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Die
Erfindung betrifft Assay-Vorrichtungen zur Bestimmung von Immunglobulinen
E – IgE bzw. sIgE (spezifisches IgE, Allergen-spezifisches
IgE) – in Schnelltests zur qualitativen Bestimmung von
Total-IgE in humanem Serum oder Plasma bzw. von sIgE in Vollblut,
Serum oder Plasma. Die als Allergy-Lateral-Flow-Assay (ALFA) konzipierten
Vorrichtungen sind für einen Suchtest konzipiert, der dem Anwender
die Möglichkeit geben soll, einen Allergie-Test sehr schnell
und eindeutig durchführen zu können. Durch die
Auswahl geeigneter Allergenlösungen wird eine Symptom-basierte
Allergie-Diagnostik ermöglicht.
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Die
Häufigkeit von Allergien hat in den letzten Jahrzehnten
weltweit stark zugenommen. Unter Allergien versteht man krankhafte
Immunreaktionen vom Typ I (Soforttypreaktion), deren Symptome im Allgemeinen
innerhalb von 30 bis 60 min auftreten. Als Krankheitsanzeichen sind
unter anderem zu nennen: Heuschnupfen (Rhinitis), Bindehautentzündung (Konjunktivitis),
Nesselsucht (Urtikaria), allergisches Asthma und als gefährlichste
Erscheinungsform die Anaphylaxie – der anaphylaktischer
Schock (Jörg Rinne, Jens Becker: Das 1 × 1
der Allergie. Synergia Verlag, Darmstadt 2007).
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Zu
den bekannten Methoden der Bestimmung von Analyten gehören
die Lateral Flow Assays (LFA) mit ihren Testsystemen. Ihnen liegt
das gleiche Prinzip zugrunde wie anderen immunologischen Assays
auch (etwa ELISA – Enzyme Linked Immunosorbent Assay, Enzym-Immunoassay),
da sie auf dem Effekt der Antikörper-Antigen-Reaktion beruhen.
Zusätzlich haben LFA chromatographische Eigenschaften,
da die Antikörper auf einer Membran gebunden sind und die
zu analysierende Probe durch die Kapillarkräfte über
den Teststreifen gezogen und dadurch ein schnell sichtbares Resultat
erreicht wird (Konrad Faulstich et al.: Point-of-Care Technologies; Devices
and applications for lateral-flow immunodiagnostics archive, Jul
07).
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In
der
EP 291194 (Analytisches
Testgerät) z. B. wird die Verwendung von Lateral-Flow-Assay-Vorrichtungen
zum Detektieren von Analyten in Flüssigkeitsproben vorgeschlagen
(Inhaber: Inverness Medical Switzerland GmbH, CH und Umilever NV,
NL – mit einer Familie von 61 Schutzrechten). Dieser Erfindung
zufolge fließt eine Probe auf einem Teststreifen zu Beginn durch
eine Reaktionszone, die ein markiertes spezifisches Bindungsreagenz
enthält, das innerhalb des feuchten Teststreifens frei
beweglich ist. Danach gelangt die Probe in eine stromabwärts
der Reaktionszone gelegene Testzone, die ein immobilisiertes spezifisches
Bindungsreagenz enthält, das entweder das markierte Bindungsreagens
oder den Analyten bindet. Der Teststreifen kann auch mit einem Flüssigkeitsabfluss
versehen sein, der es ermöglicht, ungebundenes Reagens
oder ungebundenen Analyten aus der Testzone auszuwaschen, wobei
stromabwärts der Testzone auch eine Kontrollzone bereitgestellt
sein kann (nach
DE
21 2005 000 034 U1 ).
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Die
Gebrauchsmusterschrift
DE
21 2005 000 034 U1 (Verbesserungen in oder in Zusammenhang mit
Lateral-Flow-Assay-Vorrichtungen; Inhaber: Inverness Medical Switzerland
GmbH, CH) selbst hat eine Assay-Vorrichtung zum Inhalt, die als ”Lateral-Flow-Immunoassay-Vorrichtung” ausgewiesen ist.
