DE19962204A1 - Enzym-katalysierte Modifizierung von Substanzen in biologischen Gemischen - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Enzym-katalysierten Modifizierung von Substanzen in einem Gemisch, umfassend das Inkontaktbringen der zu modifizierenden Substanz in einem Gemisch mit einem Enzym und einem Substrat.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Enzym-katalysierten Modifizierung von Substanzen in einem Gemisch, umfassend das Inkontaktbringen der zu modifizierenden Substanz in einem Gemisch mit einem Enzym und einem Substrat.

In vielen biologischen, biotechnologischen und chemischen Prozessen fallen die hergestellten Produkte als Gemische organischer Substanzen an und können als solche aus dem Reaktionsansatz extrahiert werden. Einzelne Substanzen dieser Extrakte werden aufgrund ihrer besseren Dosierbarkeit und eventueller unerwünschter Nebeneffekte der anderen Extraktinhaltsstoffe häufig isoliert und z. B. in kosmetischen Zubereitungen verwendet; vgl. DE 196 15 577 A1, JP 11080002 A2. Die isolierten Substanzen werden zudem häufig modifiziert, da sich gezeigt hat, daß durch die Modifikation die Aktivität der Substanz erhöht werden kann. Beispielsweise ist Arbutin, ein hautaufhellendes Glykosid aus der Bärentraube, in Form seines Coumaroyl-Esters bis zu 300fach aktiver als unmodifiziertes Arbutin; vgl. EP 0 524 109 B1. Solche Verbesserungen zeigen ebenfalls Salicinderivate wie p-OH-Phenylacetoyl-Salicin gegenüber Salicin. Die Isolierung der gewünschten Substanzen aus den Extrakten ist jedoch oft schwierig. Da in den Extrakten die Inhaltsstoffe meist die polare Natur des Extraktionsmittels aufweisen, sind aufwendige chromatographische Reinigungsschritte nötig. Beispielsweise enthalten alkoholische Auszüge vorwiegend eine Mischung hydrophiler Komponenten. Ferner ist die Ausbeute der gewünschten Substanz bei derartigen Isolierungen gering. Bei den aufwendigen Aufarbeitungsverfahren gehen zudem die anderen Inhaltsstoffe der Extrakte verloren.

Andererseits können die gewünschten Substanzen aber gerade in Synergie mit den anderen Inhaltsstoffen der Extrakte ihre besondere Wirkung entfalten; vgl. Lozoya, X., (1997) Spektrum der Wissenschaft, Sonderausgabe: Pharmaforschung, 6, 10-16. Daher werden beispielsweise Pflanzenextrakte aufgrund der in ihnen enthaltenen biologisch aktiven Inhaltsstoffe ohne vorherige Isolierung der gewünschten Substanzen zunehmend in der pharmazeutischen und kosmetischen Industrie eingesetzt; vgl. Leung, A. Y., Foster, S., (1996, 2. Ausgabe) Encyclopedia of common natural ingredients - used in food, drugs, and cosmetics, Verlag John Wiley and Sons, Inc., New York, Brisbane, Singapure. Auch hier ist erwünscht, die Aktivität der gewünschten Substanzen durch Modifikation zu verbessern.

Es besteht somit der Bedarf nach einem effizienten und einfachen Verfahren zur Modifikation von Substanzen in einem Gemisch ohne vorherige Isolierung der Substanz.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.

Der hier verwendete Begriff "Enzym-katalysierte Modifikation" oder "Enzym-katalysierte Modifizierung" bedeutet, daß eine Substanz (Zielsubstanz A) mit einem Substrat (Substanz B) in einem Gemisch mit Hilfe eines Enzyms als Biokatalysator gekoppelt wird.

Die Erfindung wird durch die folgende Figur erläutert.

