DE19934029A1 - Essentielle Gene und Genprodukte zur Identifizierung, Entwicklung und Optimierung von immunologischen und pharmakologischen Wirkstoffen zur Behandlung mikrobieller Infektionen - Google Patents
Essentielle Gene und Genprodukte zur Identifizierung, Entwicklung und Optimierung von immunologischen und pharmakologischen Wirkstoffen zur Behandlung mikrobieller InfektionenInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bereitstellung von therapeutischen, präventiven oder/und diagnostischen Mitteln gegen mikrobielle Infektion und zur Identifizierung und Charakterisierung essentieller Gene aus Helicobacter pylori. Weiterhin betrifft sie die identifizierten Nukleinsäuren, welche für die essentiellen Genprodukte kodieren, und die davon kodierten Polypeptide.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung und
Charakterisierung essentieller Gene von pathogenen Mikroorganismen, deren
Verwendung zum Auffinden neuer immunologischer und pharmakologischer
Wirkstoffe zur Prophylaxe, Therapie und Diagnose bakterieller Infektionen,
sowie die Weiterentwicklung und Optimierung dieser Wirkstoffe. Von der
Erfindung eingeschlossen sind die entsprechenden Nukleinsäuren, welche
für die essentiellen Genprodukte kodieren, und die davon kodierten
Polypeptide. Außerdem betrifft die Erfindung Vektoren, die die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthalten, mit diesen Vektoren
transformierte Zellen und für die Polypeptide spezifische Antikörper. Diese
Nukleinsäuren und Polypeptide können zur Diagnose, Prävention und
Behandlung von mikrobiellen Infektionen eingesetzt werden, insbesondere
können sie zur Entwicklung von Antikörpern, Impfstoffen und Inhibitoren
verwendet werden.
Die vollständige molekulare Erschließung des Genoms des Menschen und
klinisch relevanter Pathogene öffnet neue Wege in der Entwicklung von
Therapeutika bzw. Prophylaktika gegen die Krankheiten des Menschen. So
ist die Entschlüsselung des menschlichen Genoms für die nächsten Jahren
angekündigt. Die Anzahl molekular vollständig charakterisierter pathogener
Keime nimmt ständig zu. Das erklärte Ziel ist es nun, aus dem
umfangreichen Datenmaterial solche Gene zu identifizieren, deren Produkte
als potentielles Ziel für einen Wirkstoff in Frage kommen und somit für die
Entwicklung eines spezifischen Wirkstoffs benutzt werden können. Dieses
Potential läßt sich aus der Primärstruktur eines Gens nicht ableiten, sondern
muß experimentell bestimmt werden.
Liegt die komplette genomische Sequenz eines Organismus vor, steht man
vor dem Problem, die enorme Datenmenge für weiterführende biologische
Analysen zugänglich zu machen. Der erste Schritt ist die Identifizierung
aller auf dem Genom liegenden Gene. Dies geschieht in der Regel mit Hilfe
computergestützter Suchprogramme, die mit einer gewissen Sicherheit
potentielle Gene vorhersagen können. Auf diese Weise können Genkarten
erstellt werden, die allerdings noch mit einer großen Ungenauigkeit behaftet
sind. Können die vom Suchprogramm ausgewiesenen Gene keinem
bekannten Gen zugeordnet werden, muß die Funktionalität dieser
hypothetischen Gene durch den physikalischen Nachweis der Genprodukte
in der ursprünglichen Zelle nachgewiesen werden.
Eine andere Strategie, die ebenfalls auf der Anwendung spezieller
Suchprogramme beruht, ist auf die Identifizierung möglicher Genfamilien
ausgerichtet, die mit speziellen biologischen Eigenschaften verknüpft sind,
die wiederum aufgrund weiterer Annahmen als Wirkstoffziel in Betracht
kommen. Die Suchkriterien sind auf charakteristische Strukturmerkmale
ausgerichtet, die in der Regel von schon bekannten Genen abgeleitet
wurden. Das Ergebnis einer solchen Suche kann, in Abhängigkeit von der
Annäherung der Vorgaben zum wirklichen Zustand, eine hohe Trefferquote
liefern. In der Regel ist die Ungenauigkeit dieser Verfahren jedoch relativ
hoch, und die wirkliche biologische Eigenschaft des Gens bzw. dessen
Genprodukts muß auf jeden Fall experimentell bestätigt werden.
Eine weitere Strategie erfaßt die Expressionsprodukte einer Zelle, wodurch
die zum jeweiligen Entwicklungszustand aktiven Gene identifiziert werden
können. Vergleicht man verschiedene Entwicklungszustände miteinander,
kann auf diese Weise das Zusammenwirken der Gene abgeleitet werden und
in einigen Fällen kann die biologische Funktion unbekannter Gene teilweise
entschlüsselt werden. Führt man entsprechende Vergleichsuntersuchungen
mit Zellen durch, die ein pathologisches Erscheinungsbild haben, ist es
sogar möglich auch krankheitsverursachende Gene zu identifizieren und
diese als potentielle Wirkstoffziele für die Wirkstoffentwicklung einzusetzen.
Alle beschriebenen Verfahren dienen insbesondere dazu, bislang unbekannte
Gene zu identifizieren und diesen mit Hilfe Computergestützter
Datenvergleiche eine biologische Funktion zuzuordnen. Eine, eindeutige
Bewertung eines Gens bzw. Genprodukts hinsichtlich seines Potentials als
Wirkstoffziel zu dienen und somit für die Entwicklung von Wirkstoffen
herangezogen werden zu können, erfüllt jedoch keines der bekannten
Verfahren.
Einige der wichtigsten Voraussetzungen für einen pathogenen Organismus,
in einem Wirt zu überleben und sich zu vermehren, sind einerseits die
Fähigkeit, dem Immunsystem des Wirts zu entgehen, und andererseits die
Fähigkeit zur Anpassung an einen ganz speziellen Lebensraum oder Nische.
Die dafür verantwortlichen Faktoren und Proteine sind somit in der Regel
essentiell für den pathogenen Keim.
Es wäre von großem Vorteil, diese essentiellen Gene von Mikroorganismen
zu identifizieren, um auf diese Weise die Möglichkeit zur Herstellung von
therapeutischen, präventiven oder/und diagnostischen Mitteln, z. B.
Antikörpern, Impfstoffen oder Inhibitoren der entsprechenden Polypeptide
zu bekommen.
Ein Pathogen von besonderem medizinischen Interesse ist Helicobacter
pylori. Dieser Keim ist ein Gram-negatives, spiralförmiges Bakterium mit
hohem pathogenen Potential, das in den letzten Jahren verstärkt
Resistenzen gegen eine Reihe therapeutisch relevanter Antibiotika
entwickelt hat und somit von großer klinischer Bedeutung ist. Es zeichnet
sich durch extrem hohe Beweglichkeit aufgrund seiner Flagellen und der
ungewöhnlichen Fähigkeit, im stark sauren Milieu (bis pH 1,5) des Magens
überleben zu können, aus (Goodwin et al., 1989).
Obgleich das Auftreten von spiralförmigen Bakterien in der menschlichen
Magenschleimhaut seit langem bekannt ist, weiß man erst seit der
erfolgreichen Isolierung und Kultivierung dieses Bakteriums (Warren and
Marshall 1983; Marshall et al., 1984) aus der Magenschleimhaut eines
Patienten mit einem Magengeschwür (Ulcus ventriculi), daß es sich hierbei
um pathogene Keime handelt. Die H. pylori-Infektion zählt zu den häufigsten
chronischen bakteriellen Infektionen des Menschen. Sie tritt weltweit auf,
wobei ca. 50% der Bevölkerung mit diesem Bakterium infiziert sind.
Eine Infektion führt zwangsläufig zur Auslösung einer bakteriellen Gastritis
(Typ-B Gastritis) beim Menschen. Ferner geht man davon aus, daß H. pylori
auch eine ursächliche Rolle bei der Entstehung von Magen- und
Zwölffingerdarmgeschwüren (Ulcus ventriculi und Ulcus duodeni) sowie bei
einigen Formen des Magenkarzinoms (Adenokarzinom) spielt (Lee et al.,
1993; Solnick und Tompkins, 1993). In zwei Studien von 1991 wurde eine
statistisch signifikante Korrelation zwischen der H. pylori-Infektion und dem
Auftreten des Magenkarzinoms (intestinaler Typ) gezeigt, wobei beide
Studien zu dem Schluß kamen, daß ca. 60% aller auftretenden
Magenkarzinome wahrscheinlich auf eine H. pylori -Infektion zurückzuführen
sind (Parsonnet et al., 1991; Nomura et al., 1991). Auch die seltener
auftretenden MALT (Mucosa Associated Lymphoid Tissue) Lymphome des
Magens, die als Vorstufen von B-Zell-Tumoren des Immunsystems
angesehen werden, sind vermutlich eine Folge der H. pylori-Infektion. Eine
Folge der Langzeitinfektion mit H. pylori ist die atrophische Gastritis, eine
Degeneration der Schleim, Säure oder Pepsin produzierenden Zellen des
Magenepithels, die als eine präkanzeröse Läsion angesehen werden muß.