Darin geht es um die Bestimmung von Analyten in einer Probe, wobei
die Vorrichtung einen Teststreifen mit einer Lesezone umfasst, in
der das Resultat des Tests betrachtet werden kann und außerdem
ein mobiler Teil vorgesehen ist, der von einer ersten (Test-)Position
zu einer zweiten (Lese-)Position bewegbar ist.
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Andere
Beschreibungen auf der Grundlage von Lateral-Flow-Assays etwa betreffen
Verfahren und Geräte hierfür (
WO 2006/013329 A1 ),
die Teststreifen des Assays (
WO 2008/018073 A1 ), Testgeräte zur
Durchführung von spezifischen Bindungsprüfungen
EP 560410 B1 ) oder
Vorrichtungen zum Ablesen von Teststreifen
EP 653625 B1 ).
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Der
Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen verbesserten Allergie-Test
(Suchtest) zur Verfügung zu stellen. Die Aufgabe wurde
erfindungsgemäß durch Schnelltests zur qualitativen
Bestimmung von Immunglobulinen (Ig) E gelöst, der sowohl
eine Messung von Total-IgE in humanem Serum bzw. Plasma als auch
von sIgE (spezifischem IgE, Allergen-spezifischem IgE) in Vollblut,
Serum oder Plasma ermöglicht.
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Dazu
ist eine als Allergy-Lateral-Flow-Assay (ALFA) konzipierte Vorrichtung
entwickelt worden, die sich aus Allergenlösungen (Screens)
und aus einem ALFA-Basis-Set als Basiseinheit mit einer gebrauchsfertigen
Testeinheit aus Kassetten zusammensetzt.
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Der
qualitativen Bestimmung von Total-IgE liegen folgende Erkenntnisse
zugrunde:
Allergische Reaktionen vom Soforttyp (Typ I-Allergie) werden
durch Allergen-spezifische Immunglobuline der Klasse E (IgE) vermittelt.
Die normale Serumkonzentration von IgE ist altersabhängig
und erreicht den höchsten Wert im Alter von 6 bis 15 Jahren.
In vielen Fällen geht das Auftreten von Allergen-spezifischem IgE
mit einem deutlichen Anstieg der Gesamt-IgE-Konzentration im Blut
der Patienten einher.
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Das
Testprinzip besteht in einer Kombination aus einer Testeinheit – dem
ALFA Total IgE Basis Set – mit einer Anti-IgE-Lösung
(näheres im Beispiel 1 der Ausführungsbeispiele).
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Die
erfindungsgemäße qualitative Bestimmung von Allergen-spezifischem
IgE (sIgE, spezifisches IgE) erfolgt in humanem Vollblut, Serum
oder Plasma. Der Bestimmungsmethode liegt eine als Allergy-Lateral-Flow-Assay
(ALFA) konzipierte Vorrichtung für einen Suchtest zugrunde,
der dem Anwender die Möglichkeit gibt, einen Allergie-Test
schnell und eindeutig durchführen zu können. Durch
die Auswahl geeigneter Allergenlösungen wird eine Symptombasierte
Allergie-Diagnostik ermöglicht.
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Die
auslösenden Allergene der Typ I-Reaktion gehören
bis auf wenige Ausnahmen zur Gruppe der Proteine und stammen meist
aus der natürlichen Umwelt, wie z. B. aus Pflanzen-Pollen,
Tierhaaren, Nahrungsmitteln, Milben oder Insektengiften. Ein charakteristisches
Merkmal einer Typ I-Allergie ist die Beteiligung von allergenspezifischen
Immunglobulinen (Antikörpern) der Klasse E (sIgE). Der
Nachweis von sIgE ist daher ein wesentlicher Bestandteil der gegenwärtigen
Allergiediagnostik. Das erfindungsgemäße Testprinzip
besteht in einer Kombination aus einer Testeinheit – dem
ALFA Basis Set als Einfach- und Achtfachkassete – mit variabel
einsetzbaren Allergen-Lösungen (näheres im Beispiel
2 der Ausführungsbeispiele).
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Die
Auswertung der Testergebnisse erfolgt anhand eines Testschemas (1),
das aus einem Probenauftrags- (S) und einem Auswertefenster (TC) mit
einer Testlinie (T) und einer Kontrolllinie (C) besteht.