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung der Effekte von Salicin und Salicinestern auf die Prostaglandinfreisetzung in Keratinocyten. Gezeigt ist jeweils der Mittelwert aus drei Meßpunkten. In der Figur bedeuten 1 = Negativkontrolle, 2 = Salicin, 3 = Phenylpropionyl-Salicin, 4 = p-OH-Phenylacetyl-Salicin und 5 = Positivkontrolle.

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Enzym-katalysierten Modifizierung von Substanzen in einem Gemisch, umfassend das Inkontaktbringen der zu modifizierenden Substanz in einem Gemisch mit einem Enzym und einem Substrat.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß durch enzymatische selektive und schonende Modifikation der Substanzen in Gemischen deren biologische Aktivität erhöht werden kann, ohne die anderen Inhaltsstoffe zu verändern, die weiterhin als wertvolle Stoffe erhalten bleiben. Dabei wird die biologische Aktivität und/oder Verfügbarkeit verbessert sowie die Löslichkeit und/oder Affinität der Substanz (Zielsubstanz A) geändert. Ferner können durch die Enzym­ katalysierte Modifikation, z. B. durch Ankopplung biologisch aktiver Substrate (Substanz B), neue Stoffe erzeugt werden, welche gegenüber der ursprünglichen Substanz zusätzliche Wirkungen aufweisen. Die Zielsubstanz A kann z. B. durch Ankopplung von Carbonsäuren mittels Lipasen hydrophobisiert werden, durch Ankopplung von Zuckern/Polyolen mittels Glykosidasen oder Glykosyltransferasen hydrophilisiert werden, oder durch Ankopplung von substituierten arylaliphatischen Carbonsäuren mittels Lipasen oder durch Ankopplung von primären Aminen oder Peptiden mittels Transglutaminasen oder Proteasen oder durch Ankopplung von Polyolen mittels Glykosidasen oder Glykosyltransferasen in ihrer Affinität verändert werden.

Das Gemisch kann ein Extrakt aus pflanzlichen, tierischen oder mikrobiellen Zellen sein oder bei biotechnologischen oder chemischen Herstellungsverfahren anfallen. Bevorzugt ist ein Verfahren, wobei der pflanzliche, tierische oder mikrobielle Zellextrakt flüssig oder getrocknet ist. Die Modifikation der Substanz kann derart durchgeführt werden, daß zum Gemisch ein Enzym zugesetzt wird, das die Zielsubstanz A mit einem Substrat B umsetzt, so daß die gewünschte modifizierte Substanz A-B entsteht. Dabei kann das Enzym frei vorliegen oder immobilisiert sein. Immobilisiert bedeutet, daß das Enzym (Biokatalysator) ionisch oder adsorptiv an Träger gekoppelt sein kann. Der Träger kann ein hydrophiles oder hydrophobes Feststoffpartikel oder eine Säulenmatrix sein, wobei das Gemisch zur Umsetzung über die Säule gegeben wird. Der Träger kann auch ein magnetisiertes Teilchen sein, so daß das Enzym nach der Umsetzung der Substanz aus dem Gemisch mit Hilfe eines Magnetfeldes entfernt werden kann. Des weiteren kann das Enzym durch Quervernetzung oder Einschluß in Matrices oder Membranen immobilisiert sein. Ferner kann das Enzym Polymer-derivatisiert sein.

Der Vorteil gegenüber der chemischen Modifikation liegt in der hohen Selektivität, den milden Bedingungen und der Biokompatibilität der Enzym-katalysierten Umsetzung. Beispielsweise ist eine Glykosid-Modifikation durch Kopplung von Carbonsäuren mit Hilfe üblicher Methoden der chemischen Synthese bekannt; vgl. Colbert, J. C., Sugar Esters - Preparation and Application, Noyes Data Corporation, New Yersey (1974). Die chemische Darstellung von Estern aus ungeschützten Glykosiden und Carbonsäuren führt meist zu unspezifischen Gemischen aus ein- und mehrfach acylierten Zuckern, so daß die Einführung und Entfernung von Schutzgruppen notwendig ist, wenn ein bestimmtes Produkt synthetisiert werden soll. Durch Einsatz aktivierter Carbonsäurederivate wie Säurechloriden oder Säureanhydriden entstehen jedoch unerwünschte Nebenprodukte, die die Umwelt belasten, die Aufarbeitung erschweren und die Ausbeuten des gewünschten Produkts vermindern.

