AAG Glu-Lys LPL
117 447 TCA-TGA Ser-Term LPL
118 51 CGG-CCG Arg-Pro MTHFR
119 52 CGA-CAA Arg-GIn MTHFR
120 116 cGCC-ACC Ala-Thr MTHFR
121 157 CGG-CAG Arg-GIn MTHFR
• ·
-19-
122 183 cCGA-TGA Arg-Term MTHFR
123 222 GCC-GTC Ala-Val MTHFR
124 227 ACG-ATG Thr-Met MTHFR
125 251 CCC-CTC Pro-Leu MTHFR
126 323 CTC-CCC Leu-Pro MTHFR
127 324 AAC-AGC Asn-Ser MTHFR
128 325 cCGC-TGC Arg-Cys MTHFR
129 335 gCGC-TGC Arg-Cys MTHFR
130 339 gTGG-GGG Trp-Gly MTHFR
131 357 gCGC-TGC Arg-Cys MTHFR
132 358 cCGA-TGA Arg-Term MTHFR
133 374 TACa-TAG Tyr-Term MTHFR
134 377 cCGT-TGT Arg-Cys MTHFR
135 387 GGC-GAC Gly-Asp MTHFR
t t
-20-
136 429 GCA-GAA Ala-Glu MTHFR
137 567 gCGA-TGA Arg-Term MTHFR
138 572 CCC-CTC Pro-Leu MTHFR
139 584 gAAG-TAG Lys-Term MTHFR
140 586 cGAG-AAG Glu-Lys MTHFR
141 55 cATG-TTG Met-Leu PONl
142 192 CAA-CGA Gl&eegr;-Arg PONl
I ·
-21 -
B) Promotermutationen
Nr. Sequenz Position Gen
1. CTTGGCCCCCAGAATGGAGGAGGGTGTC
TG(G>T)ATTACTGGGCGAGGTGCCCTC
CCTTCCTGG		 -216 rela
tiv zum
Trans
kriptions-
start		 APOE
2 . GTTTCACCATGTTGGCCAGGCTGGTCTC
AA(A>T)CTCCTGACCTTAAGTGATTCG
CCCACTGTG		 -491 rela
tiv zum
Trans
kriptions-
start		 APOE
3 . GCAGCCAATGATCTCAGAGGCTGTATAC
CC(C>A)CCCAGAGTTATTTTATGCATA
TCAAGGAAA		 -629 rela
tiv zum
Trans
kriptions-
start		 CETP
4 . A>C -204 rela
tiv zum
Trans
kriptions-
start		 CYP7Al
5. ATAGCCAATAGGTGATGAGGTTTATTTG
CA(T>C)ATTTCCAGTCACATAAGCAGC
CTTGGCGTG		 -39 rela
tiv zum
Trans
kripti
onsstart		 LPL
6. TTTGCTCAAACGTTTAGAAGTGAATTTA
GG(T>G)CCCTCCCCCCAACTTATGATT
TTATAGCCA		 -93 rela
tiv zum
Trans
kripti
onsstart		 LPL
7. GGACACGTGG(G)GGAGTCAGCC 4G/5G Pro
moter		 PAIl
8. T>C -107 rela
tiv zum
Startkodon		 PONl
9. G>A -162 rela
tiv zum
Startkodon		 PONl
10. G>A -830 rela
tiv zum
Startkodon		 PONl
11. C>G -907 rela
tiv zum
Startkodon		 PONl
C) Spleißdefekte
-22-
Nummer Intron-
Nr. 		Art d.
Spleiß
stelle 		Position
d.
Mutation 		Basen-aus
tausch 		Gen
1. 5 ds + 1 G-T ApoB
2. 24 ds + 2 T-C ApoB
3. 3 as -2 A-G ApoE
4. 10 ds +2 T-G CETP
5. 14 ds + 1 G-A CETP
6. 9 as -6 G-A ITGB 3
7. 9 ds + 1 G-T ITGB 3
8. 1 ds + 1 G-C LPL
9. 2 as -1 G-A LPL
10. 2 ds + 1 G-A LPL
11. 3 as -6 C-T LPL
12. 6 as -3 C-A LPL
13. 6 as -3 C-T LPL
14. 1 as -1 G-T MTHFR
15. 4 ds + 1 G-A MTHFR
-23-
D) Kleine Deletionen
Nr. Position/Kodon Mutation Gen
1. 1423 AGTCTCAAAAgGTTTACTAAT APOB
2 . 1727 TGACCACACAaacaGTCTGAACAT APOB
3 . 1793 CCCTGAAGCTgCATGTGGCTG APOB
4 . 1828 AGCAGACACTg t TGCTAAGGTT APOB
5. 2182 GAAAAATTAAaAAGTCTTGAT APOB
6 . 2356 CTACAACAAGt t aagATAAAAGATT APOB
7 . 3039 GTTAACAGGGaAGATAGACTT APOB
8. 3385 CATAACAGTAcTGTGAGCTTA APOB
9. 3876 GTTTGAAAAAcAAAGCAGATT APOB
10 3942 CTGCTTTCAGgGAATGGGAAG APOB
11 4033 TTGGGAAGAAgAGGCAGCTTC APOB
12 30 ACTGGCACTGgGTCGCTTTTG APOE
13 141 CCCACCTGCGcaagctgcgTAAGCGGCTC APOE
14 208 CGGGCCCAGGcctggggcgaGCGGCTGCGC APOE
15. 210 GAAGAAGCAGagTGTGTCACGG ITGB 3
16. 324 GTGAGCTCATcccaggGACCACAGTT ITGB 3
17. 650 CTGGCAAGGAtgcagtgaattGTACCTATAA ITGB 3
18. 17 TGCCCTAAGGacccctgaagaCACAGCTGAG LPL
19. 68 GCCAAAACTTgtGGCCGCCCTG LPL
20. 69 AAACTTGTGGccgcCCTGTACAAG LPL
21. 119 GAGGAGTTTAactaCCCTCTGGAC LPL
22. 220 CATTGGAGAAgCTATCCGCGT LPL
23 . 250 CTTCATCGACtcTCTGTTGAAT LPL
24 . 290 TATGAGATCAaTAAAGTCAGA LPL
25. 395 CTGGTGGAGCagtcccGGCTTCGCCA LPL
E) Sonstige Mutationen
Nr. Art d. Mutation Gen
1. Deletion von 694 bp inklusive Exon 21 APOB
2 . Duplikation von 21 bp bei Kodon 121-12 7 APOE
3 . Insertion T bei Exon3 / Intron 3, Position +3 CETP
4 . G>A in Intron 1 CETP
5. Deletion 11.2 kb inklusive Exon 10 bis Exon 13
(partiell)		 ITGB 3
6. Deletion von 1 kb, Inversion von 15 kb ITGB 3
7. Insertion bei Kodon 34: A LPL
8 . Kodon 69: Deletion AAACTTGTGGccgcCCTGTACAAG;
Insertion gg		 LPL
9. Deletion von 2.1 kb inklusive Exon 9 LPL
10. Insertion von 2 kb in Ex. 6 / Intron 6 LPL
11. GC>TT bei Kodon 149; G149V MTHFR
12. Insertion bei Nukleotid 4977 TA PAIl
Beispiel 2:
Sofern nur eine begrenzte Anzahl relevanter Mutationen untersucht werden soll oder kann - oder eine Begrenzung hinsichtlich der zweifelsfrei mit einem erhöhten Arteriosklerose-Risiko korrelierenden Mutationen - vorgenommen werden soll, werden mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer bevorzugten Ausführungsform die folgenden Polymorphismen untersucht (Tabelle 4):
Tabelle 4:
Nr. Codon Sequenz-
mutation		 Aminosäure Gen
1. 3500 CGG-CAG Arg->Gln APOB
2 . 3500 aCGG-TGG Arg->Trp APOB
3 . 3531 aCGC-TGC Arg->Cys APOB
4. 112 qTGC-CGC Cys->Arg APOE
5. 158 qCGC-TGC Arg->Cys APOE
6. - A-204C im
Promoter		 - CYP7A1
-25-
7 . 291 AAT-AGT Asn->Ser LPL
8. 447 TCA-TGA Ser->Stop LPL
9. 22 GCC-GTC AIa->Val MTHFR
10. Nukleotid
C-629A im
Promoter		 CETP
11. G->A im
ersten
Intron		 CETP
12 . 222 C->T AIa->Val MTHFR
13 . - 4G/5G im
Promoter		 - PAIl
14 . 33 CTG-CCG Leu->Pro ITGB 3
15. 192 CAA-CGA Gln->Arg PONl

