DE19936035A1 - Lymphozytenproliferationstestkit - Google Patents

Lymphozytenproliferationstestkit

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Abstract

Es wird ermöglicht, auf Lymphozyten vor und nach einer Stimulation mit PHA und/oder Protein A und/oder NGF den Zelloberflächenmarker CD69 zu erkennen und einen Stimulationsindex zu bestimmen. DOLLAR A Die ermittelten Daten sind geeignet, Rückschlüsse auf das Vorliegen der Alzheimerschen Krankheit zu ermöglichen.

Description

Der Lymphozytenproliferationstestkit wird zur Diagnose der Alzheimerschen Erkran­ kung eingesetzt. Er dient der Erfassung präklinischer Erkrankungsphasen und der differentialdiagnostischen Abgrenzung der Alzheimerschen Erkrankung gegenüber anderen Demenzen.
Die Diagnose der Alzheimerschen Erkrankung ist mit klinischen Mitteln sowie den zur Verfügung stehenden paraklinischen und apparativ-technischen Methoden allein nicht mit letzter Sicherheit zu stellen und bedarf daher stets der autoptischen Verifi­ zierung. Insbesondere in Erkrankungsfrühstadien ist die differentialdiagnostische Abgrenzung anderer Demenzursachen oft schwierig. Gerade in diesen frühen Pha­ sen der Erkrankung ist jedoch eine sichere Stellung der Diagnose aus zweierlei Gründen wichtig. Sie erlaubt zum einen die diagnostische Abgrenzung potentiell be­ handelbarer Demenzformen und kann diese damit einer effektiven Therapie zufüh­ ren, zum anderen ist sie Voraussetzung für jegliche Form der therapeutischen Inter­ vention in den Prozeß der Neurodegeneration der Alzheimerschen Erkrankung, der nur in diesen Frühstadien erfolgreich sein kann. Eine derartige diagnostische Si­ cherheit kann nur durch Biomarker der Alzheimerschen Erkrankung, d. h. durch leicht zu bestimmende biologische Veränderungen mit einer für die Erkrankung hin­ reichenden Sensitivität und Spezifität, geleistet werden.
Biomarker der Alzheimerschen Erkrankung haben damit zum einen diagnostischen Wert, und sollen hierbei insbesondere helfen, Risikogruppen bzw. Patienten in präk­ linischen Stadien und frühen klinischen Stadien sicher zu identifizieren. Zum ande­ ren dienen Biomarker der Verlaufskontrolle und damit der Prognostik sowie der Kontrolle der Ansprechbarkeit auf kausal-therapeutische Interventionen. Ideale Bio­ marker sollten bestimmten theoretischen und praktischen Anforderungen genügen. Hierzu gehören insbesondere eine hohe Spezifität und Sensitivität, die Fähigkeit, präklinische Stadien zu identifizieren, sowie ein hoher positiver und negativer Vor­ hersagewert. Die Bestimmung der Biomarker sollte möglichst nicht-invasiv sein und den Patienten nicht ängstigen. Die Analysen sollten einfach durchführbar und preis­ wert sein.
Keiner der derzeit bekannten Biomarker der Alzheimerschen Erkrankung genügt den den o. a. Anforderungen. Insbesondere aufgrund der geringen Sensitivität und Spe­ zifität der bekannten Biomarker sind diese als diagnostisches Hilfsmittel ungeeignet.
Es ist Aufgabe der Erfindung, einen Biomarker der Alzheimerschen Erkrankung mit ausreichender Sensitivität und Spezifität anzugeben und damit ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, welches die Diagnose der Alzheimerschen Erkrankung, die Erfassung von präklinischen Erkrankungsphasen sowie die differentialdiagnostische Abgrenzung der Alzheimerschen Erkrankung gegen andere Demenzen erlaubt.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch Bestimmung der CD69 Präsentation an der Oberfläche von Lymphozyten des Patienten sowie durch Bestimmung der Pro­ liferationsrate dieser Lymphozyten nach mitogener Stimulation gelöst. Diese Merk­ male zeigen erkrankungsspezifische Abweichungen vom Normbefund.
Die Erfindung beschreibt ein Merkmal (Biomarker) der Alzheimerschen Erkrankung, durch dessen Bestimmung Patienten mit dieser Erkrankung zu identifizieren sind. Damit wird ein Verfahren angegeben, welches die Diagnose der Alzheimerschen Erkrankung, die Erfassung von präklinischen Erkrankungsphasen sowie die diffe­ rentialdiagnostische Abgrenzung der Alzheimerschen Erkrankung gegen andere Demenzen erlaubt.