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Für
die Testung wird das Probenmaterial in die Probenauftragsstelle
S des Basis Set pipettiert und direkt anschließend die
gewünschte Allergenlösung zugegeben. Während
der Inkubationszeit wird die Flüssigkeit aufgrund von Kapillarkräften
durch die Testeinheit gezogen. Dabei bindet das sIgE der Probe spezifisch
an die in der Allergenlösung enthaltenen Antigene. Die
Antigene sind markiert und werden über ein Fängermolekül
(Anti-IgE mit einem Liganden markiert) an der Test-Linie T zurückgehalten. Gleichzeitig
wird das sIgE von einem Antikörper gebunden, der an farbige
Partikel gekoppelt ist (Konjugat). Nicht-gebundenes Konjugat wird
an der Kontrolllinie C zurückgehalten und bildet innerhalb
der Inkubationszeit eine dunkel gefärbte Linie aus.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von
Immunglobulinen E besteht darin, dass ein Allergy-Lateral-Flow-Assay
(ALFA) eingesetzt wird, der sich aus Allergenlösungen (Screens) und
aus einem ALFA-Basis-Set als Basiseinheit mit einer gebrauchsfertigen
Testeinheit aus Kassetten zusammensetzt. Bei den Immunglobulinen
handelt es sich um IgE oder um sIgE und bei den Allergenlösungen
um solche aus Serum, Plasma oder Vollblut.
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Durch
die Auswahl der Allergenlösungen wird es überraschenderweise
möglich, dass die Testmethode Symptom- und Patienten-spezifisch
durchgeführt werden kann.
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Unter
anderem sind folgende Einzelallergene und Allergen-Mischungen bestimmbar:
Milben
(D. pter., d1; D. farinae, d2), Birke (t3), Lieschgras (g6), Katze
(e1), Hund (e5), Alternaria alternata (m6).
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Der
saisonaler Screen betrifft Hundszahngras (g2), Lolch (g5), Lieschgras
(g6), Wiesenrispengras (g8), Roggen (g12), Alternaria alternata
(m6), Birke (t3), Beifuß (w6).
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Der
perennialer Screen bezieht sich auf Milben (D. pter., d1; D. farinae,
d2), Katze (e1), Hund (e5), Aspergillus fumigatus (m3), Aspergillus
niger (m33).
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Der
erfindungsgemäße Test zeichnet sich aus durch
- • eine kurze Testdauer (Resultat nach
20 min)
- • die Verwendbarkeit von Serum, Plasma und von Vollblut
- • eine hervorragende Übereinstimmung mit dem Skin
Prick-Test und anderen in-vitro sIgE-Testmethoden.
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Die
Merkmale der Erfindung gehen aus den Elementen der Ansprüche
und aus der Beschreibung hervor, wobei sowohl einzelne Merkmale
als auch mehrere in Form von Kombinationen vorteilhafte Ausführungen
darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt
wird. Das Wesen der Erfindung besteht in einer Kombination aus bekannten
(Lateral Flow Assay, Bestimmung von IgE) und neuen Elementen (Allergy
Lateral Flow Assay, Verwendung auch von Vollblut, Bestimmung von
sIgE), die sich gegenseitig beeinflussen und in ihrer neuen Gesamtwirkung
einen Gebrauchsvorteil und den erstrebten Erfolg ergeben, der darin
liegt, dass die erfindungsgemäßen Assay-Vorrichtungen
einen sehr schnellen und eindeutigen Allergie-Test und eine Symptom-basierte
Allergie-Diagnostik ermöglichen.
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Die
Sensitivität und Spezifität des Allergy-Lateral-Flow-Assay
(ALFA) wurde gegen verschiedene in-vitro-diagnostische Testmethoden
(Immuno CAP® und ALLERG-O-LIQ)
ermittelt.
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Die
Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher
erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt
zu sein.
