DE19962828A1

DE19962828A1 - Screeningsverfahren für Chemotherapeutika

Info

Publication number: DE19962828A1
Application number: DE19962828A
Authority: DE
Inventors: Peter Krammer; Soeren Eichhorst; Min Li-Weber; Martina Mueller-Schilling
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1999-12-23
Filing date: 1999-12-23
Publication date: 2001-07-12
Also published as: JP2003518389A; CA2395524A1; WO2001048238A3; WO2001048238A2; AU3151601A; EP1246940A2; US20030157502A1

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Untersuchung, ob eine Testverbindung für eine Chemotherapie wirksam ist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt: a) Bereitstellung einer DNA-Sequenz, die die Figur 5A dargestellte AP-1-Stelle als Bestandteil eines Promotors, vorzugsweise des CD95L-Promotors, umfaßt, der mit einem Reportergen oder dem CD95L-Gen funktionell verknüpft ist, b) Inkontaktbringen der DNA-Sequenz von a) mit der Testverbindung in einem zellulären Assay und c) Bestimmung der Aktivierung des Promoters, wobei eine Aktivierung anzeigt, daß die Testverbindung für eine Chemotherapie wirksam ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersu chung, ob eine Testverbindung für eine Chemotherapie wirksam ist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt: a) Bereit stellung einer DNA-Sequenz, die die in Fig. 5A dargestellte AP-1-Stelle als Bestandteil eines Promotors, vorzugsweise des CD95L-Promotors, umfaßt, der mit dem CD95L-Gen oder einem Reportergen funktionell verknüpft ist, b) Inkontaktbringen der DNA-Sequenz von a) mit der Testverbindung in einem zellulären Assay und c) Bestimmung der Aktivierung des Promotors, wobei eine Aktivierung anzeigt, daß die Testverbindung für eine Chemotherapie wirksam ist.

Die Umwandlung von normalen Zellen zu Krebszellen vollzieht sich in mehreren Teilschritten, bei denen es zur Mutation zellulärer Gene (Proto-Onkogene und Tumorsuppressorgene) oder zum Erwerb viraler Onkogene kommt. Krebsrelevante Veränderun gen sind die Aktivierung von Proto-Onkogenen durch Mutationen, Genamplifikation, Überexpression oder Chromosomen-Transloka tionen, sowie die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen durch Mutationen, beispielsweise Deletionen. Bezüglich der Präven tion bzw. der Behandlung von Krebs erwiesen sich die Tumorsup pressorgene als besonders interessant, da diese offensichtlich neue Möglichkeiten in der Krebstherapie bieten. Allerdings ergibt sich aus den bisherigen Untersuchungen, daß zwar Tumor suppressorgene ein wichtiges Ziel bei der Behandlung von Krebs darstellen, leider konnten allerdings die gewonnenen Erkennt nisse bisher kaum in die Praxis umgesetzt werden und so er folgt die Krebstherapie bisher im Wesentlichen durch zyto statische Behandlungen von Krebspatienten, sei es durch rela tiv unspezifisch wirksame Zytostatika oder durch Strahlenbe handlung. Die zytostatische Behandlung von Tumoren mit Hilfe von Zytostatika oder Strahlenbehandlung hat jedoch erhebliche Nachteile, die auf massiven Nebenwirkungen beruhen. Daher besteht ein hoher Bedarf an der Identifizierung neuer Chemo therapeutika, vor allem solcher, die spezifischer wirken bzw. geringerer Nebenwirkungen aufweisen.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen be reitzustellen, die für eine Chemotherapie, beispielsweise bei der Krebsbekämpfung, wirksam sind.

Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereit stellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Aus führungsformen erzielt.

Es wurde in der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß für die starke Erhöhung der Expression des CD95L-Gens durch Chemo therapeutika eine spezifische Sequenz im CD95L-Promotor, die eine AP-1-Stelle enthält, verantwortlich ist. Durch die Erhö hung der Transkriptionsrate für das CD95L-Gen kommt es wieder um direkt oder indirekt zu einer Apoptose von Tumorzellen. Somit können durch Screeningverfahren, bei denen die vorste hende DNA-Sequenz als Sonde verwendet wird, neue Verbindungen identifiziert werden, die als Chemotherapeutika von Nutzen sind.

Zu den Chemotherapeutika zählen u. a. solche Verbindungen, die in Tumorzellen Apoptose induzieren können. Dabei zeigte sich, daß an der Induktion der Apoptose in lymphoiden und nicht lymphoiden Geweben, beispielsweise Lebergewebe und Darmgewebe, das CD95(Apo-1/Fas)/CD95L-System beteiligt ist, das eine Schlüsselfunktion bei der Regulation der Apoptose einnimmt. Die Hochregulierung des Liganden zu CD95 (CD95L) stellt wohl einen der wichtigsten Mechanismen dar, mittels dessen Krebs mittel in Tumoren Apoptose induzieren können. Im Laufe der Untersuchungen, die zu der vorliegenden Erfindung führten, wurde festgestellt, daß die Hochregulation von CD95L zumindest in Leberzellen funktionell relevant ist und auf der Ebene der Transkriptionsregulation abläuft. Es zeigte sich, daß die Stimulierung der CD95L-Expression durch Chemotherapeutika (z. B. 5-Fluorouracil (5-FU) und Etoposid) von dem basalen CD95L-Promotor (136 bp) abhängt. Ein AP-1-Element innerhalb des 5'-nicht-translatierten Bereichs (5'UTR) stromabwärts einer "TATA-Box" wird zur Induktion des Promotors benötigt. Diese Steigerung der Transkriptionsrate ist Transkriptions- und Translations-abhängig und wird durch die Bindung eines Jun/Fos-Heterodimers an diese AP-1-Stelle vermittelt. Zusam mengefaßt kann davon ausgegangen werden, daß die von Chemo therapeutika induzierte Apoptose in Leberzellen vermutlich nach folgendem Mechanismus abläuft: Einerseits induzieren Chemotherapeutika das CD95-Gen über einen transkriptionell regulierten p53-abhängigen Mechanismus. Andererseits wirken Chemotherapeutika auf den SAPK/JNK-Weg ein, was schließlich zur Hochregulation von CD95L führt. Nach Anwesenheit beider Moleküle (CD95 und CD95L) auf der Oberfläche einer Zelle kann diese entweder "Selbstmord" begehen oder ihre Nachbarzelle über einen als "Brudermord" bezeichneten Mechanismus abtöten. Es zeigte sich außerdem, daß die Wirkung der Chemotherapeutika auf den CD95L-Promotor verzögert ist. Ein steiler Anstieg der mRNA-Spiegel und der mittels der Aktivierung des Luciferase- Gens als Reprotergen gemessenen Promotoraktivität tritt 20 bis 25 Stunden nach der Behandlung mit Chemotherapeutika ein und dieser Anstieg setzt sich danach fort. Interessanterweise zeigen verschiedene Chemotherapeutika (z. B. 5-FU und Etoposid) eine synergistische Wirkung hinsichtlich der Aktivierung des CD95L-Promotors. Diese Beobachtungen können zur Verbesserung der Chemotherapie für verschiedene Tumore Anwendung finden, beispielsweise, wie schon vorstehend diskutiert, auch zur Etablierung eines Screeningsystems zur Isolierung neuer Chemo therapeutika verwendet werden, und zu einem verbesserten Ver ständnis der Nebenwirkungen bei der Verabreichung von Chemo therapeutika an Patienten führen. Damit sollte es auch möglich sein, neue Chemotherapeutika zu isolieren bzw. zu entwickeln, die eine Behandlung von Tumoren erlauben, die gegen die bisher bekannten Chemotherapeutika bereits resistent sind. Auch soll te es möglich sein, Chemotherapeutika zu finden, die eine höhere Spezifität aufweisen, wodurch geringere Nebenwirkungen auf gesunde Zellen die Folge wären.

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Untersuchung, ob eine Testverbindung für eine Chemotherapie wirksam ist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

1. Bereitstellung einer DNA-Sequenz, die die in Fig. 5A dargestellte AP-1-Stelle als Bestandteil eines Promotors, vorzugsweise des CD95L-Promotors, umfaßt, der mit einem Re portergen oder dem CDS95L-Gen funktionell verknüpft ist;
2. Inkontaktbringen der DNA-Sequenz von a) mit der Test verbindung in einem zellulären Assay; und
3. Bestimmung der Aktivierung des Promotors, wobei eine Aktivierung anzeigt, daß die Testverbindung für eine Chemo therapie wirksam ist.