Bisher bekannte Merkmale der Alzheimerschen Erkrankung, die sich am lebenden Patienten bestimmen lassen (Biomarker) zeigen nur eine ungenügende Sensitivität und Spezifität und sind als diagnostische Hilfsmittel daher ungeeignet. Mit klini­ schen Mitteln beträgt die diagnostische Sicherheit nur 80% bis 90% und bereitet insbesondere in Erkrankungsfrühphasen differentialdiagnostische Schwierigkeiten. Die Erkennung von präklinischen Erkrankungsphasen ist aufgrund des Fehlens ei­ nes geeigneten Biomarkers derzeit nicht möglich.
Den neurodegenerativen Veränderungen liegen bei der Alzheimerschen Erkrankung gestörte Prozesse der intrazellulären Vermittlung trophischer und mitogener Signale zugrunde. Diese Störungen der intrazellulären Signaltransduktion sind nicht auf das Nervensystem beschränkt.
Sie lassen sich in ähnlicher Weise auch an Lymphozyten des peripheren Blutes die­ ser Patienten finden. Aufgrund ihrer Erkrankungsspezifität besitzt diese Verände­ rung diagnostischen Wert und eignet sich als Biomarker.
Die Ermittlung, ob die für die Alzheimersche Erkrankung typische Störung der intra­ zellulären Vermittlung trophischer und mitogener Signale vorliegt, erfolgt durch Be­ stimmung der CD69 Präsentation auf Lymphozyten vor und nach mitogener Stimu­ lation. Hierfür werden Lymphozyten aus den durch Venenpunktion gewonnenen Blutproben der Patienten über einen Ficoll-Gradienten präpariert und für die weite­ ren Stimulationsexperimente eingesetzt.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden diese Stimulationsexperi­ mente direkt am Zitrat-Blut durchgeführt, ohne vorher Lymphozyten präparatorisch abzutrennen.
Für die Stimulationsexperimente werden Phytohaemagglutinin (PHA), Protein A und Nervenwachstumsfaktor (NGF) jeweils einzeln oder in unterschiedlichen Kombina­ tionen eingesetzt.
Die Bestimmung des Zelloberflächenmarkers CD69 erfolgt nach Bindung von fluo­ reszenzfarbstoff-markierten Antikörpern mittels FACS (Fluorescence activated cell sorting). Der simultane Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffmarkierten Zell-spezifischen Antikörpern erlaubt die getrennte Identifikation von Leukozyten, B-Lymphozyten, T- Lymphozyten, T-Helferzellen, zytotoxische und T-Suppressor-Zellen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Proliferation von Lympho­ zyten direkt bestimmt. Dies ist durch den Nachweis des Einbaues von radioaktiv- oder nicht-radioaktiv markierten Komponenten bzw. deren Analoga in die Lympho­ zyten DNA sowie durch den Nachweis anderer mit Proliferation einhergehender biologischer Phänomene möglich.
Die Erfindung wird durch folgende eingehende Beschreibung deutlicher.
  • 1. Gewinnung von venösem Blut durch Venenpunktion und Stabilisierung durch Zu­ gabe von Natrium citricum oder anderen geeigneten Stoffen. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden aus diesen Blutproben über einen Ficoll- Gradienten Lymphozyten durch Zentrifugation präparativ abgetrennt.
  • 2. Stimulation der Lymphozyten im Zitrat-Blut oder der präparativ isolierten Lympho­ zyten durch einzelne oder kombinierte Zugabe von Phytohaemagglutinin (PHA), Protein A, und Nervenwachstumsfaktor (NGF) oder andere trophisch oder mito­ gen wirksamer Substanzen.
  • 3. Ermittlung der CD69 Präsentation durch Bestimmung von Antikörperbindung mit­ tels FACS (Fluorescence activated cell sorting) oder durch eine andere geeignete Methode vor sowie nach Stimulation.
  • 4. Simultane Identifikation unterschiedlicher Zelltypen durch Einsatz Zelltyp­ spezifischer Antikörper und Bestimmung deren Bindung mittels FACS (Fluo­ rescence activated cell sorting) oder durch eine andere geeignete Methode.
  • 5. Rechnerische Ermittlung des Verhältnisses (Stimulationsindex) der CD69 Prä­ sentation auf T-Helferzellen vor und nach Stimulation sowie auf B-Lymphozyten vor und nach Stimulation mit PHA.
  • 6. Rechnerische Ermittlung des Verhältnisses der Stimulationsindices von T- Helferzellen und B-Lymphozyten.
