DE19958198A1 - Mit dem IGF-1 Rezeptor wechselwirkende Proteine (IIPs) - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Nukleinsäuremolekül mit der in SEQ ID NO:5 dargestellten Sequenz und die Komplementärsequenz, sowie ihre Verwendung für diagnostische und therapeutische Zwecke. Dieses Nukleinsäuremolekül ist ein Gen, welches für ein an den IGF-1 Rezeptor bindendes Polypeptid (IIP-10) codiert.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft mit dem IGF-1 Rezeptor wechselwirkende Proteine (IGF-1 receptor interacting proteins, IIPs), Nukleinsäuren, die für diese Proteine codieren, deren Verwendung für diagnostische und therapeutische Zwecke, insbesondere bei Krebserkrankungen. Inbesondere betrifft die Erfindung die Diagnose solcher Gene in Säugerzellen, insbesondere in bösartigen Tumorzellen, desweiteren Therapiemethoden zur Inhibierung der Wechselwirkung zwischen dem IGF-1 Rezeptor und IIPs, Verfahren zum Screenen für potentielle Krebstherapiemittel, sowie Zellinien und Tiermodelle, die für das Screening und für die Auswertung potentiell nützlicher pharmazeutischer Mittel, welche die Wechselwirkung zwischen IIPs und dem IGF-1 Rezeptor hemmen, geeignet sind.

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Klonierung und Charakterisierung des Gens IIP-10 und dessen Genprodukte. Die Genprodukte (Polypeptide, mRNA) sind insbesondere dadurch gekennzeichnet, daß sie die Fähigkeit besitzen, die Signalübertragung durch den IGF-1 Rezeptor modulieren zu können. Die Funktion dieser erfindungsgemäßen Genprodukte ist somit die Modulierung der Signaltransduktion durch den IGF-1 Rezeptor. Eine erzwungene Aktivierung von IIPs korreliert somit mit erhöhter Tumorzellproliferation, Überleben dieser Zellen und dem Nichteintreten der Apoptose.

Das IGF-1 Rezeptorsignalsystem spielt bei der Tumorproliferation und dem Überleben von Tumoren eine wichtige Rolle. Möglicherweise ist es auch an der Inhibierung der Tumorapoptose beteiligt. Zusätzlich und unabhängig von ihren mitogenen Eigenschaften kann die IGF-1R-Aktivierung in vitro und in vivo vor einem programmierten Zelltod schützen oder diesen zumindest verzögern (Harrington et al., EMBO J. 13 (1994) 3286-3295; Sell et al., Cancer Res. 55 (1995) 303-305; Singleton et al., Cancer Res. 56 (1996) 4522-4529). Es wurde ebenfalls gezeigt, daß eine Abnahme der IGF-1 R- Konzentration unterhalb der Wildtypkonzentrationen in vivo eine massive Apoptose von Tumorzellen hervorruft (Resnicoff et al., Cancer Res. 55 (1995) 2463-2469; Resnicoff et al., Cancer Res. 55 (1995) 3739-3741). Die Überexpression entweder des Liganden (IGF) und/oder des Rezeptors ist eine Eigenschaft von verschiedenen Tumorzellinien und kann in Tiermodellen zur Tumorbildung führen. Eine Überexpression von humanem IGF-1R führte zu einem ligandenabhängigen, ankerunabhängigen Wachstum von NIH3T3 oder Rat-1 Fibroblasten. Wurden nackte (engl. "nude") Mäuse mit diesen Zellen inokuliert, erfolgte eine rasche Tumorbildung (Kaleko et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990) 464-473; Prager et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 2181-2185). Transgene Mäuse, die IGF-11 spezifisch in den Milchdrüsen überexprimieren, entwickeln Milchdrüsenadenokarzinome (Bates et al., Br. J. Cancer 72 (1995) 1189-1193), und transgene Mäuse, die IGF-II unter der Kontrolle eines allgemeineren Promotors überexprimieren, entwickeln eine erhöhte Anzahl und ein weites Spektrum von Tumorarten (Rogler et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 13779-13784). Kleinzellenlungenkarzinome (Small Cell Lung Carcinomas) sind ein Beispiel unter vielen für IGF-I oder IGF-II mit sehr hoher Frequenz ( < 80%) überexprimierende humane Tumore (Quinn et al., J. Biol. Chem. 21 (1996) 11477-11483). Die Signalübertragung durch das IGF-System scheint ebenfalls für die Transformierungsaktivität bestimmter Onkogene erforderlich zu sein. Fötale Fibroblasten mit einem fehlerhaften IGF-1R-Gen können nicht mit dem SV40 T-Antigen, aktiviertem Ha-ras, einer Kombination von den beiden transformiert werden (Seil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 11217-11221; Sell et al., Mol. Cell. Biol. 14 (1994) 3604-3612), und auch das E5-Protein des Rinderpapillomavirus ist nicht mehr transformierend (Morrione et al., J. Virol. 69 (1995) 5300-­ 5303). Es wurde gezeigt, daß eine Störung des IGF/IGF-1R-Systems auch den transformierten Phenotyp umkehrt und Tumorwachstum hemmt (Trojan et al., Science 259 (1993) 94-97; Kalebic et al., Cancer Res. 54 (1994) 5531-5534; Prager et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 2181-­ 2185; Resnikoff et al., Cancer Res. 54 (1994), 2218-2222; Resnicoff et al., Cancer Res. 54 (1994) 4848-4850; Resnicoff et al., Cancer Res. 55 (1995) 2463-2469). Beispielsweise entwickeln mit Prostataadenokarzinomzellen aus der Ratte (PA-III) injizierte Mäuse, die mit Antisense cDNA (729 bp) gegen IGF-1R transfiziert worden waren, 90% kleinere Tumoren als Kontrolltiere, oder sie blieben auch nach 60 Tagen Beobachtung tumorfrei (Burfeind et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93 (1996) 7263-7268). Ein IGF-1R vermittelter Apoptoseschutz ist unabhängig von der de novo-Genexpression und Proteinsynthese. Somit übt der IGF-1 seine antiapoptotische Funktion wahrscheinlich über die Aktivierung von bereits gebildeten cytosolischen Mediatoren aus.

Einige an IGF-1R bindende Signalsubstrate wurden bereits beschrieben (z. B. IRS-1, SHC, p85 Pl3 Kinase etc., siehe unten). Keiner dieser Signalüberträger ist jedoch spezifisch für den IGF-1R und kann somit nicht ausschließlich für die einzigartigen biologischen Eigenschaften des IGF-1R im Vergleich mit anderen Rezeptortyrosinkinasen, einschließlich des Insulinrezeptors, verantwortlich sein. Dies zeigt, daß spezifische Zielsubstanzen des IGF-1R (oder zumindest der IGF-Rezeptorunterfamilie) existieren könnten, welche das Überleben auslösen und der Apoptose entgegenwirken und somit ausgezeichnete pharmazeutische Zielsubstanzen für eine Antikrebstherapie wären.

Mit Hilfe des Hefen-Zweihybridensystems (yeast two-hybrid system) wurde gezeigt, daß p85, die regulatorische Domäne der Phosphatidylinositol-3- Kinase (Pl3K) mit dem IGF-1R wechselwirkt (Lamothe, B., et al., FEBS Lett. 373 (1995) 51-55; Tartare-Decker, S., et al., Endocrinology 137 (1996) 1019-1024). Man beobachtet jedoch auch eine Bindung von p85 an viele andere Rezeptortyrosinkinasen fast aller Familien. Ein weiterer Bindungspartner des IGF-1R, der mit Hilfe des Zwei-Hybridenscreenings identifiziert wurde, ist SHC. SHC bindet auch andere Tyrosinkinasen, wie etwa trk, met, EGF-R und den Insulinrezeptor (Tartare-Deckert, S., et al., J. Biol. Chem. 270 (1995 23456-23460). Das Insulinrezeptorsubstrat 1 (IRS- 1) und das Insulinrezeptorsubstrat 2 (IRS-2) binden sowohl an den IGF-1R als auch an den Insulinrezeptor (Tartare-Deckert, S., et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 23456-23460; He, W., et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 11641-11645; Dey, R. B., et al., Mol. Endocrinol. 10 (1996) 631-641). Grb 10, welches mit dem IGF-1R wechselwirkt, besitzt auch viele Tyrosinkinasen als Bindepartner, z. B. met, Insulinrezeptor, kit und abl (Dey, R. B., et al., Mol. Endocrinol. 10 (1996) 631-641; Morrione, A., et al., Cancer Res. 56 (1996) 3165-3167). Auch die Phosphatase PTP1D (syp) zeigt eine starke Promiskuität in ihrer Bindungsfähigkeit, d. h. sie bindet an IGF-1R, den Insulinrezeptor, met und andere (Rocchi, S., et al., Endocrinology 137 (1996) 4944-4952). Kürzlich wurden mSH2-B und vav als Bindepartner des IGF-1R beschrieben, man beobachtet jedoch auch eine Wechselwirkung mit anderen Tyrosinkinasen, z. B. bindet mSH2-B auch an ret und den Insulinrezeptor (Wang, J. und Riedel, H., J. Biol. Chem. 273 (1998) 3136-3139). Insgesamt stellen die bisher beschriebenen IGF-1R- Bindungsproteine relativ unspezifische Ziele für therapeutische Ansätze dar, oder sie sind, wie z. B. im Fall von Insulinrezeptorsubstraten (IRS-1, IRS-2) für Insulin-gesteuerte Aktivitäten unerläßlich.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, neue Gene bereitzustellen, welche für Bindungsproteine des IGF-1R codieren, sowie die entsprechenden Polypeptide bereitzustellen, welche die Basis für eine neue Krebstherapie auf der Grundlage der Modulierung (bevorzugt der Inhibition) der Wechselwirkung zwischen IGF-1R und IIPs gemäß der Erfindung bilden.

Die Erfindung umfaßt bevorzugt eine Nukleinsäure, die für ein Protein (IIP- 10) codiert, welches an den IGF-1 Rezeptor bindet, ausgewählt aus der Gruppe umfassend

• a) die in SEQ ID NO:5 dargestellten Nukleinsäuren oder eine dazu komplementäre Nukleinsäuresequenz,
• b) Nukleinsäuren, welche unter stringenten Bedingungen mit einer der Nukleinsäuren aus a) hybridisieren, die für ein Polypeptid codieren, welches mindestens 75% Homologie mit dem Polypeptid der SEQ ID NO:6 aufweist, oder
• c) Sequenzen, welche aufgrund der Degeneration des genetischen Codes für IIP-10 Polypeptide mit der Aminosäuresequenz der von den Sequenzen von a) und b) codierten Polypeptide codieren.