Der hier verwendete Ausdruck "AP-1-Stelle" umfaßt die AP-1- Stelle (a) mit der in Fig. 5A gezeigten Sequenz und (b) mit einer sich von der in Fig. 5A dargestellten Sequenz durch eine oder mehrere Insertionen, Austausche oder Additionen von Nucleotiden unterscheidenden Sequenz, wobei diese Veränderun gen nicht zu einem Verlust der AP-1-Stelle hinsichtlich der Aktivierbarkeit durch die hier diskutierten Faktoren führen.

Bei den Testverbindungen kann es sich um sehr unterschiedliche Verbindungen handeln, sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische, organische und anorganische Verbindungen, sowie Polymere (z. B. Oligopeptide, Polypeptide, Oligonucleotide und Polynucleotide) sowie kleine Moleküle, Antikörper, Zucker, Fettsäuren, Nucleotide und Nucleotid-Analoge, Analoge von natürlich vorkommenden Strukturen (z. B. Peptid-"Imitatoren", Nucleinsäureanaloge etc.) und zahlreiche weitere Verbindungen.

Zur Herstellung der DNA-Sequenz von Schritt a) kann der Fach mann nach üblichen in vitro-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook J, EF Fritsch, T. Maniatis (1989). Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2. Ausgabe. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, NY be schrieben sind, vorgehen.

Desweiteren kann der Fachmann zur Herstellung des zellulären Assays übliche Zellen, wie HepG2 oder Hep3B, verwenden und in diese die DNA-Sequenz von Schritt a) mittels üblicher Verfah ren, wie Transfektion oder Elektroporation, einführen. Hierzu wird ebenfalls auf Sambrook J. et al., supra verwiesen. Die Verbindung kann dann den Zellen z. B. über das Medium zugegeben werden. Hierbei muß darauf geachtet werden, daß die Testver bindung mit der DNA-Sequenz von Schritt a) unter solchen Be dingungen in Kontakt kommt, daß eine spezifische Bindung er möglicht wird. Danach wird vorzugsweise im selben Testsystem bestimmt, ob eine Induktion der Transkription des mit dem Reportergen funktionell verknüpften Promotors durch Anwesen heit der Testverbindung stattgefunden hat. Dabei werden die gefundenen Werte hinsichtlich der Transkriptionsrate vorzugs weise mit den Werten in einem zweiten Testsystem verglichen, daß sich von dem ersten nur durch die Abwesenheit der Test verbindung unterscheidet. Grundsätzlich geeignete Assay-Forma te für die Identifizierung von Verbindungen, die die Expres sion von CD95L beeinflussen, sind in der biotechnologischen und pharmazeutischen Industrie gut bekannt und für den Fach mann sind zusätzliche Assays und Variationen des vorstehend zur Veranschaulichung bereitgestellten Assays offensichtlich.

Neben dem CD95L-Promotor sind für das erfindungsgemäße Verfah ren auch andere Promotoren, wie der Trail-Rezeptor-Promotor oder der CD95-Promotor, geeignet. Veränderungen hinsichtlich der Promotoraktivität können durch jedes geeignete Verfahren gemessen werden. Änderungen im Expressionsspiegel können unter Verwendung von dem Fachmann gut bekannten Verfahren untersucht werden. Dazu zählt die Überwachung der mRNA-Konzentration (z. B. unter Verwendung geeigneter Sonden oder Primer), Immunassays hinsichtlich der Proteinkonzentration (z. B. mittels der nachstehend beschriebenen Antikörper), RNAse-Schutzassays, Amplifikationsassays oder jedes andere für einen Nachweis geeignete Mittel, das auf dem Fachgebiet bekannt ist. Weitere Nachweisverfahren hinsichtlich der Aktivierung des Promotors richten sich nach den spezifischen Eigenschaften des jeweili gen Reportergens.

Das Suchen nach Verbindungen, die für eine Chemotherapie wirk sam sind, kann auch in großem Maßstab erfolgen, beispielsweise dadurch, daß eine sehr hohe Anzahl von Kandidaten-Verbindungen in Substanzbibliotheken gescreent wird, wobei die Substanzbi bliotheken synthetische oder natürliche Moleküle enthalten können. Somit ist in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Testverbindung Bestandteil einer Substanzbibliothek.

Das vorstehende erfindungsgemäße Verfahren kann anhand von Protokollen modifiziert werden, die in der wissenschaftlichen Literatur und der Patentliteratur beschrieben und auf dem Fachgebiet bekannt sind. Beispielsweise kann eine große Anzahl von möglicherweise nützlichen Molekülen in einem einzigen Test gescreent werden. Beispielsweise können dann, wenn ein Feld von 1000 Verbindungen gescreent werden soll, im Prinzip alle 1000 Verbindungen in eine Mikrotiterplattenvertiefung gegeben und gleichzeitig getestet werden. Wenn ein Promotor-Aktivator entdeckt wird, kann dann der Pool von 1000 in 10 Pools von 100 aufgeteilt werden und der Prozeß solange wiederholt werden, bis ein individueller Aktivator identifiziert ist. Jedenfalls können die Herstellung und das simultane Screenen von großen Banken aus synthetischen Molekülen mittels gut bekannter Ver fahren der kombinatorischen Chemie ausgeführt werden, siehe beispielsweise von Breemen, Anal. Chem. 69 (1997), 2159-2164 und Lam, Anticancer Drug Des. 12 (1997), 145-167.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch als Screening mit hohem Durchsatz ("high throughput screening") stark beschleu nigt werden. Die hier beschriebenen Assays hinsichtlich der Promotor-Aktivierung können zur Verwendung in einem solchen Verfahren entsprechend modifiziert werden. Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß für diesen Zweck zahlreiche Ver fahren zur Verfügung stehen.

Darüber hinaus kann eine große Anzahl von möglicherweise nütz lichen Promotoraktivität-modifizierenden Verbindungen in Ex trakten von natürlichen Produkten als Ausgangsmaterial ge screent werden. Solche Extrakte können aus einer großen Anzahl von Quellen stammen, beispielsweise den Spezies Pilze, Actino myceten, Algen, Insekten, Protozoen, Pflanzen und Bakterien. Die Extrakte, die Aktivität zeigen, können dann zur Isolierung des aktiven Moleküls analysiert werden. Siehe beispielsweise Turner, J. Ethnopharmacol. 51 (1-3) (1996), 39-43 und Suh, Anticancer Res. 15 (1995) 233-239.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungs gemäßen Verfahrens entspricht die die AP-1-Stelle enthaltende DNA-Sequenz in Schritt a) der in Fig. 5A dargestellten Nu cleinsäuresequenz von den Positionen -36 bis +100 oder einem Fragment davon (wobei das Fragment noch die AP-1-Stelle ent hält), am meisten bevorzugt von den Positionen +84 bis +91.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Reportergen ein CAT-, Luciferase-, LacZ- oder GFP-Gen.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung be trifft schließlich ein Arzneimittel, das ein Gemisch aus min destens zwei Verbindungen umfaßt, die gemäß dem erfindungs gemäßen Verfahren identifiziert wurden und/oder die Expression des CD95L-Gens fördern. Da in den nachstehenden Beispielen gezeigt werden konnte, daß die gleichzeitige Verabreichung von unterschiedlichen mit der Förderung der Expression von CD95L in Zusammenhang stehenden Verbindungen zu synergistischen Effekten führt, ist eine solche Vorgehensweise therapeutisch von besonderem Interesse, da beispielsweise die Dosierung der Einzelsubstanzen (stark) reduziert werden kann und somit po tentielle schädliche Nebenwirkungen ausbleiben oder zumindest verringert werden können. Das erfindungsgemäße Arzneimittel liegt vorzugsweise in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vor. Zu geeigneten Trägern zählen bei spielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen, etc.

Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Arzneimittel kann oral oder, vorzugsweise, parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra arterielle, intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intra thekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Stadium der Erkrankung, beispiels weise des Tumors, der Art der Verabreichung, etc.