Nach der oralen Aufnahme gelangen die Bakterien zunächst in das extrem
saure Magenlumen (pH 1 bis 2). Dort wird durch die Produktion des Enzyms
Urease, das zur Spaltung des vorhandenen Harnstoffs und damit zur lokalen
Neutralisierung des sauren pH-Wertes im Magen führt, was das Überleben
der Bakterien ermöglicht. Mittels chemotaktischer Orientierung und
flagellenabhängiger Motilität bewegen sich die Keime dann in die
Bicarbonat-gepufferte Schleimschicht der Antrum-Region des Magens, ihren
eigentlichen natürlichen Habitat. Dort befinden sie sich in einer einzigartigen
ökologischen Nische, die aufgrund der Säurebarriere nur für wenige
konkurrierende Bakterienarten zugänglich ist. Vermutlich orientieren sich die
Bakterien an den pH-Gradienten zwischen Lumen (pH 1-2) und
Epithelzelloberfläche (pH 6-7), um zum Epithel zu gelangen. Durch ihre
spiralige Form, ihre Beweglichkeit im viskosen Schleim, die Produktion von
Mukus-modifizierenden Enzymen und schließlich durch eine mikroaerophile
Lebensweise sind diese Keime optimal an die Lebensbedingungen in diesem
Habitat angepaßt. Sie halten sich meist in den tiefen Krypten der Antrum-
Region auf, wo sie vor äußeren Einflüssen wie z. B. Säure, Pepsin aber auch
vor Medikamenten zu ihrer Eradikation, wie z. B. Antibiotika, geschützt sind.
Ein Teil der Bakterienpopulation (ca. 20%) ist eng mit Epithelzellen
assoziiert, vor allem mit Schleim produzierenden Zellen. Unter der
Voraussetzung einer gastralen Metaplasie, d. h. der säureinduzierten
Ausbildung von gastralem Epithel im Duodenum, kommt es auch zur
Kolonisierung metaplastischer Areale im Zwölffingerdarm, wodurch die
Voraussetzungen zur Entstehung des Zwölffingerdarmgeschwürs (Ulcus
duodeni) geschaffen sind. Durch ihre Fähigkeit zur Adhärenz wird vermutlich
eine komplette Ausscheidung der Hellcobacter mit dem abgestoßenen
Schleim verhindert, so daß die Bakterien für Jahre, Jahrzehnte oder gar
lebenslang persistieren können (chronische Infektion).
Bevor die Existenz und die Bedeutung des H. pylori für die
Ulkuserkrankungen bekannt waren, wurden diese durch sog. Antazida, oder
H2-Rezeptorantagonisten behandelt. Dabei handelt es sich um Substanzen,
welche die Säuresekretion der Magenparietalzelle inhibieren. Unter dem
Einfluß dieser Arzneimittel kommt es zwar zumeist zur Abheilung von
Geschwüren, da jedoch eine der Ursachen dieser Geschwüre, nämlich die
H. pylori-Infektion, damit nicht eliminiert wird, kommt es in den meisten
Fällen nach kurzer Zeit zu einem erneuten Auftreten der Ulzeration (Rezidiv).
Eine weitere, häufig bei Ulzerationen angewandte Therapie ist die Wismut-
Behandlung. Verschiedene Wismut-Salze (CBS, BSS) haben einen
bakteriziden Effekt auf H. pylori. Ein bedeutender Nachteil dieser
Therapieform ist jedoch, daß eine totale Eradikation des Keims nur in einem
sehr geringen Prozentsatz der Fälle erreicht wird (8 bis 32%). Wie bei der
Behandlung mit Antazida kommt es nur zu einer vorübergehenden
Suppression des Keims, und nach Absetzen der Behandlung erfolgt in den
meisten Fällen wieder ein Aufflackern der Infektion. Ein weiterer Nachteil
der Wismut-Behandlung ist, daß eine länger dauernde Therapie mit hohen
Dosen zu einer Akkumulation dieser Substanz in der Leber, Niere und dem
Nervensystem führt und beträchtliche neurologische Nebenwirkungen hat
(Malfertheiner, 1994).
Seit der Erkenntnis, daß es sich bei den gastroduodenalen
Ulkuserkrankungen um Infektionskrankheiten handelt, werden zur
Behandlung nun auch Antibiotika eingesetzt. Die Monotherapie mit
verschiedenen Antibiotika (Amoxicillin, Nitrofuran, Furazolidin, Erythromycin
und dergleichen) stellte sich jedoch als nicht zufriedenstellend heraus, da es
auch hier nur bei 0 bis 15% der Zellen zur kompletten Eradikation der
Keime kommt. Die bisher erfolgreichste Behandlung wird zur Zeit durch eine
Kombination eines Säureblockers (Ompeprazol) mit einem Antibiotikum
(Amoxicillin) erreicht, die zu Eradikationsraten bis zu 80% führen kann
(Malfertheiner, 1994). Auf die Dauer ist eine Antibiotikabehandlung zur
Eliminierung von H. pylori jedoch nicht erfolgversprechend, da aufgrund der
unvollständigen Eradikation des Keims mit einer raschen Resistenz
entwicklung der Bakterien gegen Antibiotika gerechnet werden muß.
Das zunehmende Auftreten von Antibiotika-Resistenzen und die
eingeschränkten Behandlungsoptionen, die in der Regel beträchtliche
unerwünschte Nebenwirkungen haben, macht das Auffinden neuer
Therapieformen und dabei insbesondere die Identifizierung neuer Wirkstoffe
notwendig, vor allem Impfstoffe, die sowohl zur prophylaktischen, als auch
therapeutischen Behandlung von Hellcobacter-Infektionen verwendet
werden können. Von besonderem Interesse ist auch die Darreichungsform,
da der Wirkstoff im Magen, d. h. in einem extrem sauren Milieu wirksam
sein muß. Verbindungen mit Protonenblockern, die z. B. vor der
Verabreichung des prophylaktischen oder therapeutischen Wirkstoffs
gegeben werden, können hierbei von großem Nutzen sein.
Die molekulare Grundlage für persistierende, chronische Hellcobacter-
Infektionen ist bislang noch nicht geklärt. Es konnte gezeigt werden, daß
die Faktoren Urease, Beweglichkeit und Adhärenz essentielle Eigenschaften
des Bakteriums sind, die gastrische Mukosa kolonisieren zu können.
Obgleich der Wirtsorganismus unter normalen Bedingungen nicht in der Lage
ist, mit einer H. pylori-Infektion fertig zu werden, zeigte sich im Tiermodell,
daß die Urease, ein essentieller Virulenzfaktor von H. pylori, ein hohes
Potential als Vakzin besitzt (US-Patentanmeldung US-SN-07/970,006
"Urease-based Vaccine Against Helicobacter Infection").
Diejenigen Komponenten jedoch, die dafür verantwortlich sind, daß das
Pathogen das Immunsystem des Wirtes umgehen kann, sind bisher noch
unbekannt.
Pathogene Organismen im Allgemeinen haben eine Vielzahl von Strategien
entwickelt, im Wirt über einen langen Zeitraum vom Immunsystem
unbehelligt persistieren zu können (Haas und Göbel, 1992; Finlay und
Falkow, 1997). Ein Mechanismus, der zum Überleben in lebensfeindlichem
Milieu dient, ist die Ausbildung einer Überdauerungsform.
Im Falle von H. pylori sind in der Literatur kokkoide Formen als potentielle
Überdauerungsformen mehrfach beschrieben, ihre klinische Bedeutung ist
allerdings umstritten. Kokkoide Formen könnten für eine ex vivo
Überdauerung eine große Rolle spielen. Hinsichtlich der in vivo
Überdauerung wurde gezeigt, daß kokkoide Formen bevorzugt durch ein
ungünstiges Milieu wie z. B. einen hohen O2-Partialdruck oder subletale
Gaben von Antibiotika (Wismut-Subcitrat, Erythromycin, Amoxicillin,
Metronidazol) induziert werden (Donelli et al., 1998; Bode et al., 1993;
Sorberg et al., 1996; Berry et al., 1995).
Einige Forscher gehen davon aus, daß diese kokkoiden Bakterien
lebensfähig, aber nicht kultivierbar sind (VNC, viable but non-culturable).
Eaton und Mitarbeiter erhielten eine erfolgreiche Infektion von Mini-
Schweinchen mit vegetativen (spiraligen) H. pylori, während kokkoide
Formen in diesem Modell keine Infektion zeigten (Eaton et al., 1995). Der
direkte Nachweis von kokkoiden Formen im menschlichen Magen wurde von
Chan et al. anhand von Magengewebeschnitten aus Biopsiematerial
erbracht. In 82.8% (53/64)der untersuchten Biopsieproben konnten die
Autoren kokkoide Formen von H. pylori nachweisen (Chan et al, 1994).
Von Cao et al. wurde ein monoklonaler Antikörper zum spezifischen
Nachweis von kokkoiden H. pylori im Gewebeschnitt benutzt. Auch hier
wurden neben den vegetativen Formen in 100% der Antrumbiopsien (9/9)
H. pylori kokkoide Formen nachgewiesen (Cao et al., 1997).
Die Bindung an Epithelzellen und die Fähigkeit zur Signaltransduktion (IL-8-
Induktion, Rearrangement des Zytoskeletts, Bindung von Plasminogen,
Laktoferrin und Vitronectin auf der Bakterienoberfläche) scheint bei
kokkoiden Formen vergleichbar zu den vegetativen Formen erhalten zu sein
(Khin et al. 1996; Segal et al., 1996).
Die oben genannten Experimente deuten auf eine Bedeutung kokkoider
Formen für die Überlebensfähigkeit von Helicobacter in ungünstigem Milieu
hin. Daher ist die Identifizierung von Genen, die mit der Entstehung dieser
Form und Reaktivierung in die vitale Form zusammenhängen, für die
Entwicklung neuer Wirkstoffe von größtem Interesse.
Neben Helicobacter pylori können auch andere Helicobacter Spezies den
Magen des Menschen kolonisieren wie z. B. H. heilmannii und H. felis.
Diesbezüglich konnte gezeigt werden, daß auch H. heilmannii mit
krankhaften Ulkuserkrankungen in Zusammenhang gebracht werden kann.
