Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Steuersystem für eine Vorrichtung
zur Bearbeitung einer biologischen oder nichtbiologischen Masse
nach dem Oberbegriff des Anspruches 1. Insbesondere betrifft die
vorliegende Erfindung ein Steuersystem für eine Vorrichtung zur Bearbeitung,
Separierung und/oder Gewinnung von mikroskopisch kleinen biologischen und/oder
nichtbiologischen Objekten einer biologischen oder nichtbiologischen
Masse.The
The present invention relates to a control system for a device
for processing a biological or non-biological mass
according to the preamble of claim 1. In particular, the
present invention a control system for a device for processing,
Separation and / or extraction of microscopic biological and / or
non-biological objects of a biological or non-biological
Dimensions.
Zur
Materialinjektion in lebende Zellen ist die Verwendung von sogenannten
Mikrokapillaren bekannt, die über
einen meist pneumatisch oder hydraulisch bewegten Mikromanipulator
gesteuert werden. Die gewünschten
Substanzen werden unter großer
mechanischer Belastung in die einzelne Zelle injiziert. Die Herstellung
der sterilen Mikrokapillaren ist zeitaufwendig und kostenintensiv.to
Material injection into living cells is the use of so-called
Microcapillaries known to be over
a mostly pneumatically or hydraulically moved micromanipulator
to be controlled. The desired
Substances are taking great
mechanical load injected into the single cell. The production
The sterile microcapillaries are time consuming and costly.
Aus
diesem Grund wurde die Verwendung eines fokussierten Laserstrahls
vorgeschlagen, um kleine selbstheilende Löcher ohne mechanischen Kontakt
in die Zellmembran zu bohren. Die kurze Öffnungszeit reicht aus, um
das in der umgebenden Flüssigkeit
gelöste
Material in die Zelle einzuschleusen. Ein mit dieser Methode verbundenes
Problem be steht jedoch darin, dass für eine präzise Laser-Mikroinjektion die Zielobjekte sowohl
lateral, d.h. in x- und
y-Richtung, als auch vertikal, d.h. in z-Richtung, mit Nanometer-Genauigkeit
angefahren werden müssen.
Ein weiteres Problem besteht darin, die erfolgreich injizierten
Zellen von den anderen Zellen zu isolieren bzw. für die weiteren
Untersuchungen zu präparieren.Out
This reason was the use of a focused laser beam
suggested to make small self-healing holes without mechanical contact
to drill into the cell membrane. The short opening time is enough to
that in the surrounding liquid
dissolved
To inject material into the cell. An associated with this method
The problem, however, is that for accurate laser microinjection, the target objects both
lateral, i. in x and
y-direction, as well as vertical, i. in z-direction, with nanometer accuracy
must be approached.
Another problem is the successfully injected ones
Isolate cells from the other cells or for the others
Prepare examinations.
Zur
Separierung einzelner Zellen aus einer großen Zahl von in einer Flüssigkeit
dispergierten biologischen Objekten sind geeignete Trenn- bzw. Sortiervorrichtungen
kommerziell erhältlich.
Während bei
der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung ("Fluorescence Activated Cell Sorter", FACS) elektrostatische
Prinzipien zur räumlichen
Separation zum Einsatz kommen, wird bei der magnetisch aktivierten Zellsortierung
("Magnetic Activated
Cell Sorter", MACS)
mit magnetischen Kräften
gearbeitet. Hierbei liegen die Zellen jedoch nicht auf einem planaren
Träger
nebeneinander. Überdies
haben beide Methoden den Nachteil, dass sich manche Objekte nur
eingeschränkt
(FACS) oder überhaupt
nicht getrennt voneinander absondern lassen (MACS).to
Separation of individual cells from a large number of in a liquid
dispersed biological objects are suitable sorting devices
commercially available.
While at
fluorescence activated cell sorting (FACS) electrostatic
Principles for spatial
Separation is used in magnetically activated cell sorting
("Magnetic Activated
Cell Sorter ", MACS)
with magnetic forces
worked. However, the cells are not on a planar
carrier
side by side. moreover
Both methods have the disadvantage that some objects only
limited
(FACS) or at all
can not separate separately from each other (MACS).
Die
zuvor beschriebenen Methoden können keine
einzelnen Zellen aus einem Zellverband, wie etwa einem Gewebe oder
einem histologischen Gewebepräparat,
lösen.
Aus Zellverbänden
werden bisher einzelne Zellen mit mechanischen Mikrowerkzeugen,
z.B. Mikrokapillaren oder Mikronadeln, mühsam und mit großer Kontaminationsgefahr
herausgelöst.The
previously described methods can not
single cells from a cell assemblage, such as a tissue or
a histological tissue preparation,
to solve.
From cell aggregates
So far, individual cells with mechanical micro tools,
e.g. Microcapillaries or microneedles, laborious and with a high risk of contamination
removed.
In
der WO 97/29355A der Anmelderin wurde daher ein neuartiges Verfahren
zum Sortieren und zur Gewinnung von einzelnen biologischen Objekten, die
auf einem planaren Träger
angeordnet sind, vorgeschlagen. Dabei wird vorgeschlagen, ein selektiertes
biologisches Objekt von der umgebenden weiteren biologischen Masse
durch einen Laserstrahl abzutrennen, so dass das selektierte biologische
Objekt von der weiteren biologischen Masse frei präpariert ist.In
Applicant's WO 97/29355A therefore became a novel process
for sorting and obtaining individual biological objects which
on a planar support
are arranged, proposed. It is proposed that a selected
biological object from the surrounding further biological mass
separated by a laser beam, so that the selected biological
Object of the further biological mass is freely prepared.
Das
somit frei präparierte
biologische Objekt wird anschließend mit Hilfe eines Laserschusses
von dem Träger
zu einer Auffangvorrichtung katapultiert, wobei es sich bei der
Auffangvorrichtung beispielsweise um ein Auffangsubstrat handeln
kann. Als Träger
der biologischen Masse kann eine Polymerfolie verwendet werden.The
thus freely prepared
biological object is subsequently with the help of a laser shot
from the carrier
catapulted to a collecting device, wherein it is in the
Collecting device, for example, to act a collecting substrate
can. As a carrier
The biological mass may be a polymer film may be used.
Ein
zu separierendes biologisches Objekt einer auf dem Träger aufgebrachten
biologischen Masse wird somit zunächst selektiert, aus der biologischen
Masse ausgeschnitten und anschließend durch einen laserinduzierten
Transportprozess zu der Auffangvorrichtung geschleudert. Unter "biologischen Objekten" werden dabei im
Rahmen der vorliegenden Anmeldung vor allem lebende oder fixierte
biologische Zellen oder Zellbestandteile verstanden, die Bestandteil
eines flüssigen
oder festen biologischen Materials, wie beispielsweise eines Zellgewebes,
eines Abstriches oder einer Zellkultur etc. sind.One
to be separated biological object of an applied on the carrier
biological mass is thus selected first, from the biological
Mass cut out and then by a laser-induced
Transport process thrown to the collecting device. Under "biological objects" are in the
Framework of the present application, especially living or fixed
understood biological cells or cell components that are part of
a liquid
or solid biological material, such as a cell tissue,
of a smear or cell culture, etc.
Mit
Hilfe einer Vorrichtung zur Durchführung des zuvor beschriebenen
Verfahrens, welches dem Oberbegriff des Anspruches 1 zugrunde liegt,
können bestimmte
biologische Objekte gezielt mit einer ausgewählten Substanz durch berührungslose
Laser-Mikroinjektion beladen und anschließend die erfolgreich injizierten
biologischen Objekte aussortiert werden. Die biologischen Objekte
können
nebeneinander auf einem festen planaren Träger aufgebracht sein, wobei
der Vorgang des Absonderns innerhalb kurzer Zeit und berührungslos
durchgeführt
werden kann. Die Überlebensfähigkeit
bzw. die Morphologie der biologischen Objekte wird gewährleistet,
d.h. die biologischen Objekte werden durch den Mikroinjektionsvorgang
und durch den Abtrennprozess nicht geschädigt bzw. beeinträchtigt.With
Help of a device for carrying out the previously described
Method on which the preamble of claim 1 is based,
can be specific
biological objects targeted with a selected substance by non-contact
Loaded with laser microinjection and then successfully injected
biological objects are sorted out. The biological objects
can
be applied side by side on a solid planar support, wherein
the process of separation within a short time and without contact
carried out
can be. The survivability
or the morphology of the biological objects is ensured
i.e. the biological objects become through the microinjection process
and not damaged or impaired by the separation process.
Das
zuvor beschriebene Verfahren kann jedoch manuell nur relativ aufwendig
mit der gewollten Präzision
durchgeführt
werden, da ein abzutrennendes biologisches Objekt nach dem Schneidevorgang präzise gegenüber dem
Laser positioniert bzw. ausgerichtet werden muss, um anschließend durch
einen weiteren Laserimpuls bzw. Laserschuss zu der Auffangvorrichtung
katapultiert werden zu können. D.h.
nach dem Schneidevorgang muss der zum Katapultieren am besten geeignete
Punkt des gewünschten
biologischen Objekts, z.B. der Mittelpunkt, möglichst exakt angefahren werden.
Zudem ist bei einer manuellen Durchführung dieses Verfahrens eine
mehrmalige Wiederholung ein und desselben Schneidevorgangs/Katapultiervorgangs
nicht mit hoher Genauigkeit möglich.However, the method described above can be carried out manually only relatively expensive with the desired precision, since a separated biological object after the cutting process must be precisely positioned or aligned with respect to the laser to be catapulted then by another laser pulse or laser shot to the catcher to be able to. That is, after the cutting process, the most suitable point for catapulting the desired biological object, such as the means point, be approached as accurately as possible. In addition, in a manual implementation of this method a repeated repetition of the same cutting / catapulting process is not possible with high accuracy.
Der
vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Steuersystem
für eine
Vorrichtung zur Durchführung
eines verbesserten Verfahrens zur Bearbeitung einer biologischen
oder nichtbiologischen Masse vorzuschlagen, womit die zuvor beschriebenen
Probleme beseitigt und ein möglichst
genaues sowie benutzerfreundliches Schneiden und/oder Katapultieren
einzelner in der Masse enthaltener biologischer oder auch nichtbiologischer
Objekte möglich
ist.Of the
The present invention is therefore based on the object, a control system
for one
Apparatus for carrying out
an improved method for processing a biological
or non-biological mass suggest, with what the previously described
Problems eliminated and one possible
accurate and user-friendly cutting and / or catapulting
single contained in the mass biological or non-biological
Objects possible
is.
Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein
Steuersystem mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Die
Unteransprüche
definieren jeweils bevorzugte und vorteilhafte Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung.These
The object is achieved by a
Control system with the features of claim 1 solved. The
under claims
each define preferred and advantageous embodiments
of the present invention.
Die
vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand des Schneidens und/oder
Katapultierens biologischer Objekte beschrieben. Die Erfindung ist
jedoch ebenso für
nichtbiologische Objekte (unbelebte Materie) anwendbar, wobei es
sich z.B. um mikroskopisch kleine Objekte aus Glas, Silica, Kunststoff
etc. oder künstlich
hergestellte Vesikel usw. in der biologischen Masse handeln kann.
Ebenso ist die vorliegende Erfindung auf nichtbiologische Massen,
z.B. Polymermassen oder dergleichen, anwendbar, aus denen mikroskopisch
kleine Objekte herausgelöst
werden sollen.The
The present invention will be described below with reference to the cutting and / or
Catapulting biological objects described. The invention is
but also for
non-biological objects (inanimate matter) applicable, where it
e.g. around microscopic objects made of glass, silica, plastic
etc. or artificial
produced vesicles, etc. in the biological mass can act.
Likewise, the present invention is directed to non-biological masses,
e.g. Polymer compositions or the like, applicable from which microscopic
liberated small objects
should be.
Erfindungsgemäß wird das
Schneiden und/oder Katapultieren eines biologischen Objekts durch
Bestrahlung mit einem Laserstrahl rechnergestützt durchgeführt, wobei
eine Steuereinrichtung vorgesehen ist, welche Steuermittel zur automatischen
Ansteuerung der Laserlichtquelle, welche den zum Schneiden und/oder
Katapultieren dienenden Laserstrahl erzeugt, und zur automatischen
Ansteuerung von Verstellmitteln zur Herbeiführung einer zum Schneiden und/oder
Katapultieren erforderliche Relativbewegung zwischen dem Laserstrahl
und dem das biologische Objekt aufweisenden Träger umfasst. Die Steuermittel
sind dabei derart ausgestaltet, dass zum Abtrennen eines Objekts
die Steuermittel zur Ansteuerung der Laserlichtquelle (4)
und der Verstellmittel derart ausgestaltet sind, dass zum Abtrennen
eines Objekts von der umgebenden Masse bei Bestrahlung mit dem Laserstrahl
der Laserlichtquelle (4) eine Verbindung zwischen dem Objekt
und der umgebenden Masse stehen bleibt und die Laserlichtquelle
(4) anschließend
einen einzelnen Laserschuss auf die Verbindung setzt.According to the invention, the cutting and / or catapulting of a biological object is performed computer-assisted by irradiation with a laser beam, wherein a control device is provided, which control means for automatically controlling the laser light source, which generates the laser beam for cutting and / or catapulting, and for the automatic control of Adjusting means for bringing about a required for cutting and / or catapulting relative movement between the laser beam and the biological object having carrier. The control means are designed such that for separating an object, the control means for controlling the laser light source ( 4 ) and the adjusting means are designed such that for separating an object from the surrounding mass when irradiated with the laser beam of the laser light source ( 4 ) a connection between the object and the surrounding mass stops and the laser light source ( 4 ) then puts a single laser shot on the connection.
Die
vorliegende Erfindung ermöglicht
somit eine automatisierte Durchführung
eines Schneide- und/oder Katapultiervorgangs, wobei insbesondere mehrere
Schneide- und/oder Katapultiervorgänge rechnergestützt, d.h.
automatisch, nacheinander durchgeführt werden können. Für jeden
einzelnen Schneide-/Katapultiervorgang ist die geforderte Genauigkeit
bzw. Präzision
gewährleistet.The
present invention enables
thus an automated implementation
a cutting and / or Catapultiervorgangs, in particular several
Computer-assisted cutting and / or catapulting operations, i.
automatically, one after the other. For each
Single cutting / catapulting is the required accuracy
or precision
guaranteed.
