DE19956203A1 - Verfahren zur kontrollierbaren Durchführung komplexer PCR-Amplifikationen - Google Patents

Abstract

Beschrieben ist ein Verfahren zur kontrollierbaren Durchführung komplexer PCR-Amplifikationen, wobei man mindestens die folgenden Schritte ausführt: DOLLAR A a) PCR-Amplifikation mit mindestens 50 Primern eines ersten Typs (Typ 1) unterschiedlicher Sequenz, die komplementär zu dem einen Strang einer beliebigen DNA-Probe sind, und die zudem einen Primer oder eine Bibliothek von Primern eines zweiten Typs (Typ 2) enthält, der komplementär zu dem anderen Strang der verwendeten DNA-Probe ist, wobei die Primer des Typs 2 eine erste Markierung (Markierung 1) enthalten DOLLAR A b) Hybridisierung der Amplifikate an einen Oligomer-Array, der zu den in der PCR Reaktion eingesetzten Primern komplementäre Oligomere enthält; DOLLAR A c) Längenbestimmung der an den Array gebundenen Amplifikate durch eine mit der Länge des jeweiligen DNA-Fragments korrelierbare zweite Markierung (Markierung 2), die von der ersten Markierung (Markierung 1) im Schritt DOLLAR A a) verschieden ist und DOLLAR A d) Quantifizierung der von Markierung 1 und Markierung 2 stammenden Signale an jedem für die Analyse relevanten Ort des Oligonukleotid-Arrays.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kontrollierbaren Durchführung komplexer PCR-Amplifikationen.

Komplexe PCR-Amplifikationen, z. B. "whole genome ampli­ fikations", werden zur simultanen Vervielfältigung einer Vielzahl von Fragmenten aus DNA-Proben genutzt. Die er­ haltenen, hochdiversen Fragmente können unter anderem für Genotypisierungen, Mutationsanalyse und verwandte Themen­ bereiche genutzt werden.

Die Verfahren sind allerdings nur schwer validierbar und kalibrierbar, eben aufgrund der Komplexität und der Tat­ sache, daß ein großer Teil der amplifizierten Sequenz meist unbekannt ist. Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit komplexen PCR Amplifikationen, die mittels eines angepaßten Oligomer-Arrays einer vollständigen Analyse zugänglich sind.

PCR Reaktionen (Polymerase Kettenreaktionen) werden nor­ malerweise mit zwei spezifisch bindenden Primern durchge­ führt, wobei einer komplementär zum (+)-Strang, der ande­ re komplementär zum (-)-Strang des zu amplifizierenden Templates ist. Das Ziel einer solchen Amplifikation ist es, ein bestimmtes Fragment der Templat DNA zu verviel­ fältigen, das in der Regel genau definiert und in seiner Basensequenz zum großen Teil oder vollständig bekannt ist.

Es sind auch PCR Reaktionen bekannt, die mehr als zwei verschiedene Primer einsetzen. Meist dienen sie zur Amplifikation mehrerer, ebenfalls wenigstens zum großen Teil in ihrer Basensequenz bekannter Fragmente gleichzei­ tig in einem Gefäß. Auch in diesem Fall binden die einge­ setzten Primer spezifisch an bestimmte Abschnitte der Templat DNA. Man spricht in solchen Fällen von "Multiplex-PCR", meist hat sie nur zum Ziel, mehrere Fragmente gleichzeitig amplifizieren zu können und so Ma­ terial und experimentellen Aufwand einzusparen.