Die ursächliche Übertragung findet wahrscheinlich von Haustieren auf den
Menschen statt. Bislang wurde der im Menschen häufig vorkommende
H. pylori in den Verdacht gebracht, bei der Entstehung von Magenkrebs eine
Rolle zu spielen. Mittlerweile gibt es klinische Daten, die diesen
Zusammenhang anzweifeln. Besonders werden diese Zweifel durch neuere
Daten von Helicobacter heilmannii unterstützt, die diesem ein größeres
kanzerogenes Potential beimessen und dessen Bedeutung bei der
Entstehung des gastrischen MALT Lymphoms hervorherben (Regimbeau et
al., 1988).
Wird das bisher Gesagte zusammenfassend betrachtet, ist es klar, daß ein
Bedürfnis nach neuen Therapieformen für die Bekämpfung bakterieller
Krankheitserreger, insbesondere nach Impfstoffen und Inhibitoren von
essentiellen Genen bzw. deren Expressionsprodukten besteht. Die
zunehmende Resistenzentwickung gegen eine Vielzahl bewährter
Medikamente erfordert eine kontinuierliche Versorgung mit neuen
Wirkstoffen. Dieser steigende Bedarf an neuen Wirkstoffen kann nur
gedeckt werden, wenn neue Wirkstoffziele identifiziert und diese zur
Entwicklung neuer Wirkstoffe herangezogen werden. Essentielle Gene
stellen für die Wirkstoffentwicklung ein ideales Ziel dar, da sie für das
Überleben des Krankheitserregers notwendig sind.
Die Identifizierung essentieller Gene von Hellcobacter, insbesondere von
H. pylori bzw. heilmannii und von möglichen Helicobacter
Überdauerungsformen zur Entwicklung und Optimierung neuer
therapeutischer, präventiver und/oder diagnostischer Mittel, wie z. B.
Impfstoffe und pharmakologischer Wirkstoffe stellt daher ein Ziel der
Erfindung dar. Im Vordergrund steht das Auffinden essentieller mikrobieller
Gene, wobei auch homologe Proteine verschiedener pathogener Keime
identifiziert werden können. Mit Hilfe eines Wirkstoffs könnten dann wie bei
den klassischen Antibiotika mehrere pathogene Keime gleichzeitig eliminiert
werden. Bei Helicobacter stehen insbesondere Gene im Vordergrund, die
lebensnotwendige Funktionen im Infektionsprozeß erfüllen, sowie Gene, die
an der Entwicklung und Reaktivierung von kokkoiden Formen beteiligt sind.
Von besonderem Interesse sind hierbei essentielle Gene, die für sekretierte
Genprodukte kodieren, da diese für immunologische und pharmakologische
Wirkstoffe aufgrund ihrer exponierten Lokalisation besonders gut erreicht
werden können und daher gute Kandidaten zur Wirkstoffentwicklung sind.
Weiterhin von Interesse sind essentielle Gene, die für Genprodukte kodieren,
die an der Entwicklung und der Aufrechterhaltung von
Überdauerungsformen beteiligt sind. Eine weitere Aufgabe ist das Auffinden
essentieller mikrobieller Gene, wobei auch homologe Proteine verschiedener
pathogener Keime identifiziert werden können. Mit Hilfe eines Wirkstoffs
könnten dann wie bei den klassischen Antibiotika mehrere pathogene Keime
gleichzeitig eliminiert werden.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Bereitstellung von
Mitteln zum Nachweis, zur Therapie oder/und zur Prävention von
mikrobiellen Infektionen, das die folgenden Schritte umfaßt:
- A) Identifizieren von essentiellen Genen und den entsprechenden Polypeptiden durch Herstellung gendefizienter Mikroorganismen durch konditionale Antisense-Hemmung (CAI) oder/und subtraktive Rekombinations-Mutagenese (SRM) und Bestimmung der Lebens- und Überlebensfähigkeit der gendefizienten Mikroorganismen in einem Testsystem.
- B) Identifizieren von spezifischen Wirkstoffen, welche gegen die essentiellen Polypeptide gerichtet sind und die Inaktiviertung der Mikroorganismen oder verwendeter Mikroorganismen herbeiführen.
- C) Testen der identifizierten Wirkstoffe auf ihre Anwendbarkeit als Bestandteile von diagnostischen, präventiven oder/und therapeutischen Mitteln,
- D) Formulieren der anwendbaren Wirkstoffe als diagnostische, präventive oder/und therapeutische Mittel.
Das hier dargestellte Verfahren befaßt sich mit der Identifizierung
essentieller Gene und deren Verwendung zur Entwicklung neuer Wirkstoffe.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist somit auch ein Verfahren
zum identifizieren von essentiellen mikrobiellen Genen, das die folgenden
Schritte umfaßt:
- a) Herstellen von gendefizienten Mikroorganismen,
- b) Bestimmen der Lebens- oder/und Überlebensfähigkeit der gendefizienten Mikroorganismen aus (i),
- c) Identifizieren eines proteinkodierenden Abschnitts einer mikrobiellen DNA-Sequenz, in der die gendefizienten Mikroorganismen defiziert sind und
- d) Charakterisieren derjenigen DNA-Abschnitte, die essentiell für die Überlebensfähigkeit sind.
CAI ist die Abkürzung für "conditional antisense inhibition", d. h.
konditionale Antisensehemmung. Es handelt sich hierbei um ein Verfahren,
welches weiter unten näher beschrieben ist.
SRM steht für "subtractive recombination mutagenesis", d. h. subtraktive
Rekombinationsmutagenese und ist ebenfalls unten beschrieben.
Der Ausdruck "gendefizient", wie er hier verwendet wird, bedeutet, daß der
defiziente Organismus nicht in der Lage ist, ein oder mehrere seiner
Genprodukte herzustellen oder deren Funktion zu nutzen. Die Herstellung
des entsprechenden Genprodukts kann einerseits durch Mutagenese des
entsprechenden Gens verhindert werden, oder es kann eine Inhibition
während der Expression stattfinden, z. B. durch Antisensenukleinsäuren.
Eine Mutagenese kann dazu eingesetzt werden, ein Gen in dem Genom des
Mikroorganismus zu mutieren, oder dazu, ein mutiertes Gen in den
Mikroorganismus einzubringen, wobei man sich auch die homologe
Rekombination zunutze machen kann.
Ein proteinkodierender Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz ist beispielweise
ein Gen oder ein Teil eines Gens das/der die Expression eines Polypeptids
erlaubt.
Der Begriff "essentielles Gen" bedeutet ein Gen, das für ein Genprodukt
kodiert, ohne welches ein Organismus nicht überlebensfähig ist oder nur
beschränkt überlebensfähig ist. Essentielle Gene können in zwei Klassen
unterteilt werden: obligat essentielle und fakultativ essentielle Gene. Ein
obligat essentielles Gen kodiert für ein Protein, das für das Überleben oder
die Vermehrung eines Organismus unter allen Umständen unabdingbar ist.
Demgegenüber kodiert ein fakultativ essentielles Gen für ein Protein, das
lediglich unter bestimmten Bedingungen für das Überleben oder die
Vermehrung des Organismus notwendig ist, wie z. B. die Fähigkeit des
Organismus, innerhalb von kultivierten Säugerzellen oder im Tier zu
überleben. In beiden Fällen wird das Überleben oder die Vermehrung des
Organismus durch die Inaktivierung eines für ihn essentiellen Gens bzw. die
Inhibierung eines für ihn essentiellen Genproduktes stark beeinträchtigt bzw.
verhindert. Ist ein Bakterium nach der Inaktivierung eines bestimmten Gens
nicht mehr überlebensfähig bzw. in der Vermehrung eingeschränkt, kann
dies als erster Hinweis dafür gewertet werden, daß durch dieses Gen
essentielle Eigenschaften vermittelt werden. Die Aussagekraft solcher
Befunde muß jedoch durch begleitende Kontrollexperimente untermauert
werden, z. B. sollte eine solche letale Mutation in einem zweiten Schritt
durch eine entsprechende Komplementation des Gens bzw. Genprodukts
aufgehoben werden können. Obligat essentielle Gene sind demnach solche,
deren Nichtexpression oder Nichtvorhandensein, z. B. durch Mutagenese
oder Deletion dazu führt, daß der Organismus weder in natürlicher
Umgebung, noch auf einem ideal auf die Bedürfnisse des Mikroorganismus
abgestimmten Vollmedium lebensfähig ist. Ist ein Mikroorganismus in einem
fakultativ essentiellen Gen defizient, ist er in der Regel auf einem solchen
je nach Organismus definierten Vollmedium noch wachstumsfähig, kann
jedoch in natürlicher Umgebung, d. h. in seinem natürlichen Wirt oder Zellen
oder Gewebekulturen seines natürlichen Wirtes nicht mehr überleben.
Durch das neue Verfahren können unabhängig von ihrer speziellen Funktion
essentielle Gene von Mikroorganismen identifiziert werden. Bevorzugt wird
dieses Verfahren zur Identifizierung von essentiellen Genen aus Helicobacter
und verwandten Mikroorganismen eingesetzt.
In einem ersten Teilschritt wird das komplette Genom eines bakteriellen
Krankheitserregers mit einem molekulargenetischen Ansatz nach essentiellen
Genen durchsucht. Dieser Teilschritt erfordert keinerlei Kenntnisse über die
Primärstruktur des Genoms bzw. individueller Gene, sondern erfolgt
ausschließlich aufgrund biologischer Kriterien. Ist ein Gen als essentielle
Determinante identifiziert, wird dessen Identität ermittelt. Hierbei kann auf
die ermittelten Rohsequenzdaten der genomischen Sequenzierungen
zurückgegriffen werden. Anhand der ermittelten Gensequenz können z. B.
isogene Varianten ermittelt werden bzw. ob sich das ermittelte Gen in einem
Operon befindet, in dem sich möglicherweise weitere essentielle Gene
befinden.