Um
die einzelnen Schneide- und/oder Katapultiervorgänge festlegen bzw. überwachen
zu können,
wird mit Hilfe einer geeigneten Kamera, insbesondere einer CCD-Kamera,
ein Videobild des auf dem Träger
befindlichen biologischen Materials erzeugt und auf einem Bildschirm
eines Computer- oder
Rechnersystems dargestellt. Dieses Videobild wird mit einer Benutzerschnittstelle
des Computersystems überlagert,
wobei auf dem Bildschirm unter anderem in Echtzeit die jeweilige
Laserposition dargestellt wird. Durch eine Vielzahl von rechnergestützten Funktionen
wird sichergestellt, dass selbst ein unerfahrener Benutzer die Mikrodisksektion
bzw. das Katapultieren einzelner Zellen einfach und mit hoher Genauigkeit
durchführen
kann.Around
determine or monitor the individual cutting and / or catapulting operations
to be able to
is using a suitable camera, in particular a CCD camera,
a video image of the on the carrier
contained biological material and on a screen
a computer or
Computer system shown. This video image comes with a user interface
superimposed on the computer system,
where on the screen among others in real time the respective
Laser position is displayed. Through a variety of computer-aided functions
Ensures that even a novice user the microdisk section
or catapulting individual cells easily and with high accuracy
carry out
can.
Diese
Funktionen, die auf dem Bildschirm vorzugsweise in Form von sogenannten "Pull-Down-Menüs" oder Menüfenstern,
in denen die wichtigsten Funktionen zusammengefasst sind, angeboten
werden, ermöglichen
beispielsweise, dass der Benutzer in einem entsprechenden Betriebsmodus
unmittelbar über
entsprechende Eingabemittel, beispielsweise eine Computermaus, einem
Joystick, einem Trackball, einem Graphik-Tablett etc., die Relativbewegung zwischen
dem Träger
und dem Laser steuern kann. Gemäß einem
bevorzugten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung ist hierfür für den Träger eine automatisch steuerbare
Verstellvorrichtung vorgesehen, so dass der Träger mit dem darauf befindlichen
biologischen Material relativ zu dem Laserstrahl verstellt werden
kann. Selbstverständlich
ist jedoch auch eine Verstellung des Lasers in Bezug auf den Träger oder
sowohl eine Verstellung des Trägers
als auch des Lasers denkbar und vorzugsweise zusätzlich realisiert.These
Functions which are preferably displayed on the screen in the form of so-called "pull-down menus" or menu windows,
in which the most important functions are summarized, offered
become possible
for example, that the user is in a corresponding operating mode
immediately above
corresponding input means, such as a computer mouse, a
Joystick, a trackball, a graphics tablet, etc., the relative movement between
the carrier
and the laser can control. According to one
preferred embodiment
The present invention is for the carrier an automatically controllable
Adjustment provided so that the carrier with the thereon
biological material are adjusted relative to the laser beam
can. Of course
however, is also an adjustment of the laser with respect to the wearer or
both an adjustment of the wearer
as well as the laser conceivable and preferably additionally realized.
Als
Laser wird vorzugsweise ein gepulster UV-Laser mit einer Wellenlänge von
337 nm eingesetzt. Als Träger
wird in der Regel ein Glas-Objektträger verwendet, welcher vorzugsweise
mit einer Trägerfolie,
bestehend aus einer UV-absorbierenden Polymerfolie
mit einer Dicke zwischen 5 μm
und 15 μm,
deren Absorptionsverhalten an die Wellenlänge des UV-Lasers angepasst
ist und somit vorzugsweise in der Umgebung der Laserwellenlänge ein
Absorptionsmaximum besitzt, beschichtet sein kann. Ebenso können als
Träger
Teflonmembranen, z.B. in Form von sogenannten Petrischälchen, oder
ca. 20 μm
dicke Filtermembranen, wie sie z.B. zum Filtrieren von Blut eingesetzt
werden, verwendet werden. Die Dicke der Trägermaterialien kann somit von
0,1 μm (Folie)
bis 2 mm (Glas-Objektträger)
reichen. Als Auffangvorrichtung kann ein Auffangsubstrat verwendet
werden, welches in Form einer Folie oder Platte oder auch in Form
eines topfförmigen
Behälters
ausgebildet sein kann. Insbesondere werden als Auffangvorrichtung
Mikrozentrifugenbehälter
empfohlen, wie sie in der Molekularbiologie verwendet werden, beispielsweise
eine Mikrotiterplatte mit 50 bis 500 Vertiefungen ("Wells"), so dass nacheinander mehrere
biologische Objekte von unterschiedlichen Vertiefungen aufgefangen
werden können.
Die Auffangvorrichtung kann mit einer adhäsiven Schicht versehen sein,
so dass die herauskatapultierten biologischen Objekte durch die
Klebeschicht fixiert werden können.
Vorzugsweise ist auch für
die Auffangvorrichtung eine rechnergestützt ansteuerbare Verstellvorrichtung
vorgesehen.The laser used is preferably a pulsed UV laser with a wavelength of 337 nm. As a carrier, a glass slide is usually used, which is preferably adapted to a carrier film consisting of a UV-absorbing polymer film having a thickness between 5 .mu.m and 15 .mu.m, whose absorption behavior is adapted to the wavelength of the UV laser and thus preferably in the environment of the laser wavelength has an absorption maximum, can be coated. Likewise, as carrier Teflon membranes, for example in the form of so-called Petri dishes, or about 20 micron thick filter membranes, such as those used for filtering blood, can be used. The thickness of the support materials can thus be from 0.1 μm (foil) to 2 mm (glass slide). As a collecting device, a collecting substrate can be used, which may be in the form of a film or plate or in the form of a cup-shaped container. In particular, microcentrifuge containers, such as those used in molecular biology, for example a microtiter plate with 50 to 500 wells, are recommended as collecting devices, so that several biological objects of different wells can be collected in succession. The collecting device may be provided with an adhesive layer, so that the out-catapulted biological objects can be fixed by the adhesive layer. Preferably, a computer-controlled controllable adjustment is also provided for the collecting device.
Mittels
einer weiteren Funktion kann auf dem Bildschirm bzw. dem Videobild
der biologischen Masse eine Schnittkurve gezeichnet und anschließend automatisch
die Schnittkurve abgefahren werden, um die auf dem Träger befindliche
biologische Masse bei gleichzeitiger Aktivierung des Lasers entsprechend
der zuvor gezeichneten Kurve zu schneiden. Anschließend wird
automatisch der Laserschuss gesetzt, um das herausgeschnittene biologische
Objekt von dem Träger
zu der Auffangvorrichtung zu katapultieren.through
another feature may be on the screen or video image
The biological mass drawn an average curve and then automatically
the cutting curve are traversed to those on the carrier
biological mass with simultaneous activation of the laser accordingly
to cut the previously drawn curve. Subsequently, will
automatically the laser shot placed around the biologic cut out
Object from the carrier
catapult to the catcher.
Zur
automatischen Durchführung
eines Katapultiervorgangs oder mehrerer Katapultiervorgänge können auf
dem Bildschirm oder dem Videobild entsprechende Punkte in der biologischen
Masse definiert werden, die anschließend automatisch angefahren
werden, so dass die diesen Punkten entsprechenden biologischen Objekte
anschließend
durch ebenfalls automatisch aktivierte Laserimpulse von dem Träger zu der
Auffangvorrichtung katapultiert werden.to
automatic execution
catapulting or catapulting operations may occur
the screen or video image corresponding points in the biological
Mass be defined, which then approached automatically
so that the biological objects corresponding to these points
subsequently
by also automatically activated laser pulses from the carrier to the
Catching be catapulted.
Allgemein
ist zu bemerken, dass die Einstellungen des Lasers (insbesondere
die Laserenergie und die Laserfokusein stellung) von der Art und
Beschaffenheit des Präparats
(insbesondere dessen Größe und Dicke),
von der Präparationsweise
sowie von den Mikroskopeinstellungen (Objektiv, interne Nachvergrößerung usw.)
etc. abhängig
ist. In der Regel wird zum Schneiden weniger Energie als zum Katapultieren
eingesetzt, wobei der Laserfokus beim Katapultieren leicht unterhalb
des Präparats
versetzt werden kann.Generally
It should be noted that the settings of the laser (in particular
the laser energy and the Laserfokusein position) of the type and
Condition of the preparation
(in particular its size and thickness),
from the preparation method
as well as the microscope settings (lens, internal re-magnification, etc.)
etc. dependent
is. In general, cutting is less energy than catapulting
used, with the laser focus when catapulting slightly below
of the preparation
can be offset.
Gemäß einem
bevorzugten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung ist auch eine rechnergestützte Kalibrierungsfunktion
vorgesehen, mit deren Hilfe die erforderliche Übereinstimmung zwischen dem
Videobild, d.h. der Bildschirmdarstellung und der Bewegung des Trägers hergestellt
werden kann.According to one
preferred embodiment
The present invention is also a computerized calibration function
provided with the help of which the required agreement between the
Video image, i. the screen image and the movement of the carrier made
can be.
Hinsichtlich
der Bewegung des Trägers
bzw. der Auffangvorrichtung können
spezielle Positionen definiert und abgespeichert werden, die insbesondere
auf die Lage des Laserstrahls bezogen sind und einzeln oder nacheinander
rechnergestützt,
d.h. automatisch, angefahren werden können. Da das Videobild über ein
Objektiv aufgenommen wird und es bei einem Objektivwechsel durch
die nicht genau überein stimmenden
optischen Achsen der beiden Objektive zu einer Verschiebung des
Zentrums der Bildschirmabbildung kommen kann, wird eine Korrekturfunktion
angeboten, mit deren Hilfe rechnergestützt eine Positionsverschiebung
der optischen Abbildung infolge eines Objektivwechsels korrigiert
werden kann. Zu diesem Zweck wird durch eine spezielle Vorgehensweise
rechnergestützt
die sich bei einem Objektivwechsel einstellende Positionsverschiebung der
optischen Abbildung erfasst und anschließend die gespeicherten Trägerpositionen,
d.h. die jeweiligen X- und Y-Koordinaten,
entsprechend der erfassten Positionsverschiebung korrigiert, so
dass wieder die korrekte Zuordnung der gespeicherten Koordinaten
zur Bildschirmdarstellung hergestellt wird und eine gespeicherte
Position wieder mit dem ursprünglich
beabsichtigten Bildpunkt übereinstimmt.Regarding
the movement of the wearer
or the collecting device can
special positions are defined and stored, in particular
are related to the position of the laser beam and individually or sequentially
computer systems,
i.e. automatically, can be approached. Because the video picture over a
Lens is recorded and it at a lens change through
which do not agree exactly
optical axes of the two lenses to a shift of
Center of the screen shot can be a correction function
offered with their help computer-a position shift
the optical image corrected due to a lens change
can be. For this purpose, by a special procedure
computer-aided
which adjusts at a lens change position shift of
recorded optical image and then the stored carrier positions,
i.e. the respective X and Y coordinates,
corrected according to the detected positional shift, so
that again the correct assignment of the stored coordinates
is made for the screen display and a stored
Position again with the original
intended pixel.
Die
vorliegende Erfindung eignet sich beispielsweise dazu, bestimmte
Substanzen in einzelne biologische Objekte, beispielsweise Zellen,
zu mikroinjizieren und anschließend
diese biologischen Zellen automatisch auszusortieren. Ebenso kann
eine rechnergesteuerte Mikroinjektion ohne nachfolgende Aussonderung
der entsprechenden Zellen einfach durchgeführt werden. Es sind sogenannte
Selektionsmedien bekannt, in denen Zellen kultiviert werden können, wobei
eine mit einem bestimmten Gen injizierte Zelle Nahrung von diesem
Selektionsmedium aufnehmen und weiter wachsen kann, während nicht injizierte
Zellen absterben. Weiterhin können
mit Hilfe der vorliegenden Erfindung einzelne biologische Objekte
aus einer sehr großen
Anzahl von Objekten (z.B. 105–109) rechnergestützt räumlich abgetrennt und ausgesondert
werden. Die Abtrennung von gehäuften
Zellen als Gesamteinheit ist ebenso möglich. Des weiteren kann die
Erfindung auch zur automatischen Separation von spezifischen Zellen
aus Gewebeschnitten eingesetzt werden. Lebende Zellen können einfach
rechnergesteuert trotz Feuchtigkeit katapultiert und anschließend weiterkultiviert
werden. Zellen oder auch nichtbiologische Objekte können in Flüssigkeit
von einer Ebene in eine andere Ebene katapultiert werden. Unter "biologischen Objekten" werden im Rahmen
der vorliegenden Erfindung vor allem lebende oder fixierte biologische
Zellen oder Zellbestandteile verstanden, die Bestandteil eines flüssigen oder
festen biologischen Materials, beispielsweise eines Zellgewebes,
sein können.The present invention is suitable, for example, for microinjecting certain substances into individual biological objects, for example cells, and subsequently for automatically sorting out these biological cells. Likewise, a computer-controlled microinjection can be easily performed without subsequent separation of the corresponding cells. So-called selection media are known in which cells can be cultured, whereby a cell injected with a certain gene can take up food from this selection medium and continue to grow, while uninjected cells die off. Furthermore, with the aid of the present invention, individual biological objects from a very large number of objects (for example, 10 5 -10 9 ) can be spatially separated and rejected in a computer-assisted manner. The separation of accumulated cells as a whole unit is also possible. Furthermore, the invention can also be used for automatic separation of specific cells from tissue sections. Living cells can easily be catapulted computer-controlled despite moisture and then further cultivated. Cells or even non-biological objects can be catapulted in liquid from one level to another level. In the context of the present invention, "biological objects" are understood to mean, in particular, living or fixed biological cells or cell components which may be part of a liquid or solid biological material, for example a cell tissue.
Die
Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung
anhand bevorzugter Ausführungsbeispiele
näher beschrieben.The invention will be described below with reference to the accompanying drawings zugter embodiments described in more detail.