Bevorzugt ist ein Verfahren, wobei das Enzym ausgewählt ist aus den IUB-Enzymklassen 2 (Transferasen), 3 (Hydrolasen), 4 (Lyasen) oder 6 (Ligasen). Besonders bevorzugt ist ein Verfahren, wobei die Transferase ausgewählt ist aus der Gruppe der Acyl-, Glykosyl-, Phosphoryl-, Methyltransferasen oder Transglutaminasen, und die Hydrolase ausgewählt ist aus der Gruppe der Esterhydrolasen z. B. Lipasen oder Esterasen, Glykosidasen, Transglykosidasen, Epoxidhydrolasen oder Proteasen. Insbesondere bevorzugt ist ein Cofaktor-unabhängiges Enzym. Ein Cofaktor-unabhängiges Enzym kann z. B. eine Lipase sein und aus Candida antartica, Humicola lanuginosa, Rhizopus spec., Chromobacterium viscosum, Aspergillus niger, Candida rugosa, Geotrichum spec., Penicillium camembertii, Rhizomucor miehei, Burkholderia spec. oder Pseudomonas spec. stammen. Ein Cofaktor-unabhängiges Enzym kann ferner eine Esterase oder Protease sein und mikrobiellen oder tierischen Ursprungs sein und insbesondere aus Schweinepankreas stammen. Insbesondere bevorzugt ist ebenfalls eine aus mikrobiellen oder tierischen Ursprung stammende Transglutaminase, Glykosidase oder Transglykosidase, wobei die Transglutaminase Ca²⁺-abhängig oder unabhängig sein kann. Das verwendete Enzym kann ferner ein synthetisch hergestelltes oder modifiziertes Enzym sein, das eine oder mehrere Substitution(en), Addition(en), Deletion(en) enthält oder glykolysiert sein kann.

Das Substrat kann jedes Molekül sein, das von dem verwendeten Enzym umgesetzt werden kann. Bevorzugt ist ein Substrat, das antünflammatorische, antioxidative oder antimikrobielle Eigenschaften besitzt. Vorzugsweise ist das Substrat eine Carbonsäure, die aktiviert oder nicht aktiviert sein kann, ein primäres Amin oder Peptid der allgemeinen Formel (1) R'-NH₂, wobei R' ein aliphatischer oder arylaliphatischer Rest mit mindestens 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist, oder ein Zucker, der aktiviert oder nicht aktiviert sein kann.

Bevorzugt sind aromatische, aliphatische oder arylaliphatische Carbonsäuren, die aus 2-26 C- Atomen und/oder 1-10 Heteroatomen bestehen können und substituiert, unsubstituiert, gesättigt oder einfach oder mehrfach ungesättigt sein können. Besonders bevorzugt sind gesättigte aliphatische Monocarbonsäuren, z. B. Essigsäure, Propionsäure, n-Buttersäure, n-Valeriansäure, Capronsäure, Caprylsäure, Caprinsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Hexacosansäure und deren einfach oder mehrfach ungesättigten Derivate, z. B. Propensäure, Crotonsäure, Vinylessigsäure, Palmitoleinsäure, Ölsäure, Elaidinsäure, Linolsäure, Linolensäure, Icosapentaensäure, Stearidonsäure, Arachidonsäure, konjugierte Linolsäuren, und deren Halo-, Hydroxy- und Nitro-subtituierten Derivate. Ferner besonders bevorzugt sind aromatische und gesättigte oder ungesättigte arylaliphatische Carbonsäuren, z. B. Benzoesäure, Phenylessigsäure, Phenylpropionsäure, Phenylbuttersäure, Phenylvaleriansäure und deren einfach oder mehrfach hydroxylierten Derivate, z. B. Salicylsäure, m-, p-Hydroxybenzoesäure, Gallussäure, o-, m-, p- Hydroxy-Phenylessigsäure, o-, m-, p-Phenylpropionsäure, o-, m-, p-Phenylbuttersäure, o-, m-, p- Phenylvaleriansäure, Zimtsäure, Coumarsäuren, Kaffeesäure.