In einem zweiten Teilschritt werden die identifizierten Gene in spezielle
genetische Systeme überführt, die dazu dienen die Gene bzw. deren
Genprodukte einem direkten Wirkstoff-Screening zuzuführen und/oder die
Gene bzw. Genprodukte dazu verwendet, bereits identifizierte Wirkstoffe
weiter zu optimieren. Der wesentliche Vorteil des Gesamtverfahrens beruht
auf der rasch aufeinanderfolgenden Ausführung des Gen- und Wirkstoff-
Screenings in aussagekräftigen biologischen Systemen, so daß in relativ
kurzer Zeit aus dem kompletten Gensatz eines pathogenen Mikroorganismus
die potentiellen Wirkstoffziele identifiziert, produziert und diese direkt zum
Wirkstoff-Screening bzw. Optimierung eingesetzt werden können.
Falls ein Mirkoorganismus untersucht wird, dessen Genom bereits
sequenziert ist, kann die Identifizierung eines Gens oder Genabschnitts mit
Hilfe von Datenbankanalysen erfolgen, wobei einem Sequenzabschnitt ein
Leserahmen zugeordnet wird. Bevorzugt kann jedoch unabhängig vom
Vorhandensein einer vollständigen Genomerzeugung eine beliebige Genbank
einer Vorselektion unterzogen werden. Dabei kann bevorzugt die
Vorselektion auf Gene durchgeführt werden, die für Polypeptide mit einer
bestimmten Funktion kodieren, zum Beispiel mit Hilfe von
Homologieanalysen. Die Vorselektion kann auch auf Gene durchgeführt
werden, die nur in bestimmten Entwicklungsstufen exprimiert werden.
Im Rahmen des ersten Teilschritts kann durch Selektionsschritte eine starke
Reduktion des zu untersuchenden Genmaterials erzielt werden. Z. B. durch
einen Anreicherungsschritt für Gene, die für exportierte oder sekretierte
Genprodukte kodieren. In diesem speziellen Verfahren werden die DNA-
Abschnitte einer Genbank von einem Pathogen mutagenisiert, was
beispielsweise durch Klonieren eines solchen DNA-Abschnitts in ein
Plasmid, Transformation in einen bevorzugt heterologen Wirtsorganismus
und anschließende Mutagenese erfolgen kann. Das daraus entstandene
Expressionsprodukt kann dann nachgewiesen werden. Die Mutagenese kann
beispielsweise durch Insertion einer Markersequenz erfolgen, welche bei
Expression der mutagenisierten Sequenz in einem Wirtsorganismus zu einem
Fusionspolypeptid führt, auf das selektiert werden kann. Die Insertion der
Markersequenz ist nicht auf Transposoninsertion beschränkt, sondern kann
auch auf andere Art und Weise erfolgen, beispielsweise durch homologe
Rekombination oder Infektion und Rekombination mit Hilfe von
Bakteriophagen.
Die verwendete Markersequenz im Sinne der vorliegenden Erfindung ist im
allgemeinen ein Gen, das für ein Genprodukt kodiert, das eine Selektion auf
diejenigen Wirtsorganismen erlaubt, welche diese Sequenz exprimieren. Im
allgemeinen handelt es sich bei diesen Markersequenzen um Resistenzgene,
die Resistenz gegen bestimmte Antibiotika verleihen, oder welche es dem
Wirtsorganismus erlauben, in einem Selektionsmedium zu überleben. Der
Genmarker besitzt bevorzugt keine eigenen Expressionssignale, sondern ist
direkt abhängig von einem vorgeschalteten Promoter, wie z. B. dem
Transkriptionspromotor auf dem Promotersegment oder ein Promoter, der
auf dem klonierten heterologen zu identifizierenden DNA-Fragment liegt.
Alternativ zu Antibiotikaresistenz-Markersequenzen können auch Enzyme als
Genmarker eingesetzt werden. In diesen Fällen wird die erfolgreiche
Insertion durch eine bestimmte Farbreaktion angezeigt, welche die manuelle
Isolierung des entsprechenden Bakterienklons erlaubt.
Wenn die Markersequenz als Fusionsprotein mit dem Expressionsprodukt
des inserierten DNA-Fragments exprimiert wird und eine Selektion wie oben
beschrieben durchgeführt wird, kann DNA-Material aus den selektierten
Bakterienklonen isoliert werden und die DNA-Sequenz, die für das
Fusionsprodukt kodiert, nach bekannten Verfahren bestimmt werden. Dies
erlaubt die Zuweisung eines Leserahmens zu dem zu identifizierenden DNA-
Fragment. Es ist dann möglich, Vergleichsstudien mit allgemein verfügbaren
DNA-Sequenzdatenbanken durchzuführen, um die Identität des
identifizierten Gens abzuklären und gegebenenfalls Hinweise auf eine
biologische Funktion zu erlangen.
Durch technische und weitere Ergänzungen der beiden unten dargestellten
Verfahren, CAI und SRM, kann eine zielgerichtete Reduktion des
Probenvolumens erreicht werden. Dabei handelt es sich ebenfalls um
vorgeschaltete Selektionsverfahren, die auf bestimmte Gengruppen abzielen,
z. B. der Einsatz subtraktiver Genbanken von pathogenen und apathogener
Vertretern. Hierbei werden pathogenitätsvermittelnde Genbereiche
angereichert. Derartige Subtraktionsverfahren können auch angewendet
werden, um für bestimmte Organismen spezifische Gene zu identifizieren,
beispielsweise durch einen Vergleich und Subtraktion der Genomen von
H. pylori und H. heilmannii.
In weiteren Verfahren können z. B. Gengruppen identifiziert werden, die nur
in einem bestimmten Entwicklungsschritt exprimiert werden.
Hervorzuheben ist beispielsweise das Array-Verfahren, bei dem die
einzelnen Genproben des Pathogens rasterförmig auf einen Träger
aufgebracht werden. Die einzelnen Auftragspunkte sind bekannt, so daß
bei einer positiven Hybridisierungsreaktion mit den entwicklungsspezifischen
Transkriptionsprodukten oder cDNAs oder subtraktiven cDNAs oder
Fragmente davon, die jeweiligen Gene identifiziert und anschließend kloniert
werden können. Andere Verfahren, die entwicklungsspezifische Gengruppen
erfassen, sind vergleichende Proteom- und Differential-Display-Analysen.
Um herauszufinden, ob es sich bei den identifizierten Gensequenzen um
essentielle Gene handelt, werden Mikroorganismen hergestellt, welche in
den Sequenzen defizient sind, welche den identifizierten Gensequenzen
entsprechen. Die defizienten Mikroorganismen werden dann auf
verschiedenen Wachstumsmedien bzw. Zellkulturen oder im Tiermodell oder
im natürlichen Wirt getestet, und die defizienten Gene können dann je nach
Wachstumsfähigkeit einer Kategorie der nicht essentiellen, obligat
essentiellen oder fakultativ essentiellen Gene zugeordnet werden.
Auf die Bedeutung von Genen, welche die Entwicklung aus der vitalen in die
Überdauerungsform und umgekehrt steuern, ist bereits eingangs
hingewiesen worden. Es ist daher besonders bevorzugt, eine Vorselektion
auf solche Gene durchzuführen. Im Weiteren können Verfahren wie etwa
CAI oder SRM angewendet werden und die gendefizienten Mikroorganismen
dann auf bestimmten Nährmedien untersucht werden, welche den Übergang
von der einen in die andere Form auslösen. Bei Helicobacter ist insbesondere
das Schivo-Medium bevorzugt, welches die Reaktivierung der kokkoiden
Form in die vitale spiralige Form ermöglicht.
Die Erzeugung von defizienten Mikroorganismen kann auf mehrere Arten
erfolgen.
Es stehen eine Reihe von molekulargenetischen Verfahren zur Verfügung,
das Genom eines bakteriellen Pathogens so zu mutagenisieren, daß von
jedem Gen eine Mutante zur Verfügung steht. Die gängigste
Mutagenesemethode beruht auf der Inaktivierung von Genen, z. B. durch
zufällig im Genom inserierende Transposons, die über entsprechende Marker
selektioniert werden. Für dieses Verfahren bestehen zahlreiche Variationen,
die auf verschiedene Organismen angewendet werden können. (Joyce und
Grindley, 1984; Akerley, et al., 1998). Mit Hilfe der inserierten
Transposons läßt sich auch das mutagenisierte Gen im Genom genau
lokalisieren.
Hat man eine Genmutante mit einem nachweisbaren biologischen Effekt
erzeugt, z. B. ein vermindertes Wachstum der Zellen in einem bestimmten
Milieu, so muß in einem zweiten Schritt die eindeutige Kopplung des Gens
bzw. des Genprodukts mit dieser Eigenschaft nachgewiesen werden. Dies
geschieht in der Regel durch Komplementationsexperimente. In diesem Fall
wird in den Organismus mit der spezifischen Genmutante das ursprüngliche
Gen eingebracht und exprimiert. Kann über diesen Weg die ursprüngliche
Eigenschaft des Organismus regeneriert werden, ist der notwendige Beweis
erbracht. Allerdings läßt sich dieses Verfahren nicht bei der
Charakterisierung von Letalmutanten anwenden, d. h. bei Mutanten obligat
essentieller Gene. Einen Ausweg bietet die Verwendung konditionaler
Mutationen zur Komplementation. Z. B. lassen sich durch chemische
Mutagenese des untersuchten Gens temperatursensitive Mutanten
erzeugen, die das Genprodukt bei der normalerweise optimalen
Wachstumstemperatur in eine inaktive Zustandsform bringen und bei
niedrigeren Temperaturen ein biologisch aktives Genprodukt hervorbringen
(Das, et al., 1976; Harris, et al., 1992; Hou, et al. 1994; Polissi and
Georgopoulos, 1996). In einem anderen praktizierten Ansatz werden die
wildtypischen Komplementationen durch exogene Substanzen, sogen.