1 zeigt den prinzipiellen
Aufbau einer Vorrichtung zur Realisierung der vorliegenden Erfindung, 1 shows the basic structure of an apparatus for implementing the present invention,
2 zeigt ein Bedienpaneel
eines in 1 gezeigten
Lasers, 2 shows a control panel of an in 1 shown laser,
3 zeigt ein auf einem in 1 gezeigten Bildschirm dargestelltes
Menüfenster,
mit dem ein Menüfenster
zur automatischen Steuerung eines Trägertisches, ein Menüfenster
zur automatischen Steuerung von Schneide- und/oder Katapultiervorgängen und
ein Menüfenster
zur automatischen Steuerung einer in 1 gezeigten
Auffangvorrichtung aufgerufen werden können, 3 shows one on one in 1 a menu window for automatically controlling a tray table, a menu window for automatically controlling cutting and / or catapulting operations, and a menu window for automatically controlling an in-screen display 1 can be called,
4 zeigt das Menüfenster
zur automatischen Steuerung des Trägertisches, 4 shows the menu window for the automatic control of the carrier table,
5 zeigt das Menüfenster
zur automatischen Steuerung von Schneide- und/oder Kalibriervorgängen, 5 shows the menu window for the automatic control of cutting and / or calibrating processes,
6 zeigt das Menüfenster
zur automatischen Verstellung der Auffangvorrichtung, 6 shows the menu window for the automatic adjustment of the collecting device,
7 zeigt ein Menüfenster
zur Einstellung einer Lasermarkierung, die auf dem in 1 gezeigten Bildschirm dargestellt
wird, 7 shows a menu window for setting a laser mark, which is located on the in 1 displayed screen is displayed
8A–8C zeigen
Darstellungen zur Verdeutlichung eines rechnergestützten Schneidevorgangs
bei dem in 1 gezeigten
System, 8A - 8C show illustrations to illustrate a computer-aided cutting process in the in 1 shown system,
9A und 9B zeigen Darstellungen zur Verdeutlichung
eines rechnergestützten
Katapultiervorgangs bei dem in 1 gezeigten
System für ein
zuvor gemäß 8A– 8C geschnittenes
biologisches Objekt, und 9A and 9B show illustrations to illustrate a computer-aided catapulting in the in 1 shown system for a previously according to 8A - 8C cut biological object, and
10A und 10B zeigen Darstellungen zur Verdeutlichung
des rechnergestützten
direkten Katapultierens mehrerer biologischer Objekte, ohne dass
diese zuvor mittels Laserbestrahlung aus der umgebenden biologischen
Masse herausgeschnitten worden sind. 10A and 10B show illustrations to illustrate the computer-aided direct catapulting several biological objects, without that they have previously been cut out by means of laser irradiation from the surrounding biological mass.
In 1 ist der Aufbau eines Laser-Mikroskop-Systems
dargestellt, wie es zur Realisierung der vorliegenden Erfindung
eingesetzt werden kann. Das System ist modular aufgebaut und kann
somit an unterschiedliche experimentelle Anforderungen individuell
angepasst werden.In 1 the construction of a laser microscope system is shown, as it can be used to implement the present invention. The system has a modular design and can therefore be individually adapted to different experimental requirements.
Wesentlicher
Bestandteil des in 1 gezeigten
Systems ist eine Laservorrichtung 4, in der eine Laserlichtquelle
zur Erzeugung eines Laserstrahls untergebracht ist. Des weiteren
ist in der Laservorrichtung 4 die Optik 5, 6 untergebracht,
die erforderlich ist, um den Laserstrahl in ein Mikroskop 1 einzukoppeln
und den Laserfokus in der Objektebene auf den optischen Fokus des
Mikroskops 1 abzustimmen. Im vorliegenden Fall handelt
es sich um einen gepulsten UV-Stickstofflaser, dessen Wellenlänge 337
nm und dessen Impulsenergie z.B. 270 μJ beträgt. Die Impulsdauer beträgt 3 ms,
während
die Impulsfrequenz 1–30
Impulse pro Sekunde beträgt.Essential part of the in 1 shown system is a laser device 4 in which a laser light source for generating a laser beam is housed. Furthermore, in the laser device 4 the optics 5 . 6 housed, which is required to put the laser beam in a microscope 1 couple the laser focus in the object plane to the optical focus of the microscope 1 vote. In the present case, it is a pulsed UV nitrogen laser whose wavelength is 337 nm and whose pulse energy is, for example, 270 μJ. The pulse duration is 3 ms, while the pulse frequency is 1-30 pulses per second.
Zur
Steuerung der Laservorrichtung 4 ist das in 2 gezeigte Steuerpaneel
vorgesehen. Der Stickstofflaser emittiert einen Laserstrahl mit
einer festen Laserenergie. Für
eine präzise
Laser-Mikromanipulation ist jedoch eine präzise Verstellung der Laserenergie
erforderlich. Aus diesem Grund ist ein Quarzfilter 5 senkrecht
zum Laserstrahlpfad angeordnet. Dieser Quarzfilter wird von einem
Gleichstrommotor gedreht, der über
einen am Steuerpaneel befindlichen Potentiometerknopf 12 gesteuert
werden kann, um somit die Laserenergie entsprechend einzustellen.
Die augenblicklich eingestellte Laserenergie wird in einer LCD-Anzeige 17 dargestellt.
Zudem ist an der Seite der Laservorrichtung 4 ein Verstellknopf
zur manuellen Verstellung des Quarzfilters 5 vorgesehen,
wobei jedoch für
diese manuelle Verstellung keine LCD-Anzeige vorgesehen ist.For controlling the laser device 4 is that in 2 provided control panel provided. The nitrogen laser emits a laser beam with a fixed laser energy. For precise laser micromanipulation, however, a precise adjustment of the laser energy is required. For this reason, a quartz filter 5 arranged perpendicular to the laser beam path. This quartz filter is rotated by a DC motor via a potentiometer knob located on the control panel 12 can be controlled so as to adjust the laser energy accordingly. The currently set laser energy is displayed in an LCD 17 shown. In addition, on the side of the laser device 4 an adjustment knob for manual adjustment of the quartz filter 5 provided, but no LCD display is provided for this manual adjustment.
Neben
der Einstellung der Laserenergie kann auch der Laserfokus unabhängig von
dem Mikroskopfokus eingestellt werden, d.h. der Brennpunkt des Lasers
kann in z-Richtung relativ zur Objektebene des Mikroskops 1 verschoben
werden. Zu diesem Zweck ist ebenfalls ein Schrittmotor vorgesehen,
der die in 1 gezeigten
Linsen 6 bewegt. Die Fokussierung bzw. der Schrittmotor
kann durch einen weiteren, in 2 gezeigten
Potentiometerknopf 11 gesteuert werden, wobei die augenblickliche
Einstellung des Laserfokus in einer weiteren LCD-Anzeige 16 dargestellt
wird. Auch die Linsen 6 können über einen an der Seite der
Laservorrichtung 4 vorgesehenen Einstellknopf manuell verstellt
werden, wobei für diese
manuelle Einstellung analog zum Fall der Einstellung der Laserenergie
keine LCD-Anzeige
vorhanden ist.In addition to the setting of the laser energy and the laser focus can be adjusted independently of the microscope focus, ie the focal point of the laser can in the z-direction relative to the object plane of the microscope 1 be moved. For this purpose, a stepping motor is also provided which the in 1 shown lenses 6 emotional. The focusing or the stepper motor can by another, in 2 shown potentiometer button 11 controlled, with the current setting of the laser focus in another LCD display 16 is pictured. Also the lenses 6 can have one on the side of the laser device 4 provided adjustment knob are manually adjusted, with no LCD display is available for this manual setting analogous to the case of setting the laser energy.
Über einen
Schalter 13 des Steuerpaneels kann zwischen einem automatischen
Betrieb und einem manuellen Betrieb (getriggert über einen Fußschalter 67)
der Laservorrichtung 4 umgeschaltet werden. Des weiteren
ist ein Potentiometer knopf 14 zur Einstellung der Impulsrate
des Lasers (1–30
Impulse pro Sekunde) vorgesehen. Eine Anzeige 15 informiert
darüber,
ob die Laservorrichtung 4 augenblicklich eingeschaltet
ist.About a switch 13 The control panel can switch between automatic operation and manual operation (triggered by a footswitch 67 ) of the laser device 4 be switched. Furthermore, a potentiometer button 14 to set the pulse rate of the laser (1-30 pulses per second). An ad 15 informs about whether the laser device 4 is currently switched on.
Der
Laserstrahl wird über
mehrere beschichtete Strahlteiler in das Mikroskop 1 eingekoppelt
und zu einem Objektiv 18 hin abgelenkt. Der Durchmesser
des auf der Objektebene auftreffenden Laserstrahls ist maßgeblich
von der numerischen Apparatur des Objektivs 18 abhängig. Ein
Objektiv mit einer relativ hohen numerischen Apparatur ermöglicht Laserstrahldurchmesser
kleiner als 1 μm.
Zudem sollte darauf geachtet werden, dass das jeweils verwendete
Objektiv 18 eine hohe Durchlässigkeit für die jeweilige Laserwellenlänge aufweist,
um Energieverluste zu minimieren.The laser beam is transmitted through several coated beam splitters into the microscope 1 coupled and to a lens 18 distracted. The diameter of the laser impinging on the object plane Strahls is decisive for the numerical apparatus of the objective 18 dependent. A lens with a relatively high numerical apparatus allows laser beam diameter smaller than 1 micron. In addition, care should be taken that the lens used in each case 18 has a high transmittance for the respective laser wavelength in order to minimize energy losses.
Der über das
Objektiv 18 emittierte Laserstrahl trifft schließlich auf
einen motorisierten und computergesteuerten Mikroskop- oder Trägertisch 3, auf
dem ein Träger
mit einer zu bearbeitenden biologischen Masse angeordnet ist. Oberhalb
des Trägertisches 3 befindet
sich ein manuell betätigbarer
oder vorzugsweise ebenfalls motorisierter und computergesteuerter
Manipulator 2. Die Komponenten 2 und 3 ermöglichen
eine exakte Objektpositionierung mit Nanometer-Präzision sowie
die automatische Durchführung
von Mikro-Manipulationsprozeduren.The over the lens 18 emitted laser beam finally hits a motorized and computer-controlled microscope or support table 3 on which a carrier is arranged with a biological mass to be processed. Above the carrier table 3 There is a manually operable or preferably also motorized and computer-controlled manipulator 2 , Components 2 and 3 enable accurate object positioning with nanometer precision and automatic micro manipulation procedures.
Der
motorisierte Trägertisch 3 ist
entlang zweier linearer Achsen (x- und y-Richtung) verfahrbar. Zu
diesem Zweck sind zwei Hybrid-Schrittmotoren mit vier Schritten
pro 360°/Umdrehung
vorgesehen. Die minimale Schrittgröße beträgt 20 nm, so dass der auf der
Trägerbühne 3 befindliche
Träger mit
sehr hoher Genauigkeit positioniert werden kann.The motorized carrier table 3 is traversable along two linear axes (x and y direction). For this purpose, two hybrid stepper motors with four steps per 360 ° / turn are provided. The minimum step size is 20 nm, so that on the carrier stage 3 located carrier can be positioned with very high accuracy.
An
dem motorisierten Manipulator 2 kann beispielsweise eine
Nadel oder Mikropipette zur Mikroinjektion angebracht sein. Im Rahmen
der vorliegenden Erfindung wird jedoch davon ausgegangen, dass an
dem Manipulator 2 eine Auffangvorrichtung angebracht ist,
um von dem Träger
wegkatapultierte biologische Objekte aufzufangen. Der motorisierte Manipulator 2 kann
sowohl in x- und y-Richtung als auch in z-Richtung verfahren werden.
Zu diesem Zweck sind drei Schrittmotoren vorgesehen, welche dieselbe
Präzision
wie die für
den Trägertisch 3 vorgesehenen
Schrittmotoren aufweisen.At the motorized manipulator 2 For example, a needle or micropipette may be attached for microinjection. In the context of the present invention, however, it is assumed that on the manipulator 2 a catcher is mounted to catch biological objects catapulted away from the wearer. The motorized manipulator 2 can be moved both in the x and y direction and in the z direction. For this purpose, three stepper motors are provided which have the same precision as those for the support table 3 have provided stepper motors.
Vorzugsweise
ist sowohl der Trägertisch 3 als
auch der Manipulator 2 mit Endschaltern ausgestattet, die
gewährleisten,
dass der jeweilige Antriebsmotor automatisch gestoppt wird, falls
eine Achse bis zu dem entsprechenden Endschalter verfahren wird.Preferably, both the support table 3 as well as the manipulator 2 equipped with limit switches that ensure that the respective drive motor is stopped automatically if an axis is moved to the corresponding limit switch.
Auch
die Einstellung des Laserfokus kann begrenzt werden, um Schäden am Objektiv 18 zu vermeiden.Also, the adjustment of the laser focus can be limited to damage the lens 18 to avoid.
Bei
dem Mikroskop 1 kann es sich um ein beliebig ausgestaltetes
Mikroskop handeln. Insbesondere ist sowohl die Verwendung eines
inversen als auch eines aufrechten Mikroskops oder eines Lasermikroskops
denkbar. Das Mikroskop 1 ist mit einer Videokamera, insbesondere
einer CCD-Videokamera ("Charge Coupled Device") ausgestattet, die
den Bereich des Trägers 3 oberhalb
des Objektivs 18 aufnimmt. Das Videosignal dieser Videokamera
wird einem handelsüblichen
Computer ("Personal
Computer") 7 zugeführt und
dort mit einer Framegrapper-Karte verarbeitet, so dass das entsprechende
Videobild in Echtzeit auf dem Bildschirm oder dem Monitor 8 des
Computers 7 dargestellt werden kann. Ebenso ist ein Speichern
einzelner Videobilder auf einem geeigneten Speichermedium des Computers 7 möglich. Des
weiteren kann mit dem Computer 7 auch ein analoger oder
digitaler Videorekorder zum Aufzeichnen der von der Videokamera
gelieferten Videobilder gekoppelt sein. Wie nachfolgend noch näher beschrieben
wird, sind auf dem Com puter 7 bzw. der darauf ablaufenden
Software verschiedene Funktionen implementiert, die sowohl eine
rechnergestützte,
d.h. automatische, Ansteuerung der Laservorrichtung 4 als
auch des Mikroskops 1 ermöglichen, so dass beispielsweise
der Laser automatisch aktiviert und der Manipulator 2 bzw.
der Trägertisch 3 automatisch
verfahren werden können.
Zur Einstellung bzw. Auswahl dieser Funktionen sind herkömmliche
Eingabemittel, wie beispielsweise eine Tastatur 9 oder
eine Computermaus 10, vorgesehen. Des weiteren ist der
Laservorrichtung 4 ein Fußschalter 67 zugeordnet,
durch dessen Betätigung
der Laser manuell aktiviert werden kann.At the microscope 1 it can be an arbitrarily designed microscope. In particular, both the use of an inverted microscope as well as an upright microscope or a laser microscope is conceivable. The microscope 1 is equipped with a video camera, in particular a CCD video camera ("Charge Coupled Device"), which covers the area of the carrier 3 above the lens 18 receives. The video signal of this video camera is a commercial computer ("personal computer") 7 fed and processed there with a framegrapper card, so that the corresponding video image in real time on the screen or the monitor 8th of the computer 7 can be represented. Likewise, storing individual video images on a suitable storage medium of the computer 7 possible. Furthermore, with the computer 7 Also, an analog or digital video recorder for recording the video images supplied by the video camera to be coupled. As will be described in more detail below, are on the computer 7 or the software running on it implements various functions, which include both a computer-aided, ie automatic, control of the laser device 4 as well as the microscope 1 allow, for example, the laser is automatically activated and the manipulator 2 or the support table 3 can be moved automatically. To set or select these functions are conventional input means, such as a keyboard 9 or a computer mouse 10 , intended. Furthermore, the laser device 4 a footswitch 67 associated with the operation of which the laser can be activated manually.