  • 7. In weiteren Ausführungsformen der Erfindung werden jeweils die Präsentation von CD69 an anderen Zelltypen zugrunde gelegt und es werden jeweils alternative Rechenoperationen (Division, Substraktion, Addition, Multiplikation) ausgeführt.
  • 8. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Veränderung der intra­ zellulären Signaltransduktion und des zellulären Proliferationsverhaltens durch den Nachweis des Einbaues von radioaktiv- oder nicht-radioaktiv markierten Komponenten bzw. deren Analoga in die Lymphozyten DNA sowie durch den Nachweis anderer mit Proliferation eingehender biologischer Phänomene be­ stimmt.
Legenden zu den Abbildungen Abb. 1
Rechnerische Ermittlung des Verhältnisses (Stimulationsindex) der CD69 Präsentation auf T-Helferzellen vor und nach Stimulation sowie auf B-Lymphozyten vor und nach Stimulation mit PHA
Links: Patient mit Alzheimerscher Erkrankung (AD)
Rechts: klinisch gesunder Kontrollproband
Abb. 2 Diagnostische Sensitivität für die Alzheimersche Erkrankung Ausführungsbeispiel
  • 1. Gewinnung von venösem Blut durch Venenpunktion und Stabilisierung durch Zugabe von Natrium citricum oder Heparin oder anderen geeigneten Stoffen. [In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden aus diesen Blutproben über einen Ficoll-Gradienten Lymphozyten durch Zentrifugation präparativ ab­ getrennt.]
  • 2. Zugabe von Phytohaemagglutinin (PHA), [Protein A, und Nerven­ wachstumsfaktor (NGF) oder anderer trophisch oder mitogen wirksamer Sub­ stanzen.] zu dem Zitrat-Blut oder den präparativ isolierten Lymphozyten. Hier­ durch werden die Lymphozyten stimuliert und gehen in die Proliferation über, deren frühes Kennzeichen die Präsentation von CD69 auf der Zelloberfläche ist. Ein Teil der Blutprobe[oder der präparativ isolierten Lymphozyten] wird vor der Stimulation abgetrennt und dient in den weiteren Messungen als unstimmulierter Bezugswert.
  • 3. Markierung der CD69 Präsentation durch Fluoreszenzfarbstoff-markierte Anti­ körper, die spezifisch CD69 erkennen. Quantifizierung der Intensität der Fluo­ reszenzmarkierung bzw. der Anzahl fluoreszenzmarkierter Zellen z. B. mittels FACS (Fluorescence activated cell sorting).
    Der simultane Einsatz Zelltypspezifischer Antikörper erlaubt gleichzeitig die Identifikation unterschiedlicher Zelltypen und damit die differenzielle Erfassung der CD69-Markierung unterschiedlicher Zelltypen
    Gleichzeitig erfolgt die Quantifizierung der CD69 Präsentation an der unstimmu­ lierten Probe zur Bestimmung des Bezugswertes.
  • 4. Rechnerische Ermittlung des Verhältnisses (Stimulationsindex) der CD69 Prä­ sentation auf T-Helferzellen vor und nach Stimulation sowie auf B-Lymphozyten vor und nach Stimulation mit PHA (siehe Abbildung).
    Da die Meßwerte der klinisch gesunden Kontrollprobanden als auch der Patienten mit Alzheimerscher Erkrankung auf Grund individueller Abweichungen um einen bestimmten Wert streuen, macht sich für die diagnostische Beurteilung der Meßergebnisse die Definition von Grenzwerten notwendig. Die exakte Lage dieser Grenzwerte unterliegt dem wissenschaftlichen Fortschritt. In der unten dargestellten Abbildung ist eine Möglichkeit der Interpretation der Meßwerte dargestellt. Die Stimulationsindices von T- und B-Zellen werden im Koordinatensystem auf unterschiedlichen Achsen aufgetragen. Diese Art der zweidimensionalen Darstellung erhöht die Trennschärfe zwischen dem pathologischen und dem normalen Wertebereich, die in vorliegender Darstellung durch eine Diagonale gekennzeichent ist. Der Hinweis auf das Vorliegen oder Nicht-Vorliegen einer Alzheimerschen Erkrankung ergibt aus dem Bereich, in dem der individuelle Meßwert liegt. Bei den unten dargestellten Meßwerten von 19 Patienten mit Alzheimerscher Erkrankung und 24 klinisch gesunden Normalprobanden ergibt sich für die Alzheimersche Erkrankung eine diagnostische Sensitivität von 89,5% und eine diagnostische Spezifität von 79,2%.