Die vorliegende Erfindung betrifft schließlich die Verwendung des erfindungsgemäßen Arzneimittels zur Therapie von verschie denen Erkrankungen, insbesondere Krebs und Autoimmunerkrankun gen, wie Diabetes, Multiple Sklerose und rheumatoide Arthri tis.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 Chemotherapeutika bewirken den CD95-vermittelten Tod in HepG2-Zellen
HepG2-Zellen wurden fast bis zur Konfluenz gezüchtet und dann mit 100 µg/ml 5-FU über die angegebenen Zeiträume entweder in Gegenwart eines Isotyp-angepaßten Kontroll-Antikörpers oder in Gegenwart des anti-CD95L-Antikörpers NOK-1 (50 µg/ml) inku biert. Das gleiche Experiment wurde unter Hinzugabe von CD95- Fc (50 µg/ml) durchgeführt. Apoptose wurde durch PI-Ausschluß und Messung der Vorwärts/Seiten-Streuung (FSC/SSC) bestimmt. Die gezeigten Daten stellen Mittelwerte mit Standardabweichun gen aus drei Proben dar. Es wurden verschiedene Experimente mit ähnlichem Ergebnis durchgeführt.

Fig. 2 Nach Stimulation mit verschiedenen Chemotherapeutika wird CD95L-mRNA induziert und diese Induktion wird auf der Transkriptionsebene reguliert
Es wurden PCR-Analysen von HepG2- und Hep3B-Zellen durchge führt. Gesamt-RNA wurde extrahiert und RT-PCR wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. A+B: HepG2- und Hep3B- Zellen wurden 36 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen von Bleomycin oder 5-FU inkubiert. C: Hep3B-Zellen wurden mit 100 µg/ml 5-FU über die angegeben Zeiträume inkubiert. D+E: 5- FU (100 µg/ml) wurde 48 Stunden zu HepG2-Zellen gegeben und dazu entweder der Transkritpionsinhibitor Actinomycin C1 (D) oder der Translationsinhibitor Cycloheximid (E) in den angege benen Konzentrationen.

Fig. 3 Die Behandlung mit Chemotherapeutika führt zu einer Hochregulation von funktionalem CD95L
Es wurde ein ⁵¹Cr-Freisetzungs-Assay mit Hep3B-Zellen als Ef fektoren und SKW6.4-Zellen als Ziel verwendet. Hep3B-Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen gezüchtet und mit 5-FU behandelt. Nach 48 Stunden wurden die Chemotherapeutika aus dem Kulturmedium entfernt und ⁵¹Cr-markierte SKW6.4-Zellen wurden entweder mit einem Kontrollantikörper oder mit dem anti-CD95L-Antikörper NOK-1 zugegeben. Nach Inkubation über Nacht wurden die Überstände in einem Gamma-Zähler gemessen. Die relative Lyse wurde wie in Beispiel 1 angegeben berechnet. E/T ist das Verhältnis zwischen Effektor- und Zielzellen. Jede Konzentrationsreihe wurde dreifach ausgeführt. Das Diagramm stellt ein Experiment aus einer Serie von unabhängigen Experi menten mit dem gleichen Ergebnis dar.

Fig. 4 Die Hochregulation des CD95L-Promotors durch Chemo therapeutika wird durch gleichzeitige Stimulation mit ver schiedenen chemotherapeutischen Verbindungen potenziert und ist konzentrationsabhängig
A: Potenzierungseffekt verschiedener Chemotherapeutika auf den CD95L-Promotor. Hep3B-Zellen wurden mit dem -36/+100-Konstrukt transfiziert und die Luciferase-Aktivität wurde nach 48stündi ger Behandlung mit 5 µM Etoposid (eto), 100 µg/ml 5-FU oder einer Kombination beider Mittel gemessen. Jeder Balken stellt den berechneten Wert aus behandelten/unbehandelten Zellen dar. Die Transfektionseffizienz in A und B wurde durch Cotrans fektion eines Renilla-Luciferase-Konstrukts, das unter der Kontrolle eines basalen Promotors stand, überwacht. Es wurden verschiedene Experimente mit gleichem Ergebnis durchgeführt.
B: Titration von 5-FU. Hep3B-Zellen wurden mit dem -36/+100- Promotor-Konstrukt transient transfiziert. Die Zellen wurden 48 Stunden mit 1,7 µM Etoposid (eto) und ansteigenden Konzen trationen von 5-FU wie angegeben behandelt. Die Zellen wurden lysiert und die Luciferase-Aktivität wurde bestimmt.

Fig. 5 Ein die Nucleotide +20 bis +100 innerhalb der 5'UTR des CD95L-Gens umfassender Bereich ist für die Ligandeninduk tion nach Chemotherapie verantwortlich
A: Übersicht über die 5'UTR des CD95L-Gens. Balken stellen die -36/+100- und -36/+100-Konstrukte dar. Die eingerahmte Sequenz ist die AP-1-Stelle in der Nähe des ersten ATG-Codons. Der Pfeil zeigt die Translationsstartstelle. B: Hep3B-Zellen wur den mit den in A beschriebenen Konstrukten transfiziert und die Luciferase-Aktivität wurde nach 48stündiger Behandlung mit 5-FU (100 µg/ml) gemessen. Es ist ein repräsentatives Experi ment von fünf unabhängigen Experimenten (dreifache Proben) gezeigt. Pnull.luc ist ein als negative Kontrolle verwendetes Konstrukt ohne Promotor. Die Transfektionseffizienz wurde mittels Cotransfektion mit einem Renilla-Luciferase-Konstrukt überwacht.

Fig. 6 Die -36/+100- und -36/+19-Konstrukte verhalten sich bezüglich der Kinetiken der Aktivierung und Induzierbarkeit durch Cotransfektion mit c-jun und c-fos unterschiedlich
A: Cotransfektionsexperimente in Hep3B-Zellen mit Expressions vektoren für c-jun und c-fos. Die cotransfizierten Zellen wurden danach entweder 48 Stunden mit 100 µg/ml 5-FU behandelt oder unbehandelt gelassen. Die Transfektionseffizienz wurde entweder durch Cotransfektion eines Expressionsvektors für Chloramphenicoltransferase (CAT) oder Renilla-Luciferase (bei de unter Kontrolle eines basalen Promotors) normalisiert. Die Luciferase-Aktivität wurde mit dem "Dual luciferase"-Assay (Promega) entsprechend den Angaben des Herstellers gemessen, die CAT-Aktivität wurde mittels eines im Handel erhältlichen CAT-ELISA bestimmt. Mittelwerte (mit Standardabweichung) aus verschiedenen unabhängigen Experimenten sind gezeigt. B: "Dual luciferase"-Assay mit Hep3B-Zellen, die mit dem beschriebenen CD95L-Promotor-Konstrukt und einem Renilla-Luciferase-Expres sionsvektor (als Kontrolle für die Transfektionseffizienz) cotransfiziert worden waren. Die Zellen wurden zu den angege benen Zeiten geerntet. Zusätzlich wurde der Proteingehalt der transfizierten Zellen bestimmt. Die Werte sind Mittelwerte (mit Standardabweichung) aus drei Proben eines repräsentativen Experiments. Es wurden vier unabhängige Experimente durch geführt.

Fig. 7 Nucleäre Extrakte von mit Chemotherapeutika behandel ten Leberzellinien verschieben die Mobilität eines Oligonu cleotids, das die AP-1-Sequenz im CD95L-Promotor enthält
EMSA und "subershift"-Analysen des +73/+99-Bereichs der huma nen CD95L-Promotorsequenz wurden durchgeführt. Nucleäre Ex trakte von HepG2- und Huh7-Zellen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben präpariert. Die Zellen wurden entweder 48 Stunden mit 100 µg/ml 5-FU behandelt oder unbehandelt gelassen. EMSA- Analysen wurden wie kürzlich beschrieben durchgeführt. Für die "supershift"-Analysen wurden Antikörper gegen c-Jun oder c-Fos zugegeben. Der Isotyp-angepaßte anti-C/EBP-Antikörper wurde als Kontrolle verwendet. : Negative Kontrolle ohne nucleäre Extrakte; -: unbehandelte Zellen; +: behandelte Zellen. Anti körper wurden wie angegeben zugefügt.

Fig. 8 Mutationen innerhalb der AP-1-Stelle zerstören die Induzierbarkeit des Promotor-Konstrukts
Die AP-1-Stelle im basalen Promotor wurde wie angegeben mu tiert. Hep3B-Zellen wurden mit dem -36/+100-Konstrukt (CD95L prom wt) bzw. dem APX4-Konstrukt (mutiertes -36/+100 CD95L.luc; CD95L prom mut) transfiziert. Die Transfektions effizienz wurde durch Cotransfektion mit Renilla-Luciferase überwacht. Nach der Transfektion wurden die Zellen 48 Stunden mit 5-FU (100 µg/ml) behandelt. Die Luciferase-Aktivität wurde gemessen und die Vervielfachung der Induktion berechnet. Ein repräsentatives Experiment (von insgesamt 5 Experimenten) ist dargestellt.