Ferner bevorzugt sind primäre Amine der allgemeinen Formel (1) R'-NH₂, wobei R' ein aliphatischer oder arylaliphatischer Rest mit mindestens 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist, oder wobei R' mit Hydroxy-, Halo- oder Nitro-Resten substituiert ist. Des weiteren kann das Amin auch ein Peptid oder Polypeptid sein.

Als Substrat sind ferner bevorzugt aktivierte oder nicht aktivierte Zucker, z. B. Threose, Erythrose, Arabinose, Lyxose, Ribose, Xylose, Allose, Altrose, Galactose, Glucose, Gulose, Idose, Mannose, Talose oder Fructose und deren zusammengesetzten Di- und Oligomeren sowie Polymeren. Besonders bevorzugt sind die natürlich vorkommenden Isomere der Zucker, insbesondere die D-Formen. Ferner besonders bevorzugt sind N-Acetylglucosamin, Sialinsäure, Vitamin C und Uronsäuren. Ferner besonders bevorzugt sind aktivierte Zucker mit einem Aglykon, das gute Abgangsgruppeneigenschaften aufweist, z. B. Halo-, Aryl- (z. B. p-Nitro­ phenyl-), Nucleosid-, Allyl-, Methyl- oder Azid-Glykoside.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann direkt in den Extrakten durchgeführt werden. Die Reaktionstemperatur kann in allen Bereichen gewählt werden, in denen die eingesetzten Enzyme aktiv sind. Bevorzugt ist die Durchführung bei Temperaturen von 15°C bis 80°C, besonders bevorzugt bei Temperaturen von Raumtemperatur bis 80°C, insbesondere bevorzugt bei Temperaturen von Raumtemperatur bis 60°C, ferner insbesondere bevorzugt bei Temperaturen von Raumtemperatur bis 45°C.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann ohne Zugabe von organischen Lösungsmitteln durchgeführt werden. Ist die Zugabe von organischen Lösungsmittel gewünscht, kann z. B. Dioxan, Acetonitril, Aceton, γ-Butyrolacton, Tetrahydrofuran, tert.-Butanol, tert.-Amylalkohol oder 3-Methyl-3-pentanol, Ethanol, Methanol oder Kohlensäureester, Hexan oder deren Gemische verwendet werden.

Bevorzugt ist ein Verfahren, in dem bei einer Hydrolysereaktionen das bei der Veresterung entstehende Wasser aus dem System entfernt wird, z. B. mit üblicherweise verwendeten geeigneten Molekularsieben, Permeationsmembranen oder durch Anlegen eines entsprechenden Unterdrucks.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Substanz nach der Modifikation aus dem Gemisch entfernt. Überraschenderweise wurde gefunden, daß durch die schonende Modifikation von Substanzen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens die Eigenschaften der Substanzen so verändert werden können, daß eine Isolierung der modifizierten Substanz deutlich erleichtert wird, d. h. ihre Abtrennung von den übrigen Komponenten des Gemischs wesentlich einfacher möglich ist, als im Falle der unmodifizierten Substanz. Die modifizierte Substanz kann nach Beendigung der Reaktion mit Hilfe üblicher Isolationsmethoden, z. B. durch einfache Extraktion mit einem geeigneten Lösungsmittel oder wäßriger Zweiphasenreaktion unter Nutzung entsprechender Tenside oder Polymere und/oder Chromatographieverfahren unter Nutzung der Affinität und/oder Polarität aus dem Reaktionsgemisch, isoliert werden. Beispielsweise kann die Isolierung eines Glykosids aus einem hydrophilen Pflanzenextrakt stark erleichtert sein, wenn durch selektive Lipase-Katalyse eine hydrophobe Carbonsäure an das Glykosid gekoppelt wird, die das Glykosid in ein lipophiles Derivat umwandelt.