Claims (10)

1. Nukleotidträger zur Ermittlung des genetischen Arterioskleroserisikos, dadurch gekennzeichnet, daß der Nukleotidträger Oligonukleotid-sonden zur Untersuchung der Gene aus der Tabelle 1 aus einer Patientenprobe aufweist, die jeweils zumindest teilweise identisch oder komplementär sind zu Abschnitten der genannten Gene der Tabelle 1.
2. Nukleotidträger zur Ermittlung des genetischen Arterioskleroserisikos, dadurch gekennzeichnet, daß der Nukleotidträger Sonden aus 10- bis 25-meren Oligonukleotiden aufweist.
3. Nukleotidträger nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch 15- bis 18-mere Oligonukleotidsonden.
4. Nukleotidträger nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch 15-mere Oligonukleotidsonden.
5. Nukleotidträger nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotidsonden jeweils zumindest teilweise identisch oder komplementär sind zu Referenzsequenzen aus der Tabelle 2.
6. Nukleotidträger nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotidsonden jeweils zumindest teilweise identisch oder komplementär sind zu Mutationen der Tabelle 3.
7. Nukleotidträger nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotidsonden jeweils zumindest teilweise identisch oder komplementär sind zu Polymorphismen der Tabelle 4.
8. Nukleotidträger nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet durch Oligonukleotidsonden mit Sequenzabschnitten, die zu mindestens 90% identisch oder komplementär zu einer Auswahl der in Tabelle 3 oder 4 angegebenen Mutationen sind.
9. Nukleotidträger nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Nukleotidträger Oligonukleotidsonden zur Untersuchung eines oder mehrerer der folgenden Gene aufweist: Cholesterin 7- alpha-Hydroxylase (CYP7A1), Plasminogen-Aktivator Inhibitor-1 (PAI1) und Paraoxonase 1 (PON1).
10. Nukleotidträger nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß dieser zusätzlich weitere Sonden aufweist, vorzugsweise solche, die zu den Wildtypsequenzen der jeweiligen Referenzsequenz zumindest teilweise identisch oder komplementär sind.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1723228A1 (de) * 2004-02-18 2006-11-22 The Queen Elizabeth Hospital Research Foundation Inc., Mit nachts auftretenden schlaganfällen assoziierte mutation
US11143659B2 (en) 2015-01-27 2021-10-12 Arterez, Inc. Biomarkers of vascular disease

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EP1723228A4 (de) * 2004-02-18 2008-03-26 Queen Elizabeth Hospital Res F Mit nachts auftretenden schlaganfällen assoziierte mutation
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