Die cDNA von IIP-10 codiert für ein neues Protein mit 226 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 25.697. IIP-10 ist ein lysinreiches Protein (11%). IIP-10 enthält eine N-Glykosylierungsstelle, mehrere N- Myristoylierungsstellen, Ck2- und PKC-Phosphorylierungsstellen, eine Tyrosinkinasephosphorylierungsstelle und ein putatives Kernlokalisierungssignal (Fig. 5). Die cDNA-Sequenz von IIP-10 zeigt 65% Homologie mit der cDNA-Sequenz des Gallus Gallus Thymozytenproteins cthy28kD (EMBL Datenbank, Zugriffsnummer GG34350). Die Aminosäuresequenzen von 11P-10 und cthy28kD zeigen 70% Identität. Die Nukleotidpositionen 383 bis 584 der IIP-10-cDNA sind zu 94% identisch mit einer Teil-cDNA, die in WO 95/14772 beschrieben ist (human gene signature HUMGS06271; Zugriffsnummer T24253). Mit einem Immunofluoreszenz-Flag markiertes IIP-10 zeigt sowohl cytoplasmatische Lokalisation als auch Kernlokalisation in NIH3T3-Zellen, welche den IGF-1 Rezeptor überexprimieren. Weitere Hefen-Zweihybriden-Analysen zeigten, daß IIP-10 auf eine phosphorylierungsabhängige Weise mit dem IGF-1 Rezeptor wechselwirkt. IIP-10 bindet nicht an den Insulinrezeptor. Eine Deletionsanalyse von IIP-10 zeigte, daß für eine Bindung an den (GF-1- Rezeptor die Aminosäuren 19 bis 226 ausreichend sind.

"Wechselwirkung oder Bindung zwischen IIP-10 und (GF-1 Rezeptor" bedeutet eine spezifische Bindung des IIP-10-Polypeptids an den IGF-1 Rezeptor, jedoch nicht an Kontrollproteine, wie etwa Lamin, im Hefen- Zweihybriden-System. Eine spezifische Bindung an den IGF-1 Rezeptor kann unter Verwendung von Glutathion-S-Transferase(GST)-IIP-Fusionsproteinen, die in Bakterien exprimiert werden, und IGF-1 Rezeptoren, die in Säugerzellen exprimiert werden, gezeigt werden. Des weiteren kann in Säugerzellsytemen eine Bindung zwischen einem Flag-markierten IIP-10 Fusionsprotein (siehe Weidner, M; , et al., Nature 384 (1996) 173-176) und dem IGF-1 Rezeptor überwacht werden. Zu diesem Zweck werden eukaryontische Expressionsvektoren verwendet, um die jeweiligen cDNAs zu transfizieren. Die Wechselwirkung zwischen den Proteinen wird durch Coimmunopräzipitationsexperimente oder Studien zur subzellulären Lokalisation unter Verwendung von Anti-Flag- oder Anti-IGF-1-Rezeptor- Antikörpern sichtbar gemacht.

Weiterhin stellt die Erfindung Sonden und Primer für die erfindungsgemäßen Gene, sowie Nukleinsäuren, welche für antigene Determinanten der erfindungsgemäßen Genprodukte codieren, bereit. Daher umfassen bevorzugte Ausführungsformen Nukleinsäuren mit bevorzugt 10 bis 50 oder stärker bevorzugt 10 bis 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer der offenbarten Sequenzen.

Der Ausdruck "Nukleinsäure"- bedeutet ein Polynukleotid, welches beispielsweise eine DNA, RNA oder derivatisierte aktive DNA oder RNA sein kann. DNA- und mRNA-Moleküle sind jedoch bevorzugt.

Der Ausdruck "unter stringenten Bedingungen hybridisieren" bedeutet, daß zwei Nukleinsäurefragmente in der Lage sind, unter Standard- Hybridisierungsbedingungen, die in Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA beschrieben sind, miteinander zu hybridisieren.

Genauer ausgedrückt bedeutet "stringente Bedingungen", wie hierin verwendet, eine Hybridisierung in 5,0 × SSC, 5 × Denhardt, 7% SDS, 0,5 M Phosphatpuffer pH 7,0, 10% Dextransulfat und 100µg/ml Lachsspermien- DNA bei ungefähr 50°C bis 68°C, gefolgt von zwei Waschschritten mit 1 × SSC bei 68°C. Zusätzlich kann die Temperatur im Waschschritt von Bedingungen geringer Stringenz bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, auf Bedingungen hoher Stringenz bei ungefähr 68°C erhöht werden.

Die Erfindung umfaßt weiterhin rekombinante Expressionsvektoren, welche für die Expression von IIP-10 geeignet sind und eine entsprechende codie­ rende Sequenz enthalten, rekombinante Wirtszellen, die mit derartigen Ex­ pressionsvektoren transfiziert sind, sowie ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines Proteins, welches von dem IIP-10-Gen codiert wird.

Die Erfindung umfaßt weiterhin synthetische und rekombinante Polypeptide, welche von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren codiert werden, und bevorzugt solche, die von der in SEQ ID NO:5 dargestellten DNA-Sequenz codiert werden, sowie Peptidmimetika, die auf diesen Polypeptiden basieren. Solche Peptidmimetika haben eine hohe Affinität für Zellmembranen und werden von den Zellen rasch aufgenommen. Peptidmimetika sind bevorzugt Verbindungen, die von Peptiden und Proteinen abgeleitet sind, und werden durch strukturelle Modifizierung unter Verwendung von nicht natürlichen Aminosäuren, Konformationsbeschränkungen, isosterische Stellung, Zyklisierung usw. erhalten. Sie basieren bevorzugt auf 24 oder weniger, bevorzugt 20 oder weniger Aminosäuren, wobei eine Basislänge von ungefähr 12 Aminosäuren besonders bevorzugt ist.

Die Polypeptide und Peptidmimetika können durch ihre entsprechende DNA- Sequenz und durch die davon abgeleitete Aminosäuresequenz definiert werden. Das isolierte IIP-Polypeptid kann in natürlichen allelischen Variationen auftreten, welche von Individuum zu Individuum verschieden sind. Solche Variationen der Aminosäuren sind im allgemeinen Aminosäuresubstitutionen. Sie können jedoch auch Deletionen, Insertionen oder Additionen von Aminosäuren zu der Gesamtsequenz sein, die zu biologisch aktiven Fragmenten führen. Das erfindungsgemäße IIP Protein kann je nach Zelle und Zelltyp, in dem es exprimiert wird, sowohl bezüglich des Ausmaßes und Typs in glykosylierter oder nicht-glykosylierter Form vorliegen. Polypeptide mit tumorizider und/oder metastatischer Aktivität können leicht durch einen Tumorprogressionsinhibitionsassay unter Verwendung von Karzinomzellen, welche die Polypeptide exprimieren, und durch Messen der Proliferationsfähigkeit und Apoptose in Bezug auf Karzinomzellen, welche die Polypeptide nicht exprimieren, identifiziert werden.

"Polypeptid mit IIP-10 Aktivität oder IIP-10" bezeichnet daher Proteine mit kleineren Aminosäurevariationen, jedoch mit im wesentlichen derselben Aktivität wie IIP-10. Im wesentlichen dieselbe bedeutet hier, daß die Aktivitäten die gleichen biologischen Eigenschaften aufweisen, und daß die Polypeptide in ihren Aminosäuresequenzen mindestens 75% Homologie (Identität) mit IIP-10 zeigen. Besonders bevorzugt sind die Aminosäuresequenzen mindestens 90% identisch. Homologie im Sinne der Erfindung kann mit Hilfe von Computerprogrammen, wie etwa Gap oder BestFit (University of Wisconsin; Needleman und Wunsch, J. Biol. Chem. 48 (1970) 443-453; Smith und Waterman, Adv. Appl. Math. 2 (1981)482-­ 489) bestimmt werden.

Weitere erfindungsgemäße IIPs, welche für die Erfindung geeignet sind, sind insbesondere:

IIP-1

Es wurde eine cDNA isoliert, die für ein mit dem IGF-1 Rezeptor wechselwirkendes Protein codierte, welches IIP-1 genannt wurde (SEQ ID NO:1). Die cDNA von IIP-1 codiert für ein neues Protein von 333 Aminosäuren Länge mit einem berechneten Molekulargewicht von 35.727.

IIP-1 ist glycinreiches Protein (13%). IIP-1 enthält mehrere N- Myristoylierungsstellen, PKC- und Ck2-Phosphorylierungsstellen und zwei putative Kernlokalisationssignale. Eine zweite Isoform, IIP-1 (p26) mit 236 Aminosäuren Länge und mit einem berechneten Molekulargewicht von 26.071 wurde ebenfalls identifiziert. Dieses Produkt wurde wahrscheinlich durch alternatives Spleißen (Fig. 3) erzeugt. Beide Isoformen binden an den IGF-1 Rezeptor.

Es wurden bereits cDNA-Sequenzen von IIP-1 veröffentlicht (EMBL Datenbank Zugriffsnummern AF089818 und AF061263; DeVries, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 12340-12345). Es wurden zwei überlappende cDNA-Klone (Fig. 4) identifiziert, welche mit einer partiellen TIP-2-cDNA (Genbank Zugriffsnummer AF028824) (Rousset, R., et al., Oncogene 16 (1998) 643-654) starke Homologie zeigten und als IIP-1a und IIP-1b bezeichnet wurden. Die IIP-1a-cDNA entspricht den Nukleotidpositionen 117 bis 751 von TIP-2. Die IIP-1b-cDNA zeigt neben TIP-2-Sequenzen (Nukleotidposition 1 bis 106) zusätzliche 5'-Sequenzen, welche zu der Sequenz Y2H35 in WO 97/27296 (Nukleotide (nt) 25 bis 158) homolog sind.