Claims (10)

1. Lymphozytenproliferationstestkit, bestehend aus
  • - koagulationshemmenden Adjuvantien, wie Natriumcitrat oder Heparin oder anderen geeigneten Stoffen
  • - Stimulierungsmitteln wie Phytohaemagglutinin (PHA), Protein A, Nervenwachstums­ faktor (NGF)
  • - ein Antikörper mit CD-69-Spezifität.
2. Verwendung des Testkits nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
  • - venöses Blut durch Zugabe von Natriumcitrat stabilisiert wird,
  • - die Lymphozyten stimuliert werden durch einzelne oder kombinierte Zugabe von Stimulierungsmitteln wie Phytohaemagglutinin (PHA), Protein A, Nervenwachstums­ faktor (NGF) oder andere trophisch oder mitogen wirkende Substanzen,
  • - die CD69-Präsentation auf den Lymphozyten durch Zugabe eines spezifischen Anti­ körpers fixiert und vermessen wird,
  • - wobei dies vor und nach der Stimulation der Lymphozyten erfolgt,
  • - die Antikörperbindung mittels FACS vermessen wird,
  • - der Stimulationsindex als Verhältnis der CD69-Präsentation vor und nach der Sti­ mulation bestimmt wird,
  • - das Verhältnis der Stimulationsindices von T-Helferzellen und B-Lymphozyten er­ rechnet wird.
3. Verwendung des Testkits nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Lymphozyten über einen Ficoll-Gradienten durch Zentrifugieren präpariert wer­ den.
4. Verwendung des Testkits nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass andere Zelltypen als Lymphozyten verwendet werden, zum Beispiel T-Helferzellen, B-Lymphozyten, T-Lymphozyten, zytotoxische und T-Supressor-Zellen.
5. Verwendung des Testkits nach Anspruch 2 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung des Zelloberflächenmarkers CD69 simultan durch Verwendung fluoreszenzfarbstoff-markierter zellspezifischer Antikörper erfolgt.
6. Verwendung des Testkits nach Anspruch 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass monoklonale Antikörper eingesetzt werden.
7. Verwendung des Testkits nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als trophisch wirkende Substanzen Nervenwachstumsfaktor oder andere geeignete Neurotrophine eingesetzt werden.
8. Verwendung des Testkits nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als mitogen wirkende Substanzen Protein A, Phytohaemagglutinin oder andere ge­ eignete Mitogene eingesetzt werden.
9. Verwendung des Testkits nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass andere, in die Lymphozyten DNA eingebaute, leicht nachweisbare Komponenten vor und nach der Stimulation bestimmt werden.
10. Verwendung des Testkits nach Anspruch 1 und 9, dadurch gekennzeichnet, dass die leicht nachweisbare Komponente eine radioaktiv markierte DNA ist.
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