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Ausführungsbeispiele
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Beispiel 1: Qualitative Bestimmung von
Total IgE in humanem Serum oder Plasma
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Allergische
Reaktionen vom Soforttyp (Typ I Allergie) werden durch Allergen-spezifische
Immunglobuline der Klasse E (IgE) vermittelt. Die normale Serumkonzentration
von IgE ist altersabhängig und erreicht den höchsten
Wert im Alter von 6 bis 15 Jahren. In vielen Fällen geht
das Auftreten von Allergen-spezifischem IgE mit einem deutlichen
Anstieg der Gesamt-IgE-Konzentration im Blut der Patienten einher.
In diesen Fällen kann der IgE-Spiegel im Blut um das 1000fache
ansteigen. Angegeben wird die IgE-Konzentration in IU/mL, wobei
1 IU etwa 2,4 ng IgE entspricht.
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Die
höchsten IgE-Konzentrationen (bis zu 50000 IU/mL) werden
bei Patienten mit atopischer Dermatitis gefunden. Darüber
hinaus treten erhöhte Gesamt-IgE-Spiegel auch bei Parasitosen
auf. Von der Norm abweichende Titer finden sich u. a. bei Parasiteninfektionen
und bei bestimmten Autoimmunerkrankungen.
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1.1.: Testprinzip
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ALFA
Total IgE besteht aus einer Testeinheit – dem ALFA Total
IgE Basis Set – in Kombination mit einer Anti-IgE-Lösung.
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Zur
Durchführung des Tests wird die Patientenprobe (Serum oder
Plasma) in die Probenauftragsstelle des Basis Set gegeben. Direkt
anschließend wird die Anti-IgE-Lösung ebenfalls
in die Probenauftragsstelle getropft. Während der Inkubationszeit
von 25 bis 30 min wird die Flüssigkeit durch Kapillarkraft
durch die Testeinheit gezogen. Das Anti-IgE bindet spezifisch an
das IgE der Probe. Anti-IgE ist mit einem Liganden markiert und
wird durch Fängermoleküle (Erkennungselemente
oder Bindungspartner, die immobilisiert sind) an den drei Testlinien
(TC in 1) zurückgehalten.
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Gleichzeitig
wird das an anti-IgE gebundene IgE durch ein anti-IgE-Konjugat (anti-IgE-Gold),
welches eine rote Farbe aufweist, gebunden. Die Intensität
der Farbreaktion der drei Testlinien ist proportional zur Menge
der gebundenen Immunkomplexe bestehend aus Ligand markiertem anti-IgE,
IgE, und anti-IgE Gold-Konjugat. Zur Interpretation des Ergebnisses
wird die Anzahl der sichtbaren Testlinien sowie deren Intensität
herangezogen.
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Nicht
gebundenes Konjugat wird an der Kontrolllinie (C in 1)
zurückgehalten. Nach 25 bis 30 min Inkubation entwickelt
sich dort eine dunkelrote Linie.
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1.2.: Testdurchführung
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- a. 30 μl Serum oder Plasma werden
in das Probenauftragsfenster des Basis Sets überführt.
- b. Sofort werden 2 Tropfen der Anti-IgE-Lösung in das
Probenauftragsfenster des Basis Set gegeben.
- c. Nach 25 bis 30 min kann das Testergebnis im Auswertefenster
des Basis Sets abgelesen werden.
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Der
Test muss innerhalb von 25 bis 30 min nach Testbeginn ausgewertet
werden. Eine spätere oder frühere Beurteilung
kann unter Umständen eine falsche Interpretation des Ergebnisses
zur Folge haben.
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1.3.: Auswertung der Testergebnisse
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Das
Testergebnis ist nur gültig, wenn die Kontrolllinie (C)
der Testeinheit gut sichtbar ist. Basierend auf der Anzahl der sichtbaren
Testlinien (T) und deren Intensität wird das Ergebnis von
ALFA Total IgE unter zu Hilfenahme einer Auswertekarte interpretiert.