Nachfolgend
sollen die bei dem in 1 gezeigten
System zur Steuerung des Mikroskops 1 bzw. des Trägertisches 3 und
des Manipulators 2 sowie des Lasers 4 vorgesehenen
Funktionen näher
erläutert
werden.Below are the in the in 1 shown system for controlling the microscope 1 or the support table 3 and the manipulator 2 as well as the laser 4 intended functions are explained in more detail.
Nach
dem Einschalten des Computers 7 wird auf dem Bildschirm 8 das
von der Videokamera augenblicklich aufgenommene Mikroskopbild mit
einer Markierung für
den Laser-Zielpunkt
dargestellt. Am unteren Bildschirmrand erscheint ein Statusfenster, während am
oberen Bildschirm ein in 3 näher dargestelltes
Menüfenster 19 zum
Aufrufen weiterer Menüfenster
geöffnet
wird. Das Steuerprogramm wird im wesentlichen über die in 1 gezeigte Computermaus 10,
vorzugsweise eine Drei-Tasten-Maus gesteuert, wobei jedoch auch
einige Funktionen durch entsprechende Tastenkombinationen der Tastatur 9 aufgerufen
werden können.After turning on the computer 7 will be on the screen 8th the microscope image currently recorded by the video camera is shown with a mark for the laser target point. A status window appears at the bottom of the screen, while the top screen displays a status window 3 detailed menu window 19 to open additional menu windows. The control program is essentially about the in 1 shown computer mouse 10 , preferably a three-button mouse controlled, but also some functions by keyboard shortcuts 9 can be called.
Im
wesentlichen kann zwischen zwei unterschiedlichen Betriebsmodi unterschieden
werden. Im sogenannten Cursor-Modus
können
mit Hilfe der Maus Menüs
geöffnet,
entsprechende Menüfunktionen
ausgewählt
und sogenannte Buttons angeklickt werden. Im Verfahr-Modus werden
hingegen Bewegungen der Maus 10 direkt in entsprechende
Verstellsignale und somit entsprechende mechanische Bewegungen des
Träger tisches 3 oder
des Manipulators 2 umgesetzt. Im Cursor-Modus können der Manipulator 2 oder
der Trägertisch 3 nicht
durch Hin- und Herbewegen der Maus 10 bewegt werden. Durch Betätigen beispielsweise
der mittleren Maustaste kann zwischen dem Cursor- und dem Verfahr-Modus hin-
und hergeschaltet werden. Der Verfahr-Modus besitzt verschiedene
Varianten, zwischen denen durch Betätigen beispielsweise der rechten
Maustaste hin- und hergeschaltet werden kann. So kann in einer ersten
Variante des Verfahr-Modus durch Bewegen der Maus 10 der
Trägertisch 3 in
xy-Richtung verschoben werden. D.h. durch Verschieben der Maus 10 nach
oben wird entsprechend der Trägertisch 3 in
dieselbe Richtung verschoben, was auf dem Bildschirm 8 anhand
des jeweils in Echtzeit aktualisierten Videobilds nachvollzogen
werden kann. Diese Zuordnung kann jedoch auch umgekehrt werden,
um beispielsweise beim Betrachten der Probe eine Übereinstimmung
zwischen der Verschiebung des sichtbaren Videobilds und der Mausbewegung herbeizuführen. In
einer zweiten Variante des Verfahr-Modus wird der Manipulator 2 entsprechend
der Mausbewegung in xy-Richtung verschoben, wobei hinsichtlich der
Ansteuerung des Manipulators 2 die vorhergehenden Bemerkungen
analog Gültigkeit
besitzen. In einer dritten Variante des Verfahr-Modus kann der Manipulator 2 entsprechend
der Mausbewegung in z-Richtung verschoben werden, so dass der Abstand
zwischen dem Trägertisch 3 und
dem Manipulator 2 entsprechend verändert wird. Vorzugsweise ist
immer ein XY-Verfahr-Modus, d.h. entweder der Trägertisch-XY-Modus oder der
Manipulator-XY-Modus, vorgewählt.
Solange der Verfahr-Modus im Hintergrund zwar gewählt, jedoch
noch nicht aktiviert ist, befindet sich die Steuerung im Cursor-Modus.Essentially, a distinction can be made between two different operating modes. In the so-called cursor mode, menus can be opened with the mouse, corresponding menu functions selected and so-called buttons clicked on. In the travel mode, however, movements of the mouse 10 directly into corresponding adjustment signals and thus corresponding mechanical movements of the support table 3 or the manipulator 2 implemented. In cursor mode, the manipulator 2 or the support table 3 not by moving the mouse back and forth 10 to be moved. By Pressing, for example, the middle mouse button, switches between the cursor and the travel mode. The traversing mode has different variants, between which you can switch back and forth by pressing, for example, the right mouse button. Thus, in a first variant of the traversing mode by moving the mouse 10 the carrier table 3 be moved in the xy direction. That is, by moving the mouse 10 upwards will be according to the support table 3 moved in the same direction, which is on the screen 8th can be understood on the basis of each updated in real time video image. However, this association can also be reversed to bring about a correspondence between the displacement of the visible video image and the movement of the mouse, for example when viewing the sample. In a second variant of the travel mode, the manipulator 2 shifted according to the mouse movement in the xy direction, with respect to the control of the manipulator 2 the preceding remarks have validity analogously. In a third variant of the travel mode, the manipulator 2 be moved according to the mouse movement in z-direction, so that the distance between the support table 3 and the manipulator 2 is changed accordingly. Preferably, an XY traversing mode, ie either the tray XY mode or the manipulator XY mode, is always preselected. As long as the traversing mode is selected in the background, but not yet activated, the control is in cursor mode.
Das
Statusfenster ist immer am unteren Bildschirmrand sichtbar und kann
(im Cursor-Modus) angeklickt und mit der Maus 10 verschoben
werden. Im Statusfenster wird unter anderem angezeigt, ob sich die
Steuerung augenblicklich im Cursor-Modus oder im Verfahr-Modus befindet.
Befindet sich die Steuerung im Verfahr-Modus, wird zudem die augenblicklich
aktivierte Variante des Verfahr-Modus (Trägertisch-XY-Modus, Manipulator-XY-Modus oder
Manipulator-Z-Modus) angezeigt. Des weiteren wird im Statusfenster
die Anzahl der für
den Trägertisch 3 augenblicklich
gespeicherten Positionswerte sowie der augenblicklich ausgewählte Trägertisch-Positionswert
angezeigt. Des weiteren wird im Statusfenster angezeigt, welcher
von drei möglichen
Geschwindigkeitsbereichen für
die Verstellung des Trägertisches 3 augenblicklich
ausgewählt
ist. Eine weitere Anzeige des Statusfensters gibt den in der Steuerung
augenblicklich ablaufenden aktiven Steuerbefehl wieder. Zudem werden
im Statusfenster die X- und Y-Koordinaten angezeigt, welche die
absolute Position (in μm)
des Mikroskop- bzw. Trägertisches,
bezogen auf die beim Programmstart vorgefundene Null-Position, definieren.
Schließlich
ist in dem Statusfenster auch der Radius (in μm) eines mit einer nachfolgend
noch näher
beschriebenen Funktion gezeichneten Kreises zum automatischen Ausschneiden
eines auf dem Träger
befindlichen biologischen Objekts dargestellt.The status window is always visible at the bottom of the screen and can be clicked (in cursor mode) and with the mouse 10 be moved. The status window shows, among other things, whether the controller is currently in cursor mode or in traversing mode. If the controller is in the travel mode, the currently activated variant of the travel mode (carrier table XY mode, manipulator XY mode or manipulator Z mode) is also displayed. Furthermore, in the status window, the number of for the support table 3 currently stored position values and the currently selected carrier table position value is displayed. Furthermore, the status window shows which of three possible speed ranges for the adjustment of the carrier table 3 is currently selected. Another display of the status window shows the active control command that is currently running in the control. In addition, the X and Y coordinates are displayed in the status window, which define the absolute position (in μm) of the microscope or support table, relative to the zero position found at program start. Finally, in the status window, the radius (in μm) of a circle drawn with a function to be described in more detail below is also shown for the automatic cutting out of a biological object located on the support.
Nachfolgend
sollen die im Cursor-Modus zur Verfügung stehenden Steuerfunktionen
näher erläutert werden.following
should be the control functions available in the cursor mode
be explained in more detail.
Wie
bereits zuvor erwähnt
worden ist, wird in der Regel nach dem Einschalten des Computers 7 auf
dem Bildschirm 8 das in 3 gezeigte
Menüfenster 19 dargestellt,
welches drei sogenannte Buttons 20–22 aufweist. Durch
Anklicken dieser Buttons 20–22 mit der Maus kann
jeweils ein weiteres, dem angeklickten Button zugewiesenes Menüfenster
aufgerufen und auf dem Bildschirm 8 geöffnet werden. Durch Anklicken
des Buttons 20 kann ein in 4 gezeigtes
Menüfenster
geöffnet
werden, welches die wesentlichen zur Steuerung des Trägertisches 3 vorgesehenen
Steuerfunktionen beinhaltet. Durch Anklicken des Buttons 21 kann
ein in 5 näher dargestelltes
Menüfenster
geöffnet
werden, welches automatische Schneide- und/oder Katapultierfunkti onen beinhaltet.
Durch Anklicken des Buttons 22 kann schließlich ein
in 6 dargestelltes Menüfenster geöffnet werden,
welches Steuerfunktionen für
den in 1 gezeigten Manipulator 2 aufweist.
Der Button 22 ist nur vorgesehen, wenn ein motorisierter,
computergesteuerter Manipulator 2 verwendet wird.As has been mentioned previously, usually after turning on the computer 7 on the screen 8th this in 3 shown menu window 19 shown, which three so-called buttons 20 - 22 having. By clicking on these buttons 20 - 22 With the mouse, another menu window assigned to the clicked button can be called up and displayed on the screen 8th be opened. By clicking the button 20 can an in 4 shown menu window are opened, which are the essential for controlling the support table 3 includes provided control functions. By clicking the button 21 can an in 5 opened more detailed menu window, which includes automatic cutting and / or Katapultierfunkti ones. By clicking the button 22 Finally, an in 6 displayed menu window, which control functions for the in 1 shown manipulator 2 having. The button 22 is only provided if a motorized, computer-controlled manipulator 2 is used.
Nachfolgend
sollen die einzelnen Funktionen des in 4 gezeigten Menüfensters 23 näher erläutert werden.Below are the individual functions of the in 4 shown menu window 23 be explained in more detail.
Wie
bereits zuvor erwähnt
worden ist, kann der Trägertisch
im Verfahr-Modus durch eine einfache Mausbewegung beliebig verfahren
bzw. verstellt werden. Befindet sich der Trägertisch 3 in einer
gewünschten
Position, kann wieder in den Cursor-Modus gewechselt und mit der
Maus der in 4 gezeigte
Button 24 angeklickt werden, so dass die aktuelle Position
des Trägertisches 3 gespeichert
wird. Gleichzeitig wird der bereits zuvor erwähnte Positionszähler im
Statusfenster um 1 erhöht.
Diese Schritte können
beliebig wiederholt werden, wenn weitere neue Positionswerte abgespeichert
werden sollen. Um einzelne Positionswerte leichter wiederauffinden zu
können,
kann beim Speichern jeder einzelne Positionswert mit einem positionsspezifischen
Kommentar versehen werden. Zu diesem Zweck ist der Button 25 vorgesehen,
bei dessen Anklicken mit der Maus 10 ein Kommentar-Fenster
geöffnet
wird, in welches ein der jeweiligen Position entsprechender Kommentar
eingegeben und abgespeichert werden kann. Durch Anklicken des Buttons 26 wird
ein Auswahlfenster für
die gespeicherten Positionswerte geöffnet, so dass der Benutzer
mit der Maus einen gewünschten
Punkt bzw. eine gewünschte
Position auswählen
kann, die anschließend
durch Erzeugung entsprechender Verstellsignale für die den Trägertisch 3 verstellenden
Motoren angefahren wird. Gleichzeitig wird im Statusfenster der
angefahrene Positionswert mit seiner fortlaufenden Nummer und dem
gespeicherten Kommentar angezeigt.As already mentioned above, the carrier table can be moved or adjusted in the travel mode by a simple mouse movement. Is the carrier table 3 in a desired position, you can switch back to the cursor mode and with the mouse in the 4 shown button 24 be clicked, so that the current position of the support table 3 is stored. At the same time, the previously mentioned position counter is incremented by 1 in the status window. These steps can be repeated as desired, if further new position values are to be saved. In order to be able to find individual position values more easily, each individual position value can be provided with a position-specific comment when saving. For this purpose, the button 25 provided by clicking with the mouse 10 a comment window is opened in which a comment corresponding to the respective position can be entered and stored. By clicking the button 26 a selection window is opened for the stored position values, so that the user can select with the mouse a desired point or a desired position, which subsequently by generating corresponding adjustment signals for the support table 3 is approaching adjusting motors. At the same time, the approached position value is displayed in the status window with its consecutive number and the saved comment.
Beim
Anklicken des Buttons 68 wird ein Fenster geöffnet, welches
ein Abspeichern der zuvor mit Hilfe der Buttons 24 oder 25 gespeicherten
Positionen gemäß der Auswahlliste
des Buttons 26 in Form eines Punkt- oder Positionsarrays
in Relation zu einem von dem Benutzer definierten Referenzpunkt
auf dem Objektträger
erlaubt. Dadurch können für jeden
Objektträger
bestimmte Positionen oder Punkte abgespeichert werden, die sich
nach erneutem Einlegen des Objektträgers und nach Aufsuchen des
Referenzpunktes wiederfinden lassen. Auf diese Weise können ausgewählte Bereiche
zu einem späteren
Zeitpunkt bearbeitet, d.h. dissektiert oder katapultiert, werden.By clicking the button 68 opens a window, which saves the previously using the buttons 24 or 25 stored positions according to the selection list of the button 26 in the form of a point or position array in relation to a reference point defined by the user on the slide. As a result, specific positions or points can be stored for each slide, which can be found again after reinserting the slide and after visiting the reference point. In this way, selected areas can be edited, ie dissected or catapulted, at a later time.