PCR-Reaktionen, die nicht zuvor bekannte Fragmente ampli­ fizieren, können mit nicht spezifisch an bestimmte Regio­ nen bindenden Primern durchgeführt werden. Diese sind dann so konzipiert, daß komplementäre Bindungsstellen in der Templat DNA statistisch betrachtet mehrmals auftreten sollten. Wir sprechen in diesem Fall von komplexen PCR Amplifikationen. Solche Amplifikationen können genutzt werden, um einen bestimmten Anteil beispielsweise eines Genoms statistisch verteilt zu amplifizieren. Je nach der Anzahl der möglichen Bindungsstellen eines Primers im Ge­ nom kann die Komplexität der Amplifikate reguliert wer­ den. Die Primer können entweder sehr kurz sein, über uni­ versell paarende Basen verfügen oder aber als kombinato­ rische Bibliothek von Sequenzen synthetisiert worden sein. "Whole genome amplifications" werden beispielsweise in den folgenden Publikationen beschrieben: L. Zhang, et al.; Whole genome amplification from a single cell: Im­ plications for genetic analysis; Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992), 89, 5847-51; K. Kristjansson, et al.; Preim­ plantation single cell analyses of dytrophin gene deleti­ on using whole genome amplification; Nature Genetics (1994), 6, 19-23; P. 0. Brown; Genome scanning methods, Current Opinion in Genetics and Development (1994), 4, 366-73; M. T. Barrett, et al.; Genotypic analysis of mul­ tiple loci in somatic cells by whole genome amplificati­ on; Nucl. Acids. Res. (1995), 23, 3488-92; D. Grothues, et al. PCR amplification of megabase DNA with tagged ran­ dom primers (T-PCR); Nucl. Acids. Res. (1993), 21, 1321-2; J. Welsh et al.; Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers; Nucl. Acids. Res. (1990), 18, 7213-8; V. G. Cheung et al.; Whole genome amplification using a degenerate oligonucleotide primer allows hundreds of ge­ notypes to be performed an less than one nanogram of ge­ nomic DNA; Proc. Natl, Acad. Sci. USA (1996), 93, 14676-9.

Im Bereich der DNA-Chips ist ein Prinzip von allen Ent­ wicklungen am weitesten fortgeschritten, wie dies bei­ spielsweise in den US-A 5,593,839, US-A 5,999,695 oder US-A 5,631,734 beschrieben ist. Aber es sind auch eine Anzahl anderer DNA-Chips mit verschiedenen Eigenschaften für spezielle Anwendungen bekannt (z. B. US-A 5,667,667, US-A 5,525,464 oder US-A 5,492,806 oder z. B. Goffeau, A., Nature 385, 202-203; Weiler, J. and Hoheisel, J., Anal. Biochem. 243,218-227; Chee, M, et al., Science 274, 610-614). Jüngere Publikationen berichten schon über einen kommerziell verfügbaren HIV-Chip, der die Untersuchung des kompletten HIV-Genoms gestattet. Gegen bis zu 400.000 Oligonukleotide werden fluoreszenzmarkierte PCR-Produkte der zu untersuchenden Probe hybridisiert. Die Auswertung der Signale erfolgt mit Hilfe von CCD-Kameras oder spezi­ ellen Fluoreszenzscannern. Es wird die seit langem be­ kannte Fähigkeit solcher Systeme zur allelspezifischen Hybridisierung genutzt. Das bedeutet: Nur dort, wo die Probe absolut komplementär zu einem fixierten Oligonu­ kleotid ist, bleibt am Ende der Hybridisierungs- und Waschprozeduren ein Signal erhalten. Die Untersuchung ei­ ner bekannten Gensequenz auf Mutationen gelingt, weil sich nicht nur jeder Teilbereich der gesamten Sequenz in Form von Oligonukleotidsequenzen auf der Matrix befindet, sondern weil dies auch für jede mögliche Abweichung von der Normalsequenz zutrifft. Die Effizienz der Chip- Prozedur rührt zu einem Teil daher, daß mit zwei einfa­ chen Arbeitsschritten, nämlich der Hybridisierung und dem Waschen, die Sequenzinformation einer Vielzahl von Genen oder Genorten erhalten wird.

Die Detektion von verschiedenen in einer Amplifikation eingebauten markierten Nukleotid-Analoga oder am 5'Ende markierter DNA auf einem (wie auch immer gearteten) DNA- Chip läßt sich auf verschiedenste Art bewerkstelligen. Eine Möglichkeit ist die Detektion mit einer CCD-Camera, welche Fluoreszenzsignale registriert, welche auf dem Chip die erfolgte Bindung einer fluoreszenz-markierten beliebigen Sequenz anzeigen.

5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt bei­ spielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkripti­ on, genomischem Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil gene­ tischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Se­ quenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Dar­ überhinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die epigene­ tische Information, die die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.