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Beispiel 2: Qualitative Bestimmung von
Allergen-spezifischem IgE in humanem Serum, Plasma oder in Vollblut
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Allergie
Lateral Flow Assay (ALFA) ist ein Schnelltest zur qualitativen Bestimmung
von sIgE in humanem Serum, Plasma oder Vollblut. ALFA ist als Suchtest
konzipiert und soll dem Anwender die Möglichkeit geben,
einen Allergie-Test sehr schnell und unmissverständlich
durchführen zu können. Durch Auswahl geeigneter
Allergenlösungen wird eine Symptombasierte Allergie-Diagnostik
ermöglicht.
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2.1.: Testprinzip
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Das
ALFA Basis Set ist als Einfach- und Achtfach-Kassette mit variabel
einsetzbaren Allergenlösungen entwickelt worden.
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Für
die Testung wird das Probenmaterial in die Probenauftragsstelle
(S in 1) des Basis Set pipettiert und direkt anschließend
die gewünschte Allergenlösung zugegeben. Während
der Inkubationszeit von 20 min wird die Flüssigkeit aufgrund
von Kapillarkräften durch die Testeinheit gezogen. Dabei bindet
das sIgE der Probe spezifisch an die in der Allergenlösung
enthaltenen Antigene. Die Antigene sind markiert und werden über
ein Fängermolekül an der Test-Linie (T) zurückgehalten.
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Gleichzeitig
wird das sIgE von einem Antikörper, der an farbige Partikel
gekoppelt ist (Konjugat), gebunden. Dabei ist die Farb-Intensität
an der Testlinie proportional zur Menge der Immunkomplexe aus Ligand-markierten
Antigenen, sIgE und IgE-spezifischem Konjugat. Die Signalintensität
reicht dabei von hell-rosa (sehr wenig sIgE in der Probe) bis dunkel-rot
(sehr viel sIgE in der Probe).
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Nicht-gebundenes
Konjugat wird an der Kontrolllinie (C) zurückgehalten und
bildet innerhalb der Inkubationszeit eine dunkel-rote Linie aus.
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2.2.: Testdurchführung
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- a. 30 μl Serum oder Plasma oder 30 μl
Vollblut werden in das Probenauftragsfenster (S) des Basis Set überführt.
- b. Sofort werden 2 Tropfen der gewünschten Allergenlösung
in das Probenauftragsfenster des Basis Set gegeben.
- c. Nach 25 bis 30 min kann das Testergebnis im Auswertefenster
(TC) des Basis Set abgelesen werden.
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Der
Test muss innerhalb von 25 bis 30 min nach Testbeginn ausgewertet
werden. Eine spätere oder frühere Beurteilung
kann unter Umständen eine falsche Interpretation des Ergebnisses
zur Folge haben.
-
2.3.: Auswertung der Testergebnisse
-
Das
Testergebnis ist nur gültig, wenn die Kontrolllinie (C)
der Testeinheit gut sichtbar ist.
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Die
Auswertung wird anhand der Beurteilung der Testlinie (T) durchgeführt.
Dabei korreliert die Farbintensität der Testlinie mit der
Menge des in der Probe enthaltenen sIgE. Zu beachten ist:
- • Schwache Resultate sind erst nach
Ablauf von 20 min sichtbar.
- • Die Kontrolllinie ist in der Regel stärker
gefärbt ist als die Testlinie.
- • Stark-positive Resultate sind eventuell schon vor Ablauf
der Inkubationszeit sichtbar.
- • Testeinheit ins Licht halten.
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Mögliche
Testergebnisse sind:
-
- Variante 1: Testlinie (T) und Kontrolllinie (C) sind gefärbt
→ das
Testergebnis ist positiv, die Patientenprobe enthält sIgE
gegen das verwendete Allergen/die Allergenmischung
- Variante 2: Testlinie (T) ist nicht gefärbt, aber die
Kontrolllinie (C) ist gefärbt
→ das Testergebnis
ist negativ, die Patientenprobe enthält keine messbare
Konzentration von sIgE gegen das verwendete Allergen/die Allergenmischung
- Variante 3: Testlinie (T) und Kontrolllinie (C) sind nicht gefärbt
→ das
Testergebnis ist ungültig, der Test muss mit einem neuen
Basis Set wiederholt werden
- Variante 4: Testlinie (T) ist gefärbt, aber Kontrolllinie (C)
ist nicht gefärbt
→ das Testergebnis ist
ungültig, der Test muss mit einem neuen Basis Set wiederholt
werden.