Durch
die in 4 gezeigten Buttons 27 und 28 des
Menüfensters 23 können die
gespeicherten Positionswerte nacheinander aufgerufen und angefahren
werden. Mit jedem Anklicken des Buttons 27 wird der jeweils
nächste
Positionswert aus der Liste angefahren, während durch Anklicken des Buttons 28 der
jeweils vorhergehende Positionswert in der Liste angefahren wird.
Mit Hilfe der beiden Buttons 29 und 30 können gespeicherte
Positionswerte gelöscht werden,
wobei durch Anklicken des Buttons 29 lediglich der augenblickliche
Positionswert in der Liste gelöscht
wird, während
durch Anklicken des Buttons 30 sämtliche in der Liste enthaltenen
Positionswerte gelöscht
werden.By the in 4 shown buttons 27 and 28 of the menu window 23 The stored position values can be called up and started one after the other. With each click of the button 27 the next position value from the list is approached while clicking the button 28 the previous position value in the list is approached. With the help of the two buttons 29 and 30 Saved position values can be deleted by clicking on the button 29 only the current position value in the list is deleted while clicking the button 30 all position values contained in the list are deleted.
Durch
Anklicken des Buttons 31 kann ein Fenster aufgerufen werden,
in dem für
das Anfahren gespeicherter Positionswerte eine Geschwindigkeit festgelegt
wird. Auch der in 4 gezeigte
Bereich 34 dient zur Einstellung der Geschwindigkeit, wobei durch
Auswählen
einer der drei dargestellten Geschwindigkeitsstufen für den Verfahr-Modus
die Geschwindigkeit für
die Umsetzung der Mausbewegung in eine entsprechende Trägertischbewegung
ausgewählt
werden kann. Der darunter befindliche Einstellbereich 35 erlaubt
diesbezüglich
eine Geschwindigkeit-Feineinstellung für die Umsetzung der Mausbewegung
im Verfahr-Modus.By clicking the button 31 A window can be opened in which a speed is set for approaching stored position values. Also the in 4 shown area 34 is used to adjust the speed, and by selecting one of the three illustrated speed levels for the travel mode, the speed for converting the mouse movement to a corresponding stage movement can be selected. The adjustment range underneath 35 allows in this regard a speed-fine adjustment for the implementation of the mouse movement in the travel mode.
Durch
Anklicken des Buttons 32 kann ein vorgegebener Bereich
des auf dem Träger
befindlichen biologischen Materials mäanderförmig abgefahren werden. Nach
Anklicken des Buttons 32 wird hierzu ein Fenster geöffnet, in
dem die Breite des abzufahrenden Bereichs in x-Richtung und die
Tiefe des abzufahrenden Bereichs in y-Richtung eingegeben werden
kann (in μm).
Des weiteren kann die Anzahl der Hin- und Herbewegungen, mit denen der ausgewählte Bereich
abgefahren werden soll, sowie die Geschwindigkeit für das Abfahren
eingestellt werden. Nach Eingabe dieser Werte kann durch Anklicken
einer START-Taste dieses Fensters das automatische Abfahren vom
aktuellen Punkt ausgehend gestartet werden. Das automatische Abfahren
kann jederzeit durch Betätigen
einer beliebigen Taste unterbrochen werden. Durch Anklicken eines
in dem Fenster dargestellten CONTINUE-Buttons kann das automatische
Abfahren von der zuletzt erreichten Position aus fortgeführt werden.
Durch Anklicken eines QUIT-Buttons kann das automatische Abfahren
beendet und das entsprechende Fenster geschlossen werden. Wie nachfolgend
noch näher
erläutert
wird, ist es auch möglich,
nach vorhergehender Auswahl eines gewünschten Bereichs mit Hilfe
eines Zeichentools des Menüfensters 37 durch
Anklicken des Buttons 32 diesen Bereich automatisch mäanderförmig zu
durchfahren.By clicking the button 32 For example, a predefined area of the biological material on the support can be moved meandering. After clicking the button 32 For this purpose, a window is opened in which the width of the area to be traversed in the x direction and the depth of the area to be traversed in the y direction can be entered (in μm). Furthermore, the number of reciprocations with which the selected area is to be traveled, as well as the speed for the departure can be adjusted. After entering these values, clicking on a START button of this window will start the automatic shutdown starting from the current point. The automatic shutdown can be interrupted at any time by pressing any key. By clicking on a CONTINUE button displayed in the window, the automatic shutdown can be continued from the last position reached. By clicking on a QUIT button, the automatic shutdown can be ended and the corresponding window closed. As will be explained in more detail below, it is also possible, after previously selecting a desired area using a drawing tool of the menu window 37 by clicking the button 32 to drive through this area automatically meandering.
Der
in 4 gezeigte Button 33 dient
zur Korrektur einer infolge eines Objektivwechsels eintretenden
Positionsverschiebung der optischen Abbildung. Bei einem Objektivwechsel
kommt es aufgrund der nicht genau übereinstimmenden optischen Achsen
der beiden Objektive zu einer Verschiebung des Zentrums der Bildschirmabbildung.
Die Position des Trägertisches 3 bleibt
erhalten, es verschiebt sich lediglich der Mittelpunkt der Bildschirmabbildung.
Um diese Verschiebung der Bildschirmabbildung zu korrigieren, empfiehlt
es sich, den Trägertisch 3 vor
einem Objektivwechsel in eine vordefinierte Position zu fahren.
Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass die auf dem
Bildschirm 8 dargestellte Laser-Markierung mit einem markanten Punkt
des auf dem Träger
befindlichen biologischen Materials zur Deckung gebracht wird. Anschließend kann
das Objektiv gewechselt werden. Befindet sich danach die Laser-Markierung
nicht über
dem zuvor gewählten
markanten Punkt des biologischen Materials, ist infolge des Objektivwechsels
eine Positionsverschiebung der optischen Abbildung eingetreten. Wird
nunmehr der Trägertisch 3 erneut
in die zuvor gewählte
vordefinierte Position gefahren, so dass sich die Laser-Markierung über dem
gewählten
markanten Punkt befindet, ist diese Verschiebung ein Maß für die infolge
des Objektivwechsels eingetretene Positionsverschiebung der optischen
Abbildung. Durch anschließendes
Anklicken des Buttons 33 wird diese nach dem Objektivwechsel
durchgeführte
Verschiebung des Trägertisches 3 erfasst
und alle zuvor gespeicherten Positionswerte bzw. die jeweils entsprechenden
X- und Y-Koordinaten um die erfasste XY-Verschiebung korrigiert.
Anschließend
entsprechen alle gespeicherten Positionswerte bzw. Positionskoordinaten
des Trägertisches 3 wieder
den gleichen charakteristischen Punkten.The in 4 shown button 33 serves to correct a position shift of the optical image occurring as a result of an objective change. When changing the objective, due to the not exactly matching optical axes of the two objectives, the center of the screen image is shifted. The position of the support table 3 is maintained, it shifts only the center of the screen image. To correct this shift of the screen image, it is recommended that the support table 3 to drive before a lens change in a predefined position. This can be achieved, for example, by having it on the screen 8th shown laser mark is brought to coincide with a prominent point of the biological material located on the support. Then the lens can be changed. If thereafter the laser marking is not above the previously selected prominent point of the biological material, a position shift of the optical image has occurred as a result of the objective change. Will now be the carrier table 3 again moved to the previously selected predefined position, so that the laser marker is located above the selected prominent point, this shift is a measure of the occurred as a result of the lens change position shift of the optical image. By clicking on the button 33 This is done after the lens change displacement of the support table 3 and corrects all previously stored position values or the respectively corresponding X and Y coordinates by the detected XY displacement. Subsequently, all stored position values or position coordinates of the support table correspond 3 again the same characteristic points.
Nach
einem nachfolgend noch näher
beschriebenen Katapultieren eines biologischen Objekts aus dem auf
dem Träger
befindlichen Material zu der an dem Manipulator 2 befindlichen
Aufhangvorrichtung ("Cap"), ist es sinnvoll,
durch Fokussieren auf das "Cap" zu begutachten,
ob das herauskatapultierte biologische Objekt tatsächlich in
dem "Cap" gefangen wurde.
Um die Auffangvorrichtung bzw. das "Cap" mit
dem Mikroskop betrachten zu können,
muss der Trägertisch 3 so
verschoben werden, dass sich einerseits das Mikroskop-Objektiv frei bewegen
kann und andererseits das biologische Material nicht beschädigt wird.
Durch Anklicken des Buttons 36 wird der Trägertisch 3 automatisch
auf einen vorher definierten, als "Checkpoint" bezeichneten Punkt gefahren, der derart
festgelegt worden ist, dass die zuvor beschriebenen Kriterien erfüllt sind und
das "Cap" mit dem Mikroskop
betrachtet werden kann.After a catapulting of a biological object described below in more detail from the material on the carrier to that on the manipulator 2 located "cap", it makes sense, by focus Check on the "cap" to see if the catapulted biological object was actually caught in the "cap". In order to view the catcher or the "cap" with the microscope, the support table 3 be moved so that on the one hand, the microscope objective can move freely and on the other hand, the biological material is not damaged. By clicking the button 36 becomes the carrier table 3 automatically to a pre-defined, referred to as "checkpoint" point driven, which has been set so that the criteria described above are met and the "Cap" can be viewed with the microscope.
Im
folgenden wird das in 5 gezeigte Menüfenster 37,
welches Steuerfunktionen zur automatischen Steuerung von Schneid-
und/oder Katapultiervorgängen
mittels Laserbestrahlung enthält, erläutert. Dieses
Menüfenster 37 enthält unter
anderem Funktionen zum Zeichnen von Kurvenverläufen sowie zum Messen von Distanzen
im Bildschirmfenster. Ein mit Hilfe dieses Menüfensters 37 definierter Kurvenverlauf
kann automatisch, d.h. rechnergestützt, in eine äquivalente
Bewegung des Trägertisches 3 umgesetzt
werden, so dass es möglich
ist, den Trägertisch 3 derart
relativ zu dem Laser zu verfahren, dass die tatsächliche Schnittlinie dem zuvor definierten
Kurvenverlauf folgt. Die Geschwindigkeit und Anzahl der Wiederholungen
des Schneidevorgangs lassen sich einstellen. Dasselbe gilt auch
für das
rechnergestützt
durchgeführte
Katapultieren, wobei auf analoge Art und Weise am Bildschirm zu katapultierende
biologische Objekte ausgewählt
und markiert werden können,
die anschließend
automatisch durch entsprechendes Verschieben des Trägertisches 3 über den
Laser gefahren und mit Hilfe eines automatisch oder manuell ausgelösten Laserschusses
herauskatapultiert werden können.The following is the in 5 shown menu window 37 , which contains control functions for the automatic control of cutting and / or catapulting processes by means of laser irradiation, explained. This menu window 37 contains, among other things, functions for drawing curve curves and for measuring distances in the screen window. On using this menu window 37 defined curve can automatically, ie computer-aided, in an equivalent movement of the support table 3 be implemented, so that it is possible to the support table 3 to move relative to the laser so that the actual cutting line follows the previously defined curve. The speed and number of repetitions of the cutting process can be adjusted. The same applies to the computer-assisted catapulting, whereby biological objects to be catapulted can be selected and marked in an analogous manner on the screen, which are then automatically adjusted by corresponding displacement of the support table 3 driven by the laser and can be catapulted out with the help of an automatically or manually triggered laser shot.
Nach
jedem Objektiv- oder Kamerawechsel sollte die Bewegung des Trägertisches 3 vor
Verwendung der in dem Menüfenster 37 angebotenen
Steuerfunktionen kalibriert werden. Durch dieses Kalibrieren wird
die Bildschirm- und Trägertischebene
zur Deckung gebracht, d.h. es wird eine Übereinstimmung des auf dem
Bildschirm dargestellten Videobilds mit der realen Trägertischposition
hergestellt. Die Kalibrierung kann durch Anklicken des in 5 gezeigten Buttons 38 gestartet
werden. Anschließend
wird auf dem Bildschirm 8 ein Kreuz dargestellt. Der Benutzer
muss nunmehr in den Verfahr-Modus wechseln und durch entsprechende
Mausbewegung den Trägertisch 3 so
verschieben, dass ein markanter Punkt des biologischen Materials
unter dem dargestellten Kreuz zu liegen kommt. Anschließend muss
der Benutzer wieder in den Cursor-Modus zurückkehren und beispielsweise
durch Drücken
der linken Maustaste das Anfahren des markanten Punktes bestätigen. Dieser
Vorgang wird insgesamt viermal wiederholt, so dass insgesamt vier
auf dem Bildschirm 8 dargestellte Kreuze mit dem jeweils
gewählten
markanten Bildpunkt zur Deckung gebracht werden. Bei jedem Wechsel
des Objektivs am Mikroskop oder der Videokamera bzw. beim Umschalten
auf eine andere Videokamera muss eine erneute Kalibrierung durchgeführt werden,
wobei die Zeilen der jeweils aktiven Videokamera derart ausgerichtet
sein müssen,
dass sie mit den Bildschirmzeilen übereinstimmen: Ergänzend wird
darauf hingewiesen, dass die zuvor beschriebene Kalibrierung im
Prinzip auch dann durchgeführt
werden kann; wenn lediglich zwei auf dem Bildschirm 8 dargestellten
Kreuze mit einem markanten Bildpunkt zur Deckung gebracht werden. Durch
das viermalige Anfahren dieses markanten Bildpunkts kann jedoch
die Genauigkeit der Kalibrierung erhöht werden.After each lens or camera change should be the movement of the support table 3 before using the in the menu window 37 calibrated control functions are offered. By this calibration, the screen and tray level is brought to coincide, that is, a match of the video image displayed on the screen with the real tray table position is established. The calibration can be done by clicking the in 5 shown buttons 38 to be started. Subsequently, on the screen 8th a cross is shown. The user now has to switch to travel mode and move the support table by moving the mouse 3 move so that a prominent point of the biological material comes to rest under the cross shown. Afterwards, the user must return to the cursor mode and confirm, for example, by pressing the left mouse button, the start of the marked point. This process is repeated a total of four times, leaving a total of four on the screen 8th shown crosses are brought to coincide with the particular selected pixel. Each time you change the lens on the microscope or the video camera or when switching to another video camera recalibration must be performed, with the lines of each active video camera must be aligned so that they match the screen lines: In addition, it is noted that the calibration described above can be carried out in principle even then; if only two on the screen 8th shown crosses are brought to a striking pixel to cover. However, the four-time approach of this striking pixel can increase the accuracy of the calibration.