Es sind mehrere Verfahren bekannt, die diese Probleme lö­ sen. Meist wird eine chemische Reaktion oder enzymatische Behandlung der genomischen DNA durchgeführt, infolge de­ rer sich die Cytosin von den Methylcytosin Basen unter­ scheiden lassen. Eine gängige Methode ist die Umsetzung von genomischer DNA mit Bisulfit, die nach alkalischer Hydrolyse in zwei Schritten zu einer Umwandlung der Cyto­ sin Basen in Uracil führt (Shapiro, R., Cohen, B., Ser­ vis, R. Nature 227, 1047 (1970)). 5-Methylcytosin bleibt unter diesen Bedingungen unverändert. Die Umwandlung von C in U führt zu einer Veränderung der Basensequenz, aus der sich durch Sequenzierung nun die ursprünglichen 5- Methylcytosine ermitteln lassen (nur diese liefern noch eine Bande in der C-Spur).

Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations Massen­ spektrometrie (MALDI) ist eine neue, sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Karas, M. and Hillenkamp, F. 1988. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10.000 daltons. Anal. Chem. 60 : 2299-2301). Ein Analytmolekül wird in ei­ ne im UV absorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix ins Vakuum verdampft und das Analyt so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere. Die Flugzeit wird in die Masse der Ionen umgerechnet.

Technische Neuerungen der Hardware haben die Methode si­ gnifikant verbessert. Erwähnenswert ist delayed extracti­ on (DE). Für DE wird die Beschleunigungsspannung mit ei­ ner Verzögerung zum Laserpuls eingeschaltet und dadurch eine verbesserte Auflösung der Signale erreicht, weil die Zahl der Stöße verringert wird.

Für die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszent markierte Sonden verwendet worden. Besonders geeignet sind für die Fluoreszenzmarkierung ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'OH der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden erfolgt beispielsweise über ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich. Es sind auch Nu­ kleotide kommerziell erhältlich (Amersham Pharmacia), die beispielsweise eine Cy5-Markierung tragen und die in ei­ ner PCR-Reaktion eingebaut werden können.

Die komplexen Amplifikationen, die im Stand der Technik beschrieben werden, sind in ihrem Ergebnis gesamthaft al­ lenfalls statistisch kontrollierbar. Nach einer Amplifi­ kation, durchgeführt mit zwei unspezifisch bindenden Pri­ mern, ist es praktisch unmöglich Anzahl und Länge der verschiedenen produzierten Fragmente zu bestimmen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die Nachteile der im Stand der Technik bekannten Verfahren zu überwinden.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zur kontrollierbaren Durchführung komplexer PCR-Amplifikationen gelöst, wobei man mindestens die folgenden Schritte ausführt:

• a) PCR-Amplifikation mit mindestens 50 Primern eines ersten Typs (Typ 1) unterschiedlicher Sequenz, die kom­ plementär zu dem einen Strang einer beliebigen DNA-Probe sind, und die zudem einen Primer oder eine Bibliothek von Primern eines zweiten Typs (Typ 2) enthält, der komple­ mentär zu dem anderen Strang der verwendeten DNA-Probe ist, wobei die Primer des Typs 2 eine erste Markierung (Markierung 1) enthalten
• b) Hybridisierung der Amplifikate an einen Oligomer- Array, der zu den in der PCR Reaktion eingesetzten Pri­ mern komplementäre Oligomere enthält;
• c) Längenbestimmung der an den Array gebundenen Ampli­ fikate durch eine mit der Länge des jeweiligen DNA- Fragments korrelierbare zweite Markierung (Markierung 2), die von der ersten Markierung (Markierung 1) im Schritt a) verschieden ist und
• d) Quantifizierung der von Markierung 1 und Markierung 2 stammenden Signale an jedem für die Analyse relevanten Ort des Oligonukleotid-Arrays.

Dabei ist vorteilhafterweise erfindungsgemäß bevorzugt, daß man eine PCR-Amplifikation mit mindestens 50 Primern des Typs 1 unterschiedlicher Sequenz, die komplementär zu dem (+)-Strang einer beliebigen DNA-Probe sind, durch­ führt und die zudem einen Primer oder eine Bibliothek von Primern des Typs 2 enthält, der komplementär zum (-)- Strang ist, wobei die Primer des Typs 2 eine Markierung 1 enthalten.

Gleichermaßen erfindungsgemäß bevorzugt ist es, daß man eine PCR-Amplifikation mit mindestens 50 Primern des Typs 1 unterschiedlicher Sequenz, die komplementär zu dem (-)- Strang sind, durchführt und die zudem einen Primer oder eine Bibliothek von Primern des Typs 2 enthält, der kom­ plementär zum (+)-Strang ist, wobei die Primer des Typs 2 eine Markierung 1 enthalten.

