DE202012012795U1 - Agglomerierende Magnetische alkoxysilan-beschichtete Nanopartikel - Google Patents

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Abstract

Zusammensetzung enthaltend Agglomerate von magnetischen Alkoxysilan-beschichteten Metallnanopartikeln, dadurch gekennzeichnet, dass die Agglomerate eine mittlere Größe von 30 bis 450 nm aufweisen, wie mittels Streulichtmessung bestimmt, und dass das Zeta-Potential der Metallnanopartikel 25 bis 80 mV bei einem pH von 5,2 und einer Leitfähigkeit von 2,0 mS/cm beträgt.

Description

  • Trotz jüngster Fortschritte auf dem Gebiet der Therapie solider Tumore, wie beispielsweise Antikörper, hält der Bedarf an effizienteren und kostengünstigen Behandlungsmöglichkeiten an.
  • Die Thermotherapie oder spezifischer die Hyperthermie ist ein interessanter Ansatz für die Therapie von Krebs, da verglichen mit der Chemo- oder Bestrahlungstherapie weniger Nebenwirkungen für ein breites Spektrum von Tumorerkrankungen erwartet werden, was auf den physikalischen Wirkmechanismus zurückzuführen ist. Dennoch sind die derzeit verfügbaren Formen noch suboptimal (Moroz et al. 2002) und fordern Verbesserung.
  • Eine bevorzugte Form der Thermotherapie ist ein Verfahren, bei dem magnetische Nanopartikel direkt in einen Tumor eingebracht werden. Die Nanopartikel werden anschließend in einem alternierenden Magnetfeld erhitzt. Abhängig von der Dauer der Behandlung und den erreichten intratumoralen Temperaturen werden die Tumorzellen entweder direkt zerstört (thermale Ablation) oder empfindlicher gegenüber gleichzeitiger Chemo- oder Strahlentherapie (Hyperthermie) gemacht. Mit Hilfe dieses neuen Verfahrens ist es möglich, Tumore von innen heraus zu bekämpfen, sodass umgebendes gesundes Gewebe geschont wird. Diese Behandlungsform hat vielversprechende therapeutische Effekte bei der Behandlung von Glioblastomen gezeigt (Maier-Hauff et al. 2011).
  • Trotz positiver Ergebnisse aus ersten klinischen Studien gibt es noch Raum, die Effizienz zu verbessern und/oder die möglichen Nebenwirkungen oder Limitationen der Therapie zu verringern. Ein ungelöstes Problem ist, dass während der Instillation der Nanopartikel Depots von magnetischen Partikeln außerhalb der Zielregion im umgebenden Gewebe auftreten. Derartige externe Depots können entweder unerwünschte Nebeneffekte verursachen, da sie bei Erhitzung im alternierenden Magnetfeld zu erhöhten Temperaturen außerhalb der Zielregion führen können, oder sie limitieren die anwendbare Magnetfeldstärke, die zur Erhitzung der Nanopartikeldepots verwendet wird, da eine solche Erhitzung des umliegenden Gewebes vermieden wird. Dieses Problem basiert möglicherweise auf dem hohen Druck innerhalb des injizierten Tumorgewebes, welches zu einem Ausfluss von deponierten Nanopartikeln während oder unmittelbar nach Injektion führt. Des Weiteren, während nanoskalige Partikel benötigt werden, um hohe spezifische Absorptionsraten (SAR) zu erzielen, können sich diese Nanopartikel einfach innerhalb des interstitiellen Raumes verbreiten und somit aus der Zielregion verloren gehen. Ferner ist die Menge an Hitze, die innerhalb des Tumors „deponiert” werden kann – durch zunächst erfolgendes Deponieren von Nanopartikeln, die nachfolgend im alternierenden Magnetfeld angeregt werden – aufgrund einer suboptimalen spezifischen Absorptionsrate (SAR) der Nanopartikel/der Magnetflüssigkeit, die bisher in der Klinik verwendet werden, limitiert.
  • Zusätzlich müssen solche Nanopartikel auf kontrollierte Art und Weise im großen Maßstab und bei vertretbaren Kosten hergestellt werden, und sie müssen in einer stabilen Formulierung formulierbar sein, um als Produkt Marktreife zu erlangen.
  • Der Stand der Technik beschreibt eine Reihe von Verfahren und Verwendungen solcher Nanopartikel, wie von Gupta und Gupta (2005) zusammengefasst.
  • Lesniak et al. (1997) beschreiben ein Verfahren zur Herstellung von agglomeratfreien Nanopartikeln. Das Verfahren enthält (i) das Bereitstellen einer wässrigen Suspension von Eisenoxid-Nanopartikeln, die teilweise Agglomerate bilden, (ii) das Zugeben von Trialkoxysilanen und einem wassermischbaren, polaren organischen Lösungsmittels, z. B. Ethylenglykol, (iii) das Behandeln der resultierenden Suspension mit Ultraschall, um die Agglomeration zu reduzieren, (iv) das Entfernen des Wassers durch Destillation unter der Wirkung von Ultraschall, und (v) das Entfernen verbleibender Agglomerate. Das Verfahren führt zu agglomeratfreien Nanopartikeln mit einer hydrolyseresistenten Beschichtung basierend auf Alkoxysilanen. Allerdings verbleiben diese Nanopartikel, wenn sie lokal in solide Tumore appliziert werden, nur teilweise am Ort der Injektion, was möglicherweise an deren agglomeratfreien Eigenschaften liegt. Diese Nanopartikel werden im Körper weitläufig verbreitet, was sowohl die verbleibende Menge an Nanopartikeln innerhalb des Zielgebiets limitiert, als auch das Risiko für Nebenwirkungen aufgrund einer Akkumulation von Nanopartikeln in umgebenden Geweben oder sonst wo im Körper erhöht. Des Weiteren ist es sehr schwierig, das verwendete Ethylenglykol aufgrund seiner Interaktion mit den Aminogruppen der Alkoxysilanbeschichtung und seines hohen Siedepunkts (197°C) zu entfernen. Entsprechend beschränkt die Anwesenheit von Ethylenglykol im Endprodukt die Verwendbarkeit der Nanopartikel unter sicherheitsrelevanten und regulatorischen Aspekten.
  • Ruefenacht et al. (2006) beschreiben eine injizierbare Polymer-basierte Formulierung von hitzegenerierenden Nanopartikeln in einem flüssigen Träger, die in der Lage ist, nach Kontakt mit Körperflüssigkeit oder Gewebe In-situ-Implantate zu bilden. Während diese Formulierung anscheinend das Problem des Abflusses von Nanopartikeln aus dem Tumor zu lösen scheint, verwendet das System bevorzugt Lösungsmittel wie N-Methyl-2-Pyrrolidon (NMP) oder Dimethyl-Sulfoxid (DMSO). Beide Lösungsmittel werden generell als wenig toxisch angesehen und werden häufig für orale oder transdermale Formulierungen von Wirkstoffen verwendet. Jedoch ist wenig über die Injektion der Lösungsmittel in Geweben oder Tumoren bekannt, insbesondere im Fall von Gehirntumoren. Somit sollten solche Lösungsmittel vermieden werden. Ferner bilden diese Formulierungen nach Injektion ein definiertes Implantat, während es im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung gewünscht ist, eine gewisse Verteilung der injizierten Nanopartikel innerhalb des Tumors/Gewebes zu erzielen, welche allerdings auf den Tumor/das Gewebe beschränkt ist. Ein weiterer Nachteil dieses Systems ist die zu erwartende Volumenzunahme innerhalb des Tumors, wenn diese injizierbaren Polymerbasierten Formulierungen in Tumore injiziert werden, was in bestimmten Tumorindikationen zu Problemen führen kann, insbesondere bei Gehirntumoren, bei denen der Platz im Schädel beschränkt ist. Insgesamt sind derartige Polymerbasierte Formulierungen nicht für die Behandlung nicht-operabler Tumore geeignet.
  • Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit, verbesserte biokompatible magnetische Nanopartikel zur Verfügung zu stellen. Insbesondere ist es Gegenstand der vorliegenden Erfindung, verbesserte biokompatible magnetische Nanopartikel für die Behandlung von Tumoren zur Verfügung zu stellen.
  • Wie anhand der Beispiele gezeigt, haben die Erfinder überraschenderweise gefunden, dass die kontrollierte Aminosilanisierung von Eisenoxidnanopartikeln in der Abwesenheit von organischen Lösungsmitteln zu magnetischen Nanopartikeln mit einer unvollständigen Kondensation der Oberflächen-Aminosilane führt, was zu einer stabilen, wasserbasierten Formulierung von magnetischen Nanopartikeln (Magnetflüssigkeiten) führt, die hoch konzentriert werden kann. Nach Injektion in Gewebe oder in einen Tumor bilden diese magnetischen Flüssigkeiten vorteilhafte Depots mit einer hohen Retentionsrate innerhalb des Zielgewebes. Folglich stellen die Erfinder ein verbessertes Verfahren zur Herstellung verbesserter Nanopartikel und geeigneter Suspensionen und Zusammensetzungen (magnetische Flüssigkeiten) mit verbesserter Biokompatibilität, verbesserter Depotbildung innerhalb des Zielgebiets und weniger Nebenwirkungen zur Verfügung, was auf die Abwesenheit von organischen Lösungsmitteln und/oder dem verminderten Abfluss der deponierten Nanopartikel aus der Behandlungsregion zurückzuführen ist.
  • Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung biokompatible magnetische Nanopartikel mit einer hohen spezifischen Absorptionsrate (SAR) zur Verfügung, die in der täglichen Routine in Tumorgewebe injiziert werden können, die an oder nahe der Injektionsstelle innerhalb der gewünschten Behandlungsregion, z. B. dem Tumor, verbleiben und die sich im Wesentlichen nicht in umliegendes Gewebe verteilen. Des Weiteren stellt die vorliegende Erfindung ein robustes und kostengünstiges Herstellungsverfahren für solche biokompatiblen magnetischen Nanopartikel zur Verfügung.