IIP-1a und IIP-1b weisen beide die Sequenz auf, welche für die PDZ-Domäne von TIP-2 codiert (Nukleotide 156 bis 410), welche bekanntlich eine Domäne für eine Protein-Protein-Wechselwirkung ist (Ponting, C. D., et al., BioEssays 19 (1997) 469-479). Die PDZ-Domäne wurde mit Hilfe von Deletionsanalysen als die essentielle und ausreichende IGF-1 Rezeptorbindungsdomäne von IIP-1 identifiziert (Fig. 4).

Weitere Hefen-Zweihybriden-Analysen offenbarten, daß die Bindung von IIP- 1-Protein an den IGF-1 Rezeptor spezifisch für diese Rezeptortyrosinkinase ist. Man beobachtete keine Wechselwirkung mit dem Insulinrezeptor oder Ros. Rezeptortyrosinkinasen anderer Familien binden nicht an IIP-1 (z. B. Met, Ret, Kit, Fms, Neu, EGF-Rezeptor). Somit ist IIP-1 höchstwahrscheinlich das erste Bindungsprotein, für welches gezeigt wurde, daß es für die IGF-1-Rezeptortyrosinkinase spezifisch ist. IIP-1 bindet ebenfalls an die kinaseinaktive Mutante des IGF-1 Rezeptors.

IIP-2

IIP-2 wurde als neues Bindungsprotein für den cytoplasmatischen Teil des IGF-1 Rezeptors identifiziert, welches dem humanen APS entspricht (EMBL Zugriffsnummer: HSAB520). APS war zuvor in einem Hefen-Zweihybriden- Screen-Experiment isoliert worden, wobei die onkogene c-kit-Kinasedomäne als Köder verwendet wurde (Yokouchi, M., et al., Oncogene 15 (1998) 7- 15). IIP-2 bindet an den IGF-1 Rezeptor auf kinaseabhängige Art und Weise. Es wurde ebenfalls eine Bindung von IIP-2 an andere Mitglieder der Insulinrezeptorfamilie beobachtet (Insulinrezeptor, Ros), aber nicht an eine nicht verwandte Rezeptortyrosinkinase (Met). Die Region von IIP-2, von der sich herausstellte, daß sie mit dem IGF-1 Rezeptor wechselwirkt, entspricht dem humanen APS (Nukleotide 1126 bis 1674, EMBL Zugriffsnummer AB000520) und enthält die SH2-Domäne von APS (Nukleotide 1249 bis 1545).

IIP-3

IIP-3 wurde als neues an den IGF-1 Rezeptor bindendes Protein isoliert und ist mit PSM identisch (GenBank Zugriffsnummer AF020526). PSM ist als Signaltransduktionsprotein bekannt, welches PH-und SH2-Domänen enthält und welches an den aktivierten Insulinrezeptor bindet (Riedel, Hl., et al., Biochem. 122 (1997) 1105-1113). Es wurde ebenfalls eine Variante von PSM beschrieben (Riedel, H., et al., J. Biochem. 122 (1997) 1105-1113). Die Bindung von IIP-3 an den IGF-1 Rezeptor ist abhängig von einer Tyrosylphosphorylierung des Rezeptors.

Es wurde ein den Nukleotiden 1862 bis 2184 der Variante von PSM entsprechender cDNA-Klon identifiziert. Es stellte sich heraus, daß der isolierte cDNA-Klon für die IGF-1-Rezeptorbindungsregion codiert. Die Sequenz des isolierten cDNA-Teilklons von IIP-3 codiert für die SH2-Domäne von PSM (Nukleotide 1864 bis 2148, EMBL Zugriffsnummer AF020526).

IIP-4

IIP-4 wurde als neues mit der cytoplasmatischen Domäne des IGF-1 Rezeptors wechselwirkendes Protein isoliert. IIP-4 entspricht p59fyn, einer src-artigen Tyrosinkinase (EMBL Zugriffsnummer MMU70324 und humanes fyn EM_HUM1:HS66H14) (Cooke, M. P., und Permutter, R. M., New Biol. 1 (1989) 66-74). IIP-4 bindet auf kinaseabhängige Weise an den IGF-1 Rezeptor und an mehrere weitere Rezeptortyrosinkinasen, wie auch an den Insulinrezeptor und Met. Die an den IGF-1 Rezeptor (Nukleotide 665-1044) bindende Region von IIP-4 enthält die SH2-Domäne von p59fyn (EMBL Zugriffsnummer U70324).

IIP-5

IIP-5 wurde als neues an den IGF-1 Rezeptor bindendes Protein isoliert. IIP-5 zeigt eine starke Homologie mit dem Zinkfingerprotein Zfp38 (EMBL Zugriffsnummer MMZFPTA) und ist mindestens 80% homolog zu dem entsprechenden humanen Gen. Zfp-38 ist als Transkriptionsfaktor bekannt (Chowdhury, K., et al., Mech. Dev. 39 (1992) 129-142). IIP-5 bindet ausschließlich an den aktivierten und phosphorylierten IGF-1-Rezeptor, jedoch nicht an eine kinaseinaktive Mutante. Zusätzlich zur Bindung von IIP- 5 an den IGF-1 Rezeptor beobachtete man eine Wechselwirkung von IIP-5 mit Rezeptortyrosinkinasen der Insulinrezeptorfamilie (Insulinrezeptor, Ros). IIP-5 bindet nicht an die entfernter verwandte Rezeptortyrosinkinase Met.

Es wurde ein cDNA-Klon isoliert, welcher an den IGF-1 Rezeptor bindet und der für Nukleotide 756 bis 1194 von Zfp38 codiert (EMBL Zugriffsnummer MMZFPTA) und welcher den ersten Zinkfinger (Nukleotide 1075 bis 1158) enthält. Diese Domäne ist ausreichend für eine Bindung an den aktivierten IGF-1 Rezeptor.

IIP-6

IIP-6 wurde als neues an den IGF-1 Rezeptor bindendes Protein identifiziert. IIP-6 zeigt eine schwache Ähnlichkeit mit der Zinkfinger-Domäne von Zfp29 (EMBL Zugriffsnummer MMZFP29). Zfp29 besteht aus einer N-terminalen Transkriptionsaktivierungs-Domäne und 14 C-terminalen Cys²His²- Zinkfingern (Denny, P., und Ashworth, A., Gene 106 (1991) 221-227). Die Bindung von IIP-6 an den IGF-1 Rezeptor hängt von der Phosphorylierung der IGF-1 Rezeptorkinase ab. IIP-6 bindet ebenfalls an den Insulinrezeptor, jedoch nicht an Met. Die Region von IIP-6, welche an den IGF-1 Rezeptor bindet (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4), enthält zwei Zinkfingerdomänen des Typs Cys²His².

IIP-7

IIP-7 wurde als neues an den IGF-1 Rezeptor bindendes Protein isoliert, welches Pax-3 entspricht (EMBL Zugriffsnummer MMPAX3R und humanes Pax3 EM-HUM2:S69369). Pax-3 ist als DNA-bindendes Protein bekannt und wird während der frühen Embryogenese exprimiert (Goulding, M. D., et al., EMBO J. 10 (1991) 1135-1147). IIP-7 bindet auf phosphorylierungsabhängige Weise an den IGF-1 Rezeptor. IIP-7 bindet ebenfalls an den Insulinrezeptor und an Met. Ein Teilklon der IIP-7-cDNA codiert für die IGF-1 Rezeptorbindungsdomäne von Pax3 (Nukleotide 815 bis 1199, EMBL Zugriffsnummer MMPAX3R). Diese Region enthält das Octapeptid für die gepaarte Domäne von Pax3 (Pax3 paired domain) (Nukleotide 853 bis 876) und die Homöodomäne des gepaarten Typs (paired-type homeo domain) (Nukleotide 952 bis 1134).

IIP-8

IIP-8 codiert für die vollständige cDNA von Grb7 (EMBL Zugriffsnummer MMGRB7P, humanes Grb7 EM_HUM1:AB008789). Grb7, ein eine PH- Domäne und eine SH3-Domäne enthaltendes Signaltransduktionsprotein wurde zuerst als EGF-Rezeptor bindendes Protein veröffentlicht (Margolis, B. L., et al., Proc. Natl. Acad. Aci. USA 89 (1992) 8894-8898). IIP-8 bindet nicht an die kinaseinaktive Mutante des IGF-1 Rezeptors. Es wurde auch eine Bindung von IIP-8 an mehrere weitere Rezeptortyrosinkinasen (z. B. den Insulinrezeptor, Ros und Met) beobachtet.

IIP-9

IIP-9 wurde als neues an den IGF-1 Rezeptor bindendes Protein identifiziert. IIP-9 ist identisch mit nck-beta (EMBL Zugriffsnummer AF043260). Nck ist ein cytoplasmatisches Signaltransduktionsprotein, welches aus SH2- und SH3-Domänen besteht (Lehmann, J. M., et al., Nucleic Acids Res. 18 (1990) 1048). Die Bindung von IIP-9 an den IGF-1 Rezeptor ist phosphorylierungsabhängig. Nck bindet an die membranangrenzende Region des IGF-1 Rezeptors. Außer der Bindung von IIP-9 an den IGF-1 Rezeptor beobachtete man eine Bindung an den Insulinrezeptor, aber nicht an Ros oder Met.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung sind Polypeptide, welche mit den Polypeptiden der SEQ ID N0:6 (IIP-10) homolog, und stärker bevorzugt im wesentlichen identisch sind. Die Homologie kann unter Verwendung des von Pearson, W. R., Methods in Enzymology 183 (1990) 63-68, Academic Press, San Diego, US beschriebenen FastA-Algorithmus untersucht werden. "Im wesentlichen identisch" bedeutet, daß die Aminosäuresequenz sich nur durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheidet, beispielsweise durch Substitutionen einer Aminosäure für eine andere derselben Klasse (z. B. Valin für Glycin, Arginin für Lysin etc.), oder daß sie sich durch eine oder mehrere nicht-konservative Aminosäuresubstitutionen, Deletionen oder Insertionen unterscheidet, die sich an Positionen der Aminosäuresequenz befinden, welche die biologische Funktion des Polypeptids nicht zerstören. Dies umfaßt eine Substitution von alternativen kovalenten Peptidbindungen im Polypeptid. "Polypeptid" bedeutet eine Kette von Aminosäuren, wobei die Länge oder die posttranslationale Modifikation (z. B. Glykosylierung oder Phosphorylierung) nicht ausschlaggebend sind, und kann auch durch den Begriff "Protein" ausgetauscht werden.