Besonders bevorzugt ist es, daß man die mindestens 50 eingesetzten Primer des Typs 1 derart auswählt, daß diese an die zu amplifizierende DNA spezifisch hybridisieren, während man den zum Gegenstrang komplementären Primer des Typs 2 derart auswählt, daß dieser nicht spezifisch hy­ bridisiert.

Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, daß der Primer des Gegenstrangs weniger als 15 Basen umfaßt. Ganz beson­ ders bevorzugt ist hierbei, daß der Primer des Ge­ genstrangs weniger als 12 Basen umfaßt.

Ferner ist erfindungsgemäß bevorzugt, daß der Primer des Gegenstrangs Positionen mit universellen Basen oder dege­ nerierte Positionen umfaßt.

Es ist weiterhin erfindungsgemäß bevorzugt, daß man die Primer des Gegenstrangs durch kombinatorische Synthese herstellt.

Bevorzugt ist es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, daß Markierung 1 und Markierung 2 Fluoreszenzmarkierungen sind.

Es ist insbesondere bevorzugt, daß Markierung 1 und Mar­ kierung 2 Fluoreszenzmarkierungen und/oder ablösbare, in einem Massenspektrometer nachweisbare Massenlabel sind.

Dabei ist besonders bevorzugt, daß man das Verhältnis zwischen den von Markierung 1 und Markierung 2 ausgehen­ den Signalen an jedem für die Analyse relevanten Ort des Arrays bestimmt.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist auch, daß die verwendeten Primer des Typs 1 entweder nur die Basen T, A und C oder aber die Basen T, A, und G enthalten.

Außerdem ist erfindungsgemäß bevorzugt, daß man die DNA vor der Amplifikation chemisch derart behandelt, daß 5- Methylcytosin und Cytosin unterschiedlich reagieren und sich durch die Behandlung eine Veränderung im Basenpaa­ rungsverhalten einer dieser Basen ergibt.

Dabei ist ganz besonders bevorzugt, daß man die Behand­ lung der DNA vor der Amplifikation mittels einer Bisul­ fitlösung ( = Disulfit, Hydrogensulfit) durchführt.

In dieser Erfindung wird somit eine komplexe Amplifikati­ on beschrieben, welche so geartet ist, daß die Nachteile des Standes der Technik umgangen werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur kontrollierbaren Durchführung komplexer PCR- Amplifikationen. Dazu wird zuerst eine PCR Amplifikation mit mindestens 50 Primern des Typs 1 und einem Primer oder einer Primerbibliothek des Typs 2 durchgeführt, wo­ bei die mindestens 50 Primer des Typs 1 alle hinsichtlich ihrer Sequenz unterschiedlich sind und alle zudem kom­ plementär zu dem (+)-Strang einer beliebigen, unter Ver­ wendung dieses Verfahrens untersuchten DNA-Probe sind. Zudem sind die Primer des Typs oder die Bibliothek von Primern des Typs 2 komplementär zum (-)-Strang der unter Verwendung dieses Verfahrens untersuchten DNA-Probe. Al­ ternativ sind die Primer des Typs 1 komplementär zum (-)- Strang und die des Typs 2 komplementär zum (+)-Strang. Die Primer des Typs 2 enthalten eine Markierung des Typs 1.

In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens hybridisieren die mindestens 50 eingesetzten Primer des Typs 1 an die zu amplifizierende DNA spezifisch, während der zum Gegenstrang komplementäre Primer des Typs 2 nicht spezifisch hybridisiert, d. h. er kann unter den gewähl­ ten Reaktionsbedingungen mehreren Orten der zu untersu­ chenden DNA-Probe binden. In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens enthält des Primer des Typs 2 we­ niger als 15 Basen. In einer bevorzugten Variante des Verfahrens enthält der Primer des Typs 2 weniger als 12 Basen.