  • Definitionen
  • ”Spezifische Absorptionsrate” (SAR) ist ein Maß für die Rate, mit der Energie durch die Nanopartikel nach Anlegen des alternierenden Magnetfeldes absorbiert wird. Sie hängt von der Stärke des Magnetfelds und der Wechselfrequenz der Polarisation des Magnetfelds ab. Die SAR wird bevorzugt gemäß des von Jordan et al. (1993) entwickelten Verfahren bei einer Frequenz von 100 kHz und einer Feldstärke von bis zu 18 kA/m, vorzugsweise bei 3,5 kA/m, gemessen und bezieht sich auf die Masse an verwendetem Metall, z. B. Eisen (Einheit W/g Metall).
  • Das ”Zeta-Potential” bezieht sich auf das gemessene elektrische Potential von kolloidalen Nanopartikeln in wässriger Umgebung, gemessen mit einem Gerät wie beispielsweise dem Malvern ZetaSizer 3000 HSA bei pH 5,2 und einer Leitfähigkeit von 2,0 mS/cm (jeweils bestimmt bei 25°C). Das Zeta-Potential beschreibt das Potential an der Grenze zwischen dem Gros der Lösung und der Region der hydrodynamischen Scher- oder der Diffusionsschicht.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „etwa” eine Abweichung von einem gegebenen Zahlenwert von ±10%, bevorzugt von ±5% und insbesondere bevorzugt von ±1%.
  • Der Begriff „magnetisch” schließt magnetisch, paramagnetisch, ferromagnetisch, antiferromagnetisch, ferrimagnetisch, antiferrimagnetisch und superparamagnetisch ein. Vorzugsweise sind die Nanopartikel gemäß der vorliegenden Erfindung paramagnetisch, stärker bevorzugt ferromagnetisch, ferrimagnetisch, antiferrimagnetisch oder superparamagnetisch.
  • Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Nanopartikel superparamagnetisch.
  • Der Begriff „Nanopartikel” bezeichnet Nanopartikel im Nanometerbereich, was Nanopartikel von 1 bis 100 nm in Bezug auf deren Metallkern sind, wie mittels Elektronenmikroskopie bestimmt werden kann. Bevorzugt haben die Nanopartikel eine Größe von 5 bis 25 nm, stärker bevorzugt 7 bis 20 nm und insbesondere bevorzugt 9 bis 15 nm.
  • „Metallnanopartikel” bezeichnet magnetische Nanopartikel, die Metall oder Metallionen enthalten.
  • „Organisches Lösungsmittel” soll eine flüssige organische Verbindung bezeichnen, d. h. einen Kohlenwasserstoff, welcher die Eigenschaft hat, Feststoffe, Gase oder Flüssigkeiten zu lösen. Beispiele organischer Lösungsmittel gemäß der vorliegenden Erfindung sind, ohne Beschränkung, Ethylenglykol, Aceton, Toluol und Äquivalente.
  • Der Begriff „Alkoxysilan-Beschichtung” bezieht sich auf eine Beschichtung, die durch Polykondensation von Alkoxysilanen entsteht, ein Prozess, der auch als „Aminosilan-Beschichtung” bezeichnet wird. Der Begriff „Polykondensation”, wie hierin verwendet, bedeutet allgemein jegliche Kondensationsreaktion eines Monomers mit zwei funktionellen Gruppen, die zur Bildung eines Polymers führt.
  • In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Suspension von Agglomeraten aus magnetischen Alkoxysilanbeschichteten Metallnanopartikeln, wobei eine wässrige Suspension von magnetischen Metallnanopartikeln mit Alkoxysilan inkubiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass diese Inkubation im Wesentlichen in Abwesenheit eines organischen Lösungsmittels durchgeführt wird.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „inkubieren” oder „Inkubation” jegliche(n)/(s) Versuchsaufbau, Versuchsbedingung(en) oder Reaktionsgemisch(e), der/die/das die Polykondensation von Alkoxysilanen und somit die Aminosilan-Beschichtung der Nanopartikel erlaubt(en).
  • Wie in den Beispielen gezeigt, wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung gefunden, dass für die Behandlung von Tumoren und anderen Erkrankungen Agglomerate von magnetischen Alkoxysilan-beschichteten Metallnanopartikeln besser Depots innerhalb des Zielgebiets bilden können und weniger Nanopartikel in die Zirkulation verloren gehen oder Depots außerhalb des Zielgebiets bilden als magnetische Alkoxysilan-beschichtete Metallnanopartikel, die keine Agglomerate bilden. „Agglomieren” bedeutet in diesem Zusammenhang, dass mehrere einzelne Nanopartikel Agglomerate oder Gruppierungen von Nanopartikeln bilden. „Agglomerate” beziehen sich auf agglomerierte Nanopartikel oder Gruppierungen von Nanopartikeln.
  • Der entscheidende Schritt der vorliegenden Erfindung ist die Inkubation/Reaktion mit Alkoxysilanen im Wesentlichen in Abwesenheit eines organischen Lösungsmittels. „Im Wesentlichen in Abwesenheit” bedeutet im Zusammenhang mit organischen Lösungsmitteln, dass kleine Spuren von organischen Lösungsmitteln vorhanden sein können. Vorzugsweise ist die Menge der organischen Lösungsmittel kleiner als 10 Volumen-%, stärker bevorzugt kleiner als 5 Volumen-%, noch stärker bevorzugt kleiner als 1 Volumen-%, insbesondere kleiner als 0,5 Volumen-%. Zum Bespiel können geringe Mengen an Methanol während der Reaktion entstehen und somit in gewissem Ausmaß im Produkt verbleiben. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Beschichten in Abwesenheit eines organischen Lösungsmittels durchgeführt, insbesondere wird das Beschichten in Abwesenheit eines zugesetzten organischen Lösungsmittels durchgeführt. Das bevorzugte Lösungsmittel für die Beschichtungsreaktion ist Wasser. Ohne an eine wissenschaftliche Theorie gebunden zu sein, nehmen die Erfinder an, dass diese Reaktionsbedingungen zu einer definierten, allerdings unvollständigen Kondensationsreaktion der Alkoxysilane führt, die sich in die Agglomerationseigenschaften der Nanopartikel übersetzt.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt in Abwesenheit von Ethylenglykol durchgeführt. Ethylenglykol interferiert mit der Beschichtungsreaktion der vorliegenden Erfindung. Ferner ist es zumindest sehr schwierig, wenn nicht unmöglich, es vollständig aus der Nanopartikel-Präparation zu entfernen, da für gewöhnlich relative große Mengen an Ethylenglykol aufgrund des hohen Siedepunkt von 197°C an der Beschichtung der Nanopartikel hängen bleiben. Dies trifft auch auf die Präparationen zu, die gemäß Lesniak et al. (1997, supra) hergestellt wurden. Gemäß der Europäischen Pharmacopeia sind nur 600 ppm an Ethylenglykol im endgültigen Medizinprodukt erlaubt, so dass Nanopartikel-Präparationen mit größeren Mengen an Ethylenglykol für den kommerziellen klinischen Gebrauch unakzeptabel sind.
  • Gemäß einer Ausführungsform enthalten die Metallnanopartikel Eisen, Eisenkomplexverbindungen, Eisenkarbonyl-Verbindungen oder Eisen-Salze, wobei Eisensalze bevorzugt sind. Eisenenthaltende Nanopartikel sind aufgrund ihrer geringen Toxizität verglichen mit anderen magnetischen Metallen wie Kobalt oder Nickel bevorzugt. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Eisenkomplexverbindungen, die Eisenkarbonyl-Verbindungen oder die Eisensalze im Wesentlichen frei von anderen Metallen oder anderen Verunreinigungen, um Toxizitäten zu vermeiden. Es ist im Stand der Technik gut bekannt, dass Chemikalien Spuren von Verunreinigungen enthalten können. Somit bedeutet „im Wesentlichen frei” in diesem Zusammenhang vorzugsweise, dass weniger als 1 Gewichts-%, bevorzugt weniger als 0,1 Gewichts-%, anderer Verunreinigungen in Eisenkomplex-Verbindungen, Eisenkarbonyl-Verbindungen oder Eisensalzen enthalten sind. Besonders bevorzugt sind Eisensalze, die im Wesentlichen von anderen Verunreinigungen frei sind.
  • Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Eisensalz ein Eisenoxid, bevorzugt Magnetit und/oder Maghemit. Solche aus Eisenoxid hergestellten Eisennanopartikel können durch Fällung einer Lösung enthaltend ein Gemisch aus Eisen(III)-chlorid und Eisen(II)-chlorid mit Natriumhydroxid hergestellt werden. „Eisennanopartikel” gemäß dieser Erfindung sind Nanopartikel, die Eisen(Fe)-Atome oder Eisen(Fe)-Ionen enthalten.
  • Entsprechend wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform die wässrige Suspension der Eisenoxid-Nanopartikel durch Fällung einer Lösung enthaltend eine Mischung aus Eisen(III)-chlorid und Eisen(II)-chlorid mit Natriumhydroxid zur Verfügung gestellt.
  • Hier beträgt das Verhältnis zwischen Eisen(III)-chlorid und Eisen(II)-chlorid bevorzugt etwa 2:1.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe „Eisennanopartikel” und „Eisenoxid-Nanopartikel” gleichwertig benutzt.
  • Geeignete Fällungsreaktionen und Bedingungen wurden durch Massart (1981) sowie durch Mohapatra und Anand (2010) beschrieben. Bevorzugte Bedingungen für die Fällungsreaktion sind (i) ein Verhältnis von Eisen(III)-Chlorid und Eisen(II)-Chiorid von etwa 2:1; (ii) das Gießen der Eisen(III)-Chlorid- und der Eisen(II)-Chlorid-Lösung in eine Natriumhydroxid-Lösung mit einer Konzentration von etwa 2,13 M; (iii) eine Fällungstemperatur von etwa 25°C; und (iv) eine Fällungsreaktionszeit von etwa 52 min. Wahlweise wird die Natriumhydroxid-Lösung für eine Dauer von etwa 39 Minuten bei etwa 15°C in die Eisenchlorid-Lösung gegossen (anstatt umgekehrt). Ein Verfahren zur Herstellung beschichteter Eisenoxid-Nanopartikel mittels Fällung von in Lösung befindlichen Eisensalzen ist beispielsweise im Beispiel 1.1 ausgeführt.