Mit
dem Anklicken des Buttons 38 wird ein Fenster geöffnet, mit
dessen Hilfe die auf zuvor beschriebene Weise gewonnenen Kalibrierungsinformationen
für die
jeweils verwendete Mikroskopkonfiguration (z.B. für das jeweils
verwendete Objektiv) gespeichert werden können und somit auch nach Aus-
und Wiedereinschalten des Systems erhalten bleiben. Wird eine Mikroskopkonfiguration
bzw. ein Objektiv verwendet, für
welche bzw. für
welches bereits zuvor eine Kalibrierung durchgeführt worden ist, kann mit Hilfe
dieses Fensters die bereits zuvor abgespeicherte entsprechende Kalibrierungsinformation
abgerufen und zur entsprechenden Einstellung des Systems verwendet
werden.By clicking the button 38 a window is opened, with the aid of which the calibration information obtained in the manner described above can be stored for the respective microscope configuration used (eg for the lens used in each case) and thus retained even after the system has been switched off and on again. If a microscope configuration or a lens is used for which or for which a calibration has already been carried out beforehand, the previously stored corresponding calibration information can be retrieved using this window and used for the corresponding setting of the system.
Bei
jedem Objektivwechsel wird auch eine Neueinstellung der Laserfokuslage
bzw. der Laserenergie notwendig, welche sich zum Teil deutlich von einer
vorhergehenden Einstel lung unterscheiden kann. In dem nach Anklicken
des Buttons 38 geöffneten
Kalibrierungsfenster können
daher auch die in Abhängigkeit
vom jeweiligen Bearbeitungsvorgang und/oder von der jeweils verwendeten
Mikroskopeinstellung (Objektiv, Zwischenvergrößerung) zuvor ermittelte ideale
Laserfokuslage und/oder Laserenergieeinstellung, welche ein optimales
Schneiden bzw. Katapultieren ermöglichen,
abgespeichert und beispielsweise mit Hilfe eines weiteren Buttons
später wieder
abgerufen werden.With each lens change, a readjustment of the laser focus position or the laser energy is necessary, which may differ in some cases clearly from a previous SET ment. In the after clicking the button 38 open calibration window can therefore also the depending on the respective processing operation and / or the microscope used in each case (lens, intermediate magnification) previously determined ideal laser focus and / or laser energy setting, which allow optimal cutting or catapulting stored and, for example, with the help of another button be recalled later.
Wie
bereits erwähnt
worden ist, kann mit Hilfe des in 5 gezeigten
Menüfensters 37 ein
beliebiger Kurvenverlauf definiert werden, der anschließend als
Grundlage für
einen automatisch gesteuerten Schnittvorgang mit Hilfe der Laserbestrahlung dient.
Durch Anklicken des Buttons 42 kann auf dem Bildschirm 8 eine
kreisförmige
Schnittlinie gezeichnet werden. Zu diesem Zweck muss nach Anklicken
des Buttons 42 der auf dem Bildschirm 8 dargestellte
Cursor mit Hilfe der Maus 10 auf den gewünschten
Kreismittelpunkt gefahren und anschließend nach Drücken einer
Maustaste der Cursor auf den gewünschten
Kreisdurchmesser aufgezogen werden. Durch Betätigen der rechten Maustaste
kann die Farbe der kreisförmigen
Schnittlinie gewählt
oder auch der gezeichnete Kreis gelöscht werden. Ebenso ist es
möglich,
die von einem gezeichneten Kreis umschlossene Fläche berechen zu lassen, was
ebenfalls über das
nach Betätigen
der rechten Maustaste angebotene Menü möglich ist. Nach erfolgter Berechnung
wird der ermittelte Flächeninhalt
in einem separaten Fenster angezeigt. Ebenso kann durch Anklicken
des Buttons 69 eine rechteckförmige Schnittlinie gezeichnet
werden, wobei das Rechteck sich an den vier Eckpunkten sowie an
den Mittelpunkten der vier Seiten auf die gewünschte Form aufziehen und über die vier
Eckpunkte auch drehen lässt
(Winkelverschiebung). Auf analoge Art und Weise kann durch Anklicken
des Buttons 43 eine Freihandkurve auf dem Bildschirm 8 gezeichnet
werden, die anschließend als
Schnittkurve für
ein automatisch durchge führtes Schneiden
des auf dem Träger
befindlichen biologischen Materials verwendet wird. Dies soll nachfolgend
näher anhand
der Darstellungen in 8A–8C erläutert werden.As has already been mentioned, with the help of in 5 shown menu window 37 Any curve can be defined, which then serves as the basis for an automatically controlled cutting process using the laser irradiation. By clicking the button 42 can on the screen 8th drawn a circular section line. For this purpose, after clicking the button 42 the one on the screen 8th displayed cursor using the mouse 10 moved to the desired circle center and then after pressing a mouse button, the cursor on the desired th circle diameter are raised. By pressing the right mouse button, the color of the circular cut line can be selected or also the drawn circle can be deleted. It is also possible to calculate the area enclosed by a drawn circle, which is also possible via the menu offered after pressing the right mouse button. After the calculation has been completed, the determined area is displayed in a separate window. Similarly, by clicking the button 69 a rectangular cut line is drawn, the rectangle at the four corners and at the centers of the four sides on the desired shape and can also rotate over the four vertices (angular displacement). In an analogous way, by clicking the button 43 a freehand curve on the screen 8th are drawn, which is then used as a cutting curve for an automatic Runaway cutting the biological material located on the support. This will be explained in more detail below using the illustrations in 8A - 8C be explained.
8A zeigt die Bildschirmdarstellung
bzw. das Videobild vor dem Zeichnen einer Schnittlinie. Im vorliegenden
Fall handelt es sich beim dargestellten biologischen Material um
eine Bakterienpopulation, die planar auf dem Träger aufgebracht ist. Durch
Anklicken des Buttons 43 kann der Benutzer mit Hilfe einer
entsprechenden Mausbewegung den Cursor auf dem Bildschirm 8 bewegen,
so dass eine der Cursorbewegung folgende Freihandkurve 62 gezeichnet wird,
die in 8B strichpunktiert
dargestellt ist. Auch hinsichtlich einer bereits gezeichneten Freihandlinie
kann diese durch Betätigen
der rechten Maustaste wieder gelöscht
oder die Farbe der auf dem Bildschirm 8 dargestellten Freihandkurve
eingestellt werden. Zudem kann analog zu dem Fall einer kreisförmigen Kurve
die von der Freihandkurve umschlossene Fläche berechnet und angezeigt
werden. Durch Anklicken des in 5 gezeigten
Buttons 44 kann eine Radiergummifunktion aktiviert werden,
mit dessen Hilfe Teile der gezeichneten Freihandkurve 62 gelöscht werden
können.
Zu diesem Zweck ist insbesondere der Anfangspunkt für das Radieren
und der Endpunkt für
das Radieren anzuklicken, woraufhin der zu radierende Kurventeil
markiert und nach Bestätigung
durch den Benutzer gelöscht
wird. 8A shows the screen image or video image before drawing a cut line. In the present case, the illustrated biological material is a bacterial population that is applied planar to the carrier. By clicking the button 43 The user can move the cursor on the screen with the help of an appropriate mouse movement 8th move so that one of the cursor movement follows the freehand curve 62 is drawn in 8B dash-dotted lines is shown. Also with regard to an already drawn freehand line, this can be deleted by pressing the right mouse button or the color of the on screen 8th Freehand curve are set. In addition, analogous to the case of a circular curve, the area enclosed by the freehand curve can be calculated and displayed. By clicking on in 5 shown buttons 44 An eraser function can be activated with the help of which parts of the drawn freehand curve 62 can be deleted. For this purpose, in particular the starting point for the erasing and the end point for erasing is to be clicked, whereupon the curve part to be erased is marked and erased after confirmation by the user.
Anschließend kann
durch Betätigen
des Buttons 39 ein automatischer Schneidevorgang entlang der
auf dem Bildschirm 8 gezeichneten Kurve 62 durchgeführt werden,
d.h. der Computer 7 erzeugt automatisch Verstellsignale
für den
Trägertisch 3,
so dass dieser entsprechend der gezeichneten Freihandkurve 62 über den
Laserstrahl bewegt wird. In dem biologischen Material wird somit
durch die Laserbestrahlung eine Schnittlinie 63 ausgebildet,
die auch auf der Bildschirmdarstellung sichtbar ist und ein zuvor
durch die gezeichnete Freihandkurve 62 ausgewähltes biologisches
Objekt 64 umgibt und dieses von dem umgebenden biologischen
Material trennt. Die Geschwindigkeit, mit der dieser Laserschnitt
durchgeführt
wird, kann in einem Auswahlbereich 47 des Menüfensters 37 eingestellt
werden. Durch Betätigen
bzw. Anklicken des Buttons 40 kann der zuletzt durchgeführte Schneidevorgang
wiederholt werden, d.h. der Trägertisch 3 wird
automatisch nochmals entlang desselben Kurvenlaufs verfahren. Des
weiteren kann über
den Einstellbereich 48 die Anzahl der Wiederholungen beim
automatisch Schneiden festgelegt werden, so dass ein und derselbe
Schneidevorgang automatisch mehrmals nacheinander durchgeführt wird.Subsequently, by pressing the button 39 an automatic cutting process along the on screen 8th drawn curve 62 be carried out, ie the computer 7 automatically generates adjustment signals for the support table 3 , so that this according to the drawn freehand curve 62 is moved over the laser beam. In the biological material thus becomes a cutting line by the laser irradiation 63 trained, which is also visible on the screen display and a previously by the drawn freehand curve 62 selected biological object 64 surrounds and separates it from the surrounding biological material. The speed at which this laser cut is performed may be in a selection range 47 of the menu window 37 be set. By pressing or clicking on the button 40 the last performed cutting process can be repeated, ie the support table 3 is automatically moved again along the same cornering. Furthermore, over the adjustment range 48 the number of repetitions during automatic cutting are set so that one and the same cutting operation is automatically performed several times in succession.
Es
ist zu beachten, dass vor dem automatischen Schneidevorgang die
Laserleistung und/oder der Fokus des Laserstrahls in Abhängigkeit
von der zu bearbeitenden Probe eingestellt werden muss. Dies kann,
wie bereits zuvor erläutert
worden ist, über
das in 2 gezeigte Steuerpaneel
erfolgen.It should be noted that before the automatic cutting process, the laser power and / or the focus of the laser beam must be adjusted depending on the sample to be processed. This can, as has already been explained above, in the 2 shown control panel done.
Das
gemäß 8C ausgeschnittene biologische
Objekt 64 kann nunmehr mit Hilfe einer weiteren Laserbestrahlung
aus der biologischen Masse zu der an dem Manipulator 2 befindlichen
Auffangvorrichtung katapultiert werden. Wie später erläutert wird der Laserstrahl
hierzu auf eine zwischen dem Objekt und der biologischen Masse verbleibende
Verbindung gerichtet. Dazu sollte die Laserenergie gegenüber der
zum Schneiden verwendeten Laserenergie erhöht und/oder der Laserstrahl
gegenüber
dem zum Schneiden verwendeten Laserstrahl defokussiert werden, um
den angestrebten Photoneneffekt zu erhalten, der zum Herausschleudern
des gewünschten biologischen
Objekts 64 führt.
Untersuchungen haben ergeben, dass zum Katapultieren die Laserenergie
in der Regel um 10–25%,
vorzugsweise um 10–15%,
erhöht
werden sollte. Auch der Laserfokus kann zum Katapultieren entsprechend
prozentual verschoben werden, wobei insbesondere eine Verschiebung
des Brennpunktes um 1–2 μm gegenüber der
Objektebene durchgeführt
werden sollte. Ein einzelner Laserimpuls oder Laserschuss, der durch
einen kurzen Druck auf den in 1 gezeigten
Fußschalter 67 ausgelöst werden
kann, führt
anschließend
zum Herauskatapultieren des gewünschten
biologischen Objekts 64. Statt einer derartigen manuellen
Aktivierung des Laserimpulses ist auch eine von dem Computer 7 bzw.
der darauf implementierten Steuerung durchgeführte automatische Aktivierung des
Laserimpulses denkbar, wobei insbesondere auch die Laserenergie
und/oder der Laserfokus automatisch entsprechend eingestellt werden
kann.The according to 8C cut out biological object 64 can now with the help of a further laser irradiation from the biological mass to that on the manipulator 2 catapulted catcher. As explained later, the laser beam is directed to a connection remaining between the object and the biological mass. For this purpose, the laser energy should be increased in relation to the laser energy used for cutting and / or the laser beam should be defocused with respect to the laser beam used for cutting, in order to obtain the desired photon effect, which is required to eject the desired biological object 64 leads. Investigations have shown that for catapulting the laser energy should usually be increased by 10-25%, preferably by 10-15%. Also, the laser focus can be moved according to percentage for catapulting, in particular, a shift of the focal point should be performed by 1-2 microns relative to the object plane. A single laser pulse or shot by a short press on the in 1 shown footswitch 67 can then be triggered, catapults out the desired biological object 64 , Instead of such a manual activation of the laser pulse is also one of the computer 7 or the control implemented thereon, automatic activation of the laser pulse conceivable, wherein in particular also the laser energy and / or the laser focus can be automatically adjusted accordingly.
Wie
in 9B gezeigt ist, bleibt
nach dem Herauskatapultieren des gewünschten biologischen Objekts 64 eine
entsprechende Lücke 65 in
dem auf dem Träger
befindlichen biologischen Material zurück. Da das entsprechende biologische
Objekt 64 zuvor aus der umgebenden biologischen Masse herausgeschnitten
worden ist, weist das biologische Objekt 64 bzw. die Lücke 65 eine
sehr saubere Schnittlinie auf.As in 9B is shown after catapulting out the desired biological object 64 a corresponding gap 65 in the biological material on the support back. Because the corresponding biological object 64 previously excised from the surrounding biological mass has the biological object 64 or the gap 65 a very clean cut line.
Nur
der Vollständigkeit
halber sei an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass selbstverständlich auch
bereits separierte biologische Objekte 64 von dem Träger zu der
an dem Manipulator 2 befindlichen Auffangvorrichtung (beispielsweise
in Form eines Mikrozentrifugenbehälters) katapultiert werden
können. Für die Mikrodisksektion
einzelner Zellen oder einzelner biologischer Objekte ist in der
Regel eine geringere Schneide- und Katapultierenergie erforderlich.For the sake of completeness, it should be noted at this point that, of course, already separated biological objects 64 from the carrier to the manipulator 2 located collecting device (for example in the form of a microcentrifuge container) can be catapulted. Microdisk sectioning of individual cells or individual biological objects usually requires less cutting and catapulting energy.