Aufgrund der veränderten Polarität des Glykosids gegenüber den restlichen Inhaltsstoffen, kann das modifizierte Glykosid aus dem Extrakt leicht durch Abtrennung isoliert werden. Dies kann durch dem Fachmann bekannte Trennverfahren durchgeführt werden, z. B. durch eine Lösungsmittelextraktion, ein chromatographisches Verfahren oder eine Umkristallisation. Bevorzugt erfolgt die Abtrennung durch eine Lösungsmittelextraktion, wobei als Lösungsmittel vorzugsweise wenig polare, mit Wasser wenig mischbare organische Lösungsmittel, z. B. aliphatische oder aromatische Kohlenwasserstoffe mit 3 bis 20 Kohlenstoffatomen, Ether oder Ester mit 3 bis 30 Kohlenstoffatomen, oder halogenierte Kohlenwasserstoffe z. B. Methylenchlorid oder Chloroform, verwendet werden können. Als Lösungsmittel besonders bevorzugt sind Pentan, Hexan, Heptan, Isooctan, Methylenchlorid, Methyl-tert-Butylether und Toluol. Bevorzugt ist ein Substrat (Anker), das antiinflammatorische, antioxidative oder antimikrobielle Eigenschaften besitzt. Insbesondere bevorzugt wird das Substrat so gewählt, daß die Substanz hinsichtlich ihrer späteren Formulierbarkeit, Stabilität und/oder biologischen Wirksamkeit in eine verbesserte Form überführt wird.

Falls gewünscht, kann das Substrat nach Isolierung der modifizierten Substanz durch eine enzymatische Umkehrreaktion, z. B. eine Lipase- oder Protease oder Glykosidase-katalysierte Hydrolyse, leicht wieder abgespalten werden. Ferner kann eine chemische Umkehrreaktion angewendet werden. Bevorzugt ist eine milde und selektive enzymatische Reaktion zur Abspaltung des Substrats.

Beispiele Beispiel 1 Einfache Isolierung von Arbutin aus einem kommerziell erhältlichen Extrakt der Blätter der Bärentraube (Charge A) nach enzymatischer Überführung in einen Palmitoyl-Ester

10 ml eines kommerziell erhältlichen ethanolischen Auszuges aus Blättern der Bärentraube (Extractum Ursi Fluid, Chemische Fabrik Dr Hetterich KG, Fürth; Charge 04062098, enthält mindestens 5,0% Arbutin und andere hochpolare Inhaltsstoffe) wurden einrotiert und mit 500 mg Palmitinsäure, 2 g immobilisierter Lipase (Isoenzym B aus Candida antarctica), 5 g Molekularsieb und 5 ml Aceton im rotierenden (75 rpm) 50 ml Rundkolben bei 45°C inkubiert. Die Umsetzung von Arbutin mit Palmitinsäure wurde mittels Dünnschichtchromatographie nach 24 Stunden (Kieselgel 60-Platten mit Fluoreszenzindikator; Laufmittel: Chloroform/Methanol/Wasser 65 : 15 : 2 (v/v/v); Visualisierung: UV-Detektion sowie mittels Essigsäure/Schwefelsäure/Anisaldehyd 100 : 2 : 1 (v/v/v)-Tauchreagenz) durch Vergleich mit Referenzsubstanz (R_f 0,39) nachgewiesen. Das Zielprodukt konnte durch einfache Extraktion mit Methylenchlorid oder Chloroform von den restlichen Inhaltsstoffen abgetrennt werden.
NMR der isolierten Substanz:
¹³C-NMR (CD₃OD): δ (ppm) = 14,4 (C-16), 23,.7 (C-15), 26,0 (C-3), 30,0-33,0 (C-4-C-14), 35,1 (C-2), 64,7 (C-6'), 71,7 (C-4'), 74,8 (C-2'), 75,3 (C-5'), 77,8 (C-3'), 103,6 (C-1'), 116,6 (C-3*, C-5*), 119,5 (C-2*, C-6*), 152-154 (C-1*, C-4*), 175,2 (C=O). (Markierung: ohne = Acylrest, ' = Glucose, * = Aglykon).