Induktoren, gesteuert. Über diese Induktoren wird die Expression des
komplementierenden Gens eingeschaltet, das auf einem Episom in die
genspezifische Mutante eingebracht wird und nach Induktion das fehlende
Genprodukt ersetzt (Murphy, etal., 1995-. Chow and Berg, 1988; Arigoni,
et al., 1998).
Die genannten Verfahren sind sehr zeitaufwendig und werden nur für die
Untersuchung individueller Gene oder begrenzter genomischer Abschnitte
eingesetzt. Verfahren, die eine durchgängige Charakterisierung einer
vollständigen, mutagenisierten Genbank eines ausgewählten Pathogens
nach dem beschriebenen Schema ermöglichen, sind bislang nicht bekannt.
Die nachfolgend beschriebenen neuen genetischen Verfahren, die
Konditionale Antisense-Hemmung (CAI) und die Subtraktive
Rekombinationsmutagenese (SRM) erfüllen diese Anforderungen. Beide
Verfahren können zur Identifizierung essentieller Gene eingesetzt werden,
wobei sich das CAI-Verfahren besonders für die Identifizierung obligat
essentiellen Gene eignet und das SRM-Verfahren für fakultativ essentielle
Gene.
Das CAI-Verfahren beruht auf der konditionalen Hemmung der Translation
von einem oder mehreren Genen, die auf einem klonierten Genomfragment
(welches dann als Matrize oder Template dient) liegen und über ein Plasmid
im zu untersuchenden Keim propagiert werden. Im Vergleich zu
konventionellen Verfahren bleibt die genomische Struktur des zu
untersuchenden Keims unverändert, d. h. im Originalzustand. Im zu
untersuchenden Keim wird die Hemmung der Translation durch die
konditional induzierbare Synthese spezifischer Antisense-RNA (asRNA)
ausgelöst, die das komplette klonierte Genomfragment umfaßt, inklusive der
auf dem Genomfragment lokalisierten Gene. Die Antisense-
Nukleinsäuresequenzen können dann im Mikroorganismus in großen Mengen
synthetisiert werden und binden an die ursprüngliche mRNA, wobei diese
mRNA nicht mehr translatiert werden kann und somit dem
Expressionsapparat entzogen wird. Die Folge ist, daß entweder kein
Genprodukt oder nur geringe Mengen davon gebildet werden. Die Synthese
der asRNA unterliegt der Kontrolle durch einen Promoter (asPromoter),
dessen Aktivität konditional, durch definierte, externe Signale gesteuert
wird. Diese konditionale Inhibition der Expression eines Gens oder Operons
erfolgt somit über die Regulation der Synthese der asRNA durch den
induzierbaren asPromoter. Zum Nachweis, daß ein Gen bzw. Operon, wie
im vorliegenden Fall, für das Überleben und die Vermehrung des Organismus
unter bestimmten Bedingungen essentiell ist, wird die Überlebens- und
Vermehrungsrate eines Klons, in dem die Synthese der asRNA induziert ist,
mit seiner Überlebens-/Vermehrungsrate bei nicht induzierter asRNA
Synthese verglichen. Ist die Überlebens-/Vermehrungsrate des Klons bei
Induktion der asRNA Synthese vermindert, so handelt es sich bei dem
inhibierten Gen bzw. Operon um ein (obligat oder fakultativ) essentielles
Gen. Diese Wachstumsanalysen können automatisiert durchgeführt werden,
so daß eine sehr große Anzahl von Genen innerhalb kurzer Zeit untersucht
werden können. Aus diesen Klonen wird das Plasmid isoliert und die DNA-
Sequenz des klonierten Genomfragments, das als Template für die asRNA
Synthese dient, bestimmt und in Folge die Struktur des essentiellen Gens
ermittelt.
Ein für das CAI-Verfahren geeigneter Plasmidvektor ist in Abb. 1
dargestellt. Er enthält ein genomisches oder subgenomisches DNA-Fragment
aus dem zu untersuchenden Mikroorganismus unter der Kontrolle eines
induzierbaren Promoters (Pi) und weiteren üblichen Expressionssignalen
sowie ein mRNA-stabilisierendes Element, so daß das DNA-Fragment in
Form von Antisense RNA (asRNA) exprimiert werden kann und eine lange
biologische Aktivität hat. Ein geeigneter Promoter ist z. B. der Tet-Promoter.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kodiert der CAI-Vektor
zusätzlich ein Gen für ein regulatorisches Protein, welches den Promoter
reguliert, in diesem Fall, z. B. den Tet-Repressor, welcher durch ein exogenes
oder extrazelluläres Signal, wie z. B. Tetrazyklin, gesteuert werden kann. Der
CAI-Vektor der besonderen Ausführungsform von Abb. 1 enthält
weiterhin ein oder mehrere selektionierbare Markergene sowie zwei
Replikationsursprünge (ori), einen für den zu untersuchenden
Mikroorganismus (hier als Pathogen bezeichnet) und einen weiteren für
einen üblichen Klonierwirt z. B. E. coli. Mit Hilfe solcher CAI-Vektoren können
aus ganzen mikrobiellen Genomen Antisense-Bibliotheken erstellt werden.
Abb. 2 zeigt eine schematische Darstellung eines bevorzugten CAI-
Verfahrens. Von einem CAI-Plasmid, das kleine Fragmente einer
genomischen Bank des zu untersuchenden Mikrooganismus enthält, wird
asRNA von einem induzierbaren Promoter (Pi) aus, unter Kontrolle eines
extrazellulären Signals synthetisiert (siehe Abb. 1). Die asRNA hybridisiert
sequenzspezifisch mit der mRNA desjenigen Gens, das dem klonierten DNA
Fragment auf dem CAI Plasmid entspricht. Durch die Bildung des asRNA-
mRNA Hybrids wird die Translation dieser mRNA reduziert oder verhindert.
In Folge entsteht ein defizienter Mikroorganismus, der nicht in der Lage ist,
daß betreffende Genprodukt zu bilden. Handelt es sich um das Produkt
eines essentiellen Gens, dessen Bildung inhibiert wird (A), ist die
Lebensfähigkeit des entsprechenden Klons eingeschränkt oder verhindert.
Die Lebensfähigkeit des Mikroorganismus wird im folgenden anhand seiner
Lebens- oder Überlebens- oder Vermehrungsrate in einem definierten
biologischen System bestimmt. Bei nicht erfolgender Induktion der asRNA
Synthese (B), oder wenn das CAI-Plasmid das Fragment eines nicht-
essentiellen Gens enthält (C), ist der Klon des Mikroorganismus normal
lebens- und vermehrungsfähig.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen des CAI-Verfahrens werden
ganze Antisense-RNA-Plasmidbanken aus genomischen Fragmenten des zu
untersuchenden Mikroorganismus analysiert (siehe Abb. 3). Eine
genomische Bank mit CAI-Plasmiden (siehe Abb. 1) wird in den zu
untersuchenden homologen Mikroorganismus unter nicht-induzierenden
Bedingungen übertragen und die plasmidtragenden Klone über einen
plasmidkodierten Marker selektioniert. Die Lebensfähigkeit der einzelnen
Klone, die jeweils ein bestimmtes CAI Plasmid aus der Genbank erhalten,
wird anschließend anhand ihrer Vermehrungsrate unter induzierten bzw.
nicht induzierten Bedingungen (+ und - in der Abbildung), bezogen auf die
asRNA Synthese, im direkten Vergleich untersucht. In Klonen, die sich unter
asRNA induzierenden Bedingungen kaum oder nur langsam vermehren, wird
die Translation von mindestens einem essentiellen Gen verhindert. Aus
diesen Klonen werden die CAI-Plasmide isoliert. Die essentiellen Gene
werden durch Sequenzierung der genomischen Fragmente in den isolierten
CAI-Plasmiden identifiziert.
Dieser Ansatz läßt sich auch bevorzugt mit einem subtraktiven Verfahren
kombinieren (SCAI), von dem eine Ausführungsform zur Veranschaulichung
in Abb. 4 dargestellt ist. Eine genomische Bank mit CAI-Plasmiden (siehe
Abb. 1 und 3) wird in den zu untersuchenden, homologen Mikroorganismus
übertragen und die entstehenden individuellen Klone werden als bakterielle
CAI-Bank in einem Pool zusammengefaßt. Dieser Pool wird zur Selektion in
zwei identische Gruppen (den Driver- und den Tester-Pool) aufgespalten.
Der Ausdruck "Driver" wird hierbei für denjenigen Pool von bakteriellen
Klonen verwendet, der so behandelt wird, daß der induzierbare Promoter
aktiviert wird und asRNA vom CAI-Vektor exprimiert. Der "Tester"-Pool
enthält einen identischen Satz Klone mit CAI-Plasmiden, der jedoch unter
nicht-induzierenden Bedingungen gehalten wird und somit Wildtyp-
Eigenschaften besitzt.
In der Regel wird der "Driver"-Pool zur Selektion (z. B. im Tier) eingesetzt,
während der "Tester"-Pool unbehandelt aufbewahrt wird. Es können aber
auch beide Gruppen einer Selektion unterzugen werden, wobei lediglich der
"Driver"-Pool durch Gabe des Signals (z. B. Tetrazyklin) induziert wird.
Klone, in denen durch die Expression einer bestimmten asRNA die
Translation eines essentiellen Gens gehemmt wird, gehen während der
Selektion aus der Gruppe verloren. Nach angemessener Zeit werden die
überlebenden Klone beider Gruppen wiedergewonnen und die CAI-Plasmide
aus den Klonen beider Gruppen isoliert. Die klonierten genomischen
Fragmente werden anschließend über PCR amplifiziert, wobei Oligonukleotid
Primer verwendet werden, die mit Vektorsequenzen seitlich der klonierten
genomischen Fragmente hybridisieren. Diejenigen amplifizierten DNA
Fragmente, die Teile von essentiellen Genen darstellten, werden durch
subtraktive Hybridisierung (siehe Abb. 8) angereichert und isoliert.