  • Alternativ können die wässrigen Suspensionen der Eisenoxid-Nanopartikel durch thermische Zersetzung eines Eisensalzes oder einer Eisenkomplex-Verbindung bereitgestellt werden. Der Begriff „Eisenkomplex-Verbindung”, wie hier verwendet, bezeichnet allgemein jeglichen Komplex, der Eisen enthält, bevorzugt jede Verbindung, die komplexiertes Eisen enthält. Geeignete Verfahren wurden durch Waldöfner und Stief (2011) beschrieben. Zusammengefasst wird eine eisenhaltige Verbindung und ein organisches Lösungsmittel für 10 Minuten (min) bei einer Temperatur zwischen 50°C und 50°C unterhalb der Reaktionstemperatur gehalten. Als nächstes wird die Lösung auf 200 bis 400°C erhitzt, um Nanopartikel zu gewinnen. Die Nanopartikel werden mit Sauerstoff, Peroxid oder einem tertiären Aminoxid oxidiert und mit Salpetersäure und Eisennitrat behandelt, was zu Maghemit-Nanopartikeln führt. Ein anderes geeignetes Verfahren zur Herstellung von Eisenoxid-Nanopartikeln mittels thermischer Zersetzung wurde durch Guardia et al. beschrieben (Guardia et al. 2010a; Guardia et al. 2010b; Guardia et al. 2012). Zusammengefasst wird Eisen(III)-Acetylacetonat mit Decansäure in Dibenzylether gemischt. Die Lösung wird konstant auf bis zu 200°C erhitzt. Nach 2 Stunden (h) bei 200°C wird die Lösung unter Rückfluss erhitzt und bei dieser Temperatur für 1 Stunde (h) gehalten und abschließend auf Raumtemperatur abgekühlt, gewaschen und per Zentrifugation gesammelt. Ein Verfahren zum Herstellen von Eisenoxid-Nanopartikel mittels thermischer Zersetzung gemäß der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise im Beispiel 1.2 ausgeführt.
  • Entsprechend wird in einer alternativ bevorzugten Ausführungsform die wässrige Suspension der Eisenoxid-Nanopartikel durch thermische Zersetzung eines Eisensalzes oder einer Eisenkomplex-Verbindung bereitgestellt.
  • Eisensalze und Eisenkomplex-Verbindungen, die für das Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind dem Fachmann wohl bekannt und schließen, ohne Beschränkung, Eisen(III)-chlorid, Eisen(II)-chlorid, Eisen(III)-acetylacetonat, Eisencarbonyl und Äquivalente ein.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die Metall-Nanopartikel vor der Inkubation/Reaktion mit Alkoxysilan mit H2O2 behandelt. Dieser optionale Schritt ist bevorzugt, da das Eisen unter kontrollierten Bedingungen vollständig zu Fe2O3 (Maghemit) oxidiert wird und deswegen nachfolgende Reaktionsschritte in Abwesenheit von Schutzgas (wie z. B. Argon) durchgeführt werden können. Ansonsten, in Abwesenheit von H2O2, ist es bevorzugt, unter Schutzgas wie Argon zu arbeiten, um die Reaktionsbedingungen zu kontrollieren.
  • Das Alkoxysilan ist bevorzugt ein Trialkoxysilan. Es ist bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus 3-(2-Aminoethylamino)-Propyl-Trimethoxysilan (DIAMO), 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES), Trimethoxysilylpropyl-Diethylentriamine (TRIAMO) und N-(6-Aminohexyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilan ausgewählt. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Alkoxysilan 3-(2-Aminoethylamino)-Propyl-Trimethoxysilan.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Beschichtungsreaktion durch Zugabe von 0,3 bis 0,6 × 10–3 Mol, bevorzugt 0,4 bis 0,5 × 10–3 Mol und insbesondere bevorzugt 0,43 bis 0,45 × 10–3 Mol Trialkoxysilan pro 0,9 Mol des Metalls durchgeführt.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Inkubation/Reaktion mit Alkoxysilan bei einem pH zwischen 2 und 6 (was bedeutet, dass auch ein pH von 2 oder 6 in diesem Bereich enthalten ist) durchgeführt, bevorzugt zwischen 2,5 und 5,5, insbesondere bevorzugt bei 4,5 ± 1. Während der Reaktion kann der pH, wenn notwendig, auf solche Werte eingestellt werden. Essigsäure kann für ein solches Einstellen des pH verwendet werden.
  • Die magnetischen Metall-Nanopartikel werden bevorzugt vor der Inkubation/Reaktion mit Alkoxysilan zerkleinert. Die Nanopartikel werden bevorzugt mittels Ultraschallbehandlung zerkleinert, um eine Suspension von kugelförmigen oder kubischen elektronendichten Nanopartikeln herzustellen, die dann der Beschichtungsreaktion unterworfen werden können. Gemäß einer Ausführungsform wird die Ultraschallbehandlung in einem Ultraschallbad bei 45 kHz für 30 Minuten (min) bis 2 Stunden (h), insbesondere für etwa 1 Stunde (h), durchgeführt. Das Zerkleinerungsverfahren wird bevorzugt unter sauren Bedingungen, bevorzugt zwischen pH 2,5 und 3,0 durchgeführt. Zerkleinerung der Nanopartikel gemäß der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise in Beispiel 1.1 beschrieben.
  • Ein anderes geeignetes Verfahren für die Zerkleinerung der Nanopartikel ist die Laser-basierte Deagglomeration/Laserfragmentierungstechnik (Schnoor et al. 2010).
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann ferner den Schritt des Zerkleinerns von Agglomeraten nach Beginn der Inkubation/Reaktion mit Alkoxysilan enthalten, welcher wie oben stehend beschrieben ausgeführt werden kann. Gemäß einer Ausführungsform beginnt die Zerkleinerung der Nanopartikel gleichzeitig mit oder nach der Beschichtungsreaktion. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hingegen beginnt der Zerkleinerungsschritt vor dem Beschichtungsschritt und wird gleichzeitig mit und/oder nach dem Beschichtungsschritt fortgesetzt. Insbesondere wird mit der Zerkleinerung vor dem Beschichtungsschritt begonnen und diese wird während und nach dem Beschichtungsschritt fortgeführt. Bevorzugt wird die Zerkleinerung insgesamt für ungefähr 24 Stunden (h) oder länger durchgeführt.
  • Nach der Beschichtung und Zerkleinerung kann eine Suspension hergestellt werden, die stabil bei Raumtemperatur gelagert werden kann, was sie zu einer bevorzugten Ausführungsform macht. Ohne an eine wissenschaftliche Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass die meisten einzelnen Nanopartikel vollständig mit Alkoxysilan beschichtet sind, welches einfach an benachbarte Nanopartikel anhaftet und sich so die Agglomerate gemäß dieser Erfindung bilden, wie aus ersichtlich ist. Dennoch ist die Suspension flüssig genug, um Nadeln leicht zu passieren und um in Tumorgewebe injizierbar zu sein.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird ein zusätzlicher Schritt zur Entfernung unvollständig beschichteter und/oder sehr großer Agglomerate (z. B. Agglomerate aus mehr als 2.000 Nanopartikeln) aus der Suspension ausgeführt. Geeignete Verfahren für diesen Schritt sind die Zentrifugation (z. B. für 10 Minuten (min) bei 2.000 Umdrehungen/pro Minute (rpm)) und die Filtration (z. B. durch einen plissierten Filter mit einer Porengröße von 12–25 μm). Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden sowohl Zentrifugation als auch Filtration angewandt. Es wurde beobachtet, dass überwiegend und vollständig Alkoxysilan-beschichtete Nanopartikel nicht aus der Suspension sedimentieren, z. B. wenn diese für 10 Minuten (min) bei 2.000 Umdrehungen/pro Minute (rpm) zentrifugiert werden. Entsprechend stellt/stellen der Überstand der Zentrifugation und/oder der Durchfluss der Filtration eine erfindungsgemäße Suspension dar, die keine Sedimentation über den Zeitraum eines Tages, bevorzugt einer Woche, insbesondere bevorzugt eines Monates zeigt/zeigen, und die demnach über eine lange Zeit gelagert werden kann.
  • Auf der anderen Seite können unvollständig beschichtete Nanopartikel z. B. durch Zentrifugation zu einem großen Anteil aus der Suspension entfernt werden. Ein solches Entfernen von unvollständig beschichteten Nanopartikeln ist bevorzugt, da unvollständig beschichtete Nanopartikel eine geringere SAR aufweisen, welches somit die Volumen-SAR einer Suspension erniedrigt.
  • Der/die Zerkleinerungsschritt(e) und wahlweise der Entfernungsschritt wird/werden bevorzugt durchgeführt, bis die Agglomerate der Metallnanopartikel eine mittlere Größe (z-average) von 30 bis 450 Nanometer (nm), bevorzugt von 50 bis 350 Nanometer (nm) und insbesondere bevorzugt von 70 bis 300 Nanometer (nm) haben, wie mittels Streulichtmessung bestimmt. In diesem Zusammenhang wird die mittlere Größe gemäß Beispiel 3 in Wasser bestimmt. Mittels dieser Streulichtmessung wird die Größe der Nanopartikel-Agglomerate bestimmt – im Gegensatz zu der Größe der kugelförmigen oder kubischen elektronendichten Einzel-Nanopartikel, die solche Agglomerate bilden. ”Z-average” in Bezug auf die Größe von Agglomeraten bedeutet das Ergebnis der Streulicht-Größenbestimmung wie in Beispiel 3 durchgeführt. Z-average-Werte oberhalb der angegebenen Bereiche führen zur Sedimentation der Nanopartikel und sind deshalb generell nicht für die vorgesehenen Anwendungen dieser Nanopartikel geeignet. Sogar wenn die Dispersion vor Instillation eines Tumors wieder hergestellt werden kann, können größere Agglomerate zu ernsthaften Problemen führen, da die Dispersion sich während des Passierens durch die Nadel teilweise in Puffer und Agglomerate aufteilen könnte, was zu einer ungleichmäßigen Verteilung der Nanopartikel im Gewebe führen würde.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Suspension der Agglomerate auf eine Konzentration von mindestens etwa 2 M, bevorzugt von mindestens etwa 3 M, stärker bevorzugt von mindestens etwa 4 M, weiter bevorzugt von mindestens etwa 5 M, insbesondere bevorzugt von mindestens etwa 6 M konzentriert, wie anhand ihres Metallgehalts bestimmt. Die gewünschte Metallkonzentration innerhalb der Suspension gemäß dieser Erfindung kann durch die Verdunstung von Wasser in einem Rotationsverdampfer eingestellt werden. Proben der Suspension können bzgl. ihres Feststoffgehalts und ihrer Metallkonzentration mit Hilfe der unten beschriebenen Verfahren analysiert werden (siehe beispielweise Beispiel 2).
  • Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Nanopartikel in Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung zu hohen Konzentrationen von 2 M Metallgehalt und darüber konzentriert werden können, ohne deren Verwendbarkeit als Medizinprodukt oder Arzneimittel zu verlieren. Diese hochkonzentrierten Suspensionen können immer noch in der täglichen Routine verabreicht oder injiziert werden und über Monate gelagert werden, was von großer Bedeutung ist. Nach Autoklavieren der Suspension kann etwas Gelieren beobachtet werden, was aber durch intensives Vortexen (z. B. für etwa 12 Stunden) rückgängig gemacht werden kann. Verglichen mit einer Suspension mit niedrigerer Metallkonzentration haben diese Suspensionen eine höhere spezifische Absorptionsrate (SAR) bezogen auf das Volumen sowie eine hohe Viskosität. Überraschenderweise wurde für die erfindungsgemäßen Nanopartikel gezeigt, dass die Depotbildung solcher Nanopartikel innerhalb des gewünschten Gewebes, z. B. im Tumor, abhängig ist von der Konzentration der Nanopartikel, das heißt, dass eine Erhöhung der Nanopartikelkonzentrationen zu einer verbesserten Depotbildung führt. Dieses Ergebnis war unerwartet, da man vernünftigerweise annehmen kann, dass die Konzentration der injizierten Nanopartikel bei unterschiedlichen Konzentrationen schnell innerhalb des Gewebes ausgeglichen wird, so dass identische Nanopartikel in unterschiedlichen Konzentrationen sich nicht unterschiedlich verhalten.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Suspension von Agglomeraten von magnetischen Alkoxysilan-beschichteten Metallnanopartikeln erhältlich nach einem der oben beschriebenen Verfahren. Wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben wird, kann die Suspension in der täglichen Routine in Tumore injiziert werden, verbleibt innerhalb des Tumorgewebes und kann somit für die Hyperthermie und die Thermoablation genutzt werden. Es wurde überraschenderweise gefunden, dass die erfindungsgemäße Alkoxysilan-Beschichtung zu den Eigenschaften der Nanopartikel führt, nämlich in solcher Art und Weise zu agglomerieren, dass die Agglomerate nach Injektion in Gewebe überwiegend in nächster Umgebung zur Injektionsstelle verbleiben, aber noch immer einfach zu handhaben sind. Dies macht diese Agglomerate besonders geeignet für die Injektion in Tumorgewebe, z. B. für die Hyperthermie und/oder die Thermoablation.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Zusammensetzung umfassend Agglomerate von magnetischen Alkoxysilan-beschichteten Metallnanopartikeln, wobei die Agglomerate eine mittlere Größe von 30 bis 450 nm, bevorzugt von 50 bis 350 nm und insbesondere bevorzugt von 70 bis 300 nm haben, wie mittels Streulichtmessung bestimmt. Die Größenbestimmung von agglomerierten Nanopartikeln gemäß der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise in Bespiel 3 beschrieben.
  • Die Agglomerate umfassende Zusammensetzung ist bevorzugt im Wesentlichen frei von organischen Lösungsmitteln. „Im Wesentlichen frei von organischen Lösungsmitteln” bedeutet in diesem Zusammenhang, dass kleine Spuren von organischen Lösungsmitteln vorhanden sein können, z. B. dass die Menge an organischen Lösungsmitteln kleiner als 5 Volumen-%, bevorzugt kleiner als 1 Volumen-%, stärker bevorzugt kleiner als 0,5 Volumen-%, insbesondere bevorzugt kleiner als 0,1 Volumen-% ist. in einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann kein organisches Lösungsmittel in der Nanopartikel-Präparation mittels üblicher Methoden nachgewiesen werden.
  • Die Metallnanopartikel dieser Zusammensetzungen sind bevorzugt Nanopartikel mit einem Metallkern mit einer Größer von 5 bis 25 nm, bevorzugt mit einer Größe von 7 bis 20 nm und insbesondere bevorzugt mit einer Größe von 9 bis 15 nm, wie mittels Elektronenmikroskopie bestimmt. Die Agglomerate der Suspension bestehen bevorzugt aus Duzenden bis Hunderten solcher einzelner Nanopartikel, wobei keine oder nur sehr wenige kleine Agglomerate mit weniger als zehn Nanopartikeln sind, wie mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestimmt – vorzugsweise weniger als 3 Agglomerate von 10 oder weniger Nanopartikeln in einem repräsentativen TEM-Bild, welches 700 × 700 nm und mindestens 1000 Nanopartikel zeigt. Transmissionselektronenmikroskopie gemäß der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise in Beispiel 6 beschrieben.
  • Wiederum können in einem repräsentativen TEM-Bild, welches 700 × 700 nm und mindestens 1000 Nanopartikel zeigt, bevorzugt weniger als 10 einzelne Nanopartikel, bevorzugt weniger als 5 einzelne Nanopartikel, insbesondere bevorzugt ein oder kein einzelnes Nanopartikel erkannt werden. Ein Nanopartikel ist in diesem Zusammenhang ein im Wesentlichen kugelförmiges oder kubisches elektronendichtes Nanopartikel, das in Transmissionselekronenmikroskopie-Bildern sichtbar ist. Ein einzelnes Nanopartikel ist ein Nanopartikel, das nicht an mindestens ein anderes Nanopartikel geheftet ist.
  • Die Form der einzelnen Nanopartikel ist bevorzugt kugelförmig oder kubisch. Die Größe und Form der Nanopartikel kann durch Anpassung des pH, der Ionenstärke, der Temperatur, der Art des Salzes (Perchlorate, Chloride, Sulfate und Nitrate) oder des Fe(II)/Fe(III)-Konzentrationsverhältnisses angepasst werden (zusammengefasst in Mohaoatra und Anand 2010).
  • Die Metallnanopartikel enthalten bevorzugt Eisen, Eisenkomplex-Verbindungen, Eisenkarbonyl-Verbindungen oder Eisensalze, bevorzugt Eisensalze. Das Eisensalz ist bevorzugt ein Eisenoxid, insbesondere Magnetit. Die bevorzugten Nanopartikel können mittels der oben beschriebenen Verfahren erhalten werden, besonders durch Zurverfügungstellen der Suspension von Eisenoxid-Nanopartikeln mittels Fällen einer Lösung, die ein Gemisch aus Eisen(III)-Chlorid und Eisen(II)-Chlorid mit Natriumhydroxid enthält.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform hat die Zusammensetzung, die die erfindungsgemäßen Agglomerate aus magnetischen Alkoxysilan-beschichteten Metallnanopartikel umfasst, ein Zeta-Potential von 25 bis 80 mV, bevorzugt von 35 bis 70 mV und insbesondere bevorzugt von 45 bis 60 mV. Das Zeta-Potential der Zusammensetzung wird, wie in Beispiel 4 beschrieben, bei pH 5,2 und einer Leitfähigkeit von 2,0 mS/cm (jeweils bestimmt bei 25°C) bestimmt. Das Zeta-Potential ist von der erfolgreichen Beschichtung der Nanopartikel abhängig und hängt von den Aminogruppen der Alkoxysilane ab.
  • Niedrigere Zeta-Potentiale deuten auf eine unvollständige Beschichtung der Nanopartikel hin. Das richtige Zeta-Potential innerhalb der zur Verfügung gestellten Bereiche trägt zu den Eigenschaften der Nanopartikel nach Injektion ins Gewebe bei, d. h. dass injizierte Nanopartikel an oder in der Nähe der Injektionsstelle innerhalb z. B. des Tumors verbleiben und sich nicht in das umgebende Gewebe verteilen, was das anwendbare Magnetfeld und somit den Erfolg der Behandlung begrenzen würde. Ferner stellt das Zeta-Potential innerhalb der beschriebenen Bereiche die optimale kolloidale Stabilität sicher und verlängert somit die Lagerstabilität der Nanopartikel-Zusammensetzung.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist eine Zusammensetzung umfassend Agglomerate von magnetischen Alkoxysilan-beschichteten Metallnanopartikeln, wobei die Agglomerate in einem wasserbasierten, physiologisch akzeptablen Puffer suspendiert sind. Physiologisch akzeptable Puffer sind im Stand der Technik bekannt und enthalten z. B. Azetat, Zitrat, Karbonat oder Phosphat bei einem pH (bei 25°C) zwischen 5 und 8, bevorzugt zwischen 5 und 6, und insbesondere bevorzugt zwischen 5,1 und 5,8 und einer Leitfähigkeit (bei 25°C) von 1,5 bis 2,5 mS/cm, bevorzugt 1,7 bis 2,3 mS/cm. Die Osmolalität einer geeigneten Suspension beträgt 0,01 bis 0,05 Osmol/kg, bevorzugt 0,02 bis 0,04 Osmol/kg. Derartige Suspensionen sind vorzugsweise zur Verwendung als Infusion für die systemische Behandlung oder als Injektionen für interstitielle oder intratumorale Verabreichung gebrauchsfertig.
  • Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung weist bevorzugt eine Nanopartikel-Konzentration von mindestens etwa 2 M, bevorzugt von mindestens etwa 3 M, stärker bevorzugt von mindestens etwa 4 M, noch stärker bevorzugt von mindestens etwa 5 M und insbesondere bevorzugt von mindestens etwa 6 M auf, wie bestimmt anhand ihres Metallgehalts. Die Nanopartikel-Konzentration ist bevorzugt kleiner als etwa 8 M, da zu hohe Konzentrationen für bestimmte Anwendungen aufgrund der hohen Viskosität der Dispersion zu Schwierigkeiten während der Injektion führen könnten. Bezüglich Eisen entsprechen 2 M 112 mg/ml. Die Metallkonzentration kann mittels Photometrie bestimmter Metallkomplexe bestimmt werden; z. B. kann Eisen nach Überführung in einen Eisen(II)-Phenanthrolin-Komplex, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt werden.
  • Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Nanopartikel in der Zusammensetzung gemäß der vorliegender Erfindung zu hohen Konzentrationen von 2 M Metallgehalt oder mehr konzentriert werden können, ohne dabei die Brauchbarkeit als Medizinprodukt oder Arzneimittel zu verlieren. Diese hochkonzentrierten Suspensionen können in der täglichen Routine immer noch infundiert oder injiziert und, bedeutsamer Weise, über Monate gelagert werden. Nach dem Autoklavieren der Suspension kann eine gewisse Gelbildung beobachtet werden, die allerdings durch intensives Vortexen (z. B. für 12 Stunden) rückgängig gemacht werden kann. Verglichen mit einer Suspension mit geringerer Metallkonzentration haben diese Suspensionen höhere SAR-Werte bezogen auf das Volumen und eine hohe Viskosität. Überraschenderweise wurde für die Nanopartikel der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass die Depotbildung solcher Nanopartikel innerhalb des Zielgewebes, z. B. des Tumors, von der Konzentration der Nanopartikel abhängt, d. h. dass höhere Nanopartikel-Konzentrationen zu einer verbesserten Depotbildung führen. Dieses Ergebnis war unerwartet, da man vernünftigerweise annehmen kann, dass die Konzentration der injizierten Nanopartikel für unterschiedliche Konzentrationen innerhalb des Gewebes schnell ausgeglichen wird, so dass sich identische Nanopartikel in unterschiedlichen Konzentrationen nicht unterschiedlich verhalten.
  • Wie aus Beispiel 9 ersichtlich, konnten bei hochkonzentrierten Zusammensetzungen mehr Nanopartikel innerhalb des Tumors deponiert werden (z. B. 95% des injizierten Eisens für eine 6 M Suspension verglichen mit 90% für eine 2 M Suspension am Tag 0). Diese Beobachtung stimmt mit dem Ergebnis überein, dass für die 6 M Suspension verglichen mit der 2 M Suspension weniger Eisen in Lunge, Leber und Milz gefunden wurde (z. B. 3% gegenüber 14% am Tag 0). Entsprechend wird geschlussfolgert, dass, je höher die Konzentration ist, umso weniger Nanopartikel in die Zirkulation eindringen und in anderen Organen enden.
  • Ferner wurde gefunden, dass höher konzentrierte Nanopartikel der Erfindung in einem Zeitfenster von 7 Tagen vollständig innerhalb des Tumors verbleiben (für eine 6 M Suspension: 95% am Tag 0 gegenüber 96% am Tag 7), während innerhalb desselben Zeitfensters gewisse Verluste an Eisengehalt für eine geringer konzentrierte Suspension beobachtet werden konnten (für eine 2 M Suspension: 90% am Tag 0 gegenüber 86% am Tag 7). Diese Beobachtung ist besonders überraschend, da man erwarten würde, dass Nanopartikel nach der Injektion in das Tumorgewebe schnell verdünnt werden und kein unterschiedliches Verhalten über längere Zeiträume zeigen.
  • Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung hat vorzugsweise eine Viskosität bei einer Scherrate von 100/s von 0,005 Pa·s oder mehr, bevorzugt von 0,01 Pa·s oder mehr, stärker bevorzugt von 0,1 Pa·s oder mehr, und insbesondere bevorzugt von 1 Pa·s oder mehr, wie mittels Rotationsrheometrie bestimmt. Rotationsrheometrie gemäß der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise in Beispiel 8 verdeutlicht. Die Viskosität erhöht sich für Suspensionen gemäß dieser Erfindung mit ansteigender Nanopartikel- oder Eisenkonzentration.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die spezifische Absorptionsrate (SAR) der Nanopartikel in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung größer oder gleich 2 W/g des entsprechenden Metalls (z. B. Eisen), besonders größer oder gleich 3 W/g des entsprechenden Metalls und insbesondere 4 bis 50 W/g des entsprechenden Metalls, wie bestimmt bei einer magnetischen Feldstärke von 3,5 kA/m und einer Frequenz von 100 kHz gemäß des von Jordan et al. (1993) beschriebenen Verfahrens. Generell werden hohe SAR-Werte bevorzugt, da folglich höhere Temperaturen während der Bestrahlung mit einem alternierenden Magnetfeld erreicht werden können. Wenn der SAR-Wert der Nanopartikel zu gering ist, d. h. geringer als die beschriebenen Werte, so ist es wahrscheinlich, dass die aufgrund der Bestrahlung mit einem alternierenden Magnetfelds erreichten Temperaturen im ganzen Tumor zu niedrig sind, um einen therapeutischen Effekt zu erzielen.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist eine erfindungsgemäße Zusammensetzung, wobei nach Injektion der Zusammensetzung in ein isogenes Tumormodel am oder nach Tag 7 nach der Injektion mindestens 90%, bevorzugt 93%, stärker bevorzugt mindestens 95% und insbesondere bevorzugt mindestens 98% des applizierten Metalls innerhalb des injizierten Tumors bleibt. Ein isogenes Tumormodel entsprechend dieser Erfindung ist ein Tumormodell, bei dem die Tumorzellen, die für das Induzieren eines Tumors verwendet werden, genetisch dem Wirtstier angepasst sind. Zum Beispiel wird die Mammakarzinom-Zelllinie C3H RS1 verwendet, um Tumore im Mausstamm C3H-HeN zu generieren. Im Tumor verbleibendes Metall kann mittels Messen der Metallwiederfindung unter Verwendung von Spektrometrie, z. B. durch ein Tecan Infinite M 200 Spektrometer, bestimmt werden.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Zusammensetzung, die durch irgendeines der erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Medizinprodukt enthaltend eine Suspension oder eine Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung. Da magnetische Nanopartikel ihren therapeutischen Effekt nach Bestrahlung durch ein alternierendes magnetisches Feld aufgrund der Generierung von Hitze auf physikalische Art und Weise ausüben und nicht direkt mit dem Metabolismus des Patienten Wechselwirken, werden diese Nanopartikel in vielen Rechtsgebieten als Medizinprodukte klassifiziert. Dennoch können sie als schlagkräftiges Mittel zur Behandlung oder Prophylaxe von Tumorerkrankungen und anderen Erkrankungen mittels Hyperthermie und/oder Thermoablation verwendet werden, wenn Zellen in einer bestimmten Region des Körpers nicht funktionieren.
  • Beispiele für solche anderen Erkrankungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, sind Rheuma, Arthritis, Arthrose und bakterielle Infektionen. Tumorerkrankungen, die mit den erfindungsgemäßen Nanopartikeln behandelt werden können, sind bevorzugt solide Tumore, insbesondere lokale und lokal fortgeschrittene Tumore, oder systemische Tumorerkrankungen, die lokale Probleme bereiten wie inoperable Metastasen. Beispiele sind Gehirntumore, z. B. Glioblastom und Astrozytom, Gehirnmetastasen, Prostatakrebs, Pankreaskrebs, hepatozelluläres Karzinom, Hals- und Nackentumore, Blasenkrebs, Magenkrebs, Nierenzellkarzinom, Ovarialkarzinom, Cervixkarzinom, Sarkom, Basalzellkarzinom und Melanom.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Arzneimittel enthaltend eine Suspension oder eine Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung. Die Suspension oder Zusammensetzung der Erfindung kann mit aktiven Wirkstoffen wie Anti-Krebsmitteln formuliert werden, z. B. mit chemotherapeutischen Mitteln (die in alkylierende Mittel, antineoplastische Antibiotika, Antimetaboliten und Derivate natürlichen Ursprungs unterteilt werden können), Hormonen/Wachstumsfaktoren oder Hormonen/Wachstumsfaktoranaloga oder Inhibitoren von Hormonen/Wachstumsfaktoren, Inhibitoren der Signalübertragung und Immuntherapeutika. Geeignete Wirkstoffe sind zum Beispiel in Waldöfner und Stief (2011, Absätze [0096] bis [0102]) aufgeführt. Entsprechend ist es ein Aspekt der Erfindung, dass die Nanopartikel gemäß der vorliegenden Erfindung mit solchen aktiven Wirkstoffen kombiniert werden.
  • In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf eine Suspension oder Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung einer Proliferationserkrankung, Krebs, Tumoren, Rheuma, Arthritis, Arthrose und bakterieller Infektionen wie ferner vorstehend und nachfolgend genauer beschrieben in einem Patienten, wie vorstehend und nachfolgend definiert.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Behandeln oder Vorbeugen einer Proliferationserkrankung, Krebs, Tumoren, Rheuma, Arthritis, Arthrose und bakterieller Infektionen, umfassend den Schritt des Verabreichens der erfindungsgemäßen Suspension oder der Zusammensetzung einem menschlichen oder tierischen Patienten, wie ferner vorstehend und nachfolgend beschrieben.
  • Bevorzugt enthält die Suspension oder Zusammensetzung für die Verwendung gemäß dieser Erfindung oder das Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von Erkrankungen gemäß dieser Erfindung des Weiteren, den Patienten einem Wechselmagnetfeld auszusetzen. Gewöhnlich wird das Wechselmagnetfeld Stunden oder Tage nach Injektion der Suspension oder Zusammensetzung in die Zielregion des Patienten, z. B. den Tumor, angelegt (Johannsen et al. 2007; Thiesen and Jordan 2008; Maier-Hauff et al. 2011).