Beispiel 2 Einfache Isolierung von Arbutin aus kommerziellem Extrakt der Blätter der Bärentraube (Charge B) nach enzymatischer Überführung in einen Phenylpropionyl-Ester

5 ml eines kommerziell erhältlichen Extraktes aus Blättern der Bärentraube (Extractum Ursi Fluid, Chemische Fabrik Dr Hetterich KG, Fürth; Charge 01810797, enthält mindestens 5,7% Arbutin) wurde einrotiert und mit 2 g immobilisierter Lipase (Isoenzym B aus Candida antarctica), 5 g Molekularsieb und 5 ml t-Butanol als Lösungsmittel im rotierenden (75 rpm) 50 ml Rundkolben bei 60°C inkubiert. Phenylpropionsäure wurde schrittweise (je 50 mg pro 4 Stunden) zugegeben, um Überschüsse an Säure im Ansatz zu vermeiden. Die Umsetzung von Arbutin mit Phenylpropionsäure wurde mittels Dünnschichtchromatographie nach 24 Stunden (Kieselgel 60-Platten mit Fluoreszenzindikator; Laufmittel: Chloroform/Methanol/Wasser 65 : 15 : 2 (v/v/v); Visualisierung: UV (254 nm)-Detektion sowie mittels Essigsäure/Schwefel­ säure/Anisaldehyd 100 : 2 : 1 (v/v/v)-Tauchreagenz) durch Vergleich mit Referenzsubstanz (6-O- Phenylpropionyl-[4-(Hydroxyphenyl)]- -D-glucopyranosid, R_f 0,33) nachgewiesen. Das Zielprodukt konnte durch einfache Extraktion mit Methylenchlorid oder auch Chloroform isoliert werden.
NMR der isolierten Substanz:
¹³C-NMR (CD₃OD): δ (ppm) = 31,9 (C-2), 36,9 (C-3), 64,8 (C-6'), 71,7 (C-4'), 74,9 (C-2'), 75,3 (C-5'), 77,8 (C-3'), 103,5 (C-1'), 116,7 (C-3*, C-5*), 119,7 (C-2*, C-6*), 127,2 (C-7), 129,4 (C-5, C-6, C-8, C-9), 141,8 (C-4), 152,2, 153,9 (C-1*, C-4*), 174,2 (C=O). (Markierung: ohne = Acylrest, ' = Glucose, * = Aglykon).

Beispiel 3 Abspaltung des Substrats (Anker)

5 mg des isolierten Palmitoyl-Arbutins (Beispiel 1) wurde in Phosphatpuffer (pH 7,4, 0,1 M) gelöst und 2 h mit 5 mg Candida antarctica Lipase B (SP 435) inkubiert. Der Verlauf der Abspaltung wurde mittels Dünnschichtchromatographie (Kieselgel 60-Platten mit Fluoreszenzindikator; Laufmittel: Chloroform/Methanol/Wasser 65 : 15 : 2 (v/v/v); Visualisierung: UV-Detektion sowie mittels Essigsäure/Schwefelsäure/Anisaldehyd 100 : 2 : 1 (v/v/v)- Tauchreagenz) verfolgt. Nach 1 h war der Ester komplett hydrolysiert.