Ein erfindungsgemäß für einen CAI-Vektor geeigneter Promoter ist
beispielsweise der Tet-Promoter, dessen Aktivität über ein regulatorischen
Proten (in diesem Fall den Tet-Repressor) gesteuert werden kann und durch
ein extrazelluläres Signal (Tetracyclin) induziert werden kann. Weitere
induzierbare Promoteren sind im Stand der Technik bekannt.
Antisense-RNA stabilisierende Elemente sind dem Fachmann auf diesem
Gebiet bekannt und brauchen hier nicht näher erläutert zu werden.
Der hohe Wirkungsgrad des CAI Verfahrens bei der Inaktivierung von
Einzelgenen in einem Organismus ergibt sich aus der überlappenden
Klonierung kleiner genomischer Fragmente und der damit einhergehenden
Synthese unterschiedlicher asRNA Abkömmlinge für einen bestimmten
Genbereich. Auf diese Art wird die Wahrscheinlichkeit, eine asRNA zu
erhalten, welche die Translation des gesuchten Zielgens effizient inhibiert,
stark erhöht. Derartige Untersuchungen können auf das komplette Genom
eines Pathogens ausgerichtet werden, was die Überprüfung einer sehr
großen Anzahl individueller genomischer Fragmente erforderlich macht. Hier
sind apparative Hilfsmittel (Roboter) von Vorteil, um einen hohen
Probendurchsatz zu erzielen. Allerdings können in diesen Fällen nur
bestimmte Zustände untersucht werden, z. B. das Wachstum der Zellen in
einem bestimmten Medium.
Durch den zusätzlichen Einsatz substraktiver Verfahrensschritte (Subtractive
Conditional Antisense Inhibition, SCAI), kann die Anzahl der zu
untersuchenden individuellen Klone bevorzugt stark reduziert werden.
Die Subtraktive Rekombinationsmutagenese (SRM) wird bevorzugt zur
Identifizierung fakultativ essentieller Gene herangezogen. Im Unterschied
zum CAI-Verfahren werden dauerhafte Genmutationen erzeugt, wobei die
Anreicherung essentieller Gene über einen substraktiven Schritt erreicht
wird. Die SRM Methode kann wie das CAI Verfahren mit Genbanken von
pathogenen Mikroorganismen durchgeführt werden.
Das SRM Verfahren beruht auf der Inaktivierung einzelner Gene im Genom
eines Pathogens durch vollständige Insertion eines bestimmten
Suizidplasmids, wobei dieses ein Teil einer Genbank ist. Die Insertion der
Plasmide in das Genom erfolgt, durch homologe Rekombination. Die
erfolgreiche Insertion wird durch Expression eines plasmidkodierten
Antibiotikum-Resistenzmarkers angezeigt.
Eine bevorzugte Ausführungsform der SRM-Methode wird anhand der
Abb. 5 bis 8 veranschaulicht.
In Abb. 5 ist ein geeigneter SRM-Vektor dargestellt, der wie der CAI-
Vektor ein genomisches oder subgenomisches DNA-Fragment des zu
untersuchenden Mikroorganismus enthält, sowie einen Replikationsursprung
(ori) für einen Klonierwirt (z. B. E. coli), ein oder mehrere selektionierbare
Markergene und einen weiteren konditional aktiven Replikationsursprung für
den zu untersuchenden Mikroorganismus, z. B. einen temperatursensitiven
Ursprung oder einen Ursprung, dessen Aktivität von einem in trans
vorhandenen Replikationsfaktor abhängig ist und der zusätzlich in das
System eingebracht werden kann. Dadurch daß das SRM-Plasmid eine
genomische Sequenz des zu untersuchenden Mikroorganismus enthält,
kommt es bei Transfektion dieses Vektors in diesem Mikroorganismus zu
einer homologen Rekombination, bei der das gesamte SRM-Plasmid in das
genomische Gen des Mikroorganismus inseriert wird und das entsprechende
Gen, fall es sich um ein solches handelt, inaktiviert. Dies führt zu einer
Insertionsmutante. Geeignete induzierbare Replikationsursprünge sind, wie
erwähnt, temperatursensitive oris oder solche, die durch einen Faktor
gesteuert werden können, wie z. B. den RGK-Faktor pir oder den pWV Faktor
repA, der in trans dem System zugeführt wird.
Die Insertion eines SRM-Plasmids (siehe Abb. 5) in das Genom des zu
untersuchenden Mikroorganismus erfolgt über homologe Rekombination
zwischen dem im Plasmid klonierten genomischen Fragment des
Mikrooganismus und der komplementären, genomischen DNA Sequenz.
Nachdem das Plasmid in den entsprechenden Mikroorganismus überführt
worden ist, werden unter nicht permissiven Bedingungen, d. h. bei inaktivem
ori, diejenigen Klone über Selektion auf den plasmidkodierten Marker isoliert,
in welchen das SRM-Plasmid in das Genom inseriert ist. Die Exzision des
SRM-Plasmids erfolgt ebenfalls über homologe Rekombination. Unter
permissiven Bedingungen wird die Replikation des insertierten Plasmids
eingeleitet, wodurch genügende Mengen an freiem Plasmid in den Zellen
entstehen, so daß das Plasmid aus dem Klon wieder isoliert werden kann.
Sofern die Insertion eines SRM-Plasmids in ein essentielles Gen
stattgefunden hat, wird die Lebensfähigkeit des betreffenden Klons
eingeschränkt (A), während Mutanten in nichtessentiellen Genen normal
lebensfähig sind (B).
Ebenso wie beim CAI-Verfahren kann eine Bank von Insertionsplasmiden
aus genomischen Fragmenten des zu untersuchenden Mikroorganismus in
diesen Mikroorganismus übertragen werden und genomische
Insertionsmutanten gebildet werden. Diese bevorzugte Ausführungsform des
SRM-Verfahrens ist in Abb. 7 dargestellt. Eine Bank von SRM-
Plasmiden, die einzelne genomische oder subgenomische Fragmente
enthalten, wird in den zu untersuchenden, homologen Mikroorganismus
übertragen. Unter Bedingungen, welche die Plasmidreplikation nicht
erlauben, werden genomische Insertionsmutanten mit Hilfe eines
plasmidkodierten Markers (siehe Abb. 5) selektioniert. In diesem Schritt
können nur Insertionsmutanten überleben, die in einem nicht- oder fakultativ
essentiellen Gen mutiert sind, da Mutanten eines essentiellen Gens nicht
lebensfähig sind. Die individuellen Insertionsmutanten werden in einem Pool
zusammengefaßt und dieser Pool anschließend in zwei identische Gruppen,
den Driver- und den Tester-Pool, aufgeteilt. Der Driver-Pool wird
selektioniert, z. B. durch die Infektion eines Tiers. Der Tester-Pool bleibt
unbehandelt. Durch die Selektion gehen solche Klone aus dem Driver-Pool
verloren, die eine Insertion in einem fakultativ essentiellen Gen (das für das
Überleben und die Vermehrung unter den Selektionsbedingungen notwendig
ist) enthalten. Anschließend werden aus den überlebenden Klonen beider
Pools, die in das Genom des Mikroorganismus inserierten Plasmide unter
permissiven Bedingungen rezirkularisiert und zurückgewonnen. In dem
Driver-Pool fehlen solchen Plasmide, die Fragmente von fakultativ
essentiellen Genen enthalten. Die in den SRM Plasmiden klonierten
Fragmente werden in beiden Pools anschließend über PCR amplifiziert (siehe
Abb. 4). Diejenigen amplifizierten DNA Fragmente, die Teile von fakultativ
essentiellen Genen darstellen, werden durch genetische Subtraktion (siehe
Abb. 8) angereichert und isoliert.
Eine besondere Ausführungsform, welche sich eine subtraktive
Hybridisierung zur Anreicherung in Fragmenten essentieller Gene zunutze
macht, ist in Abb. 8 beispielhaft veranschaulicht.
- A) PCR-basierte genetische Subtraktion. Die Tester DNA-Fragmente (siehe Abb. 4 und 7) werden mit einem Adapteroligonukleotid in solcher Weise ligiert, daß der Adapter nur mit einem der beiden DNA Stränge eines doppelsträngigen Tester DNA Fragments kovalent verbunden ist, was z. B. durch die Ligation eines doppelsträngigen, nicht phosphorylierten Adapters an die 3'-phosphorylierten DNA Fragmente der Tester DNA erreicht wird. Diese Tester DNA Fragmente werden dann mit einem molaren Überschuss an Driver DNA Fragmenten gemischt. Die Mischung wird denaturiert und langsam rehybridisiert. Anschließend werden überhängende Einzelstrangenden mit DNA Polymerase zum Doppelstrang aufgefüllt. Die Produkte dieser Reaktion werden mittels PCR amplifiziert, wobei Oligonukleotid Primer verwendet werden, die den Adaptersequenzen entsprechen. Nur solche Tester DNA Fragmente, die nicht mit Driver DNA Fragmenten hybridisert haben, werden exponentiell amplifiziert somit angereichert und anschließend durch Klonierung isoliert.
- B) Genetische Subtraktion durch physikalische Abtrennung von biotinylierten DNA Fragmenten. Die Driver DNA Fragmente werden biotinyliert und anschließend im Überschuß mit Tester DNA Fragmenten gemischt, denaturiert und langsam rehybridisiert. Die biotinylierten Homo-Driver-Driver Doppelstränge und Heteroduplexe (Driver-Tester Doppelstränge) werden durch Extraktion mit Träger gekoppeltem Streptavidin von den Tester-Tester Homoduplexen abgetrennt. Letztere werden durch Klonierung isoliert.