  • Analog zu Jordan et al. (2008) kann die Suspension oder die Zusammensetzung dieser Erfindung ferner in einem Verfahren zur Steigerung der Aktivität eines Antikrebs-Mittels angewendet werden, umfassend die Schritte des Verabreichens einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche die hierin beschriebenen Nanopartikel-Agglomerate umfasst, einem behandlungsbedürftigen Patienten, und in einem davon getrennten Schritt das Verabreichen mindestens ein Antikrebs-Mittel zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch akzeptablem Hilfsstoff, Trägerstoff und/oder Lösungsmittel. Die zwei Verabreichungen können gleichzeitig oder eine nach der anderen (zuerst Nanopartikel, danach das Antikrebs-Mittel oder umgekehrt) erfolgen, allerdings auf solche Art und Weise, dass die Nanopartikel und das Antikrebs-Mittel zum gleichen Zeitpunkt innerhalb des Körpers des Patienten vorhanden sind, damit sie zusammen wirken und den therapeutischen Effekt des jeweils anderen verstärken können. Während, gemäß der vorliegenden Erfindung, die Nanopartikel-Agglomerate für Monate und Jahre innerhalb des Gewebes innerhalb der Zielregion bleiben und nach Bestrahlung mit einem Wechselmagnetfeld Hitze generieren können, wirkt ein verabreichtes Antikrebs-Mittel typischer Weise für Stunden oder Tage. „Zusammen wirken” bedeutet in diesem Zusammenhang somit, dass noch immer ausreichend pharmakologisch aktive Spiegel des Antikrebs-Mittels im Gewebe anwesend sind. Entsprechend stellt die Erfindung in einem weiteren Aspekt erfindungsgemäße Nanopartikel zur Anwendung in einem Verfahren für die Prophylaxe und/oder zur Behandlung von Tumorerkrankungen bereit, wobei die Nanopartikel zusammen mit Antikrebs-Mitteln auf solche Art und Weise verabreicht werden, dass die Nanopartikel und das Antikrebs-Mittel gleichzeitig innerhalb des Körpers des Patienten anwesend sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Agglomerate der erfindungsgemäßen Nanopartikel komplexiert mit oder kovalent gekoppelt an ein aktivpharmazeutisches Mittel oder an ein Zielfindungsmittel wie beispielsweise an im Stand der Technik bekannte Antikörper, Antikörperfragmente oder Liganden. Zum Beispiel wird die Kopplung von aktiven Wirkstoffen und/oder Liganden an Nanopartikel in Jordan et al. (2008), Gao et al. (2011), Waldöfner und Stief (2011) und Ivkov et al. (2005) beschrieben.
  • Andere geeignete pharmazeutische oder Medizinprodukt-Formen als Suspensionen der erfindungsgemäßen Nanopartikelagglomerate sind Pulver, z. B. zur Inhalation, oder Lyophilisate, die vor der Infusion oder Injektion rekonstituiert werden können, oder Implantate umfassend Nanopartikelagglomerate gemäß dieser Erfindung, z. B. solide oder gelähnliche Medizinprodukte, Schwämme oder Filme, wie zum Beispiel in Jordan (2009) genauer beschrieben.
  • Generell können die Arzneimittel oder Medizinprodukte gemäß dieser Erfindung einfach mit den konventionellen Therapien wie Chemotherapie oder Bestrahlung, die in der entsprechenden Behandlung oder Prophylaxe der Erkrankung zur Anwendung kommen, kombiniert werden. Sie können entweder zur Erhöhung der Effektivität der einzelnen Behandlung und/oder zur Verminderung der Nebenwirkungen der konventionellen Therapie mittels Absenkung derer Dosis verwendet werden, wenn diese mit den Arzneimittel oder den Medizinprodukten dieser Erfindung kombiniert werden.
  • Im Licht der vorangegangenen allgemeinen Diskussion dienen die nachfolgenden, spezifischen Abbildungen und Beispiele lediglich der Veranschaulichung und sind nicht dafür bestimmt, die Bandbreite der Erfindung zu begrenzen. Andere generische und spezifische Konfigurationen werden den Fachleuten geläufig sein.
  • Abbildungen
  • : Transmissionselektronenmikrograph einer 2 molaren (M) Suspension von magnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln hergestellt gemäß Beispiel 1.
  • : Die Viskosität von drei unterschiedlichen Eisenoxid-Nanopartikel-Präparationen gemäß Beispiel 1 wurde mittels Rotationsrheometrie gemäß Beispiel 8 bestimmt. Die Scherviskosität in Pa·s ist in Abhängigkeit von der Scherrate in/s für AS1 (6 M Fe) [gefüllte Rauten], AS2 (3 M Fe) [offene Kreise] und AS1 (2 M Fe) [gefüllte Quadrate] dargestellt.
  • : Die SAR von drei unterschiedlichen Nanopartikel-Präparationen gemäß Beispiel 1 wurde gemäß Beispiel 5 bestimmt. Die SAR in W/g Fe ist in Abhängigkeit der Wechselmagnetfeldstärke in kA/m für AS1 (6 M Fe) [gefüllte Rauten], AS2 (3 M Fe) [offene Kreise] und AS1 (2 M Fe) [gefüllte Quadrate] dargestellt.
  • Beispiele
  • 1. Herstellung von beschichteten magnetische Eisenoxid-Nanopartikeln
  • 1.1 Mittels Fällung von Eisenoxid aus Eisensalz-Lösungen (AS1 und AS2)
  • Fällung und Waschen: NaOH wird in einen Glaskolben eingewogen, wird in gereinigtem Wasser zu einer Konzentration von 2,13 M gelöst und nachfolgend auf 25°C gekühlt. Fe(III)-Chlorid und Fe(II)-Chlorid (Verhältnis 2:1) werden in eine Glasflasche gefüllt und in gereinigtem Wasser gelöst, um eine 0,48 M Fe(III)-Chloride/0,24 M Fe(II)-Chloride Lösung zu erhalten. Die Eisenchloridlösung wird in die NaOH-Lösung gegossen und während einer Zeitspanne von ungefähr 53 min gemischt, während die Temperatur konstant bei 25°C gehalten wird. Die generierten Nanopartikel werden der Sedimentation überlassen und der Überstand wird verworfen. Die Nanopartikel werden mit entgastem Wasser gewaschen bis der Überstand eine Leitfähigkeit von < 5 mS/cm erreicht.
  • Optional wird die NaOH-Lösung in die Eisenchlorid-Lösung während einer Zeitspanne von ungefähr 39 min bei 15°C gegossen (anstatt umgekehrt). Diese Modifikation des Verfahrens wurde für die AS2-Nanopartikel durchgeführt.
  • Beschichtung und Zerkleinerung:
  • Die oben beschriebene Nanopartikelsuspension wird mit verdünnter HCl auf einen pH zwischen 2,5 und 3,0 eingestellt. Anschließend wird der Kolben in ein Ultraschallbad gestellt und mit Ultraschall bei 45 kHz für eine Stunde unter Rühren behandelt. Nun wird tropfenweise über eine Zeit von 90 min 3-(2-Aminoethylamino)propyltrimethoxysilane (Fluka, 48 ml pro 1,2 l Nanopartikelsuspension) zugegeben, während der pH durch tropfenweise Zugabe von Essigsäure unter dem Grenzwert von 5,5 gehalten wird, wobei der pH nicht unter 5,0 gehen sollte. Nach diesem Schritt wird der pH mit verdünnter HCl auf 4,65 eingestellt und die Suspension wird für weitere 23 Stunden mit Ultraschall behandelt. Partikel, die mittels dieses Protokolls (ohne die optionalen Schritte) hergestellt wurden, wurden als AS1-Nanopartikel bezeichnet.
  • Optional werden die Nanopartikel vor dem Beschichten für zwei Tage mit H2O2 behandelt, um eine feinere Dispersion der Nanopartikel und eine bessere kolloidale Stabilität zu erhalten. Ferner bewirkt H2O2, dass das Eisen unter kontrollierten Bedingungen vollständig zu Fe2O3 oxidiert wird und deswegen nachfolgende Reaktionsschritte in Abwesenheit von Schutzgas (wie z. B. Argon) durchgeführt werden können. Dieser optionale Schritt wurde für die oben stehenden AS2-Nanopartikel durchgeführt.
  • Dialyse: Die Suspension wird mit einer Blutdialyse-Patrone (Fresenius F8 HPS) gegen entgastes Reinstwasser gereinigt, bis eine Leitfähigkeit von 400 μS/cm erreicht ist.
  • Zentrifugation and Konzentration: Eine Hälfte der resultierenden Suspension wird in einen Zentrifugenbecher gefüllt und für 10 min bei 2.000 rpm zentrifugiert. Als nächstes wird der Überstand durch einen plissierten Filter (12–25 μm) in eine Glasflasche gefüllt, die zuvor für 5 min mit Argon gespült wurde. Das Verfahren wird mit der zweiten Hälfte der Suspension identisch wiederholt. Danach wird die Nanopartikelsuspension mit einem Rotationsverdampfer bis zu der gewünschten Fe-Konzentration aufkonzentriert (z. B. 112 mg/ml Fe entsprechen 2 M Fe, 168 mg/ml Fe entsprechen 3 M Fe, oder 335 mg/ml Fe entsprechen 6 M Fe). Die Nanopartikelproben können bezüglich Feststoffgehalt und Fe-Konzentration analysiert werden.
  • 1.2 Mittels thermischer Spaltung von Eisenkomplexen (AS4 und AS5)
  • AS4-Partikel wurden ähnlich zu den in Waldoefner und Stief (2011) beschriebenen Verfahren hergestellt. Zusammengefasst wurden Eisen(III)-chlorid Natriumacetat, Diaminohexan und Ethylenglykol in einer dreihalsigen Flasche vereint und gerührt, bis eine homogene Lösung erhalten wurde. Anschließend wurde das Gemisch bis nahe der Siedetemperatur stark erhitzt und für fünf Stunden unter Rückfluss erhitzt. Nach Waschen und Sammeln der Partikel mittels Zentrifugation wurden die getrockneten Partikel mit Trimehylenoxid in Ethylenglykol gemischt und auf 130°C erhitzt und für 2 h so belassen. Dann wurde das Gemisch unter Rückfluss für 1 h erhitzt. Für den folgenden Oxidationsschritt wurden die gewaschenen Partikel in Salpetersäure resuspendiert und mit Eisennitrid behandelt. Nach Waschen und Sammeln der Partikel mittels Zentrifugation wurden die Partikel anschließend mit einem Tetraalkoxysilan beschichtet, um eine dicke SiO2-Hülle zu formen. Daraus hervorgegangene Partikel wurden mittels Zentrifugation gesammelt und in Wasser resuspendiert. Die finale Beschichtung, Zerkleinerung und Reinigung (Dialyse, Zentrifugation und Konzentrierung) kann auf die gleiche Art durchgeführt werden wie oben stehend für die AS1-Partikel beschrieben ist.
  • AS5-Partikel wurde ähnlich zu den von Guardia et al. (Guardia et al. 2010 a; Guardia et al. 2010 b; Guardia et al. 2012) beschriebenen Verfahren hergestellt.