Der Primer des Typs 2 kann bevorzugt auch degenerierte Basenpositionen enthalten, d. h. Positionen, die in ver­ gleichbarer Weise an verschiedene Basen des Gegenstrangs binden können, z. B. an A, G oder T. Es können dabei auch bevorzugt sogenannte universelle Basen zum Einsatz kom­ men, die sowohl an komplementäre T, C, G, und A- Nukleobasen binden können. In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens wird der Primer des Typs 2 durch kombinatorische Synthese hergestellt, so daß eine Biblio­ thek von Primern gleicher Länge erhalten wird. Demzufolge werden Bibliotheken von Primer verwendet, die an bestimm­ ten Positionen in einer gegebenen Sequenz unterschiedli­ che Basen beinhaltet.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens ist die Mar­ kierung 1 der Primer des Typs 2 eine Fluoreszenzmarkie­ rung. In einer weiteren besonders bevorzugten Variante des Verfahrens ist die Markierung der Primer des Typs 2 eine Massenmarkierung, die zum Nachweis dieses Primers in einem Massenspektrometer verwendet werden kann. In einer besonders bevorzugten Ausführung erfolgt der Nachweis in einem MALDI-Massenspektrometer, wobei die Ablösung der Massenmarkierung entweder durch Belichtung mit dem Laser des Massenspektrometers oder aber durch den Kontakt mit der MALDI-Matrix durchgeführt wird.

In einer weiteren, besonders bevorzugten Variante des Verfahrens enthalten die verwendeten Primer des Typs 1 entweder nur die Basen T, A und C oder aber die Basen T, A, und G.

Im zweiten Schritt des Verfahrens wird eine Hybridisie­ rung der Amplifikate an einen Oligomer-Array, der zu den in der PCR Reaktion eingesetzten Primern komplementäre Oligomere enthält, durchgeführt.

Im dritten Schritt des Verfahrens wird nun eine Längenbe­ stimmung der an jeden für die Analyse relevanten Ort des Arrays gebundenen Amplifikate durch eine mit der Länge des jeweiligen DNA-Fragments korrelierbare Markierung 2, die von der Markierung 1 des ersten Verfahrensschrittes verschieden ist, durchgeführt. In einer bevorzugten Vari­ ante des Verfahrens ist die Markierung 2 eine Fluores­ zenzmarkierung. In einer weiteren besonders bevorzugten Variante des Verfahrens ist die Markierung der Primer des Typs 2 eine Massenmarkierung, die zum Nachweis dieses Primers in einem Massenspektrometer verwendet werden kann. In einer besonders bevorzugten Ausführung erfolgt der Nachweis in einem MALDI-MAssenspektrometer, wobei die Ablösung der Massenmarkierung entweder durch Belichtung mit dem Laser des Massenspektrometers oder aber durch den Kontakt mit der MALDI-Matrix durchgeführt wird. Die Mar­ kierung 2 wird in Abhängigkeit von der Länge des jeweili­ gen Amplifikates entweder an dieses gebunden oder bei der Amplifikation in dieses integriert. Dies kann bevorzugt durch die Verwendung von fluoreszenz- oder massenmarkier­ ten Triphosphaten in der Amplifikation erfolgen. In einer weiteren, besonders bevorzugten Variante des Verfahrens erfolgt die Längenbestimmung durch Hybridisierung nicht spezifisch bindender Oligonukleotide oder Peptide Nucleic Acids, welche wiederum eine Fluoreszenzmarkierung und/oder Massenmarkierung tragen. Die Fluoreszenzmarkie­ rungen und Massenmarkierungen müssen von denen der Primer des Typs 2 verschieden sein.

Im vierten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens er­ folgt die Quantifizierung der von Markierung 1 und Mar­ kierung 2 stammenden Signale an jedem für die Analyse re­ levanten Ort des Oligonukleotid-Arrays. In einer beson­ ders bevorzugten Variante des Verfahrens wird das Ver­ hältnis der Intensitäten von der Markierung 1 und der Markierung 2 jeweils ausgehenden Signale an jedem für die Analyse relevanten Ort des Arrays bestimmt. In einer be­ vorzugten Variante des Verfahrens wird damit ermittelt, welche Primer des Typs 1 tatsächlich zu einer Amplifika­ tion beigetragen haben und außerdem wird ermittelt, wie die durchschnittliche Länge der von einem der Primer aus­ gehenden Amplifikate ist.