Erfindungsgemäß bedeutet ein "biologisches aktives Fragment" ein Fragment, welches die physiologische Wirkung des vollständigen natürlich vorkommenden Proteins ausüben kann (beispielsweise die Bindung an sein biologisches Substrat, Verursachen einer Antigenantwort usw.).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Fragmente des erfin ngsgemäßen Polypeptids, welche antigen sind. Der Ausdruck "antigen", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet Fragmente des Proteins, welche eine spezifische immunogene Antwort auslösen können, z. B. eine Immunantwort, welche Antikörper hervorruft, die spezifisch an das erfindungsgemäße Protein binden. Die Fragmente sind bevorzugt mindestens 8 Aminosäuren lang, bevorzugt bis zu 25 Aminosäuren. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Fragmente die Domäne, welche für die Bindung der IIPs an den IGF-1 Rezeptor verantwortlich ist (d. h. die PDZ-Domäne von IIP-1). "Domäne" bedeutet die Region von Aminosäuren in einem Protein, welche direkt an der Bindung mit seinem Bindepartner beteiligt ist. PDZ-Domänen sind Repeats mit ungefähr 90 Resten und finden sich in einer Anzahl von Proteinen, die möglicherweise in Ionen-, Tunnel- und Rezeptor-Clustering und bei der Bindung von Rezeptoren an Effektorenzyme eine Rolle spielen. Solche PDZ sind allgemein in Cabral, J. H., et al., Nature 382(1996) 649-652 beschrieben.

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Proteins, dessen Expression oder Aktivierung mit der Tumorproliferation korreliert, wobei eine exogene DNA in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen exprimiert wird und das gewünschte Protein isoliert wird, oder indem die exogene DNA in vivo für pharmazeutische Mittel exprimiert wird, wobei das Protein bevorzugt von einer DNA-Sequenz, die für IIP-10 codiert, codiert wird. Bevorzugt handelt es sich dabei um die in SEQ ID NO:5 dargestellte DNA-Sequenz.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch auf rekombinante Art und Weise oder synthetisch hergestellt werden. Ein nicht-glykosyliertes IIP-10- Polypeptid wird erhalten, wenn es rekombinant in Prokaryonten erzeugt wird. Mit Hilfe der durch die Erfindung bereitgestellten Nukleinsäuresequenzen ist es möglich, in Genomen jedweder gewünschten Zelle nach dem IIP-10-Gen oder seinen Varianten zu suchen (z. B. außer in humanen Zellen auch in Zellen anderer Säugetiere), um diese zu identifizieren und das erwünschte für das IIP-10-Protein codierende Gen zu isolieren. Solche Verfahren und geeignete Hybridisierungsbedingungen (siehe oben, "stringente Bedingungen") sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und beispielsweise bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989) cold Spring Harbor Laboratory Press, new York, USA und bei Hames, B. D., Higgins, S. G., Nucleic acid hybridisation - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England beschrieben. In diesem Fall werden im allgemeinen für die Experimente die in diesen Publikationen beschriebenen Standardprotokolle verwendet.

Die Verwendung gentechnologischer Methoden ermöglicht die Herstellung von vielen aktiven IIP-10-Derivaten. Solche Derivate können beispielsweise an einzelnen oder mehreren Aminosäuren modifiziert sein, beispielsweise durch Substitution, Deletion oder Addition. Die Derivatisierung kann beispielsweise mit Hilfe von ortsspezifischer Mutagenese durchgeführt werden. Solche Variationen können vom Fachmann auf dem Gebiet leicht durchgeführt werden (J. Sambrook, B. D. Hames, supra). Es muß lediglich mit Hilfe des unten erwähnten Inhibitionsassays für Tumorzellwachstum sichergestellt werden, daß die charakteristischen Eigenschaften von IIP-10 erhalten bleiben.

Mit Hilfe solcher für ein IIP-10 Protein codierende Nukleinsäuren kann das erfindungsgemäße Protein auf reproduzierbare Art und Weise und in großen Mengen erhalten werden. Für die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen, wie etwa prokaryontischen Wirtszellen oder eukaryontischen Wirtszellen, wird die Nukleinsäure in geeignete Expressionsvektoren integriert, wobei der Fachmann auf dem Gebiet mit solchen Methoden vertraut ist. Ein solches Expressionsvektor enthält bevorzugt einen regulierbaren/induzierbaren Promotor. Diese rekombinanten Vektoren werden dann für die Expression in geeignete Wirtszellen eingebracht, beispielsweise E.coli als prokaryontische Wirtszelle oder Saccharomyces cerevisiae, die Teratokarzinomzellinie PA-1 sc 9117 (Büttner et al., Mol. Cell. Biol. 11 (1991) 3573-3583), Insektenzellen, CHO- oder COS-Zellen als eukaryontische Wirtszellen. Die transformierten oder transduzierten Wirtszellen werden unter Bedingungen kultiviert, welche die Expression des heterologen Gens erlauben. Die Isolierung des Proteins aus der Wirtszelle oder aus dem Kulturüberstand der Wirtszelle kann nach bekannten Verfahren durchgeführt werden. Solche Verfahren sind beispielsweise bei Ausubel I., Frederick M., Current Protocols in Molecular Biology (1992), John Wiley and Sons, New York beschrieben. Es kann auch eine in vitro-Reaktivierung des Proteins notwendig sein, wenn es sich in der Zellkultur nicht in löslicher Form befindet.

Die Erfindung betrifft daher auch ein IIP-Polypeptid, welches das Produkt einer prokaryontischen oder eukaryontischen Expression einer exogenen DNA ist.

Das Protein kann aus den Zellen oder dem Kulturüberstand isoliert werden und mit Hilfe von chromatographischen Verfahren, bevorzugt durch Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und/oder Reverse-Phase-HPLC aufgereinigt werden.

IIP-10 kann nach der rekombinanten Produktion mit Hilfe von Affinitätschromatographie unter Verwendung von bekannten Protein- Aufreinigungs-Techniken, einschließlich Immunopräzipitation, Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, Chromatofokussierung, isoelektrischer Fokussierung, selektiver Präzipitation, Elektrophorese oder dgl. erhalten werden.

Diagnostische Verfahren

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren für die Detektion eines für ein IIP-Gen codierenden Nukleinsäuremoleküls, umfassend Inkubieren einer Probe (beispielsweise Körperflüssigkeiten, wie etwa Blut, Zellysate) mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül und Bestimmen der Hybridisierung des Nukleinsäuremoleküls mit einem Zielnukleinsäuremolekül unter stringenten Bedingungen zur Bestimmung des Vorhandenseins eines Nukleinsäuremoleküls, welches das IIP-Gen ist. Somit betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung der IGF-1R-Aktivierung oder -Inhibition in Säugerzellen oder Körperflüssigkeiten.

Daher umfaßt die Erfindung ebenfalls ein Verfahren für die Detektion des Proliferationspotentials einer Tumorzelle, umfassend

• a) Inkubieren einer Probe einer Körperflüssigkeit eines Patienten, der unter Krebs leidet, einer Probe von Krebszellen oder einer Probe eines Zellextrakts oder eines Zellkulturüberstands der Krebszellen, worin die Probe Nukleinsäuren enthält, mit einer Nukleinsäuresonde, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
  • a) die in SEQ ID NO: 1, 3 oder 5 dargestellten Nukleinsäuren oder dazu komplementären Nukleinsäuren und
  • b) Nukleinsäuren, welche unter stringenten Bedingungen mit einer der Nukleinsäuren aus (i) hybridisieren und
• b) Detektieren der Hybridisierung mit Hilfe eines weiteren Bindungspartners der Nukleinsäure der Probe und/oder der Nukleinsäuresonde oder mit Hilfe von Röntgen-Radiographie.

Die Hybridisierung zwischen der Sonde und Nukleinsäuren aus der Probe zeigt das Vorhandensein der RNA solcher Proteine an. Solche Verfahren sind dem Fachmann bekannt und sind beispielsweise in WO 89/06698, EP- A 0 200 362, USP 2915082, EP-A 0 063 879, EP-A 0 173 251, EP-A 0 128 018 beschrieben.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die codierende Nukleinsäure der Probe vor dem Test amplifiziert, beispielsweise mit Hilfe der bekannten PCR-Technik. Im allgemeinen wird im Rahmen der Nukleinsäurediagnostik eine derivatisierte (markierte) Nukleinsäuresonde verwendet. Diese Sonde wird mit einer denaturierten DNA oder RNA aus der Probe, welche an einen Träger gebunden ist, in Kontakt gebracht, und es werden die Temperatur, die Ionenstärke, der pH-Wert und andere Puffer- Bedingungen in diesem Verfahren so ausgewählt - je nach der Länge und Zusammensetzung der Nukleinsäuresonde und der resultierenden Schmelztemperatur des erwarteten Hybrids - daß die markierte DNA oder RNA an die homologe DNA oder RNA binden kann (zur Hybridisierung siehe auch Wahl, G. M., et al., Proc. Natl. Acad. Aci. USA 76 (19791 3683-3687). Geeignete Träger sind Membranen oder Trägermaterialien auf Nitrocellulosebasis (z. B. Schleicher und Schüll, BA 85, Amersham Hybond, C.), verstärkte oder gebundene Nitrocellulose in Pulverform oder Nylonmembranen, die mit verschiedenen funktionellen Gruppen derivatisiert sind (z. B. Nitrogruppen) (z.B Schleicher und Schüll, Nytran; NEN, Gene Screen; Amersham Hybond M.; Pall Biodyne).

Die Hybridisierung von DNA oder RNA wird dann durch Inkubieren des Trägers mit einem Antikörper oder einem Antikörperfragment detektiert, nachdem zuvor ausgiebig gewaschen und gesättigt wurde, um unspezifische Bindungen zu vermeiden.

Der Antikörper oder das Antikörperfragment ist gegen die Substanz gerichtet, die während der Derivatisierung in die Nukleinsäuresonde eingebracht wurde. Der Antikörper ist ebenfalls wiederum markiert. Es ist jedoch auch möglich, eine direkt markierte DNA zu verwenden. Nach der Inkubation mit den Antikörpern werden wieder Waschschritte vorgenommen, um lediglich spezifisch gebundene Antikörperkonjugate zu detektieren. Die Bestimmung wird dann nach bekannten Verfahren mit Hilfe der Markierung auf dem Antikörper oder dem Antikörperfragment durchgeführt.