Fig. 9 Dominant-negative c-jun- und dominant-negative MEKK- 1- und JNKK-1-Konstrukte hemmen die Promotoraktivierung nach Chemotherapie
A: Einfluß von DN c-jun. Hep3B-Zellen wurden mit dem -36/+100-, -36/+19- oder pnull.luc-Konstrukt transfiziert. Die Zellen wurden entweder mit einem Kontrollplasmid (c) oder einem Ex pressionskonstrukt für dominant-negatives c-jun (+) cotrans fiziert. Als Kontrolle wurde in einem Experiment c-jun zusätz lich cotransfiziert. Nach Beendigung der Transfektion wurden die Zellen aufgeteilt. Eine Hälfte wurde mit 100 µg/ml 5-FU behandelt, die andere Hälfte blieb unbehandelt. Die Balken zeigen die Vervielfachung der Induktion, die wie folgt be rechnet wurde: RLU (behandelte Zellen)/RLU (unbehandelte Zel len). Relative Luciferase-Einheiten wurden mittels der Re nilla-Luciferase-Aktivität unter Verwendung des "Dual lucife rase"-Systems normalisiert. Es wurden drei unabhängige Experi mente durchgeführt, von denen eines gezeigt ist. B: Einfluß der JNK/SAPK-Kaskade. Cotransfektionsexperimente mit einem Kontrollvektor (pUCSV) oder dominant-negativen Mutanten für die Stress-aktivierten Proteinkinasen JNKK-1, MEKK-1, MKK3 und MKK6 wurden durchgeführt. Die Werte bezüglich der Vervielfa chung der Induktion wurden wie in A berechnet. Eines von drei unabhängigen Experimenten ist dargestellt.

Fig. 10 C-jun wird in Hep3B-Zellen und humanen primären Hepatozyten nach Behandlung mit Chemotherapeutika hochregu liert
A+B: Hep3B-Zellen wurden auf LabTek™-Kulturträgern ausgesät und zwei Tage gezüchtet. Danach wurden die Zellen entweder unbehandelt gelassen (A) oder 40 Stunden mit 5-FU (100 µg/ml) behandelt (B), fixiert und wie beschrieben angefärbt.
C+D: Humane primäre Hepatozyten wurden wie in Beispiel 1 be schrieben isoliert und auf Kulturträger ausgesät. Danach wur den die Zellen entweder unbehandelt gelassen (C) oder 40 Stun den mit 5-FU (50 µg/ml) behandelt (D), fixiert und mit einem für c-Jun spezifischen Antikörper angefärbt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Allgemeine Verfahren (A) Zellinien

Die folgenden Zellinien wurden verwendet: 1) HepG2, die von einem humanen Leberblastom stammt und Wildtyp-p53 mit niedri ger Konzentration exprimiert, 2) Huh7, die von einem humanen hepatozellulären Karzinom stammt und eine mutierte Form von p53 exprimiert, bei der eine Punktmutation an Codon 220 zu einer kürzeren Halbwertszeit von p53 führt, 3) Hep3B, die von einem humanen hepatozellulären Karzinom stammt und für p53 defizient ist und 4) SKW6.4, eine humane T-Zelleukämie-Zelli nie. HepG2-, Hu7- und HepG3-Zellen wurden in DMEM (Gibco BRL, Eggenstein, Deutschland) gezüchtet, das mit 10% hitzeinakti viertem fötalem Kälberserum (FCS)(Gibco BRL), 10 mM HEPES (Gibco BRL), 5 mM L-Glutamin (Gibco BRL) und 100 µg/ml Genta mycin (Gibco BRL) supplementiert worden war. SKW6.4-Zellen wurden in RPMI-Medium (Gibco BRL) gehalten, das 10% FCS (Gibco BRL), 10 mM HEPES (Gibco BRL), 2 mM L-Glutamin (Gibco BRL) und 100 µg/ml Gentamycin (Gibco BRL) enthielt.

(B) Isolierung und Kultivierung primärer humaner Hepatozyten

Primäre humane Hepatozyten wurden mittels einer 2-Schritt- Perfusionstechnik aus gesundem Lebergewebe von Patienten er halten, bei denen eine partielle Leber-Resektion durchgeführt wurde. Dazu wurde in ein Blutgefäß des entfernten Lebergewebes eine Kanüle eingeführt und diese wurde 15 bis 20 min mit Ca- und Mg-freier "Hank's balanced salt solution (HBSS; Gibco BRL) perfundiert, die 0,5 mM EDTA und 50 mM HEPES enthielt. Die Perfusion wurde 15 bis 25 min mit "William's Medium E" (WME; Gibco BRL) fortgesetzt, das 0,05% Collagenase Typ IV (Sigma) und 5 mM CaCl₂enthielt. Zellen wurde mechanisch von der Leber kapsel abgetrennt und die erhaltene Zellsuspension wurde ge filtert und in eiskaltem, Serum-freiem WME gewaschen. Zur Abtrennung der Hepatozyten von nicht-parenchymalen Zellen wurde 10 min bei 50 × g mit Percoll™ (eingestellt auf eine Dichte von 1,065 g/ml; Biochrom, Deutschland, zentrifugiert. Die Zellen wurden zweimal mit WME gewaschen und in Erhaltungs medium zu einer Dichte von 1,0-1,5 × 10⁵ lebende Zellen/cm² auf Kollagen-beschichtete Kulturplatten (Kollagen Typ I, Serva Biochemicals, Deutschland) ausgesät. Die Lebensfähigkeit wurde mittels des Trypan-Blau-Ausschluß-Verfahrens bestimmt. Als Erhaltungsmedium wurde WME verwendet, das mit folgenden Ver bindungen supplementiert worden war: 5 mM L-Glutamin (Flow Laboratory, Deutschland), 0,6% Glucose, 0,02 M HEPES, 50 µg Gentamycin (Sigma), 100 µg/ml Penicillin (Flow Laboratory), 100 µg/ml Streptomycin (Flow Laboratory), 37 µM Inosin (Ser va), 17,4% DMSO (Merck, Darmstadt, Deutschland) und 0,14 E/ml Insulin (Serva). Am Tag 1 und 2 wurde das Erhaltungsmedium mit 10% FCS (Gibco BRL) supplementiert. Die Zellen wurden bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert.

(C) Plasmide

Die seriellen Deletionskonstrukte des CD95L-Promotors wurden in den pTATA.luc-Vektor (erhältlich von T. Wirth, Institut für medizinische Strahlen- und Zellforschung, Würzburg, Deutsch land) cloniert oder in den pGL2-Basisvektor (Promega, Madison, Wisconsin, USA). Die Deletionskonstrukte von -2269/+100 bis -36/+100 wurden wie kürzlich beschrieben hergestellt (Li-Weber et al., European Journal of Immunology 28 (1998), 2373). Der -36/+19-Vektor wurde folgendermaßen konstruiert: Das -36/100- CD95L-Promotorfragment wurde mit Psp5II geschnitten und das erhaltene kleinere Fragment wieder in den pTATA.luc-Vektor cloniert. Die Sequenzen aller Konstrukte wurden mittels auto matisierter Didesoxy-Sequenzierung (TOPLAB, München, Deutsch land) überprüft und bestätigt.

Dominant-negative MEKK-1-Zellen (SRα3-ΔMEKK (K432M)) und domi nant-negative JNKK-Zellen (SRα3-JNKK (K611R) wurden von M. Ka rin zur Verfügung gestellt (Angel et al., Nature 332 (1988), 166), dominant-negative MKK3-Zellen (MKK3b-(A)) und dominant- negative MKK6-Zellen (MKK6b-(A)) von J. Woodgett (Nishina et al., Development 126 (1999), 505) und das Kontrollplasmid pUCSV von P. Angel. Die DN-MEKK-, DN-JNKK-, DN-MKK3-, DN-MKK6- und pUCSV-Konstrukte wurden bereits beschrieben (Angel et al., Nature 332 (1988), 166). Dominant-negative c-jun-Zellen (Δaa 1-192) und der leere Kontrollvektor pCMV wurden von D. Bohmann zur Verfügung gestellt (Leppa et al., EMBO Journal 17 (1998), 4404). Mutationen in die +90 AP-1-Stelle bei dem -35/+100- Konstrukt (APX-4) wurden mittels des "QuikChange"-Mutagenese- Kits (Stratagene Corp., La Jolla, Kalifornien, USA) einge führt. Die folgenden Primer (MWG Biotech GmbH, Ebersberg, Deutschland) wurden für die Mutagenese-Reaktion verwendet: APX-4/Sense: 5'-CCG TTT GCT GGG GCT GGC CTA ATT AAC CAG CTG CCT CTA GAG G-3'; APX-4/Antisense: CCT CTA GAG GCA GCT GGT TAA TTA GGC CAG CCC CAG CAA ACG G-3'. Die unterstrichenen Nucleo tide stellen im Vergleich zur der Wildtypsequenz des CD95L- Promotors mutierte Stellen dar. Die Mutationen wurden durch automatisierte Sequenzierung (TOPLAB GmbH, München, Deutsch land) überprüft und bestätigt.