Die beispielsweise durch SRM erzeugten Insertionsmutanten werden in
Tierversuchen oder Zellkultursystemen hinsichtlich ihrer veränderten
biologischen Eigenschaften untersucht. Durch die gezielte Verwendung
spezieller Wirtszellen, z. B. kultivierte Makrophagen oder Wirtsgewebe, z. B.
Milz, können Gengruppen selektiert werden, die essentielle Eigenschaften
des Pathogens determinieren, z. B. die Besiedlung bestimmter Wirtszellen.
Isoliert man die überlebenden Mutanten aus den Zellen, so fehlen die
Mutanten essentieller Gene. Subtrahiert man aus der kompletten Genbank,
die überlebenden Mutanten, so erhält man die Mutanten der essentiellen
Gene. Dies geschieht über einen speziellen PCR-basierten
Substraktionsschritt.
Das CAI- bzw. das SRM-Verfahren ist eine sehr effiziente Methode zur ein
deutigen Identifizierung und Charakterisierung essentieller Gene. Da essen
tielle Gene ein natürliches Ziel für inhibierende Wirkstoffe darstellen, bieten
die dargestellten Verfahren eine ideale Grundlage für die Entwicklung neuer
Wirkstoffe.
In den nachfolgend beschriebenen Verfahren werden die identifizierten Gene
direkt zum Wirkstoff-Screening eingesetzt, wobei im Vergleich zu herkömm
lichen Verfahren, auf aufwendige Aufreinigungsschritte verzichtet werden
kann. Im Mittelpunkt dieser Verfahren stehen bakterielle Trägerzellen, die
zum Screening nach prophylaktischen und therapeutischen Wirkstoffen
eingesetzt werden können.
Die hergestellten gendefizienten Mikroorganismen werden dann auf ihre
Wachstumsfähigkeit oder ihre Überlebensfähigkeit getestet. Geeignete
Testsysteme sind z. B. In-vitro-Systeme, Zellkultursysteme, Gewebekultur
systeme und Tiermodelle als natürliche Umgebung. Wird das Verfahren bei
H. pylori angewandt, werden die Organismen einerseits auf einem sog.
Vollmedium angezüchtet, wobei das Vollmedium die bestmöglichen Voraus
setzungen für ein Wachstum für H. pylori ermöglicht. Gleichzeitig werden die
defizienten H. pylori Organismen in einer Kultur gezüchtet, welche der
natürlichen Umgebung von H. pylori möglichst genau entsprechen soll. Es
werden hierzu einerseits Zellkulturen basierend auf Primärkulturen oder
Zellinien aus gastrointestinalem Gewebe verwendet oder aber ausdifferen
ziertes Primärgewebe (Sphäroide) in Kulturmedium. Weitere Möglichkeiten
zur Simulation der natürlichen Umgebung von H. pylori bestehen in der
Verwendung von stimulierten Makrophagen, denn H. pylori besitzt die
Fähigkeit, von diesen nicht aufgenommen und metabolisiert zu werden.
Außerdem kann auch überprüft werden, ob die defizienten H. pylori
Organismen in der Lage sind, sich in immundefizienten Mäusen über einen
bestimmten Zeitraum zu etablieren.
Ist ein defizientes H. pylori Bakterium zwar in der Lage, auf Vollmedium zu
überleben, wächst aber nicht in einer natürlichen Umgebung, wie oben
beschrieben, so wird das in diesem Organismus defiziente Gen als fakultativ
essentielles Gen bezeichnet.
Wenn der defiziente H. pylori Organismus in keinem der beiden Testlebens
räume überlebensfähig ist, so handelt es sich um ein obligat essentielles
Gen.
Allgemein können Gene von Mikroorganismen einer dieser Kategorien
zugeordnet werden.
Aus diesen Ergebnissen können dann die in mutierten oder/durch asRNA
unterdrückten Sequenzen identifiziert und jeweils einer dieser beiden
Kategorien zugeordnet werden, oder aber der Kategorie der nichtessentiellen
Gene, wenn der gendefiziente Organismus keine Beeinträchtigungen in
seiner Wachstumsfähigkeit zeigt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein genetisches
Verfahren zur Isolierung und Klonierung der identifizierten essentiellen Gene
aus verschiedenen klinischen Helicobacter Isolaten bzw. aus heterologen
pathogenen Keimen von klinischer Bedeutung bereitzustellen. Das
erfindungsgemäße Verfahren umfaßt daher weiterhin die Schritte
- a) Herstellen von Primern zur Amplifikation und Detektion von homologen Gensequenzen in heterologen Mikroorganismen
- b) Identifizieren der homologen Gensequenzen.
Eine bevorzugte Durchführung dieser weiteren Verfahrensschritte besteht
darin, sogenannte Megaprimer von den identifizierten essentiellen
Helicobacter-Genen mittels PCR (Polymerase Chain Reaction) herzustellen,
deren Sequenz direkt aus den entsprechenden Plasmiden der
mutagenisierten DNA-Abschnitte abgeleitet werden kann. Diese Primer
können dann verwendet werden, um die bereits identifizierten essentiellen
Gene aus verschiedenen Helicobacter-Isolaten zu isolieren. Falls diese
essentiellen Gene Entsprechungen in anderen Mikroorgansimen haben,
können die Primer unter Umständen auch zur Isolierung dieser Gene aus von
Helicobacter verschiedenen Mikroorgansimen verwendet werden. Weiterhin
kann dann die genaue DNA-Sequenz der isolierten Gene und die Feststellung
der Genvarianz innerhalb der verschiedenen Helicobacter-Isolate bzw.
zwischen den verschiedenen Mikroorganismen bestimmt werden.
Bei der Herstellung der Megaprimer entstehen DNA-Fragmente mit variablen
3'-Enden. Aufgrund dieser Eigenschaft ist es möglich, die DNA-Fragmente
zur Isolierung variabler, bzw. verwandter Gene mittels des beschriebenen
PCR-Verfahrens einzusetzen.
Zur Identifizierung neuer immunologischer Wirkstoffe aus dem Pool der
identifizierten essentiellen Gene eines Pathogens bzw. zur
Weiterentwicklung dieser Wirkstoffe werden bakterielle Träger insofern sehr
wirksam eingesetzt, da die identifizierten Gene direkt in diese Trägersysteme
kloniert und dort exprimiert werden können. Das Wirkstoff-Screening
erfolgt dann direkt mit Hilfe dieser rekombinanten, bakteriellen Träger. Als
Träger werden bevorzugt attenuierte Bakterien, wie z. B. Salmonellen,
verwendet, da diese über ein natürliches Potential zur Immunstimulanz
verfügen. Werden diese attenuierten Bakterien als Träger bzw.
Produzenten für die identifizierten essentiellen Gene der pathogenen Keime
verwendet und wird mit diesen Impfstämmen eine Immunisierung an einem
Säugetier durchgeführt, so kann eine nachhaltige Immunantwort ausgelöst
werden.
Mittlerweile sind die immunologischen Eigenschaften dieser bakteriellen
Trägersysteme so weit verfeinert worden, daß eine gezielte Immunantwort
ausgelöst werden kann (VanCott et al., 1998; Carrier-Patent EP 98116827.1).
Diese Eigenschaft ist insofern bedeutsam, da die verschiedenen
Krankheitserreger oftmals nur über einen bestimmten Zweig des
Immunsystems wirksam bekämpft werden können. D. h. schutzvermittelnde
Antigene lassen sich nur dann identifizieren, wenn sie dem Immunsystem
in der richtigen Form präsentiert werden. Nur wenn der verwendete Träger
mit einem wirksamen Antigen beladen wurde, kann es zu einer
Schutzwirkung kommen. Aufgrund der vielfältigen immunologischen
Eigenschaften bakterieller Trägersysteme und deren Überlegenheit
gegenüber herkömmlichen synthetischen Adjuvantien sind diese zur
Identifizierung immunologisch relevanter Antigene besonders geeignet.
Darüber hinaus können die bakteriellen Trägersysteme mit effizienten
Genexpressionssystemen ausgestattet werden, welche die Herstellung auch
problematischer Antigene erlauben (PCT/EP91/02478, EP 98116827.1).
Aufgrund der direkten Subklonierung der isolierten essentiellen Gene und
der einfachen Handhabung der bakteriellen Träger bei der Herstellung und
Vakzinierung, können in relativ kurzer Zeit eine große Anzahl von Antigenen
hinsichtlich ihres immunogenen und protektiven Potentials durchgetestet
werden. In herkömmlichen Verfahren müssen die Test-Antigene dagegen
zeitaufwendigen Aufreinigungsverfahren unterworfen werden, wobei
oftmals schon bei der gentechnischen Herstellung der ausgewählten
Antigene in Bakterien Schwierigkeiten auftreten, die mit der toxischen
Wirkung dieser Antigene auf den produzierenden Bakterienstamm verknüpft
sind.
Eine wichtige Voraussetzung für das Entwickeln von Wirkstoffen besteht
darin, das immunogene Potential der identifizierten Sequenzen festzustellen,
um zu bestimmen, inwiefern die entsprechenden Genprodukte für die
Herstellung von Antikörpern oder Impfstoffen geeignet sind.
Zur Identifizierung immunologischer Wirkstoffe gegen klinisch relevante
Helicobacter-Organismen muß zunächst ermittelt werden, in wie weit das
Genprodukt des identifizierten essentiellen Gens immunogene Eigenschaften
besitzt. D. h. es muß experimentell ermittelt werden, ob mit dem Antigen
eine humorale und zelluläre Immunantwort in einem Säugetier ausgelöst
werden kann, die gegen das originale Genprodukt des Erregers gerichtet ist.