Die Detektion der Expression kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden:

• - in situ-Hybridisierung mit fixierten ganzen Zellen, mit fixierten Gewebeabstrichen und isolierten Metaphasechromosomen,
• - Koloniehybridisierung (Zellen) und Plaquehybridisierung (Phagen und Viren),
• - Southern-Hybridisierung (DNA-Detektion),
• - Northern-Hybridisierung (RNA-Detektion),
• - Serumanalyse (z. B. Zelltypanalyse von Zellen im Serum durch Slot- Blot-Analyse),
• - nach der Amplifikation (z. B. PCR-Technik).

Die Nukleinsäuresonde wird bevorzugt mit der Nukleinsäure der Probe inkubiert, und die Hybridisierung wird gegebenenfalls mit Hilfe eines weiteren Bindungspartners für die Nukleinsäure in der Probe und/oder die Nukleinsäuresonde detektiert.

Die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung sind somit wertvolle prognostische Marker bei der Diagnose des metastatischen und Progressionspotentials von Tumorzellen eines Patienten.

Screening für Antagonisten und Agonisten von IIPs oder Inhibitoren

Gemäß der Erfindung können Antagonisten von IIP-10 oder Inhibitoren der Expression von IIP (z. B. Antisense-Nukleinsäuren) verwendet werden, um die Tumorprogression zu hemmen und um massive Apoptose von Tumorzellen in vivo zu verursachen, bevorzugt mit Hilfe von somatischer Gentherapie.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch Verfahren zum Screenen für potentielle Therapeutika für Krebs, Diabetes, neurodegenerative Krankheiten, Knochenkrankheiten. Sie betrifft auch Verfahren für die Behandlung von Krankheiten, sowie Zellinien und Tiermodelle, die für das Screenen und die Beurteilung von potentiell nützlichen Therapien solcher Krankheiten geeignet sind. Es war daher eine weitere Aufgabe der Erfindung, Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen bereitzustellen, welche bei der Behandlung der erwähnten Krankheiten und verwandten Krankheiten von Nutzen sind. Diese Verfahren umfassen Verfahren zur Modulierung der Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide, Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche selektiv an die erfindungsgemäßen Proteine binden können, und Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Aktivität der Polypeptide modulieren können. Diese Verfahren können in vitro und in vivo durchgeführt werden und können die erfindungsgemäßen transformierten Zellinien und transgenen Tiermodelle zum Einsatz kommen lassen.

Ein Antagonist von IIPs oder ein Inhibitor von IIP wird als Substanz oder Verbindung definiert, welche die Wechselwirkung zwischen IGF-1R und IIP, bevorzugt IIP-10, hemmt. Daher nimmt die biologische Aktivität des IGF-1R in Gegenwart einer solchen Verbindung ab. Im allgemeinen beinhalten Screeningverfahren für IIP-Antagonisten das Inkontaktbringen von möglichen Substanzen mit IIP-enthaltenden Wirtszellen unter eine Bindung begünstigenden Bedingungen, und Messen des Ausmaßes der abnehmenden Rezeptor-vermittelten Signalübertragung (im Fall eines Antagonisten). Ein solcher Antagonist ist als pharmazeutisches Mittel für den Einsatz in der Tumortherapie geeignet. Für die Behandlung von Diabetes, neuronalen Krankheiten oder Knochenkrankheiten ist eine Stimulierung des Signalübertragungsweges erforderlich, d. h. das Screening für Agonisten ist hier nützlich.

Die IIP-Aktivierung kann auf verschiedene Art und Weise gemessen werden. Im allgemeinen zeigt sich die Aktivierung durch eine Veränderung in der Zellphysiologie, beispielsweise durch eine Zunahme oder Abnahme der Wachstumsrate oder durch eine Veränderung im Differenzierungsstadium oder durch eine Veränderung des Zellmetabolismus, welcher mit Standard- Zell-Assays, z. B. MTT- oder XTT-Assays (Roche Diagnostics GmbH, DE) detektiert werden kann.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und Proteine könnten daher zur Identifizierung und Entwicklung von Arzneimitteln verwendet werden, welche die Wechselwirkung zwischen IGF-1R und IIPs stören. Beispielsweise könnte ein Mittel, welches an eines der Proteine bindet, bevorzugt dieses Protein binden, anstatt eine Bindung mit seinem natürlichen Bindepartner zu erlauben. Jedes Mittel, welches an den IGF-1 Rezeptor binden kann und daher die Bindung eines IIPs verhindern kann, oder umgekehrt an ein IIP bindet und dadurch die Bindung an den IGF-1 Rezeptor verhindern kann, wäre denkbar. In beiden Fällen würde eine Signaltransduktion des IGF-1 Rezeptorsystems moduliert (bevorzugt inhibiert). Das Screening für Substanzen mit dieser Fähigkeit geschieht durch Aufstellen eines Kompetitionsassays (Assay ist Standard im Stand der Technik) zwischen der Testverbindung und der Wechselwirkung mit IIP und dem IGF-1 Rezeptor unter Verwendung von aufgereinigtem Protein oder Fragmenten mit denselben Eigenschaften wie die Bindungspartner.

Das erfindungsgemäße Protein ist geeignet für die Verwendung in einem Assayverfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Aktivität der erfindungsgemäßen Proteine modulieren. Die hier beschriebene Modulierung der Aktivität umfaßt die Inhibition oder Aktivierung des Proteins und umfaßt die direkte oder indirekte Beeinflussung der normalen Regulierung der Proteinaktivität. Verbindungen, welche die Proteinaktivität modulieren, umfassen Agonisten, Antagonisten und Verbindungen, welche einen direkten oder indirekten Einfluß auf die Regulierung der Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins ausüben. Das erfindungsgemäße Protein kann sowohl aus nativen und rekombinanten Quellen zur Verwendung in einem Assay-Verfahren zur Identifizierung von Modulatoren erhalten werden. Im allgemeinen enthält ein Assay-Verfahren zur Identifizierung von Modulatoren den IGF-Rezeptor, ein Protein der vorliegenden Erfindung und eine Testverbindung oder eine Probe, welche einen putativen Modulator der besagten Proteinaktivität enthält. Die Testverbindungen oder Proben können direkt auf beispielsweise aufgereinigtem erfindungsgemäßen Protein getestet werden, wobei es gleich ist, ob dieses nativ oder rekombinant ist. Weiterhin können sie auf subzellulären Fraktionen von Zellen, welches das Protein, welches wiederum nativ oder rekombinant sein kann, produzieren, und/oder auf ganzen Zellen, die das Protein in nativer oder rekombinanter Form exprimieren, getestet werden. Die Testverbindung oder die Probe kann dem erfindungsgemäßen Protein in Gegenwart oder Abwesenheit von bekannten Modulatoren des Proteins zugefügt werden. Die Modulierungsaktivität der Testverbindung oder der Probe kann beispielsweise durch Analyse der Fähigkeit der Testverbindung oder der Probe, an das Protein zu binden, das Protein zu aktivieren, seine Aktivität zu inhibieren, die Bindung von anderen Verbindungen an das Protein zu inhibieren oder zu verstärken, die Rezeptorregulierung zu modifizieren oder die intrazelluläre Aktivität zu modifizieren, bestimmt werden.

Die Identifizierung von Modulatoren der Proteinaktivität ist nützlich für die Behandlung von Krankheitszuständen, bei denen die Proteinaktivität eine Rolle spielt. Weitere Verbindungen können zur Stimulierung oder Inhibition der Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins nützlich sein. Solche Verbindungen könnten für die Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden, bei denen die Aktivierung oder Inaktivierung des erfindungsgemäßen Proteins zu einer Zellproliferation, Zelltod, Nichtproliferation, Induktion von zellulären neoplastischen Transformationen oder metastatischem Tumorwachstum führt, und könnten somit für die Prävention und/oder Behandlung von Krebskrankheiten, wie etwa z. B. Prostata- und Brustkrebs, verwendet werden. Die Isolierung und Aufreinigung eines für das erfindungsgemäße Protein codierenden DNA- Moleküls wäre geeignet zur Bestimmung der Gewebeverteilung der Proteine, sowie für die Entwicklung eines Verfahrens zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Aktivität des Proteins und/oder seine Expression modulieren.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung, welche die Wechselwirkung zwischen IGF-1R und einem der Polypeptide IIP-1 bis IIP-10 inhibiert, umfassend

• a) Inkontaktbringen von IGF-1R und einem der IIP-Polypeptide mit einer Lösung, die eine in Frage kommende Verbindung enthält, so daß der IGF-1R und das IIP-Polypeptid in der Lage sind, einen Komplex zu bilden, und
• b) Bestimmen der Menge an Komplexen in Bezug auf das vorbestimmte Ausmaß an Bindung in Abwesenheit der in Frage kommenden Verbindung und daraus Bewerten der Fähigkeit der in Frage kommenden Verbindung, die Bindung zwischen dem IGF-1R und dem IIP-Polypeptid zu hemmen.

Ein solcher Screening-Assay wird bevorzugt als ELISA-Assay durchgeführt, wobei der IGF-1R oder das IIP-Polypeptid an eine feste Phase gebunden sind.