(D) Antikörper

Neutralisierende anti-CD95L-Antikörper (NOK-1) und Isotyp-an gepaßte Kontrollantikörper wurden von Pharmingen (Hamburg, Deutschland) bezogen. Gegen c-jun, c-fos und CEBP gerichtete Antikörper für "Supershift"-Analysen stammten von Santa Cruz Biotechnology Inc. (Heidelberg, Deutschland). Die Behandlung der Zellen mit mAb IgG3-anti-APO-1 erfolgte bei einer Konzen tration von 100 ng/ml wie kürzlich beschrieben (Berndt et al., PNAS USA 95 (1998), 12 556).

(E) Behandlung mit Chemotherapeutika

Zellkulturen wurden mit Bleomycin (cell pharm GmbH, Hannover, Deutschland) in einem Dosisbereich von 1 µg/ml bis 1 mg/ml, 5- FU (ribosepharm GmbH, München, Deutschland) bei einer Konzen tration von 10 µg/ml bis 150 µg/ml, Etoposid (Bristol-Myers Sqibb GmbH, München, Deutschland) in einem Dosisbereich von 1 bis 5 µM oder Cisplatin (ribosepharm GmbH, München, Deutsch land) in einem Dosisbereich von 0,5 µg/ml bis 2,0 µg/ml be handelt. Die Zellen wurden mit den unterschiedlichen Chemo therapeutika 2 bis 64 Stunden inkubiert. Die klinisch relevan ten Konzentrationen bei der Krebstherapie beim Menschen sind folgendermaßen: Bleomycin: 1,5 µg/ml bis 3,0 µg/ml; 5-FU: -; Etoposid: -; Cisplatin: 0,4 µg/ml bis 1,6 µg/ml.

(F) Messung des Zelltods

Nach der entsprechenden Behandlung wurden die Zellen mit 1% Trypsin-EDTA 5 min trypsiniert, zweimal mit PBS gewaschen und mit 2,5 µg/ml Propidiumiodid (PI; Sigma) gefärbt. Die Farb stoffaufnahme wurde mit einem "FACScan"-Zytometer (Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland) unter Verwendung der "CellQuest"-Software gemessen. Veränderungen der Vorwärts- /Seiten-Streuung (FSC/SSC) der Zellpopulation wurden beglei tend ausgewertet. Zur Quantifizierung der DNA-Fragmentierung wurden die Überstände bei 200 × g zentrifugiert, die Zellen trypsiniert und wie vorstehend angegeben gewaschen. Zellen wurden zusammen mit der Zelldebris in einem hypotonischen Lysepuffer (0,1% Natriumcitrat und 0,1% Triton X100™) lysiert, der 50 µg/ml Propidiumiodid enthielt. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 4°C. Die Nuclei wurden dann hinsichtlich des DNA-Gehalts mittels Durchflußzytometrie (Nicoletti et al., Journal of Immunological Methods 139 (1991), 271) analysiert.

(G) ⁵¹Cr-Freisetzungsassay

Durch Chemotherapie induzierte CD95L-vermittelte Zytotoxizität wurde untersucht. Hep3B-Zellen (Effektorzellen) wurden in Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät und mit Chemotherapeutika 48 Stunden lang behandelt. Nach zwei Tagen wurde das Medium auf den Effektorzellen ausgetauscht. SKW6.4-Zellen (Zielzel len) wurden 30 min in Na₂ ⁵¹CrO₄ (100 µCi; NEN, Neu-Isenburg, Deutschland) inkubiert. Danach wurden markierte Zellen zu den Effektorzellen gegeben. Nach 12 bis 16 Stunden wurden von jeder Vertiefung 100 µl Überstand gesammelt und diese in einem Gamma-Zähler gemessen. Die spezifische Lyse wurde entsprechend der Formel L = (E-S)/(T-S) berechnet, wobei E die Gamma-Zäh lungen der unbekannten Probe darstellen, S die spontane Lyse der markierten Zielzellen im Medium ohne Effektorzellen und T die maximale Freisetzung der in 2 N HCl gehaltenen Zielzellen. Der Assay wurde nur dann weiter analysiert, wenn S/T ≦ 30% war. Jedes Experiment wurde in dreifacher Ausfertigung durch geführt.

(H) Nachweis der CD95L-mRNA-Expression mittels RT-PCR

RNA aus verschiedenen Quellen wurde mittels des "RNeasy"-Kits (Quiagen GmbH, Hilden, Deutschland) entsprechend den Hinweisen des Herstellers gereinigt. Für jede Isolierung wurden 5 × 10⁶-10⁷ Zellen von HepG2- und HepB3-Zellinien verwendet. 1 µg Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von MMLV-RT (Gibco BRL) mit oligo(dT)₁₅-Primern (Roche Diagnostics, Heidelberg, Deutsch land) in einer 20 µl-Reaktion durchgeführt, wobei das Reak tionsgemisch 10 mM DTT und 500 µM dNTPs enthielt. 5 µl Ali quots wurden in einem DNA-"Thermocycler" (Stratagene, Heidel berg, Deutschland) mit 0,5 E Taq DNA-Polymerase (Roche Diagno stics) in einer 50 µl Reaktion amplifiziert. Es wurden 35 Zyklen durchgeführt (Denaturierungsschritt: 30 sec 94°C; An lagerungsschritt: 30 sec 56°C; Verlängerungsschritt: 30 sec 72°C). Die Reaktion wurde mittels eines Verlängerungsschritts (10 min 72°C) beendet.

Primer wurden von MWG Biotech GmbH, Ebersberg, Deutschland, bezogen. Sie hatten folgende Sequenzen: CD95L/Sense: 5'ATG TTT CAG CTC TTC CAC CTA CAG A-3'; CD95L/Antisense: 5'-CCA GAG AGA GCT CAG ATA CGT TGA C-3', wobei ein PCR-Produkt mit einer Länge von 500 bp erhalten wurde. Die Primer überspannen alle drei Introns von CD95L, was die Unterscheidung zwischen cDNA und genomischer DNA erleichtert. Als interne Kontrolle wurde jede revers transkribierte mRNA mittels einer β-actin-PCR überprüft, wobei die folgenden PCR-Primer verwendet wurden: β actin/Sense: 5'-TGA CGG GGT CAC CCA CAC TGT GCC CAT CTA-3'; und β-actin/Antisense: 5'-CTA GAA TTT GCG GTG GAC GAT GGA GGG- 3', wobei ein PCR-Produkt mit einer Länge von 600 bp erhalten wird. PCR-Produkte wurden auf 1,5-2% TBE(Tris-Borat-EDTA)- Agarosegels analysiert.

(I) Transiente Transfektionen

Einen Tag vor der Transfektion wurden die Zellen mit einer Dichte von 0,6 × 10⁶/9 cm-Petrischalen ausplattiert. Das Medium wurde zwei Stunden vor der Transfektion ausgetauscht. Die Transfektion erfolgte mittels des auf Calciumphophatpräzi pitation beruhenden Verfahrens. Kurz zusammengefaßt wurden 5 bis 40 µg DNA in 500 µl einer Calciumchloridlösung verdünnt.

Das DNA/Calciumchlorid-Gemisch wurde tropfenweise zu 500 µl HBS gegeben. Die Präzipitation wurde 20 min bei Raumtemperatur durchgeführt und danach wurde das Präzipitationsgemisch zum Kulturmedium gegeben. Das Präzipitat wurde 12 bis 24 Stunden auf den Zellen gelassen. Danach wurden die Zellen 3 min mit 16% Glyzerin in vollständigem Medium schockbehandelt. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen mindestens sechs Stunden in Medium gezüchtet, das mit 20% FCS supplementiert worden war. Schließlich wurden die Zellen auf Platten mit sechs Vertiefungen aufgeteilt und die chemotherapeutische Behandlung für verschiedene Zeiträume wurde eingeleitet.