Das
Katapultieren ausgewählter
biologischer Objekte 64 kann bei dem in 9A gezeigten System auch automatisch
durchgeführt
werden. Durch Anklicken des in 5 gezeigten
Buttons 41 kann eine beliebige Anzahl von biologischen
Objekten markiert werden, die anschließend automa tisch katapultiert
werden sollen. Zu diesem Zweck muss mit Hilfe der Computermaus 10 ein
nach dem Anklicken des Buttons 41 auf dem Bildschirm 8 sichtbarer
Marker auf das jeweils gewünschte
biologische Objekt bewegt und die Auswahl dieses biologischen Objekts beispielsweise
durch Betätigen
der linken Maustaste bestätigt
werden. Das auf diese Weise für
den nachfolgenden automatischen Katapultiervorgang ausgewählte biologische
Objekt erscheint anschließend entsprechend
markiert in dem auf dem Bildschirm 8 dargestellten Videobild.
Dieser Vorgang kann mehrmals wiederholt werden, so dass auf dem
Bildschirm 8 eine entsprechende Anzahl von ausgewählten biologischen
Objekten 66 markiert werden, wie es in 10A gezeigt ist. Im Statusfenster wird
die Anzahl der markierten biologischen Objekte 66 angezeigt.The catapulting of selected biological objects 64 can at the in 9A system also be performed automatically. By clicking on in 5 shown buttons 41 Any number of biological objects can be marked, which should then be automatically catapulted. For this purpose must with the help of the computer mouse 10 one after clicking the button 41 on the screen 8th visible marker moves to the respective desired biological object and the selection of this biological object, for example, by pressing the left mouse button be confirmed. The biological object selected in this way for the subsequent automatic cataphorping operation then appears appropriately marked in the on-screen 8th displayed video image. This process can be repeated several times, leaving on the screen 8th a corresponding number of selected biological objects 66 be marked as it is in 10A is shown. The status window shows the number of selected biological objects 66 displayed.
Anstelle
der zuvor beschriebenen Vorgehensweise, bei der der Laserfokus/die
Laserenergie vor dem Schneiden bzw. Katapultieren über das Steuerpaneel
auf geeignete Werte eingestellt werden, kann das System vorteilhafterweise
auch Buttons 39 automatisch die zuvor über das Kalibrierungsfenster
(Button 38) gespeicherten idealen Laserfokus- und Laserenergieeinstellungen
in Abhängigkeit
von der jeweils verwendeten Mikroskopkonfiguration ausgelesen und übernommen
werden. Hierzu kann eine automatische Erkennung der jeweils verwendeten
Mikroskopkonfiguration bzw. des jeweils verwendeten Objektivs vorgesehen
sein.Instead of the procedure described above, in which the laser focus / laser energy is set to suitable values before cutting or catapulting via the control panel, the system can advantageously also have buttons 39 automatically the previously via the calibration window (button 38 ) are read out and adopted as a function of the respectively used microscope configuration depending on the ideal laser focus and laser energy settings. For this purpose, an automatic recognition of the respectively used microscope configuration or of the lens used in each case can be provided.
Wie
bereits zuvor erläutert
worden ist, sollte zum Katapultieren der Laserstrahl stets auf einen Punkt
des gewünschten
biologischen Objekts bewegt werden, welcher ideal zum Katapultieren
geeignet ist. Dabei wird erfindungsgemäß beim Ausschneiden des entsprechenden
biologischen Objekts eine ca. 1–2 μm dünne Verbindung
zwischen dem gewünschten
biologischen Objekt und der umgebenden biologischen Masse belassen
und anschließend
zum Katapultieren den Laser exakt über diese dünne Verbindung gefahren, wo bei
der anschließende
Katapultiervorgang insbesondere auch ohne Defokussierung des Laserstrahls
durchgeführt
werden kann. Diese Vorgehensweise besitzt den Vorteil, dass vor
dem Katapultiervorgang ein ungewolltes Herausfallen oder Verschieben
des zuvor ausgeschnittenen biologischen Objekts vermieden werden
kann.As
previously explained
should be, to catapult the laser beam always to a point
of the desired
biological object, which is ideal for catapulting
suitable is. It is according to the invention when cutting the corresponding
biological object about a 1-2 micron thin connection
between the desired
biological object and the surrounding biological mass
and subsequently
For catapulting the laser drove exactly over this thin connection, where at
the subsequent one
Catapulting especially without defocusing the laser beam
carried out
can be. This approach has the advantage that before
the catapulting an unintentional falling out or moving
of the previously cut out biological object are avoided
can.
Die
Buttons 42, 43 und 69 dienen nicht nur zur
Definition einer geeigneten Schnittlinie, sondern können auch
zur Auswahl eines gewünschten
Areals verwendet werden, wobei anschließend durch Anklicken des Buttons 32 des
in 4 gezeigten Menüfensters 23 das
somit ausgewählte
Areal automatisch durch mäanderförmiges Abrastern
durchfahren wird. Dies geschieht Vorzugsweise bei einer größeren Vergrößerung,
so dass auch sehr kleine Punkte des beobachteten Präparats tatsächlich aufgefunden werden
können.
Sobald ein interessanter Punkt auftaucht, kann das mäanderförmige Abfahren
gestoppt und die entsprechende Position mit Hilfe der in 4 gezeigten Buttons 24 oder 25 abgespeichert
werden. Anschließend
kann das mäanderförmige Abfahren wieder
fortgesetzt werden. Die Geschwindigkeit sowie die Schrittweite des
mäanderförmigen Abfahrens kann
jeweils individuell eingestellt werden.The buttons 42 . 43 and 69 not only serve to define a suitable cutting line, but can also be used to select a desired area, and then by clicking the button 32 of in 4 shown menu window 23 the thus selected area is automatically traversed by meander-shaped scanning. This is preferably done at a larger magnification, so that even very small points of the observed preparation can actually be found. As soon as an interesting point emerges, the meandering downhill can be stopped and the corresponding position with the help of the in 4 shown buttons 24 or 25 be stored. Subsequently, the meandering departure can be continued again. The speed and the step size of the meandering shutdown can each be set individually.
Mit
Hilfe der Funktion des Buttons 41 kann auch eine Mikroinjektion
für gewünschte Zellen durchgeführt werden.
Wie zuvor beschrieben worden ist, werden hierzu die zu injizierenden
Zellen aus einem Verbund ausgewählt
und rechnergestützt
sehr präzise
am Injektionsort (beispielsweise am Zellkernbereich) markiert. Durch
anschließende
Betätigung des
Buttons 41 werden nunmehr die gewünschten Zellen automatisch
angefahren und mit Hilfe des Lasers automatisch gezielt ein einziges
Loch in die jeweils angefahrene Zelle geschossen, um beispielsweise
ein bestimmtes Gen zu injizieren. Dieses Verfahren kann auch lediglich
zur Markierung von Zellen oder von unbelebter Materie (sogenannte
Mikrogravur) verwendet werden.With the help of the function of the button 41 Microinjection may also be performed for desired cells. As described above, for this purpose, the cells to be injected are selected from a composite and computer-aided marked very precisely at the injection site (for example, at the nucleus area). By subsequently pressing the button 41 Now, the desired cells are automatically approached and automatically targeted with the help of the laser shot a single hole in each cell used, for example, to inject a particular gene. This method can also be used only for marking cells or inanimate matter (so-called microgravity).
Zur
Abtrennung, d.h. Selektion, der mikroinjizierten bzw. mikrogravierten
Zellen mit dem Laser, müssen
die entsprechenden Zellen auf einer Trägerfolie der zuvor beschriebenen
Art gezüchtet
werden. Mit Hilfe der Buttons 42, 43 oder 69 kann
anschließend
eine Schnittlinie um die ge wünschten
Zellen gezeichnet und mit Hilfe des Lasers entlang der vorgezeichneten
Schnittlinie geschnitten werden, so dass eine Membran- oder Folieninsel
mit den darauf liegenden Objekten entsteht. Dieser Membran- oder Folienteil
dient als Transportmedium für
die darauf liegenden Objekte, so dass bei Setzen eines weiteren
Laserschusses der Membran- bzw. Folienteil zusammen mit den darauf
liegenden Objekten herausgeschossen und anschließend weiterkultiviert werden
kann. Auf ähnliche
Art und Weise können
auch lebende Zellen aus frischen Abstrich- oder Quetschpräparaten
gewonnen werden.For separation, ie selection, of the microinjected or microgravated cells with the laser, the corresponding cells must be grown on a carrier foil of the type described above. With the help of the buttons 42 . 43 or 69 Subsequently, a cutting line can be drawn around the desired cells and cut with the aid of the laser along the predetermined cutting line so that a membrane or film island is formed with the objects lying thereon. This membrane or film part serves as a transport medium for the objects lying on it, so that when setting a further laser shot of the membrane or film part together with the objects lying on it out can be shot and then further cultivated. Similarly, live cells can also be obtained from fresh smear or squeeze preparations.
Da
der mit Hilfe des Mikroskops 1 betrachtete Bereich des
Objektträgers
auf Grund der installierten Videokamera kontinuierlich auf den Monitor
oder Bildschirm 8 des Computers 7 dargestellt
wird, ist eine interaktive Kontrolle oder Steuerung des Schneide-
und/oder Katapultiervorgangs durch den jeweiligen Benutzer möglich. Jeder
Schnitt- oder Katapultiervorgang hinterlässt auf dem Bildschirm 8 in Abhängigkeit
von der verwendeten Bildverarbeitungssoftware eine helle Linie,
die als Diskriminierungsparameter für ein sauberes bzw. vollständiges Ausschneiden
oder Katapultieren verwendet werden kann. Erkennt der Benutzer durch
Betrachten des Bildschirms 8, dass die Schnitt- oder Katapultierlinie nicht „sauber" ist, kann er eine
Wiederholung des Schnitt- oder Katapultiervorgangs veranlassen und dazu
möglicherweise
die Laserenergie und/oder die Laserfokuslage neu einstellen bzw.
korrigieren.Since the with the help of the microscope 1 observed area of the slide due to the installed video camera continuously on the monitor or screen 8th of the computer 7 is shown, an interactive control or control of the cutting and / or catapulting operation by the respective user is possible. Every cutting or catapulting process leaves on the screen 8th depending on the image processing software used, a bright line that can be used as a discrimination parameter for a clean or complete cut or catapult. Detects the user by viewing the screen 8th that the cutting or catapulting line is not "clean", it can cause a repetition of the cutting or catapulting process and possibly reset or correct the laser energy and / or the laser focus position.
In 5 ist ein weiterer Button 70 dargestellt,
mit dessen Hilfe größere Areale
der zu bearbeitenden biologischen Masse direkt vom Glas-Objektträger abgetragen
werden können.
Zu diesem Zweck wird zunächst
mit Hilfe der zuvor beschriebenen Buttons 42, 43 oder 69 ein
zu bearbeitender Bereich der biologischen Masse markiert oder ausgewählt. Bei Anklicken
des Buttons 70 wird ähnlich
zu dem zuvor beschriebenen mäanderförmigen Abrastern
durch eine entspre chende Ansteuerung des Trägertisches 3 die gesamte
Fläche
des markierten Bereichs abgefahren und der Laser derart angesteuert,
dass mittels einer schnellen Laserschussserie einzelne Objekte aus
dem markierten Bereich herauskatapultiert und somit der gesamte
markierte Bereich ablatiert wird. Objekte, die nicht über eine
Trägerfolie
oder eine Trägermembran
miteinander verbunden sind, werden auf diese Weise nicht als Ganzes
herausgeschossen, sondern werden einzeln in die Auffangvorrichtung 2 katapultiert,
so dass sie für
eine nachfolgende genetische oder proteomische Analyse zur Verfügung stehen.
Die Rasterpunkte für
die einzelnen Laserschüsse
können
vom Benutzer bestimmt werden, wobei insbesondere der Abstand der
Rasterpunkte in Mikrometern auswählbar
ist. Auf diese Weise lassen sich in Abhängigkeit von der eingestellten
Laserenergie ganze Areale der biologischen Masse ablatieren, um
größere Areale
ohne Verwendung einer zusätzlichen
Trägerfolie
oder Trägermembran
zur Gewinnung einzelner Objekte in die Auffangvorrichtung 2 zu
katapultieren oder auch unerwünschtes
Material vom Objektträger
zu entfernen.In 5 is another button 70 shown, with the help of larger areas of the biological mass to be processed can be removed directly from the glass slide. For this purpose, first using the buttons described above 42 . 43 or 69 a region of the biological mass to be processed is marked or selected. By clicking the button 70 is similar to the previously described meandering scanning by a corre sponding control of the support table 3 the entire surface of the marked area is traversed and the laser is controlled in such a way that individual objects are catapulted out of the marked area by means of a fast laser shot series and thus the entire marked area is ablated. Objects that are not connected to each other via a carrier film or a carrier membrane are not shot out as a whole in this way, but are individually in the collecting device 2 catapulted so that they are available for subsequent genetic or proteomic analysis. The grid points for the individual laser shots can be determined by the user, wherein in particular the spacing of the grid points in micrometers can be selected. In this way, depending on the set laser energy, entire areas of the biological mass can be ablated to larger areas without the use of an additional carrier foil or carrier membrane for obtaining individual objects in the collecting device 2 catapult or even remove unwanted material from the slide.
Eine
besondere Funktion stellt der in 5 gezeigte
Button 45 dar. Durch Anklicken dieses Buttons kann eine
Distanzmessung eingeschaltet werden. Wird anschließend beispielsweise
durch Betätigen
der linken Maustaste ein Anfangspunkt auf dem dargestellten Videobild
angewählt
und der Cursor bei weiterhin gedrückter linker Maustaste zu einem
gewünschten
Endpunkt bewegt, wird nach Loslassen der entsprechenden Maustaste
automatisch die Distanz zwischen dem gewählten Anfangspunkt und dem
gewählten
Endpunkt ermittelt und auf dem Bildschirm 8 dargestellt.
Durch erneutes Anklicken des Buttons 45 kann die Distanzmessungsfunktion
wieder ausgeschaltet werden.A special feature is the in 5 shown button 45 By clicking this button, a distance measurement can be switched on. If, for example, by pressing the left mouse button, a starting point on the displayed video image is selected and the cursor moves to a desired end point while the left mouse button is pressed, the distance between the selected starting point and the selected end point is automatically determined after releasing the corresponding mouse button screen 8th shown. By clicking again on the button 45 the distance measuring function can be switched off again.
Der
ebenfalls in 5 gezeigte
Button 46 hat das Löschen
sämtlicher
Markierungen auf dem Bildschirm 8 zur Folge. D.h. nach
Anklicken des Buttons 46 werden alle auf dem Bildschirm 8 gezeichneten Schnittkurven
und alle zum Katapultieren markierten Punkte gelöscht.The also in 5 shown button 46 has cleared all markers on the screen 8th result. That means after clicking the button 46 will all be on the screen 8th drawn cutting curves and all points marked for catapulting deleted.