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Grenzen:
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Hohe
Titer an Allergen-spezifischen IgG können sIgE maskieren.
Negative Test-Resultate können eine schwache Sensibilisierung
des Patienten gegen das untersuchte Allergen nicht ausschließen.
Die Sensitivität kann bei der Testdurchführung
mit Vollblut bei einigen Allergenen, verglichen mit der Sensitivität
von Serum oder Plasma, niedriger sein. Empfohlen wird die Testdurchführung
mit Serum oder Plasma.
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Beispiel 3: Saisonaler Screen
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Auslöser
einer Allergie im Frühjahr oder Sommer können
Allergene aus Birken-, Beifuß- oder aus Gräserpollen,
Schimmelpilze oder andere Allergene – wie Hundszahngras,
Lolch, Lieschgras, Wiesenrispengras, Roggen oder Alternaria alternata – sein,
die zu dieser Zeit durch die Luft fliegen und gegen die der Körper
allergen-spezifische Antikörper gebildet hat (Sensibilisierung).
Diese Allergene werden über die Atemwege aufgenommen. Pollen
sind nach Hausstaubmilben die zweithäufigste Ursache für
eine Allergie. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Testes
kann eine Sensibilisierung gegen diese Allergene innerhalb von 20
bis 30 min nachgewiesen werden.
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3.1: Testprinzip
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Nach
Aufgabe des Blutes und der Allergenlösung binden allergen-spezifische
Antikörper (sIgE) an die Allergene in der Lösung.
Die Allergen sind markiert und binden über diese Markierung
an die Testlinie. Ein in der Testkassette enthaltenes Konjugat (rot)
bindet das sIgE. Nach 20 bis 30 min kann das Testergebnis abgelesen
werden. Eine leicht pink bis dunkel rote Testlinie ist ein positives
Ergebnis und bestätigt den Verdacht auf eine Sensibilisierung
gegen die genannten Allergene.
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Beispiel 4: Perennialer Screen
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Auslöser
einer ganzjährigen Allergie können Allergene aus
Hausstaubmilbe, Katzen- und Hunde-Epithelien, Schimmelpilzen oder
andere Allergene – wie Aspergillus fumigatus oder Aspergillus
niger – sein, die ganzjährig durch die Luft fliegen
und gegen die der Körper allergen-spezifische Antikörper gebildet
hat (Sensibilisierung). Diese Allergene werden über die
Atemwege aufgenommen. Hausstaubmilben sind vor Pollen die häufigste
Ursache für eine Allergie. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen
Testes kann eine Sensibilisierung gegen diese Allergene innerhalb
von 20 bis 30 min nachgewiesen werden.
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4.1.: Testprinzip
-
Nach
Aufgabe des Blutes und der Allergenlösung binden alergen-spezifische
Antikörper (sIgE) an die genannten Allergene in der Lösung.
Die Allergen sind markiert und binden über diese Markierung
an die Testlinie. Ein in der Testkassette enthaltenes Konjugat (rot)
bindet das sIgE. Nach 20 bis 30 min kann das Testergebnis abgelesen
werden. Eine leicht pink bis dunkel rote Testlinie ist ein positives
Ergebnis und bestätigt den Verdacht auf eine Sensibilisierung
gegen die genannten Allergene.
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1: Testschema
ALFA
-
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- S
- Probenauftragsfenster
- TC
- Auswertefenster
- T
- Testlinie
- C
- Kontrolllinie
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - EP 291194 [0004]
- - DE 212005000034 U1 [0004, 0005]
- - WO 2006/013329 A1 [0006]
- - WO 2008/018073 A1 [0006]
- - EP 560410 B1 [0006]
- - EP 653625 B1 [0006]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Jörg
Rinne, Jens Becker: Das 1 × 1 der Allergie. Synergia Verlag,
Darmstadt 2007 [0002]
- - Konrad Faulstich et al.: Point-of-Care Technologies; Devices
and applications for lateral-flow immunodiagnostics archive, Jul
07 [0003]