In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens wird die DNA-Probe vor der Amplifikation chemisch derart behandelt, daß 5-Methylcytosin und Cytosin unterschied­ lich reagieren und sich durch die Behandlung eine Verän­ derung im Basenpaarungsverhalten einer dieser Basen er­ gibt. In einer besonders bevorzugten Variante des Verfah­ rens wird dies durch eine Behandlung der DNA vor der Amplifikation mit einer Bisulfitlösung ( = Disulfit, Hydro­ gensulfit) erreicht. Bei Verwendung dieser Varianten dient das Verfahren zur kontrollierbaren Herstellung kom­ plexer DNA-Amplifikate, die für die Untersuchung von Cytosin-Methylierungsmustern in der jeweiligen DNA-Probe verwendet werden.

Claims (14)

1. Verfahren zur kontrollierbaren Durchführung komplexer PCR-Amplifikationen, wobei man mindestens die folgen­ den Schritte ausführt:

• a) PCR-Amplifikation mit mindestens 50 Primern ei­ nes ersten Typs (Typ 1) unterschiedlicher Sequenz, die komplementär zu dem einen Strang einer beliebigen DNA-Probe sind, und die zudem einen Primer oder eine Bibliothek von Primern eines zweiten Typs (Typ 2) enthält, der komplementär zu dem anderen Strang der verwendeten DNA-Probe ist, wobei die Primer des Typs 2 eine erste Markierung (Markierung 1) enthalten
• b) Hybridisierung der Amplifikate an einen Oligo­ mer-Array, der zu den in der PCR Reaktion eingesetz­ ten Primern komplementäre Oligomere enthält;
• c) Längenbestimmung der an den Array gebundenen Amplifikate durch eine mit der Länge des jeweiligen DNA-Fragments korrelierbare zweite Markierung (Markierung 2), die von der ersten Markierung (Markierung 1) im Schritt a) verschieden ist und
• d) Quantifizierung der von Markierung 1 und Mar­ kierung 2 stammenden Signale an jedem für die Analyse relevanten Ort des Oligonukleotid-Arrays.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine PCR-Amplifikation mit mindestens 50 Pri­ mern des Typs 1 unterschiedlicher Sequenz, die kom­ plementär zu dem (+)-Strang einer beliebigen DNA- Probe sind, durchführt und die zudem einen Primer oder eine Bibliothek von Primern des Typs 2 enthält, der komplementär zum (-)-Strang ist, wobei die Primer des Typs 2 eine Markierung 1 enthalten.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine PCR-Amplifikation mit mindestens 50 Pri­ mern des Typs 1 unterschiedlicher Sequenz, die kom­ plementär zu dem (-)-Strang sind, durchführt und die zudem einen Primer oder eine Bibliothek von Primern des Typs 2 enthält, der komplementär zum (+)-Strang ist, wobei die Primer des Typs 2 eine Markierung 1 enthalten.

4. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die mindestens 50 eingesetzten Primer des Typs 1 derart auswählt, daß diese an die zu amplifizierende DNA spezifisch hybri­ disieren, während man den zum Gegenstrang komplemen­ tären Primer des Typs 2 derart auswählt, daß dieser nicht spezifisch hybridisiert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Primer des Gegenstrangs weniger als 15 Basen umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Primer des Gegenstrangs weniger als 12 Basen umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Primer des Gegenstrangs Positionen mit uni­ versellen Basen oder degenerierte Positionen umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Primer des Gegenstrangs durch kombinato­ rische Synthese herstellt.

9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß Markierung 1 und Markierung 2 Fluoreszenzmarkierungen sind.

10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß Markierung 1 und Markierung 2 Fluoreszenzmarkierungen und/oder ablösbare, in ei­ nem Massenspektrometer nachweisbare Massenlabel sind.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man das Verhältnis zwischen den von Markierung 1 und Markierung 2 ausgehenden Signalen an jedem für die Analyse relevanten Ort des Arrays be­ stimmt.

12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß die verwendeten Primer des Typs 1 entweder nur die Basen T, A und C oder aber die Basen T, A, und G enthalten.

13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß man die DNA vor der Ampli­ fikation chemisch derart behandelt, daß 5-Methylcyto­ sin und Cytosin unterschiedlich reagieren und sich durch die Behandlung eine Veränderung im Basenpaa­ rungsverhalten einer dieser Basen ergibt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung der DNA vor der Amplifikation mittels einer Bisulfitlösung ( = Disulfit, Hydrogensul­ fit) durchführt.