Beispiel 4 Enzymatische Modifikation von Salicin in Weidenrindenextrakten

10 ml eines kommerziell erhältlichen Weidenrindenextraktes (Extractum Salicis, Chemische Fabrik Dr Hetterich KG, Fürth; enthält mindestens 2,5% Salicin) wurde einrotiert und mit 2 g immobilisierter Lipase (Isoenzym B aus Candida antarctica), 5 g Molekularsieb, 500 mg Phenylpropionsäure und 5 ml t-Butanol als Lösungsmittel im rotierenden (75 rpm) 50 ml Rundkolben bei 60°C inkubiert. Die Umsetzung von Salicin mit Phenylpropionsäure wurde mittels Dünnschichtchromatographie nach 24 Stunden (Kieselgel 60-Platten mit Fluoreszenzindikator; Laufmittel: Chloroform/Methanol/Wasser 65 : 15 : 2 (v/v/v); Visualisierung: UV (254 nm)-Detektion sowie mittels Essigsäure/Schwefelsäure/Anisaldehyd 100 : 2 : 1 (v/v/v)- Tauchreagenz) nachgewiesen. Das Zielprodukt konnte durch einfache Extraktion mit Methylenchlorid oder auch Chloroform isoliert werden.
NMR der isolierten Substanz:
¹³C-NMR (CD₃OD): δ (ppm) = 30,9 (C-2), 38,7 (C-3), 61,6 (C-7*), 65,2 (C-6'), 72,2 (C-4'), 75,6 (C-2'), 76,1 (C-5'), 78,4 (C-3'), 103,7 (C-1'), 117,6 (C-6*), 124,5 (C-4*), 127,6 (C-7), 130,1-131,0 (C-3*, C-5*, C-5. C-6, C-8, C-9), 132,8 (C-2*), 143,4 (C-4), 157,5 (C-1*), 175,2 (C=O). (Markierung: ohne = Acylrest, ' = Glucose, * = Aglykon).

Beispiel 5 Einführung zusätzlicher wirksamer Teilstrukturen in Inhaltsstoffe der Weidenrinde

Arylaliphatische Carbonsäuren sind bekannt für antioxidative und antibakterielle Effekte. Darüber hinaus zeigt p-hydroxylierte Phenylessigsäure antiinflammatorische Wirkung. 10 ml eines kommerziell erhältlichen Weidenrindenextraktes (Extractum Salicis, Chemische Fabrik Dr Hetterich KG, Fürth; enthält mindestens 2,5% Salicin) wurde einrotiert und mit 2 g immobilisierter Lipase (Isoenzym B aus Candida antarctica), 5 g Molekularsieb, 500 mg p-OH- Phenylessigsäure und 5 ml t-Butanol als Lösungsmittel im rotierenden (75 rpm) 50 ml Rundkolben bei 60°C inkubiert. Die Umsetzung von Salicin mit p-OH-Phenylessigsäure wurde mittels Dünnschichtchromatographie nach 24 Stunden (Kieselgel 60-Platten mit Fluoreszenzindikator; Laufmittel: Chloroform/MethanollWasser 65 : 15 : 2 (v/v/v); Visualisierung: UV (254 nm)-Detektion sowie mittels Essigsäure/Schwefelsäure/Anisaldehyd 100 : 2 : 1 (v/v/v)- Tauchreagenz) nachgewiesen. Das Zielprodukt wurde für die NMR-Analyse durch einfache Extraktion mit Methylenchlorid isoliert.
NMR der isolierten Substanz:
¹³C-NMR (CD₃OD): δ (ppm) = 41,8 (C-2), 61,0 (C-7*), 65,0 (C-6'), 71,5 (C-4'), 74,9 (C-2'), 75,4 (C-5'), 77,8 (C-3'), 103,2 (C-1'), 117,1 (C-6*), 123,9 (C-4*), 129,4-132,3 (C-2*, C-3*, C- 5*; C-4, C-5, C-7, C-8), 136,1 (C-3), 156,0-159,2 (C-1*, C-6), 173,31 (C=O). (Markierung: ohne = Acylrest, ' = Glucose, * = Aglykon).