  • Eine Lösung von Eisen(III)-acetylacetonat und Decansäure in Debenzylether wurde rasch bis auf 200°C unter Rühren erhitzt. Dann wurde das Gemisch für 2 h bei dieser Temperatur gerührt und innerhalb von 15 min auf 298°C erhitzt. Diese Temperatur wurde für eine weitere Stunde gehalten. Abschließend hat man die Suspension bis auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
  • Dann wurde Azeton zu dem Gemisch hinzugegeben und das Präzipitat wurde luftgetrocknet. Die Partikel wurden in Wasser resuspendiert. Die finale Beschichtung, Zerkleinerung und Reinigung kann auf die gleiche Art durchgeführt werden wie oben stehend für die AS1-Partikel beschrieben ist.
  • 2. Eisenkonzentrations-/Feststoffgehalt-Bestimmung
  • Die Bestimmung der Eisenkonzentration innerhalb einer Suspension basiert auf der photometrischen Messung der Extinktion eines Eisen(II)-Phenanthrolin-Komplexes. Der Komplex wird durch Aufschluss der Nanopartikel mit Salzsäure hergestellt bis dass der Aufschluss vollständig ist, was mittels visueller Beobachtung bestimmt wird. Das gesamte enthaltene Eisen wird mittels Hydroxylamin-Hydrochlorid zu Eisen(II) reduziert und in Essigsäure/Azetat-Puffer in den Phenanthrol in-Komplex umgewandelt. Die Extinktion des Komplexes wird bei 513 nm mittels eines Shimadzu UV-1700 Pharmaspec gegen einen Eisen(II)-Ethylendiammoniumsulfat-Standard (Merck, Darmstadt) gemessen.
  • Der Feststoffgehalt einer Suspension wird mittels Wiegen von z. B. 1 ml der Suspension vor und nach Verdampfen des Lösungsmittels (z. B. Wasser) bestimmt.
  • 3. Größenbestimmung der Partikel
  • Um die mittlere Größe der Nanopartikel zu messen, wird ein Streulicht-Verfahren zur Bestimmung der hydrodynamischen Größe der Nanopartikelpräparation angewandt (z. B. Malvern ZetaSizer 3000 HSA oder Malvern Zetasizer ZS). Der primäre Parameter ist der durchschnittliche Z-Wert (z-average value), der durch die Streuungsintensität gewichtet ist. Somit werden im Fall einer polydispersen Verteilung größere Nanopartikel stärker gewichtet als kleinere. Ferner bestimmt dieses Verfahren die durchschnittliche Größe der Nanopartikel-Agglomerate und nicht die Größe der einzelnen primären Nanopartikel.
  • Prinzip: Wenn die Nanopartikel oder Moleküle mit einem Laser bestrahlt werden, dann schwankt die Intensität des gestreuten Lichts mit einer Rate, die von der Größe der Nanopartikel/Agglomerate abhängt, da kleinere Nanopartikel durch die Lösungsmittelmoleküle weiter „gestoßen” werden und sich schneller bewegen. Die Analyse dieser Intensitätsschwankungen liefert die Geschwindigkeit der Brown'schen Bewegung und somit mittels der Stokes-Einstein Beziehung die Nanopartikelgröße.
  • Verfahren: Ein kleiner Teil der Testsubstanz wird abhängig von seiner Konzentration verdünnt (1:1000 bis zu 1:3000). Eine Probe der verdünnten Suspension wird in das Messgerät gestellt und gemäß der Empfehlungen des Malvern ZetaSizer 3000 HSA behandelt.
  • 4. Zeta-Potential-Messung
  • Um das Zeta-Potential der Nanopartikel zu messen, wird eine Probe für 30 Sekunden (sec) gevortext. 75 ml einer 1:1000 Verdünnung der Lösung mit einer Konzentration von ungefähr 0,11 mg/ml bezogen auf Fe (oder ein anderes Metall) in Reinstwasser wird hergestellt und für 15 min mit Ultraschall behandelt. 20 ml der Lösung werden in die Messzelle des Malvern ZetaSizer 3000 HSA (oder des Malvern ZetaSizer Nano ZS) injiziert und entsprechend den Empfehlungen des Herstellers gemessen. Der pH-Wert der Lösung wir in einem getrennten pH-Meter bestimmt.
  • 5. SAR-Messung
  • Die SAR der Probe von Beispiel 1 wurde gemäß dem von Jordan et al. (1993) entwickelten Verfahren bei einer Frequenz von 100 kHz und einer Feldstärke von bis zu 3,5 kA/m bestimmt. Die Ergebnisse für 3,5 kA/m und höheren Feldstärken sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1: Spezifische Absorptionsrate
    Feldstärke in W/g bei 100 kHz SAR
    AS1 112 mg/ml Fe 3,5 3,5
    AS1 112 mg/ml Fe 7,5 9,45
    AS2 168 mg/ml Fe 3,5 4,0
    AS2 168 mg/ml Fe 6,0 8,56
    AS1 335 mg/ml Fe 6,0 7,22
    AS4 112 mg/ml Fe 3,0 4,02
    AS4 112 mg/ml Fe 4,0 15,69
    AS5 112 mg/ml Fe 6,0 11,99
  • SAR-Durchschnittswerte von mehreren Herstellungsläufen von AS1- und AS2-Nanopartikeln bei unterschiedlichen Wechselmagnetfeldstärken sind in dargestellt.
  • 6. Transmissionselektronenmikroskopie
  • Elektronenmikroskopie von Nanopartikeln können mittels TEM-Analyse in Analogie zu dem von Jordan et al. (1996, Seite 712, 3.2.2) beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
  • Eine 2 M Suspension von magnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln, die gemäß des Verfahrens nach Beispiel 1 hergestellt wurde, wurde mittels TEM analysiert. Das resultierende Mikroskopbild ist als dargestellt. Auf dem Mikroskopbild sind große Agglomerate von Nanopartikeln (ein einzelnes Nanopartikel wird durch einen Pfeil gezeigt) zu sehen. Es können keine einzelnen Nanopartikel innerhalb des dargestellten Bereichs beobachtet werden – alle Nanopartikel sind an andere angehängt.
  • 7. Spezifikationen der Suspension
  • Ein Herstellungslauf gemäß Beispiel 1 führte zu den physikalischen/chemischen Spezifikationen, wie diese in Tabelle 2 dargestellt sind. Tabelle 2: Spezifikationen einer repräsentativen Charge
    AS1 AS4 AS5
    Partikelgröße (z-average) 89 nm 179.6 180.8 nm
    Zeta-Potential 53.5 mV 47.8 mV 42.5 mV
    Leitfähigkeit (25°C) 2.16 mS/cm 0.90 mS/cm -
    pH (25°C) 5.28 4.38 -
    Osmolalität 0.03 Osmol/kg 0.08 Osmol/kg -
    SAR (bei 100 kHz, 7.5 kA/m) 10 W/g Fe (7.5 kA/m) 14 W/g Fe (4 kA/m) 12 W/g Fe (6 kA/m)
    Gesamt-Eisengehalt (Fe) 15 Gewichts-% 18% Gewichts -
    Konzentration (Fe) 1.99 mol/l 1.70 mol/l 1.88 mol/l
  • 8. Rotationsrheometrie/Viskositätsmessung
  • Die Viskosität der Nanopartikelproben wurde durch Malvern-Materialcharakterisierungsdienstleistungen unter Verwendung von Rotationsrheometrie bei 20°C ermittelt, wobei die Scherviskosität (in Pa·s) in Abhängigkeit von der Scherrate (von 7 bis 1500/s) bestimmt wurde. Die Ergebnisse für die Nanopartikelpräparationen nach Beispiel 1 sind in gezeigt.
  • 9. Depotbildung von magnetischen Flüssigkeiten in vivo
  • 1 × 106 Tumorzellen der C3H RS1 Mammakarzinom-Zellline wurden in die rechte hintere Gliedmaße von Mäusen des Stammes C3H-HeN (Harlan Laboratories, Borchen) injiziert. Sobald die gesetzten Tumore ein Volumen von 0,57 bis 0,85 cm3 hatten, wurden die Tiere randomisiert (15 Tiere pro Gruppe) und die Tumore der rechten hinteren Gliedmaße mit Magnetflüssigkeit des Beispiels 1 injiziert, wobei diese eine Fe-Konzentration von entweder 112 oder 335 mg/ml hatte. Der genaue Gehalt des Injektionsvolumens wurde durch Wiegen der Injektionsspritze vor und nach Injektion und Berechnen der Differenz (im Durchschnitt 31 μl ± 5.8 μl) ermittelt.
  • Der gesamte Fe-Gehalt des Gewebes/Tumors der Mäuse wurde nach 0 oder 7 Tagen durch UV-vis Messung bei 565 nm mittels des Spektroquant 14761 Test (Merck, Darmstadt) und einem Cary 50 (Agilent Technologies, Santa Clara, Ca, USA) und einem Tecan Infinite M 200 (Tecan Group Ltd, Männedorf, Schweiz) Spektrometer bestimmt. Der ursprünglich verabreichte Fe-Gehalt wurde durch Subtrahieren des ursprünglichen Fe-Gehalts des Gewebes (bestimmt durch Messung des Fe-Gehalts des nicht-okulierten linken Beins) und des Verlusts an Magnetflüssigkeit während der Inokulation, die durch den verwendeten Tupfer aufgesaugt wurde, vom gesamten Fe-Gehalt des Gewebes/Tumors berechnet. Die Fe-Wiederfindunq (Durchschnitt von 15 Tumoren pro Gruppe) wurde als Gesamt-Fe-Gehalt, geteilt durch den ursprünglich verabreichten Fe-Gehalt, berechnet. Tabelle 3: Fe-Wiederfindung wie bestimmt mittels Cary 50
    Cary Fe-Wiederfindung Tumor [%] Fe-Wiederfindung Lunge/Leber/Milz [%] Fe-Wiederfindung Tumor/Lunge/Leber/Milz [%]
    112 mg/ml Fe Tag 0 90 14 104
    Tag 7 86 10 96
    335 mg/ml Fe Tag 0 95 3 98
    Tag 7 96 3 99
    Tabelle 4: Fe-Wiederfindung wie bestimmt mittels Tecan Infinite M 200
    Tecan Fe-Wiederfindung Tumor [%] Fe-Wiederfindung Lunge/Leber/Milz [%] Fe-Wiederfindung Tumor/Lunge/Leber/Milz [%]
    112 mg/ml Fe Tag 0 95 16 111
    Tag 7 93 13 106
    335 mg/ml Fe Tag 0 98 4 102
    Tag 7 98 4 102
  • Unter Berücksichtigung des ursprünglichen Fe-Gehalts (wie im linken Bein bestimmt) und der Verluste aufgrund der kleineren Inokulationsvolumen der Magnetflüssigkeit waren die Wiederfindungsraten des Gesamt-Fe im Durchschnitt für alle vier Gruppen 99% für den Cary 50 und 104% für den Tecan Infinite M 200. Generell waren die Wiederfindungszahlen für den Tecan Infinite M 200 (Tabelle 4) gegenüber dem Cary 50 (Tabelle 3) höher.