(J) Luciferase-Assay

Nach dreimaligem Waschen in PBS wurden die Zellen in 200 µl passivem Lysepuffer (Promega) lysiert. Nach einer 20minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen von den Plat ten abgekratzt. Die Lysate wurden zwei Gefrier/Auftau-Zyklen unterworfen und danach wurde Zelldebris durch Zentrifugation abgetrennt. Die Überstände wurden in einem "Duolumat"-Gerät (Fa. Berthold, Wildbach, Deutschland) mittels des "dual luci ferase"-Assaysystems von Promega gemessen. Zur Normalisierung der Transfektionseffizienzen wurde ein von einem basalen Pro motor gesteuerter Renilla-Luciferase-Expressionsvektor pRenil la verwendet. Renilla-Luciferase wurde in dem "dual lucifera se"-Assaysystem gemessen und die CAT-Expression wurde mittels eines im Handel erhältlichen ELISA (Roche Diagnostics) be stimmt. Außerdem wurde die Proteinmenge in dem Proteinassay von Biorad (München, Deutschland) gemessen und zur Normalisie rung des Proteingehalts der transfizierten Zellen verwendet.

(K) EMSA und "supershift"-Analysen

Nucleäre Extrakte von HepG2- und Huh7-Zellen wurden präpa riert. Kurz zusammengefaßt wurden 4 × 10⁷ Zellen in 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 2 mM MgCl₂, 140 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 0,5 mM PMSF und 0,1% Triton-X100 lysiert. Danach wurde eine Sac charose-Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt und die nucleäre Fraktion in 20 mM HEPES, pH-Wert 7,9, 25% Glyzerin, 0,42 M NaCl, 1,5 MgCl₂, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM DTT und 0,5 mM PMSF abgetrennt. Nach 30 min Zentrifugation wurden die nukleären Membranen pelletiert und die Überstände in flüssigem Stick stoff nach Bestimmung des Proteingehalts mit dem vorstehend beschriebenen Assay aufbewahrt.

Die AP-1-Stelle bei +90 im CD95L-Promotor enthaltenden doppel strängigen Oligonucleotide wurden mittels T4 Polynucleotidki nase (MBI Fermentas, St.Leon-Roth, Deutschland) mit [γ-³²P]ATP (5000 Ci/mmol; Amersham GmbH, Braunschweig, Deutschland) end markiert. Die einzelsträngigen Oligonucleotide hatten folgende Sequenzen: Sense: 5'-GGG CTG GCC TGA CTC ACC AGC TGC-3'; und Antisense: 5'-GCA GCT GGT GAG TCA GGC CAG CCC-3'. Freie Nu cleotide wurden mit "Microspin G-50"-Säulen (Pharmacia GmbH, Freiburg, Deutschland) entfernt.

Die Bindungsreaktionen wurden 30 min bei 4°C unter Verwendung von 5 µg nucleärem Protein in einem Puffer durchgeführt, der 100 ng/µl BSA (Roche Diagnostics), 50 ng/µl poly[d(I-C)] (Ro che Diagnostics), 2 mM DTT (Gibco BRL), 500 µM "Pefablock" (Roche Diagnostics), 1 µg/ml Aprotinin (Roche Diagnostics), 25 mM HEPES, 5 mM MgCl₂ (Sigma), 35 mM KCl (Sigma) und 3 × 10⁴ cpm des markierten Oligonucleotids enthielt. Für die Supershift- Analysen wurde 1 µg Antikörper zu der Bindungsreaktion gege ben. Die Proben wurden auf einem nicht-denaturierenden 6% Polyacrylamidgel in 0,5% TBE aufgetrennt und über Nacht wurde eine Autoradiographie erstellt.

(L) Immunfluoreszenz-Studien

Kultivierte Hep3B-Zellen oder frisch isolierte humane primäre Hepatozyten wurden auf Lab-Tek™-Kammerträgern (Renner GmbH, Darmstadt, Deutschland) ausplattiert. Nach einer Züchtung über einen Zeitraum von mindestens zwei Tagen wurden die Zellen mit Chemotherapeutika behandelt. Im Anschluß daran wurde eine Fixierung in Methanol/Aceton (5 min bzw. 10 sek bei -20°C) durchgeführt. Die Zellen wurden danach 1 Stunde bei 37°C zuerst mit dem spezifischen primären Antikörper gegen humanes c-Jun (Santa Cruz GmbH, Heidelberg, Deutschland) inkubiert und nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen 1 Stunde mit Fluoreszein-Isothiocyanat-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen- IgG (Dianova, Hamburg, Deutschland) bedeckt. Eine unspezi fische Anfärbung wurde durch Inkubation mit Maus- oder Kanin chen-Immunglobulinen anstelle des spezifischen primären Anti körpers oder durch Blockierung des primären Antikörpers mit dem immunogenen Peptid überwacht. Die Träger wurden mit Deck gläschen bedeckt und mittels eines Fluoreszenzmikroskops ausgewertet.

Beispiel 2 Chemotherapeutika induzieren Apoptose in Leber zellenkrebs-Zellinien über das CD95/CD95L-System

HepG2-Zellkulturen wurden bei 70% Konfluenz mit dem 5-FU ent weder in Abwesenheit oder Anwesenheit von einer der CD95L blockierenden Verbindungen behandelt und die Apoptose wurde durch PI-Ausschluß und Analyse der Vorwärts-/Seiten-Streuung (FSC/SSC) bestimmt. Wie aus Fig. 1 ersichtlich führt die chemotherapeutische Behandlung zu einer signifikanten Erhöhung der Apoptose-Rate, wobei dies 12 bis 24 Stunden nach Verabrei chung von 5-FU eintritt und nach 48 Stunden 43% erreicht. Diese Ergebnisse wurden durch Anfärbung der Zellen hinsicht lich des subdiploiden DNA-Gehalts bestätigt. Die Wirkung der Chemotherapeutika konnte durch gleichzeitige Verabreichung von 50 µg/ml CD95-Fc oder 50 µg/ml NOK-1 Antikörper im wesentli chen blockiert werden, was auf einen starken Einfluß des CD95- Systems auf die Chemotherapie induzierte Apoptose hinweist. Ähnliche Ergebnisse wurden durch Behandlung mit Etoposid, ein Hemmstoff von Topoisomerasen, erzielt.

Beispiel 3 CD95L wird nach Verabreichung von Chemothera peutika hochreguliert

Nachdem gezeigt werden konnte, daß CD95/CD95L-Interaktionen für die Induktion der Apoptose nach der Einwirkung von Chemo therapeutika von Bedeutung sind, wurde die potentielle Hoch regulierung von CD95L nach Stimulierung untersucht. Wie aus Fig. 2A ersichtlich ist, wird CD95L-mRNA nach Behandlung mit Bleomycin, einem Chemotherapeutikum aus der Gruppe der Anti biotika, hochreguliert. Alle verwendeten Konzentrationen lagen im klinisch relevanten Bereich. Die Hochregulation konnte sowohl in HepG2 (wt p53)- als auch Hep3B (p53 -/-)-Zellen beobachtet werden, ist somit unabhängig von p53, da der Zelli nie Hep3B dieses Protein fehlt.

5-FU und Etoposid können sowohl in HepG2- als auch Hep3B-Zel len CD95L Zeit- und Dosis-abhängig hochregulieren (Fig. 2B und 2C). Die Hochregulation von CD95L ist verzögert und tritt in zeitlicher Relation zum Auftreten der Apoptose in Leber zellenkrebs-Zellinien nach 20 bis 25 Stunden ein. Zur Auf klärung des der Hochregulation von CD95L in Leberzellenkrebs- Zellinien zugrunde liegenden Mechanismus wurden entweder mit dem Transkriptionsinhibitor Actinomycin C1 oder dem Trans lationsinhibitor Cycloheximid Blockierungsexperimente durch geführt. Beide Wirkstoffe wurden bei subtoxischen Konzentra tionen verwendet und diese zeigten keine Auswirkung auf die Transkription oder Translation des "housekeeping"-Gens β-Ac tin. Die Hochregulation von CD95L nach Behandlung mit Chemo therapeutika wurde jedoch effizient verringert (Fig. 2D und 2E), was auf eine Regulation von CD95L auf der Transkriptions ebene hindeutet.