Eine weitere Ausführung der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines therapeutischen Mittels zur Behandlung von Karzinomen in einem Patienten, umfassend Kombinieren einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung, welche die Wechselwirkung zwischen IGF-1R und IIP in biochemischen und/oder zellulären Assays mindestens bis zu 50% inhibiert. Biochemische Assays basieren bevorzugt auf ELISA- Assays oder homogenen Assays. Im Falle des ELISA-Systems werden zur Detektion der Komplexe Antikörper verwendet, die spezifisch für die beiden Bindungspartner sind. Im Falle des homogenen Assays wird mindestens ein Bindungspartner mit Fluorophoren markiert, wodurch die Analyse der Komplexe ermöglicht wird. Zelluläre Assays sind bevorzugt Tests, in denen Tumorzellen oder mit den Expressionskonstrukten des IGF-1R und der jeweiligen Bindungsproteine transfiziert wurden, mit oder ohne Substanzen behandelt werden und die Komplexbildung zwischen den beiden Komponenten unter Verwendung von Standard-Zellassays analysiert wird.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines therapeutischen Mittels zur Behandlung von Karzinomen in einem Patienten, umfassend Inkontaktbringen eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers mit einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung, welche die Wechselwirkung zwischen IGF-1R und einem der IIPs 1 bis 10 in einem zellulären Assay inhibiert, wobei in dem zellulären Assay Tumorzellen oder mit Expressionskonstrukten des IGF-1R und der jeweiligen IIPs transfizierte Zellen mit der Verbindung behandelt werden und die Komplexbildung zwischen IGF-1R und dem jeweiligen IIP analysiert wird, und das Ausmaß der Komplexbildung im Fall einer Inhibition 50% nicht übersteigt, wobei man für die Komplexbildung ohne die Verbindung im selben zellulären Assay 100% annimmt.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der unter einem Karzinom leidet, mit einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung, welche die Wechselwirkung zwischen IGF-1R und einem der IIPs 1 bis 10 in einem zellulären Assay inhibiert, wobei in dem zellulären Assay Tumorzellen oder mit Expressionskonstrukten des IGF-1R und des jeweiligen IIPs transfizierte Zellen mit der Verbindung behandelt werden und eine Komplexbildung zwischen IGF-1R und dem jeweiligen IIP analysiert wird und das Ausmaß der Komplexbildung im Fall einer Inhibition 50% nicht übersteigt, bezogen auf 100% für die Komplexbildung ohne die Verbindung im selben zellulären Assay.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Antikörper gegen erfindungsgemäßes IIP-1 oder IIP-10 oder auch eines der llPs-2 bis 9.

Antikörper wurden aus humanen, Mäuse- oder Rattenpolypeptiden erzeugt. Durch die Erfindung mit umfaßt sind insbesondere Antikörper, welche IIP-1 oder IIP-10 spezifisch erkennen. Solche Antikörper werden unter Verwen­ dung von standardmäßigen immunologischen Techniken hergestellt. Die Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein und können auch rekombinant hergestellt werden, wie z. B. für einen humanisierten Antikörper. Ein Antikörperfragment, welches die Fähigkeit zur Wechsel­ wirkung mit IIP-1 oder IIP-10 beibehält, wird ebenfalls durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt. Ein solches Fragment kann durch die proteolytische Spaltung eines vollständigen Antikörpers oder auf gentechnologische Weise hergestellt werden. Erfindungsgemäße Antikörper sind geeignet für diagnostische und therapeutische Anwendungen. Sie werden zur Detektion und Quantifizierung von IIP-1 oder IIP-10 in biologischen Proben, insbesondere in Gewebeproben und Körperflüssigkeiten verwendet. Sie werden ebenfalls zur Modulierung der Aktivität von IIP-1 oder IIP-10 eingesetzt, indem sie entweder als Agonist oder Antagonist fungieren.

Die folgenden Beispiele, Verweise, Sequenzprotokolle und Zeichnungen sollen dem Verständnis der vorliegenden Erfindung dienen, deren Schutzumfang durch die zugehörigen Ansprüche dargestellt ist. Es versteht sich von selbst, daß in den hier beschriebenen Verfahren Modifizierungen vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.

Beschreibung der Figuren und Sequenzen

Fig. 1 Domänenstruktur von Hefen-Zweihybriden-Ködern, die für das Screening von cDNA-Bibliotheken verwendet wurden, um cytoplasmatische Bindungsproteine des IGF-1-Rezeptors zu finden. Die LexA-DNA-Bindungsdomäne wurde mit der cytoplasmatischen (cp) Domäne (Nukleotide 2923 bis 4154) des Wildtyp-IGF-1-Rezeptors (a) oder der kinaseinaktiven Mutante (K/A-Mutation an Aminosäureposition 1003) (b) (Ullrich, A., et al., EMBO J. 5 (1986) 2503-2512; Weidner, M., et al., Nature 384 (1996) 173-176) fusioniert. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenz von zwei verschiedenen zwischen die LexA-DNA-Bindungsdomäne und die Rezeptordomäne inserierten Linkem ist unten gezeigt. Die I1- (Wildtyp-IGF-1 Rezeptor) und K1- (kinaseinaktive Mutante des lGF-1 Rezeptors) Konstrukte enthalten ein zusätzliches Prolin und Glycin im Vergleich zu den 12- und K2-Konstrukten.

Fig. 2 Modifizierung des Hefen-Zweihybriden-LexA/IGF-1 Rezeptor- Köderkonstrukts.
a) Schematische Darstellung der cytoplasmatischen Bindungsstelen des IGF-1 Rezeptors. Die α-Untereinheiten des IGF-1 Rezeptors sind über Disulfidbindungen mit den β-Ketten verbunden. Der cytoplasmatische Teil der β-Kette enthält Bindungsstellen für Substrate in der membranangrenzenden Region und der C-terminalen Domäne.
b) Domänenstruktur des Zweihybriden-Köders, die lediglich die membranangrenzenden IGF-1-Rezeptorbindungsstellen enthält. Die membranangrenzende Domäne des IGF-1 Rezeptors (Nukleotide 2923 bis 3051) (Ullrich, A., et al., EMBO J. 5 (1986) 2503-2512) wurde mit der Kinasedomäne von tprmet (Nukleotide 3456 bis 4229) (Gen Bank Zugriffsnummer HSU19348) fusioniert.
c) Die Domänenstruktur des Zweihybriden-Köders, der lediglich die C-terminale IGF-1 Rezeptorbindungsstellen enthält. Die C-terminale Domäne des IGF-1 Rezeptors (Nukleotide 3823 bis 4149) (Ullrich, A., et al., EMBO J. 5 (1986) 2503-2512) wurde mit der Kinasedomäne von tprmet (Nukleotide 3456 bis 4229) (GenBank Zugriffsnummer HSU 19348) fusioniert.

Fig. 3 Isoformen von IIP-1.
a) Darstellung der cDNA-Sequenzen von IIP-1 und IIP-1 (p26). Die Nukleotide sind oben numeriert. Die potentielle Translationsstartstelle innerhalb der IIP-1 cDNA befindet sich an Position 63. Das erste ATG als potentielle Translationsstartstelle in der alternativen Spleißvariante IIP-1 (p26) befindet sich an Position 353. Beide cDNAs enthalten ein Stopcodon an Position 1062.
b) Domänenstruktur von IIP-1 und IIP-1 (p26). Die Aminosäurepositionen sind oben angezeigt. Im Vergleich zu IIP-1 (p26) enthält IIP-1 zusätzliche 97 Aminosäuren am N- Terminus. Beide Isoformen von IIP-1 enthalten eine PDZ- Domäne, welche sich in der Region zwischen Aminosäuren 129 und 213 befindet.

Fig. 4 Darstellung der IGF-1 Rezeptorbindungsdomäne von IIP-1.

Es wurden vollständiges IIP-1, seine cDNA-Teilklone (IIP-1a und IIP-1b) sowie Deletionsmutanten (IIP-1a/mu1, IIP-1a/mu2, (IP-1a/mu3, IIP-1b/mu1) auf eine Wechselwirkung mit dem IGF-1 Rezeptor im Hefen-Zweihybridensystem untersucht. Hefezellen wurden mit einem LexA-IGF-1-Rezeptor- Fusionskonstrukt und einem Aktivierungsplasmid, welches für mit der VP16-Aktivierungs-Domäne fusioniertes IIP-1 oder verschiedene IIP-1 Mutanten codiert, kotransfiziert. Die Bindung zwischen IIP-1 oder seinen Mutanten und dem IGF-1 Rezeptor wurde durch Überwachung des Wachstums von Hefetransfektanten analysiert, die auf Histidin-defizientes Medium plattiert worden und für 6 Tage bei 30°C inkubiert worden waren (Durchmesser der Hefekolonien: + + +, < 1 mm in 2 Tagen, + +, < 1 mm in 4 Tagen; +, < 1 mm in 6 Tagen; -, kein Wachstum detektiert). Die PDZ-Domäne kann als essentiell und ausreichend für das Zustandekommen einer Bindung an den IGF-1 Rezeptor definiert werden. Die Nukleotidpositionen bezüglich des vollständigen IIP-1 sind oben angezeigt.

Fig. 5 Proteinsequenzmotife von IIP-10.
Die Aminosäuresequenz von IIP-10 wurde unter Verwendung des Computerprogramms "Motifs" analysiert, welches nach Proteinmotiven sucht, indem es nach im PROSITE Dictionary beschriebenen Proteinsequenzen für reguläre Expressionsmuster sucht.
SEQ ID NO:1 Nukleotidsequenz von IIP-1 (cDNA).
SEQ ID NO:2 Erwartete Aminosäuresequenz von IIP-1.
SEQ ID NO:3 Nukleotidsequenz des partiellen cDNA-Klons von IIP-6.
SEQ ID NO:4 Abgeleitete Aminosäuresequenz des partiellen cDNA- Klons von IIP-6. Cystein- und Histidinreste der zwei Cys₂His₂-Zinkfingerdomänen sind die Aminosäuren 72, 75, 88, 92, 100, 103, 116 und 120.
SEQ ID NO:5 Nukleotidsequenz von IIP-10 (cDNA).
SEQ ID NO:6 Abgeleitete Aminosäuresequenz von IIP-10.
SEQ ID NO:7 Primer TIP2c-s.
SEQ ID NO:8 Primer TIP2b-r.
SEQ ID NO:9 Primer Hcthy-s.
SEQ ID NO:10 Primer Hcthy-r.

Beispiel 1 Isolierung und Charakterisierung von IGF-1R-Bindeproteinen

Es wurde das Hefen-Zweihybridensystem (Fields, S., und Song, O., Nature 340 (1989) 245-246) verwendet, um unbekannte cytosolische IGF-1- Rezeptorbindeproteine zu isolieren. Für das Screening wurde eine modifizierte Version des Hefen-Zweihybridensystems verwendet, welche in der Hefe eine Tyrosylphosphorylierung der Rezeptoren zwischen den Ketten (interchain tyrosyl phosphorylation) erlaubt.