Des
weiteren ist in 5 ein
Anzeigenbereich 49 dargestellt, wobei in diesem Anzeigenbereich 49 stets
die laufende Nummer des aktuell angefahrenen Punktes bei einer zum
Katapultieren zuvor markierten Punkteschar dargestellt wird.Furthermore, in 5 an ad area 49 shown in this ad area 49 always the running number of the currently approached point is displayed at a previously marked for catapulting point crowd.
Nachfolgend
sollen kurz die Steuerfunktionen des zur Steuerung des Manipulators 2 vorgesehenen
Menüfensters
erläutert
werden, welches durch Anklicken des in 3 gezeigten Buttons 22 aufgerufen
bzw. geöffnet
werden kann. Das entsprechende Menüfenster 50 ist ist 6 dargestellt.Below are briefly the control functions of the control of the manipulator 2 provided menu window can be explained, which by clicking the in 3 shown buttons 22 can be opened or opened. The corresponding menu window 50 is is 6 shown.
Durch
Anklicken des in 6 gezeigten
Buttons 51 kann der Manipulator 2 in eine zuvor
definierte und abgespeicherte Home-Position gefahren werden. Diese
Home-Position entspricht einer Position des Manipulators 2,
bei der sich der Manipulator 2 außerhalb des Sichtfeldes befindet
und bestückt
werden kann. Entsprechend kann durch Anklicken des Buttons 52 der
Manipulator 2 in die sogenannte Target-Position gefahren werden, welche der
eigentlichen Arbeitsposition des Manipulators 2 entspricht und
insbesondere zum Aufsammeln von herauskatapultierten biologischen
Objekten verwendet wird. In dieser Target-Position befindet sich
der Manipulator 2 bzw. die daran befestigte Auffangvorrichtung
im Sichtfeld über
dem Träger
des biologischen Materials. Über
dem unter den Buttons 51 und 52 befindlichen Einstellbereich 53 kann
analog zu dem in 4 gezeigten
Menüfenster 23 die
Geschwindigkeit der automatischen Manipulatorbewegung in drei Geschwindigkeitsstufen
grob eingestellt werden. Mit Hilfe des darunter befindlichen Schiebers 54 kann
zusätzliche
eine Feineinstellung der Anfahrgeschwindigkeit von 1–100% vorgenommen
werden.By clicking on in 6 shown buttons 51 can the manipulator 2 be moved to a previously defined and stored home position. This home position corresponds to a position of the manipulator 2 in which the manipulator 2 located outside the field of view and can be equipped. Accordingly, by clicking on the button 52 the manipulator 2 be moved into the so-called target position, which is the actual working position of the manipulator 2 corresponds and is used in particular for collecting out catapulted biological objects. In this target position is the manipulator 2 or the collecting device attached thereto in the field of view above the carrier of the biological material. Above the below buttons 51 and 52 located adjustment range 53 can be analogous to that in 4 shown menu window 23 the speed of the automatic manipulator movement in three speed levels are roughly adjusted. With the help of the slider below 54 In addition, a fine adjustment of the approach speed of 1-100% can be made.
Der
Zahlenwert unterhalb des Schiebers 54 zeigt den jeweils
aktuell eingestellten Prozentsatz an.The number below the slider 54 shows the currently set percentage.
Die
in den 4–6 gezeigten und zuvor erläuterten
Menüfenster 23, 37 bzw. 50 fassen
die wichtigsten Steuerfunktionen des in 1 gezeigten Systems zusammen und dienen
dazu, dass auch ein unerfahrener Anwender möglichst rasch auf diese Steuerfunktionen
zugreifen kann. Neben diesen Menüfenstern
wird am oberen Bildschirmrand ständig
eine Menüleiste
angeboten, welche mehrere nebeneinander angeordnete Menüpunkte aufweist,
bei deren Anklicken Untermenüs
(sogenannte "Pull-Down-Menüs") geöffnet werden,
um weitere Einstellungen vorzunehmen. Alle Steuerfunktionen der
in 4–6 gezeigten
Menüfenster
sind auch in diesen "Pull-Down-Menüs" enthalten.The in the 4 - 6 shown and previously he clarified menu window 23 . 37 respectively. 50 summarize the main control functions of the 1 The system shown together and serve that even an inexperienced user can access these control functions as quickly as possible. In addition to these menu windows, a menu bar is constantly being offered at the top of the screen, which has several menu items arranged next to one another, with which submenus (so-called "pull-down menus") are opened in order to make further settings. All control functions of in 4 - 6 shown menu windows are also included in these "pull-down menus".
So
enthält
diese Menüleiste
beispielsweise einen Menüpunkt "File", bei dessen Anklicken
Informationen über
die aktuelle Programmversion aufgerufen, das aktuelle Video- bzw.
Kamerabild auf einem ausgewählten
Speichermedium gespeichert oder das Steuerprogramm beendet werden
kann. Des weiteren weist die Menüleiste
einen Menüpunkt "Optik" auf, der Funktionen
zur Konfiguration der Bildschirmwiedergabe des Kamerabilds enthält. Unter diesem
Menüpunkt
kann beispielsweise die Wiedergabe der drei Grundfarben Rot, Grün und Blau
sowie der Kontrast und die Helligkeit der Bildschirmdarstellung
verändert
werden, wobei die unter diesem Menüpunkt vorgenommenen Einstellungen
auch Einfluss auf die als Datei gespeicherte Kamerabilder haben.So
contains
this menu bar
for example, a menu item "File", by clicking on it
information about
called the current program version, the current video or
Camera image on a selected
Storage medium saved or the control program will be terminated
can. Furthermore, the menu bar indicates
a menu item "optics" on the functions
for configuring the screen playback of the camera image. Under this
menu item
For example, you can play the three basic colors red, green and blue
as well as the contrast and the brightness of the screen display
changed
with the settings made under this menu item
also affect the camera images stored as a file.
Ein
weiterer Menüpunkt "Stage" der am oberen Bildschirmrand
dargestellten Menüleiste
umfasst einige Funktionen der in 4 und 5 gezeigten Menüfenster.
Zudem kann unter diesem Menüpunkt die
automatische Bewegung des Trägertisches 3 derart
konfiguriert werden, dass die Bewegung auf eine wählbare Koordinatenachse
beschränkt
bleibt oder eine horizontale Mausbewegung in eine seitenverkehrte horizontale
Bewegung des Trägertisches 3 umgesetzt
wird. Für
das automatische Schneiden können
die entsprechenden Steuerparameter (Radius der Kreisbewegung in μm, Anzahl
der Wiederholungen, Schnittgeschwindigkeit etc.) eingestellt werden.
Darüber
hinaus kann unter diesem Menüpunkt auch
das Rechteck konfiguriert werden, welches für ein mäanderförmiges Abfahren der auf dem
Träger befindlichen
biologischen Masse verwendet wird (vergleiche den in 4 gezeigten Button 32).
Zusätzlich
kann unter diesem Menüpunkt
eine bestimmte Verfahrposition des Trägertisches 3 als Referenzposition
für alle
gespeicherten Positionswerte definiert werden. Sollte zu einem späteren Zeitpunkt
dieselbe biologische Probe wiederverwendet werden, lässt sich
somit der Bezug zu früher
gespeicherten Koordinaten wiederherstellen. Damit die Referenzposition
auf der biologischen Probe wiedergefunden werden kann, sollte sie
dauerhaft gekennzeichnet sein (beispielsweise durch eine entsprechende
Lasermarkierung).Another menu item "Stage" of the menu bar displayed at the top of the screen contains some of the functions in 4 and 5 shown menu window. In addition, under this menu item, the automatic movement of the support table 3 be configured so that the movement remains limited to a selectable coordinate axis or a horizontal mouse movement in a reversed horizontal movement of the support table 3 is implemented. For automatic cutting, the corresponding control parameters (radius of the circular movement in μm, number of repetitions, cutting speed, etc.) can be set. In addition, under this menu item, the rectangle can be configured, which is used for a meandering departure of the biological mass on the carrier (see the in 4 shown button 32 ). In addition, under this menu item, a specific movement position of the support table 3 be defined as a reference position for all stored position values. Should the same biological sample be reused at a later date, the relation to previously stored coordinates can be restored. In order for the reference position to be retrievable on the biological specimen, it should be permanently marked (for example by an appropriate laser marking).
Ein
weiterer Menüpunkt "Manipulator" der am oberen Bildschirmrand
dargestellten Menüleiste betrifft
die Steuerung des Manipulators 2 und umfasst sämtliche
der in 6 gezeigten Steuerfunktionen. Zudem
kann unter diesem Menüpunkt
die aktuelle Manipulatorfunktion als Target-Position oder Home-Position
gespeichert werden (vergleiche die in 6 gezeigten
Buttons 51 und 52, mit denen diese Positionen
automatisch wiederangefahren werden können). Des weiteren kann unter
diesem Menüpunkt
festgelegt werden, in welcher Reihenfolge die drei Koordinatenachsen
bei der Bewegung des Manipulators 2 von und zur Home-Position
abgefahren werden sollen. Durch eine geeignete Wahl dieser Einstellung
kann der Manipulator 2 veranlasst werden, Hindernisse zu
umfahren, so dass verhindert werden kann, dass der Manipulator 2 die
daran befestigte Auffangvorrichtung oder die auf dem Träger befindliche
biologische Probe durch eine Bewegung des Manipulators beschädigt wird.
Um eine Beschädigung
der Probe zu verhindern, sollte die z- Richtung beim Herausfahren des Manipulators 2 als
erste und beim Hereinfahren des Manipulators 2 als letzte
gefahren werden. Zudem kann unter diesem Menüpunkt auch die Zuordnung zwischen
der Mausbewegung und der Manipulatorbewegung hinsichtlich der X-,
Y- und Z-Koordinate umgekehrt werden.Another menu item "Manipulator" of the menu bar displayed at the top of the screen concerns the control of the manipulator 2 and includes all of the in 6 shown control functions. In addition, under this menu item, the current manipulator function can be stored as a target position or home position (compare the in 6 shown buttons 51 and 52 with which these positions can be automatically restarted). Furthermore, it can be determined under this menu item, in which order the three coordinate axes in the movement of the manipulator 2 to be traveled from and to the home position. By a suitable choice of this setting, the manipulator 2 be caused to avoid obstacles, so that it can be prevented that the manipulator 2 the collecting device attached thereto or the biological sample on the carrier is damaged by a movement of the manipulator. In order to prevent damage to the sample, the z-direction when moving out of the manipulator should 2 as the first and when driving in the manipulator 2 be driven as last. In addition, under this menu item, the association between the mouse movement and the manipulator movement with respect to the X, Y and Z coordinates can be reversed.
Die
Menüleiste
weist des weiteren einen "Lasermarker"-Menüpunkt
auf, über
den die Bildschirmdarstellung des Lasermarkers konfiguriert werden kann.
Der Lasermarker zeigt denjenigen Ort an, an dem der Laserstrahl
bei Auslösung
auf die auf dem Träger
befindliche Probe trifft. Durch Anklicken dieses Menüpunkts kann
beispielsweise das in 7 gezeigte
Konfigurationsfenster 55 geöffnet werden. Mit Hilfe des
Auswahlbereichs 56 kann das zur Darstellung des Laserauftreffpunktes
gewählte
Symbol, mit dem der Laser auf dem Bildschirm 8 dargestellt wird,
ausgewählt
werden. Beim dargestellten Beispiel ist als Lasermarkierung ein
Fadenkreuz ausgewählt.
Ist das Kästchen 57 aktiviert,
wird die Darstellung des Lasermarkers auf dem Bildschirm 8 nach Anklicken
des Buttons 60 gelöscht.
Durch Aktivierung des Kästchens 58 kann
nach anschließendem Anklicken
des Buttons 60 der Lasermarker mit der Maus verschoben
werden. Es erscheint dann ein durch Bewegung der Maus verschiebbares
Positionierungskreuz, wobei beispielsweise durch Drücken der
linken Maustaste die aktuelle Position dieses Positionierungskreuzes
als neue Lasermarkerposition übernommen
werden kann. Durch Anklicken des Buttons 59 kann ein Fenster
zur Auswahl der Darstellungsfarbe des Lasermarkers geöffnet werden.
Durch Anklicken des Buttons 61 können schließlich alle vorgenommenen Änderungen
verworfen und die im Speicher befindliche Position des Lasermarkers
geladen werden. Anschließend
wird das Fenster 55 geschlossen.The menu bar also has a "laser marker" menu item via which the screen display of the laser marker can be configured. The laser marker indicates the location where the laser beam strikes the sample on the carrier when triggered. By clicking this menu item, for example, the in 7 shown configuration window 55 be opened. Using the selection area 56 can be the symbol chosen to represent the point of laser impact, with which the laser on the screen 8th is displayed. In the example shown, a crosshair is selected as the laser mark. Is that box 57 Activated, the display of the laser marker is on the screen 8th after clicking the button 60 deleted. By activating the box 58 can after clicking the button 60 the laser marker can be moved with the mouse. It then appears a displaceable by movement of the mouse positioning cross, which, for example, by pressing the left mouse button, the current position of this positioning cross can be adopted as a new laser marker position. By clicking the button 59 A window for selecting the display color of the laser marker can be opened. By clicking the button 61 Finally, all changes made can be discarded and loaded in the memory position of the laser marker can be loaded. Subsequently, the window becomes 55 closed.
Die
Menüleiste
weist schließlich
auch einen Menüpunkt "Cut" auf, in dem sämtliche
Steuerfunktionen des in 5 gezeigten
Menüfensters 37 zusammengefasst
sind, die insbesondere zum automatischen Schneiden und/oder Katapultieren
dienen. Darüber
hinaus sind hier auch Steuerfunktionen denkbar, mit denen rechnergestützt verschiedene Laserenergie/Laserfokuseinstellungen
vorgenommen oder von dem in 2 gezeigten
Steuerpaneel übernommen
und abgespeichert werden können,
um diese gespeicherten Werte anschließend abzurufen und automatisch
einzustellen. Für
diese Funktionen können
beispielsweise auch in dem in 5 gezeigten
Menüfenster 37 entsprechende
Buttons/Schieberegler etc. vorgesehen werden.Finally, the menu bar also has a menu item "Cut" in which all the control functions of the in 5 shown menu window 37 are summarized, which are used in particular for automatic cutting and / or catapulting. In addition, control functions are also conceivable here, with which computer-assisted different laser energy / laser focus settings are made or from the in 2 shown control panel can be stored and stored to retrieve these values stored and set automatically. For these functions, for example, in the in 5 shown menu window 37 appropriate buttons / sliders, etc. are provided.