Beispiel 6

Murine (MSCP5) und humane (HPKII) Haut-Keratinocyten wurden mit 0,2 µCi ¹⁴C- Arachidonsäure/ml Medium für 16 Stunden markiert. Als Testsubstanzen wurden Salicin, Phenylpropionyl-Salicin und p-OH-Phenylacatyl-Salicin in frischem Medium mit ansteigender Konzentration zugegeben und 2 Stunden inkubiert. In der Positivkontrolle NS398 (10 µM) bei MSCP5-Zellen ist die Prostaglandinsynthese um 85% reduziert. Die Prostaglandine wurden im Vergleich zu Referenzsubstanzen identifiziert und radiodensitometrisch quantifiziert. MSCPS: 100% = 201 cpm; HPKII: 100% = 63 cpm.

Claims (14)

1. Verfahren zur Enzym-katalysierten Modifizierung von Substanzen in einem Gemisch, umfassend das Inkontaktbringen der zu modifizierenden Substanz in einem Gemisch mit einem Enzym und einem Substrat.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gemisch ein flüssiger oder getrockneter pflanzlicher, tierischer oder mikrobieller Zellextrakt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Enzym ausgewählt ist aus den IUB- Enzymklassen 2 (Transferasen), 3 (Hydrolasen), 4 (Lyasen) und 6 (Ligasen).

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Transferase ausgewählt ist aus der Gruppe der Acyl-, Glykosyl-, Phosphoryl-, Methyltransferasen oder Transglutaminasen, und die Hydrolase ausgewählt ist aus der Gruppe der Esterhydrolasen (Lipasen oder Esterasen), Glykosidasen, Transglykosidasen, Epoxidhydrolasen oder Proteasen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Enzym ein Cofaktor­ unabhängiges Enzym ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Cofaktor-unabhängige Enzym eine Lipase ist und aus Candida antartica, Humicola lanuginosa, Rhizopus spec., Chromobacterium viscosum, Aspergillus niger, Candida rugosa, Geotrichum spec., Penicillium camembertii, Rhizomucor miehei, Burkholderia spec. oder Pseudomonas spec. stammt, oder eine Esterase oder Protease ist und aus mikrobiellen oder tierischen Ursprungs ist, insbesondere aus Schweinepankreas stammt.

7. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Transglutaminase, Glykosidase und Transglykosidase mikrobiellen oder tierischen Ursprungs ist und die Transglutaminase Ca²⁺- abhängig oder unabhängig ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Enzym an einem Träger immobilisiert ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis. 8, wobei das Substrat eine aktivierte oder nicht aktivierte Carbonsäure, ein primäres Amin oder Peptid der allgemeinen Formel (1) -R'NH₂, wobei R' ein aliphatischer oder arylaliphatischer Rest mit mindestens 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist, oder ein aktivierter oder nicht aktivierter Zucker ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Verfahren bei Temperaturen von 15°C bis 80°C, besonders bei Temperaturen von Raumtemperatur bis 80°C, insbesondere bei Temperaturen von Raumtemperatur bis 60°C, ferner insbesondere bei Temperaturen von Raumtemperatur bis 45°C durchgeführt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, ferner umfassend das Isolieren der modifizierten Substanz aus dem Gemisch.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Isolierung durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel erfolgt.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, ferner umfassend das Abspalten des Substrats von der modifizierten Substanz.

14. Kosmetische, pharmazeutische oder Lebensmittel-Zubereitung umfassend mindestens eine Substanz erhältlich nach einem der Ansprüche 1 bis 13.