Das Hefen-Zweihybriden-Köderplasmid (BTM116-cplGF-1 Rezeptor) wurde durch Fusion der cytoplasmatischen Domäne der β-Untereinheit des IGF-1 Rezeptors (Nukleotide 2923 bis 4154) (Ullrich, A., et al., EMBO J. 5 (1986) 2503-2512) mit der LexA-DNA-Bindedomäne fusioniert, welche Dimere bildet und die Situation des aktivierten Wildtyprezeptors nachahmt (siehe Weidner, M., et al., Nature 384 (1996) 173-176). Durch Einführung eines Prolin-Glycin-Spacers zwischen die LexA-DNA-Bindedomäne und die Rezeptordomäne wurde die Fähigkeit des Köders, bekannte Substrate des IGF-1 Rezeptors zu binden, bemerkenswert erhöht im Vergleich mit anderen Spaceraminosäuren (Fig. 1).

Alternativ hierzu wurde ein Köder konstruiert, der nur die membranangrenzende oder C-terminale Region des IGF-1 Rezeptors enthält (Nukleotide 2923 bis 3051 oder Nukleotide 3823 bis 4146) (Ullrich, A., et al., EMBO J. 5 (1986) 2503-2512) fusioniert mit der Kinasedomäne einer nichtverwandten, sehr potentiellen Rezeptortyrosinkinase. Es wurde hier die Kinasedomäne von tpr met (Nukleotide 3456 bis 4229) (GenBank Zugriffsnummer HSU 19348) (Fig. 2) verwendet. Somit war es möglich, die Region des IGF-1 Rezeptors, welche die Bindung an Dowmstream-Effektoren steuert, darzustellen.

Das IGF-1 Rezeptorköderplasmid wurde verwendet, um cDNA-Bibliotheken auf Aktivierungsdomänen zu screenen (z. B. Aktivierungsdomänen auf VP 16- oder Gal4-Basis) (siehe Weidner, M., et al., Nature 384 (1996) 173-176). Die Köder- und Beuteplasmide wurden in den Saccaromyces cerevisiae- Stamm L40 cotransfiziert, welcher ein His3- und IacZ-Reportergen enthält. Bibliothekenplasmide wurden aus in Histidin-defizientem Medium wachsenden Hefekolonien isoliert, sequenziert und wieder in den Hefestamm 1140 eingebracht. Mit Hilfe von Cotransfektionsexperimenten mit verschiedenen Testködern, d. h. BTM116-Plasmiden, die für eine kinaseinaktive Mutante des IGF-1 Rezeptors (L1033A) oder für die cytoplasmatische Domäne von Rezeptortyrosinkinasen der Insulinrezeptorfamilie (Insulinrezeptor, Ros) und für nicht verwandte Rezeptortyrosinkinasenfamilien (Met, EGF-Rezeptor, Kit, Fms, Neu) codieren, wurde die Spezifität der putativen Wechselwirkungen zwischen Köder und Beute ausgewertet. Es wurden mehrere cDNAs identifiziert, welche für zuvor unbekannte an den IGF-1 Rezeptor bindende Proteine (IIPs) codieren. Zusätzlich wurden Bindungsdomänen von bekannten Substraten des IGF-1 Rezeptors gefunden, wie etwa die C-terminale SH2-Domäne von p85Pl3K und die SH2-Domäne von Grb10. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Darstellung der Bindungsspezifizität der IIPs bezüglich verschiedener Rezeptortyrosinkinasen, die im Hefen-Zweihybridensystem getestet wurden. Hefezellen wurden mit einem LexA-Fusionskonstrukt, welches für verschiedene Rezeptortyrosinkinasen codiert, und einem Aktivierungsplasmid, welches für verschiedene IIPs codiert, die mit der VP16-Aktivierungsdomäne fusioniert sind, cotransfiziert. Die Wechselwirkung zwischen den IIPs und den verschiedenen Rezeptortyrosinkinasen wurde durch Überwachung des Wachstums von Hefetransfektanten analysiert, die auf Histidin-defizientem Medium plattiert wurden und für 3 Tage bei 30°C inkubiert wurden (wt IGF-1 R: kinaseaktiver IGF-1 Rezeptor, mu IGF-1R: kinaseinaktive Mutante des IGF-1 Rezeptors, IR: Insulinrezeptor, Ros: Ros-Rezeptortyrosinkinase, Met: Met- Rezeptortyrosinkinase; +, Wachstum von Hefetransfektanten innerhalb von 3 Tagen auf < 1 mm Durchmesser; -, kein Wachstum nachgewiesen, nd, nicht bestimmt).

Beispiel 2 Assaysysteme A) In vitro/biochemische Assays Assay auf ELISA-Basishomogener Assay

IGF-1R und die Bindungsproteine (IIPs) werden mit oder ohne Tag-Enzyme in E.coli oder eukaryontischen Zellen exprimiert und bis zur Homogenität aufgereinigt. Die Wechselwirkung zwischen IGF-1R und den jeweiligen Bindungsproteinen wird in Gegenwart oder Abwesenheit von Substanzen analysiert. Verbindungen, welche die Bindung zwischen IGF-1R und den jeweiligen Bindungsproteinen entweder inhibieren oder fördern, werden ausgewählt. Im Fall des ELISA-Systems werden Antikörper, die spezifisch für die zwei Bindepartner sind, zur Detektion der Komplexe ausgewählt. Im Fall des homogenen Assays wird mindestens ein Bindepartner mit Fluorophoren markiert, was die Analyse der Komplexe erlaubt. Alternativ hierzu werden Anti-Tag-Antikörper zur Überwachung der Wechselwirkung verwendet.

B) Zelluläre Assays

Tumorzellen oder Zellen, die mit Expressionskonstrukten des IGF-1R und den jeweiligen Bindungsproteinen transfiziert wurden, werden mit oder ohne Substanzen behandelt, und anschließend wird die Komplexbildung zwischen den beiden Komponenten unter Verwendung von Standardassays analysiert.

Beispiel 3 cDNA-Klonierung von IIP-1 und IIP-10 (und RT-PCR-Assay)

Unter Verwendung von Datenbankeninformation (ESTs) wurde die Nukleotidsequenz des vollständigen IIP-1 mit Sequenzen der partiellen cDNA-Klone von IIP-1 (IIP-1a, IIP-1b) einem Alignment unterzogen. cDNA- Klonierung von vollständigem IIP-1 wurde mit Hilfe von RT-PCR auf der Grundlage von Gesamt-RNA durchgeführt, die aus einer MCF7_ADR-- Brustzellinie isoliert worden war. RT-PCR mit zwei Oligonukleotidprimern: TIP2c-s (SEQ ID NO:7) und TIP2b-r (SEQ ID NO:8) führte zur Amplifikation von zwei DNA-Fragmenten von 1 kb Länge (IIP-1) und 0,7 kb Länge (IIP-1 (p26)).

Die Nukleotidsequenz des vollständigen IIP-10 wurde unter Verwendung von Datenbankeninformationen (ESTs) mit der Sequenz cDNA-Teilklon von IIP- 10 einem Alignment unterzogen. cDNA-Klonierung von IIP-10 wurde auf der Basis von Gesamt-RNA durchgeführt, die aus der Darmkrebszellinie SW480 isoliert wurde. RT PCR mit zwei Oligonukleotidprimern Hcthy-s (SEQ ID NO:9) und Hcthy-r (SEQ ID NO:10) führte zur Amplifikation eines cDNA- Fragments von 676 Basenpaaren Länge (IIP-10).

DNA-Sequenzierung wurde unter Verwendung der Dideoxynukleotid- Kettenterminationsmethode auf einem ABI 373A-Sequenzierer durchgeführt unter Verwendung des Ampli Taq® FS Dideoxyterminatorkits (Perkin Eimer, Foster City, CA). Ein Vergleich zwischen der cDNA und den abgeleiteten Proteinsequenzen wurde unter Verwendung von Advanced Blast Search (Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol. 215 (1990) 403-410; Altschul, S. F., et al., Nucleic Acids Res. 25 (1997) 3389-3402) durchgeführt.

Beispiel 4 Western Blot-Analyse von IIP-1 und IIP-10

Gesamtzellysate wurden in einem Puffer, enthaltend 50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% Deoxycholsäure, 0,1% SDS und 1 mM EDTA hergestellt und durch Zentrifugieren bei 4°C für 15 Minuten geklärt. Die Proteinkonzentration der Überstände wurde mit dem Mikro BCA- Proteinassaykit (Pierce Chemcial Co., Rockford, IL) nach dem Herstellerhandbuch gemessen. IGF-1 Rezeptoren wurden unter Verwendung von Anti-IGF-1 Rezeptorantikörpern immunopräzipitiert (Santa Cruz). Die Proteine wurden durch SDS-PAGE fraktioniert und elektrophoretisch auf Nitrocellulosefilter übertragen. Die Nitrocellulosefilter wurden mit 10% (Gewicht/Volumen) fettfreiem Milchpulver in 20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,2% Tween-20 vorinkubiert. Die Bindung eines monoklonalen Antikörpers aus der Maus, welcher gegen das Flag-Epitop gerichtet ist, wurde mit einem Ziegen-Antimaus-IgG-Antiserum, welches Meerrettich- Peroxidase-markiert war, detektiert (Biorad, München, DE) und mit einem verstärkten Chemolumineszenzdetektionssystem ECLTM (Amersham, Braunschweig, DE) visualisiert.

Beispiel 5 Überexpression in IIP-1 bis IIP-10 in Säugerzellen durch Liposom-vermittelte Transfektion

Die cDNAs für IIP-1 bis IIP-10 wurden in die NotI-Stelle von pBATflag oder pcDNA3flag kloniert (Weidner, M., et al., Nature 384 (1996) 173-176; Behrens, J., et al., Nature 382 (1996) 638-642; Behrens, J., et al., Science 280 (1998) 596-599). NIH3T3-Zellen oder andere Empfängerzellen wurden mit pcDNAflagIIP-1 bis pcDNAflagIIP-10 oder alternativ mit pBATflagIIP-1 bis pBATIfagIIP-10 unter Verwendung von FuGENE6 (Roche Biochemicals) als Transfektionsmittel transfiziert. Die Zellen wurden in 0,4 mg/ml G418 selektiert. Einzelne Klone wurden gepickt und auf die Expression von IIP-1 bis IIP-10 analysiert und bezüglich ihrer Proliferation funktionell charakterisiert.