Zur Untersuchung ob die Hochregulation auf der mRNA-Ebene mit einer Hochregulation des CD95L-Proteins auf der Zelloberfläche zusammenfällt, wurde die Fähigkeit behandelter Hep3B-Zellen CD95-positive Zielzellen zu töten untersucht. ⁵¹Cr-markierte SKW6.4-Zellen, eine B-Zellinie, die hohe CD95-Spiegel expri miert, wurden auf einem Hep3B-Zellmonolayer über Nacht inku biert. Die Hep3B-Zellen wurden entweder unbehandelt gelassen oder 48 Stunden vor der Inkubation mit SKW6.4-Zellen mit 100 µg/ml 5-FU behandelt. Nach Gewinnung des Überstands wurde die freigesetzte ⁵¹Cr-Aktivität gemessen. Wie in Fig. 3 darge stellt führt die Behandlung von Hep3B-Zellen mit 5-FU zu einer signifikanten Abtötung CD95-tragender SKW6.4-Zellen, was auf eine Wechselwirkung zwischen CD95 und CD95L hindeutet. Um diesen Effekt weiter zu untersuchen, wurden Blockierungsexpe rimente mit dem Antikörper NOK-1 durchgeführt. Wie in Fig. 3 dargestellt führt die Hemmung von CD95L zu einer beinahe voll ständigen Hemmung des Zelltods, wobei lediglich eine restliche Abtötungsaktivität von etwa 5% zu beobachten ist. Faßt man zusammen, so belegen diese Daten, daß Chemotherapeuthika zu einer Hochregulation von funktionalem CD95L-Protein auf der Zelloberfläche führen.

Beispiel 4 Chemotherapeutika üben ihre Wirkung auf den CD95L- Promotor aus, wobei synergistische Effekte zu beobachten sind

Da aufgrund der beobachteten Hochregulation auf der Trans kriptionsebene davon ausgegangen wurde, daß Chemotherapeutika ihre Wirkung direkt auf den CD95L-Promotor ausüben, wurden verschiedene Luciferase-Reporterkonstrukte jeweils unter Kon trolle eines bestimmten Fragments aus dem 5'-nicht translatierten Bereich des CD95L-Gens hergestellt. Die -1204/+100-, -860/+100-, -345/+100- und -36/+100-Konstrukte wurden bereits beschrieben und sind in Jurkat T-Zellinien in transienten Transfektionsassays nach Stimulation mit Phorbole ster und Ionomycon gut induzierbar (Li-Weber et al., European Journal of Immunology 28 (1998), 2373). Um die Wirkung von Chemotherapeutika auf Leberzellen näher zu untersuchen wurden Hep3B-Zellen mit den verschiedenen Konstrukten transient transfiziert und die Zellen wurden dann durch Behandlung mit 5-FU, Etoposid oder einer Kombination beider Verbindungen stimuliert. Alle vorstehend beschriebenen Konstrukte waren gleichermaßen induzierbar. Ein repräsentatives Experiment für das -36/+100-Konstrukt ist in Fig. 4 gezeigt. Die Kombination verschiedener Chemotherapeutika zeigt einen synergistischen Effekt auf alle Konstrukte (Fig. 4A). Außerdem zeigen diese Wirkstoffe eine starke Dosis-Abhängigkeit (Fig. 4B), was ein Anzeichen dafür ist, daß die Promotorregulation bei physiolo gischen Konzentrationen der Chemotherapeutika stattfindet, da die Experimente in einem klinisch relevanten Dosisbereich durchgeführt wurden.

Beispiel 5 CD95L wird in Leberzellen nach Stimulation mit Chemotherapeutika über die Aktivierung des neu identifizierten AP-1-Elements hochreguliert.

Da alle Promotor-Konstrukte im Bereich von -1204/+100 bis -36/+100 die gleiche Induzierbarkeit nach Stimulation mit Che motherapeutika zeigten, wurde davon ausgegangen, daß ein zwi schen -36 und dem Translationsstart gelegenes Promotorelement u. U. für die Promotor-Aktivierung verantwortlich ist. Um diese vermutete Stelle weiter einzugrenzen wurden 3'-Deletionskon strukte des CD95L-Promotors erzeugt. Eines dieser Konstrukte (-36/+19) wurde für weitere Experimente verwendet und dieses ist in Fig. 5A schematisch im Vergleich zu dem -36/+100-Luci ferase-Konstrukt gezeigt. Wie in Fig. 5B dargestellt, zeigte dieses Konstrukt eine signifikant verringerte basale Aktivität und war außerdem weniger induzierbar als das -36/+100-Kon strukt. Daraus wurde gefolgert, daß der +20/+100-Bereich des CD95L-Promotors ein Element enthält, das für die Induzierbar keit durch Stimulation mit Chemotherapeutika verantwortlich ist.

Eine Computersuche nach Bindungsstellen für Transkriptions faktoren ergab eine Konsensus-Sequenz für den dimeren Faktor AP-1. Die genaue Lage dieser Sequenz ist in Fig. 5A (einge rahmt) gezeigt. Zur Bestätigung, daß diese Stelle tatsächlich eine funktionale AP-1-Stelle ist, wurden gemeinsam mit den -36/+100- und -36/+19-Luciferase-Reporterkonstrukten c-jun- und c-fos-Konstrukte transfiziert. Wie in Fig. 6A gezeigt, ergab die Cotransfektion mit c-jun und c-fos eine deutliche Stimula tion des -36/+100-Konstrukts, das die AP-1-Stelle enthält, nicht jedoch des -36/+19-Konstrukts, dem diese Stelle bei +90 fehlt. Die Transfektion nur mit c-jun oder nur mit c-fos ergab auch einen stimulierenden Effekt. Die Cotransfektion mit den AP-1-Bestandteilen und die Behandlung mit 5-FU führte nicht zu einer signifikanten Aktivitätssteigerung des -36/+19-Kon strukts, was stark auf das Fehlen des verantwortlichen Pro motorfragments hinweist. Im Gegensatz dazu führte die Behand lung von cotransfizierten Zellen mit 5-FU zu einem weiteren Anstieg der Luciferase-Aktivität in dem -36/+100-Konstrukt, vergleichbar mit der Induktion ohne Transfektion mit c-jun und c-fos.

Zur weiteren Untersuchung der Bedeutung der AP-1-Stelle für die Induktion durch Chemotherapeutika wurden kinetische Stu dien durchgeführt (Fig. 6B). Das -36/+100-Konstrukt reagierte mit einer starken Aktivierung, die 20 bis 25 Stunden nach Initiation der 5-FU-Behandlung begann. Die Aktivierung schritt danach fort und erreichte nach 64 Stunden das höchste Niveau. Das -36/+19-Konstrukt zeigte jedoch keine Reaktion auf diese Behandlung. Selbst nach einer auf 64 Stunden ausgeweite ten Inkubation mit 5-FU konnte kein signifikanter Anstieg beobachtet werden. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeu tung der AP-1-Stelle für die chemotherapeutische Behandlung weiter.

Da der AP-1-Komplex durch verschiedene Bestandteile, die die Reaktion auf einen bestimmten zellulären Stimulus bewirken, gebildet werden kann, wurden Untersuchungen zur Struktur der Dimerbindung an den Promotor durchgeführt. Dazu wurden "Gels hift"-Analysen mit Oligonucleotiden durchgeführt, die die Konsensus-AP-1-Stelle (CCTGACTC) im CD95L-Promotor umfaßten. Diese Oligonucleotide konnten durch nucleäre Extrakte von 5- FU-behandelten HepG2-Zellen und von 5-FU-behandleten Huh7- Zellen (eine weitere Leberzellenkarzinom-Zellinie) hinsicht lich ihrer Mobilität verschoben werden, wobei mit Extrakten aus unbehandelten Zellen nur eine geringe Mobilitätsverschie bung zu beobachten war (Fig. 7). Diese Komplexbildung konnte mit unmarkiertem Wildtyp-Oligonucleotid und mit einem Konsen sus-AP-1-Oligonucleotid kompetitiv aufgehoben werden, jedoch nicht mit unmarkierten Oligonucleotiden, die die Konsensus- Sequenzen für entweder NF-kB oder SP-1 enthielten, was deut lich auf eine spezifische Bindung von AP-1 an die Zielstelle im Promotor hinweist. Zur Identifizierung von Teilkomponenten des Bindungskomplexes wurden "Supershift"-Experimente durch geführt. Antikörper gegen c-Jun und c-Fos konnten die Mobili tät des Komplexes weiter verschieben (Fig. 7). Anti-c-Jun- und anti-c-Fos-Antikörper verschoben die Mobilität der Kom plexe mit nucleären Extrakten von beiden Zelltypen (HepG2 und Huh7), allerdings in unterschiedlichem Ausmaß. Anti-c-Fos- Antikärper führten bevorzugt in nucleären HepG2-Extrakten zu einer Mobilitätsverschiebung und anti-c-Jun-Antikörper bevor zugt in Huh7-Extrakten. Weder Antikörper gegen C/EBP (als eine Isotyp-angepaßte Kontrolle) (Fig. 7) noch Antikörper gegen JunD oder ATF2 beeinflußten die Mobilität der Komplexe, was auf eine Präferenz eines Jun/Fos-Heterodimers für diese Stelle hinweist.