  • Vergleicht man die Fe-Wiederfindung zwischen der 112 mg/ml Fe-Formulierung mit der 335 mg/ml Fe-Formulierung, so zeigten beide Bestimmungen eine Tendenz, dass am Tag 0 für die 335 mg/ml Formulierung mehr Fe-Nanopartikel innerhalb des Tumor zurückgehalten wurden (95% gegenüber 90% bestimmt mit Cary, und 98% gegenüber 95% bestimmt mit Tecan). Auf der anderen Seite waren die Mengen an Fe-Nanopartikeln, die in anderen Geweben (Lunge, Leber und Milz) gefunden wurden, am Tag 0 für die 112 mg/ml Fe-Formulierung deutlich höher (14%/16% für 112 mg/ml gegenüber 3%/3% für 335 mg/ml). Somit kann gefolgert werden, dass bei der niedriger konzentrierte Formulierung mehr Fe-Nanopartikel während und möglicherweise unmittelbar nach Verabreichung innerhalb des Tages 0 aus dem Tumor ausgewaschen werden als bei der höher konzentrierten Formulierung.
  • Um die Rate des Fe zu bestimmen, das nach 7 Tagen innerhalb des Tumors verbleibt, im Vergleich mit dem Fe, das effektiv am Tag 0 dem Tumor verabreicht worden war, wurden die Fe-Wiederfindungsraten am Tag 0 durch die Fe-Wiederfindungsraten am Tag 7 dividiert und zwischen den Bestimmungen durch den Cary 50 und den Tecan infinite M 200 gemittelt (Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt). Ebenso wurde der Verbleib des Fe, das am Tag 0 in Lunge, Leber und Milz angesammelt war, analysiert, in dem die Menge mit dem Fe verglichen wurde, welches am Tag 7 in diesen Organen war. Tabelle 5: Verbleibendes Fe innerhalb des Tumors/der Organe nach 7 Tagen (Verhältnis zwischen Tag 0 und Tag 7, gemittelt zwischen Cary und Tecan)
    verbleibendes Fe Tumor [%] verbleibendes Fe Lung/Leber/Milz [%]
    112 mg/ml Fe 97% 75%
    335 mg/ml Fe 101% 100%
  • Während es für die 112 mg/ml Fe-Formulierung einen weiteren Verlust von ungefähr 3% Fe von Tag 0 zu Tag 7 gab, blieb der Fe-Gehalt für die 335 mg/ml Fe-Formulierung während dieses Zeitfensters konstant. interessanterweise verschwand für die 112 mg/ml Fe-Formulierung innerhalb einer Woche ungefähr ¼ des Fe, das seinen Weg in Lunge, Leber oder Milz gefunden hatte, während für die 335 mg/ml Formulierung das gesamte Fe, das an Tag 0 in diesen Organen gefunden wurde, an Tag 7 dort verblieben war (jedoch muss man berücksichtigen, dass die Gesamtmenge des Fe, das in diesen Organen gefunden wurde, für die 335 mg/ml Fe-Formulierung insgesamt nur ungefähr ¼ der Menge Fe war, die in diesen Organen für die 112 mg/ml Formulierung gefunden worden war, siehe Tabelle 3 und, Spalte ”Fe-Wiederfindung Lunge/Leber/Milz”).
  • Entsprechend zeigt die höher konzentrierte Nanopartikel-Formulierung zusätzlich eine verbesserte Verbleibquote von Nanopartikeln innerhalb des Tumors über einen Zeitraum von 7 Tagen, was von großer Bedeutung ist, wenn Patienten mehreren Magnetfeldbehandlungen über Wochen und Monate unterzogen werden.
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Claims (20)

  1. Zusammensetzung enthaltend Agglomerate von magnetischen Alkoxysilan-beschichteten Metallnanopartikeln, dadurch gekennzeichnet, dass die Agglomerate eine mittlere Größe von 30 bis 450 nm aufweisen, wie mittels Streulichtmessung bestimmt, und dass das Zeta-Potential der Metallnanopartikel 25 bis 80 mV bei einem pH von 5,2 und einer Leitfähigkeit von 2,0 mS/cm beträgt.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Agglomerate eine mittlere Größe von 50 bis 350 nm, bevorzugt eine mittlere Größe von 70 bis 300 nm aufweisen, wie mittels Streulichtmessung bestimmt.
  3. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung im Wesentlichen frei von organischen Lösungsmitteln ist.
  4. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallnanopartikel einen Metallkern mit einer Größe von 5 bis 25 nm, bevorzugt mit einer Größe von 7 bis 20 nm und insbesondere bevorzugt mit einer Größe 9 bis 15 nm aufweisen, wie mittels Elektronenmikroskopie bestimmt.
  5. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallnanopartikel Eisen, Eisenkomplex-Verbindungen, Eisenkarbonyl-Verbindungen oder Eisensalze, bevorzugt Eisensalze, umfassen.
  6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Eisensalz ein Eisenoxid, bevorzugt Magnetit und/oder Maghemit, ist.
  7. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Zeta-Potential der Metallnanopartikel 35 bis 70 mV, bevorzugt 45 bis 60 mV, bei einem pH von 5,2 und einer Leitfähigkeit von 2.0 mS/cm beträgt.
  8. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Agglomerate in einem wasserbasierten, physiologisch akzeptablen Puffer suspendiert sind.
  9. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel eine Konzentration von mindestens etwa 2 M, bevorzugt von mindestens etwa 3 M, stärker bevorzugt von mindestens etwa 4 M, noch stärker bevorzugt von mindestens etwa 5 M und insbesondere bevorzugt von mindestens etwa 6 M aufweisen, wie anhand ihres Metallgehaltes bestimmt.
  10. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Viskosität der Zusammensetzung bei einer Scherrate von 100/s gleich oder größer als 0.005 Pa·s ist, bevorzugt gleich oder größer als 0.01 Pa·s, stärker bevorzugt gleich oder größer als 0.1 Pa·s, und insbesondere bevorzugt gleich oder größer als 1 Pa·s, wie mittels Rotationsrheometrie bestimmt.
  11. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die spezifische Absorptionsrate (SAR) der Nanopartikel in der Zusammensetzung größer oder gleich 2 W/g Me ist, bevorzugt größer oder gleich 3 W/g Me und insbesondere bevorzugt 4 bis 12 W/g Me ist, wie bei einer magnetischen Feldstärke von 3,5 kA/m und einer Frequenz von 100 kHz bestimmt.
  12. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nach Injektion der Zusammensetzung in ein isogenes Tumormodell am oder nach Tag 7 nach der Injektion mindestens 90%, bevorzugt mindestens 93%, stärker bevorzugt mindestens 95%, und insbesondere bevorzugt mindestens 98% des applizierten Metalls innerhalb des injizierten Tumors verbleibt.
  13. Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass diese durch ein Verfahren zum Herstellen einer Suspension von Agglomeraten von magnetischen Alkoxysilan-beschichteten Metallnanopartikel erhältlich ist, bei dem eine wässrige Suspension von magnetischen Metallnanopartikeln mit Alkoxysilan inkubiert wird, wobei die Inkubation im Wesentlichen in der Abwesenheit eines organischen Lösungsmittels durchgeführt wird, wobei das Alkoxysilan Trialkoxysilan ist und wobei 0,3 bis 0,6 × 10–3 Mol Trialkoxysilan pro 0.9 Mol Metal hinzugefügt wird.
  14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass diese durch die Merkmale nach einem der Ansprüche 1 bis 12 definiert ist.
  15. Suspension von Agglomeraten von magnetischen Alkoxysilan-beschichteten Metallnanopartikel, dadurch gekennzeichnet, dass diese durch ein Verfahren zum Herstellen einer Suspension von Agglomeraten von magnetischen Alkoxysilan-beschichteten Metallnanopartikel erhältlich ist, bei dem eine wässrige Suspension von magnetischen Metallnanopartikeln mit Alkoxysilan inkubiert wird, wobei die Inkubation im Wesentlichen in der Abwesenheit eines organischen Lösungsmittels durchgeführt wird, wobei das Alkoxysilan Trialkoxysilan ist und wobei 0,3 bis 0,6 × 10–3 Mol Trialkoxysilan pro 0.9 Mol Metal hinzugefügt wird.
  16. Zusammensetzung nach Anspruch 13 oder Suspension nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Suspension von Metallnanopartikeln bereitgestellt wird a) durch Fällung einer Lösung enthaltend eine Mischung von Eisen(III)-Chlorid und Eisen(II)-Chlorid mit Natriumhydroxid, oder b) durch thermische Spaltung eines Eisensalzes oder einer Eisenkomplex-Verbindung.
  17. Zusammensetzung oder Suspension nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass diese in einem Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung einer Proliferationserkrankung, Krebs, Tumoren, Rheuma, Arthritis, Arthrose und bakterieller Infektionen in einem Patienten angewendet wird.
  18. Zusammensetzung oder Suspension zur Anwendung in einem Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass in diesem Verfahren der Patient einem Wechselmagnetfeld ausgesetzt wird.
  19. Medizinprodukt, dadurch gekennzeichnet, dass dieses eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder eine Suspension nach Anspruch 15 enthält.
  20. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, dass dieses eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder eine Suspension nach Anspruch 15 enthält.
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