Northern Blot Analyse

Northern Blots für Multigewebe-mRNA des Menschen und der Maus wurden von Klontech erhalten (Palo Alto, CA, US). Eine cDNA-Sonde, welche die Nukleotide 343 bis 676 der codierenden Region für IIP-10 umfaßt, wurde unter Verwendung des PCR-DIG-Labeling Mix (Roche Diagnostics GmbH, DE) mit DIG-dUTP markiert. Eine Digoxygenin-markierte Aktin-RNA-Sonde wurde von Roche Diagnostics GmbH, DE erhalten. Die Hybridisierung wurde unter Verwendung der DIG EasyHyb Hybridisierungslösung (Roche Diagnostics GmbH, DE) durchgeführt. IIG-10 mRNA wurde mit Hilfe von mit alkalischer Phosphatase konjugierten DIG-spezifischen Antikörpern und dem CSPD-Substrat (Roche Diagnostics GmbH, DE) detektiert.

Beispiel 6 Detektion von mRNA in Krebszellen

Um zu detektieren, ob Proteine, die von Nukleinsäuren codiert werden, welche mit SEQ ID NO:1 oder mit SEQ ID NO:5 oder den Komplementärsequenzen davon hybridisieren, in Krebszellen exprimiert werden, und somit um nachzuweisen, ob mRNA vorhanden ist, ist es auf der einen Seite möglich, etablierte Verfahren der Nukleinsäurehybridisierung anzuwenden, wie etwa Northern-Hybridisierung, in situ-Hybridisierung, Dot- oder Slot-Hybridisierung und davon abgeleitete diagnostische Techniken (Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA; Hames, B. D., Higgins, S. G., Nucleic acid hybridisation - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England; WO 89/06698; EP-A 0 200 362; EP-A 0 063 879; EP-A 0 173 251; EP-A 0 128 018). Auf der anderen Seite ist es auch möglich, Verfahren aus dem großen Repertoire von Amplifikationstechniken anzuwenden, die spezifische Primer verwenden (PCR Protocols - A Guide to Methods and Applications (1990), publ. M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, T. J. White, Academic Press Inc.; PCR - A Practical Approach (1991), publ. M. J. McPherson, P. Quirke, G. R. Taylor, IRL Press).

Die RNA für diese Verfahren wird nach der Methode von Chomcszynski und Sacchi, Anal. Biochem. 162 (1987) 156-159 aus Krebsgewebe isoliert. 20 µg Gesamt-RNA wurde auf einem 1,2%igen Agarose-Formaldehydgel aufgetrennt und auf Nylonmembranen übertragen (Amersham, Braunschweig, DE). Dies geschah nach Standardverfahren (Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA). Die DNA-Sequenzen SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:5 wurden als Sonden radioaktiv markiert (Feinberg, A. P., und vogelstein, B., Anal. Biochem. 137 (1984) 266-267). Die Hybridisierung wurde bei 68°C in 5 × SSC, 5 × Denhardt, 7% SDS/0,5 M Phosphatpuffer pH 7,0, 10% Dextransulfat und 100 µg/ml Lachsspermien-DNA durchgeführt. Anschließend wurden die Membranen zweimal jeweils für eine Stunde in 1 × SSC bei 68°C gewaschen und dann auf Röntgenfilm gelegt.

Beispiel 7 Verfahren zur Identifizierung von Modulatoren der Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins

Der Expressionsvektor von Beispiel 5 (entweder für IIP-1 oder IIP-10, 1 Oµg/10⁶ Zellen) wird unter Verwendung von bekannten Standardverfahren in NIH 3T3-Zellen eingebracht (Sambrook et al.). Zellen, welche den Vektor aufgenommen haben, werden durch ihre Fähigkeit, in Gegenwart der Selektion oder unter selektiven Bedingungen (0,4 mg/ml G418) zu wachsen, identifiziert. Zellen, welche die für IIP codierende DNA exprimieren, stellen RNA her, welche wie in Beispiel 5 beschrieben durch Northern Blot-Analyse detektiert wird. Alternativ hierzu werden das Protein exprimierende Zellen durch die Identifizierung des Proteins durch Western Blot-Analyse unter Verwendung der in Beispiel 4 bschriebenen Antikörper identifiziert. Zellen, die das Protein von dem Expressionsvektor exprimieren, zeigen eine veränderte Morphologie und/oder verstärkte Wachstumseigenschaften.

Zellen, welche das Protein exprimieren und eine oder mehrere der oben beschriebenen veränderten Eigenschaften aufweisen, werden mit und ohne eine putative Modulatorverbindung kultiviert. Durch Screening von chemischen und natürlichen Bibliotheken können solche Verbindungen identifiziert werden, indem High-Throughput Zell-Assays, die Zellwachstum überwachen, verwendet werden (z. B. Zellproliferationsassays, die als chromogene Substrate die Tetrazoliumsalze WST-1, MTT oder XTT verwenden, oder ein ELISA-Detektionssystem zur Detektion von Zelltod unter Verwendung von Bromdesoxyuridin (BrdU), siehe Boehringer Mannheim GmbH, Apoptosis and Cell Proliferation, 2. Auflage, 1998, S. 70-­ 84).

Die Modulatorverbindung verursacht eine Zunahme oder eine Abnahme der Zellantwort auf die IIP-Proteinaktivität und wird entweder ein Aktivator oder ein Inhibitor der IGF-Funktion sein.

Alternativ hierzu werden putative Modulatoren zu Tumorzellkulturen hinzugegeben, und die Zellen zeigen eine veränderte Morphologie und/oder reduzierte oder verstärkte Wachstumseigenschaften. Es wird eine putative Modulatorverbindung mit und ohne IIP-Protein zu den Zellen hinzugegeben, und eine Zellantwort wird durch direkte Beobachtung der morphologischen Charakteristika der Zellen gemessen, und/oder die Zellen werden auf ihre Wachstumseigenschaften hin überwacht. Die Modulatorverbindung wird eine Zunahme oder eine Abnahme in der Zellantwort auf das IIP-Protein verursachen und wird entweder ein Aktivator oder Inhibitor der IGF-1- Rezeptoraktivität sein.

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims (13)

1. Nukleinsäure,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie für ein an den IGF-1 Rezeptor bindendes Protein codiert, ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

• a) die in SEQ ID NO:5 dargestellte Nukleinsäuresequenz oder Komplementärsequenz dazu,
• b) Nukleinsäuresequenzen, welche unter stringenten Bedingungen mit einer der Nukleinsäuren aus (a), die für ein Polypeptid mit Homologie zu der in SEQ ID NO:6 dargestellten Polypeptidsequenz codieren, hybridisieren,
• c) Nukleinsäuresequenzen, welche aufgrund der Degeneration des genetischen Codes für Polypeptide codieren, welche die Aminosäuresequenz der von einer der Nukleinsäuren aus (a) und/oder (b) codierten Polypeptide aufweisen.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Sequenz gemäß SEQ ID NO:5 aufweist.

3. Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierung in 5,0 × SSC, 5 × Denhardt, 7% SDS, 0,5 M Phosphatpuffer pH 7,0, 10% Dextransulfat und 100 µg/ml Lachsspermien-DNA bei ungefähr 50°C bis 68°C, gefolgt von zwei Waschschritten mit 1 × SSC bei 68°C durchgeführt wird.

4. Rekombinanter Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält und zu deren Expression geeignet ist.

5. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einem rekombinanten Expressionsvektor nach Anspruch 4 transformiert ist.

6. Rekombinantes Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es von einer der Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 1-3 codiert ist und an den IGF-1 Rezeptor bindet.

7. Verfahren zur Herstellung eines Proteins, welches an den IGF-1 Rezeptor bindet, umfassend: Exprimieren einer exogenen DNA in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen und Isolieren des gewünschten Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein codiert ist von der in SEQ ID NO:5 dargestellten DNA-Sequenz oder einer Nukleinsäure, welche unter stringenten Bedingungen mit einer zu der in SEQ ID NO:5 dargestellten Nukleinsäure komplementären Nukleinsäure hybridisiert.

8. Verfahren zur Detektion des Proliferationspotentials einer Krebszelle, umfassend:

• a) Inkubieren einer Probe, ausgewählt aus einer Körperflüssigkeit eines an Krebs leidenden Patienten, Tumorzellen, Zellextrakten und/oder Zellkulturüberständen von Tumorzellen, wobei die Probe Nukleinsäuren enthält, mit einer Nukleinsäuresonde, die ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus:
  • a) den in SEQ ID NO: 1, 3 oder 5 dargestellten Nukleinsäuren oder dazu komplementären Nukleinsäuren,
  • b) Nukleinsäuren, welche mit einer der Nukleinsäuren aus (i)hybridisieren, und
• b) Detektieren der Hybridisierung mit Hilfe eines weiteren Bindepartners der Nukleinsäure der Probe und/oder der Nukleinsäuresonde.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin eine Hybridisierung mit mindestens einem Nukleinsäurefragment einer der in SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:5 dargestellten Nukleinsäuren oder einem Komplementärfragment davon bewirkt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9 worin die zu detektierende Nukleinsäure vor der Detektion amplifiziert wird.

11. Verfahren zum Screenen einer Verbindung, welche die Wechselwirkung zwischen IGF-1R und einem der Polypeptide IIP-1 bis IIP-10 hemmt, umfassend:

• a) Inkontaktbringen von IGF-1R und dem IIP-Polypeptid mit einer eine in Frage kommende Verbindung enthaltenden Lösung, so daß der IGF-1R und das IIP-Polypeptid in der Lage sind, einen Komplex zu bilden, und
• b) Bestimmen der Menge an Komplex im Vergleich zu dem vorbestimmten Ausmaß an Bindung in Abwesenheit der Verbindung und daraus Bewerten der Fähigkeit der Verbindung, die Bindung des IGF-1R an das IIP-Polypeptid zu hemmen.

12. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Karzinomen in einem Patienten, umfassend: Mischen eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers mit einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung, welche die Wechselwirkung zwischen IGF-1R und einem der Polypeptide IIP-1 bis IIP-10 in einem Zell-Assay moduliert, wobei in dem Zell-Assay Tumorzellen oder mit Expressionskonstrukten von IGF-1R und IIP tranformierte Zellen mit der Verbindung behandelt werden und eine Komplexbildung zwischen IGF-1R und dem jeweiligen IIP analysiert wird und das Ausmaß an Komplexbildung im Fall einer Inhibition 50%, bezogen auf 100% Komplexbildung ohne die Verbindung im selben Zell-Assay, nicht übersteigt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin die Verbindung die Wechselwirkung inhibiert.