Als weiterer Nachweis für die Bedeutung dieser CD95L-Promotor stelle für die Hochregulation als Folge der chemotherapeuti schen Behandlung wurde dieses AP-1-Element durch ortsgerichte te Mutagenese mutiert. Die Konsensus-Wildtypseguenz CTGACTCA wurde an drei unterschiedlichen Positionen zu CTAATTAA mu tiert. Diese Mutationen zerstören die Antwortbereitschaft eines AP-1-Luciferase-Reporterkonstrukts. Die Einführung die ser Mutationen in das -36/+100-Reporterkonstrukt hob die Indu zierbarkeit des Konstrukts nach 48stündiger Behandlung mit 100 µg/ml 5-FU fast vollständig auf (Fig. 8). Dies ist ein weite rer Beleg für die Bedeutung der AP-1-Stelle bei der durch Chemotherapie induzierten Apoptose.

Beispiel 6 Beteiligung des Stress-aktivierten Proteinkinase- Wegs (SAPK/JNK) bei der Chemotherapie-induzierten Hochregula tion von CD95L

Bei vielen Zellstress auslösenden Faktoren ist die SAPK/JNK- Kaskade in den Zielzellen beteiligt. Chemotherapeutika stellen sowohl in vivo als auch in vitro starke Stressfaktoren dar. Daher wurde untersucht, ob dieses System der nacheinander aktivierten Kinasen an der Reaktion auf Chemotherapeutika beteiligt ist. Das letzte Ziel der SAPK-Kaskade ist die Phos phorylierung von c-Jun. Daher wurden Cotransfektionen eines dominant-negativen c-jun-Konstrukts (DN c-jun), dem die Amino säuren 1 bis 192 fehlten (ein Bereich, der die Phosphorylie rungsstellen an den Serinresten 63 und 73 umfaßt), mit den verschiedenen Luciferase-Reporterkonstrukten durchgeführt. Das dominant-negative c-jun beeinträchtigt die Aktivierung des AP- 1-Komplexes beträchtlich, da es zwar noch die Dimerisierungs domäne enthält, die AP-1-Zielgene jedoch nicht mehr aktivieren kann. Die Wirksamkeit der Hemmung ist in Fig. 9A gezeigt. Die Cotransfektion von Hep3B-Zellen mit dem -36/+100-Reporterkon strukt, c-jun und dominant-negativen c-jun setzte die akti vierende Wirkung von c-jun auf den Promotor vollständig außer Kraft (Fig. 9A, die zwei rechten Spalten). Was jedoch noch bedeutsamer ist, ist die Tatsache, daß dominant-negatives c- jun die Promotoraktivierung nach Behandlung mit Chemotherapeu tika auch drastisch hemmt, was die Notwendigkeit der c-jun- Phosphorylierung für die beobachtete Hochregulation unter streicht (Fig. 9A).

Schließlich wurde auch die Beteiligung Stress-aktivierter Kinasen an der Aktivierung des CD95L-Promotors untersucht. Dazu wurden Hep3B-Zellen mit dominant-negativen Konstrukten von verschiedenen SAPK/JNKs cotransfiziert. Wie in Fig. 9B dargestellt konnte die Aktivierung durch 5-FU durch Cotrans fektion der dominant-negativen MEKK-1 und der dominant-negati ven JNKK gehemmt werden, was auf die aufeinanderfolgende Akti vierung der MEKK-1⇒JNKK⇒JNK⇒ c-Jun-Achse hinweist. Als Kon trolle wurde eine dominant-negative Mutante des p38-Wegs ver wendet. Beide dominant-negativen Konstrukte des p38-Wegs (DN- MKK3 und DN-MKK6) hatten praktisch keine Auswirkung auf die Hochregulierung der Promotoraktivierung nach Behandlung mit Zytostatika. Es kann deshalb davon ausgegangen werden, daß Chemotherapeutika CD95L über den vorstehend erwähnten JNK-Weg induzieren.

Da AP-1 ein Protein der Akut-Phase darstellt und normalerweise innerhalb von wenigen Minuten nach einem gegebenen Stimulus aktiviert wird, wurde untersucht, ob eine gesteigerte Akti vierung von AP-1 in einem zeitlichen Rahmen beobachtet werden kann, der zu der in dem vorstehenden experimentellen System gefundenen Hochregulation von CD95L paßt. Dazu wurden Hep3B- Zellen 40 Stunden nach Behandlung mit 5-FU mit einem Antikör per gegen c-Jun immungefärbt. Nach Immunfluoreszenz-Färbung wurden die Intensität der Färbung und die räumliche Verteilung positiver Signale untersucht. Die Spezifität der Färbung wurde durch Blockierungsexperimente unter Verwendung antigener Pep tide bestätigt. Unbehandelte Hep3B-Zellen zeigten leichte positive Signale (Fig. 10A). Nach Behandlung mit 5-FU für 40 Stunden häuften die Zellen AP-1 im Nucleus stark an, was als punktförmige positive Signale in Fig. 10B zu sehen ist. Die ser Befund deutet darauf hin, daß nach ausgedehnter Behandlung mit Chemotherapeutika eine starke Aktivierung von AP-1 ein tritt. Es wurde auch untersucht, ob dieses Phänomen auch in primären humanen Zellen auftritt. Dazu wurden primäre humane Hepatozyten isoliert, die aus Patientenmaterial während einer Lebertransplantation erhalten worden waren. Die isolierten Zellen wurden zur Eliminierung von Stress-Auswirkungen auf grund des Isolationsverfahrens zwei Tage kultiviert und da nach 40 Stunden mit 5-FU behandelt, fixiert und immungefärbt. Die kultivierten primären humanen Hepatozyten waren bezüglich AP-1 negativ (Fig. 10C). Nach 40stündiger chemotherapeuti scher Behandlung zeigten die primären Hepatozyten jedoch eine starke nucleäre Reaktivität, die über den gesamten Nucleus verstreut war (Fig. 10D), was anzeigt, daß in den primären humanen Hepatozyten derselbe Reaktionstyp abläuft wie in den Leberzellenkrebs-Zellinien.

Claims

1. Verfahren zur Untersuchung, ob eine Testverbindung für eine Chemotherapie wirksam ist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

a) Bereitstellung einer DNA-Sequenz, die die in Fig. 5A dargestellte AP-1-Stelle als Bestandteil eines Promotors umfaßt, der mit einem Reportergen oder CD95L-Gen funktionell verknüpft ist;
b) Inkontaktbringen der DNA-Sequenz von a) mit der Testverbindung in einem zellulären Assay; und
c) Bestimmung der Aktivierung des Promotors, wobei eine Aktivierung anzeigt, daß die Testverbindung für eine Chemotherapie wirksam ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Promotor der CD95L-Promotor ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Testverbin dung Bestandteil einer Substanzbibliothek ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die die AP-1-Stelle umfassende DNA-Sequenz die in Fig. 5A dargestellte Nukleinsäuresequenz von den Positionen -36 bis +100 oder ein Fragment davon ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die die AP-1-Stelle umfassende DNA-Sequenz die in Fig. 5A dargestellte Nukleinsäuresequenz von den Positionen +84 bis +91 ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Reportergen das CAT-, Luciferase-, LacZ- oder GFP-Gen ist.

7. Arzneimittel, das ein Gemisch aus mindestens zwei Ver bindungen umfaßt, die nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 identifiziert wurden und/oder die Expression des CD95L-Gens fördern.

8. Verwendung des in Anspruch 7 definierten Gemisches zur Therapie von Krebs und/oder Autoimmunerkrankungen.