Damit werden auf keinen Fall solche Antigene ausgeschlossen, die im
Rahmen einer natürlichen Infektion vom Immunsystem nicht erkannt
werden. Im Gegenteil, vielmehr könnte man erwarten, daß z. B. bei
chronisch infizierten Menschen die Immunantwort gegen schutzvermittelnde
Antigene unterdrückt ist oder von einer Qualität ist, die letztendlich keine
Schutzwirkung vermittelt. Auszuschließen sind jedoch solche Antigene, die
einer hohen genetischen Variation unterliegen und somit einer wirksamen
Immunantwort kaum zugänglich sind.
Zum Nachweis der Identität des identifizierten Genprodukts bei einer
natürlich vorkommenden Infektion, wird Antiserum von Patienten
gewonnen, die entweder unter einer aktiven Gastritis mit Beschwerden
leiden, oder aus Patienten, bei denen die Helicobacter-Infektion symptomlos
verläuft. Mit diesen Seren wird das elektrophoretisch aufgetrennte
rekombinante Protein in einem klassischen Western Blot Verfahren getestet.
Findet eine Erkennungsreaktion mit einem rekombinanten Protein jeweils mit
beiden Seren, also dem eines Patienten mit einer fulminanten und dem eines
Patienten mit einer symptomlosen Helicobacter Infektion, statt, so spielt
dieses Protein bei einer natürlichen Infektion eine Rolle. Wird das
rekombinante Polypeptid dagegen nur von dem Serum des Patienten mit
einer symptomlosen Infektion erkannt, kann das zusätzlich ein Hinweis auf
ein protektives Potential des entsprechenden Proteins sein. Weiterhin
können Antikörper, die gegen dieses Protein spezifisch gerichtet sind,
möglicherweise zur passiven Immunisierung eingesetzt werden.
Von besonderem Interesse sind außerdem Antikörper von Individuen, die
nachweislich keine Helicobacter-Träger sind, da diese auf ein protektives
Potential eines entsprechenden rekombinanten Polypeptids schließen lassen.
Desweiteren werden die immunogenen Polypeptide zusammen mit
geeigneten Zusatzstoffen zur Immunisierung in vivo eingesetzt. Verwendet
werden dazu verschiedene Adjuvantien, bakterielle Toxine, Zytokine oder
ein erfindungsgemäßes Polypeptid als Lebendvakzin. Die Immunantwort
wird daraufhin getestet, ob sie nach einer erfolgten Verabreichung eines
bestimmten Polypeptids der Erfindung in Kombination mit entsprechenden
Zusatzstoffen nach Infektion mit dem homologen Keim eine schützende
Wirkung gegen weitere homologe Infektionen herbeiführt (z. B. Infektionen
mit verschiedenen H. pylori Stämmen).
Noch eine weitere Möglichkeit zum Testen der Immunogenität besteht darin,
im Tiermodell (z. B. Maus, Kaninchen) eine Immunantwort gegen
Helicobacter oder andere Mikroorganismen auszulösen und aus den
immunisierten Tieren Antikörper zu gewinnen, die dann in einer weiteren
Western-Blot-Analyse verwendet werden können. Gleichzeitig müssen
Patientenbiopsien in situ immunologisch mit den gleichen Antikörpern
untersucht werden, da Helicobacter und andere Mikroorganismen in Kultur
bestimmte Proteine verlieren oder hinzugewinnen können.
Parallel dazu ist es bevorzugt zu untersuchen, ob gegen eine Infektion mit
heterologen Keimen (bevorzugt andere gram-negative Bakterien), welche
das entsprechende Polypeptid exprimieren, eine schützende Wirkung erzielt
werden kann.
Nachdem festgestellt wurde, ob die identifizierten Gene bzw. deren
Expressionsprodukte in der Lage sind, eine Immunantwort hervorzurufen,
kann gemäß dem Verfahren der Erfindung weiterhin untersucht werden, ob
auch eine bereits bestehende Infektion mit derartigen Antigenen behandelt
werden kann. Kann auf diese Weise ein Polypeptid identifiziert werden, das
eine therapeutische Wirkung zeigt, wird es bevorzugt auch auf seine
Aktivität bei Infektionen mit heterologen Keimen untersucht.
Das Screening nach prophylaktisch bzw. therapeutisch wirksamen,
immunologischen Stoffen kann nach folgendem Schema verlaufen, wobei
die Einhaltung der einzelnen Schritte nicht zwingend ist:
- 1. Klonierung des identifizierten Gens in einen geeigneten bakteriellen Trägerstamm und Nachweis sowie Quantifizierung des vollständigen Genprodukts durch SDS-PAGE.
- 2. Immunologische Charakterisierung des erzeugten Genprodukts mit Hilfe von (a) Seren infizierter oder/und natürlich geschützter Wirte, die das Genprodukt im Trägerstamm erkennen sollte; (b) Hyperimmunseren von Tieren, die mit dem rekombinanten Trägerstamm immunisiert wurden. Wobei das jeweilige Hyperimmunserum das originale Genprodukt im pathogenen Keim erkennen sollte. Hierbei kann es möglich sein, daß das originale Antigen nur in einem bestimmten Entwicklungszeitraum vom Pathogen produziert wird.
- 3. Die protektive Wirkung der individuellen Antigene in der prophylaktischen oder/und therapeutischen Anwendungsform wird im Tiermodell untersucht.
Alle protektiven Antigene, die mit den beschriebenen Verfahren identifiziert
wurden, können nunmehr in einem zweiten Schritt weiterentwickelt werden.
Im Vordergrund dieser Weiterentwicklung steht u. a. die Evaluierung der
genetischen Konstanz der identifizierten protektiven Antigene innerhalb des
Pathogens bzw. verwandter pathogener Keime in seiner weltweiten
Verbreitung. Weiterhin wird zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe, auf die
genetischen Unterschiede im Immunsystem der Impflinge eingegangen. Ziel
beider Verfahren ist die Identifizierung von Antigenen oder Epitopen, die
möglichst breit angewendet werden können. Zur Erfassung der
Genvariabilität innerhalb einer Spezies bzw. homologer Keime kann der
sogenannte Mega-Primer-Ansatz eingesetzt werden. Aus dem Plasmid mit
dem relevanten Gen werden direkt genspezifische Primer mit variablen 3'-
Enden über PCR hergestellt, welche die Amplifikation homologer Gene
ermöglichen. Anhand der ermittelten DNA-Sequenz der amplifizierten Gene
kann deren Variabilität abgeleitet und z. B. genkonstante Bereiche bestimmt
werden.
Die genetischen Unterschiede zwischen einzelnen Impflingen, auf ein
definiertes Antigen zu reagieren, kann mit Hilfe einer In Vitro-Vakzinierung
evaluiert werden. Aus unterschiedlichen Spendern werden hierzu
antigenpräsentierende Zellen (APC) isoliert, z. B. dentritische Vorläuferzellen,
welche in vitro expandiert und mit den zu testenden Antigenen beschickt
werden, wobei die Antigene bevorzugt über entsprechende Vektoren
exprimiert werden. Die identifizierten Gene können auch einzeln oder in
definierten Kombinationen in dendritischen Zellen (DC) von nicht infizierten
Spendern exprimiert werden. Dabei werden die Genprodukte von der
Wirtszelle prozessiert und durch den MHC-Komplex präsentiert. DC sind
besonders für die Antigenpräsentation gegenüber naiven oder
"schlummernden" T-Zellen geeignet. Werden DC mit T-Zellen autologer
Spender inkubiert, ist es möglich zu bestimmen, ob dieser Spender gegen
das eingesetzte Antigen reagieren würde, wenn er auf natürliche Weise
damit in Kontakt käme, z. B. im Rahmen einer Schutzimpfung. Anhand der
Immunantwort der T-Zellen kann auf eine mögliche Immunogenität des
entsprechenden Antigens geschlossen werden. Eine solche Immunantwort
besteht beispielsweise aus einer Proliferation der T-Zellen, bzw. einer
Zytokin-Ausschüttung insbesondere von IL-2 und IL-4. Die Zytokine können
beispielsweise mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Assaykits (z. B. von
Genzyme Cambridge M. A.) ausgewertet werden.
Schließlich können die in der beschriebenen Weise identifizierten und
charakterisierten Antigene bzw. Epitope zur Entwicklung der ersten
Impfstoff-Prototypen eingesetzt werden. Hierbei wird zwischen zwei
Impfstofftypen unterschieden, der aktiven und der passiven Impfung.
Zur passiven Immunisierung, werden dem Impfling Antikörper oder
Antikörperfragmente mit schützender bzw. inhibierender Wirkung von außen
zugeführt.
Antikörper werden in Form von polyklonalen, bevorzugt monoklonalen
Antikörpern (MAKs) oder rekombinanten Antikörpern bereitgestellt. Hierzu
gehören Antikörper, die spezifisch mit Polypeptiden der Erfindung oder
deren Untereinheiten und Fragmenten reagieren und für eine prophylaktische
und/oder therapeutische Anwendung, z. B. einer passiven Immunisierung,
verwendet werde können. Diese Anti-Protein- oder Anti-Peptid-Antiseren
bzw. monoklonalen Antikörper können mit Hilfe von Standardprotokollen
z. B. durch die Immunisierung von Tieren wie Mäusen, Ratten oder Ziegen
mit einem gereinigten Polypeptid der Erfindung, einen Fusionsprotein oder
einem Subfragment dessen hergestellt werden. Darüber hinaus können die
Tiere auch mit bakteriellen Vakzineträgern immunisiert werden, die mit
entsprechenden Genen der Erfindung ausgestattet sind und die kodierten
Polypeptide exprimieren. Die Antikörper sind dabei bevorzugt
immunspezifisch gegen antigene Determinanten oder Epitope hierzu der
beschriebenen Helicobacter-Polypeptide oder einem eng verwandten
Polypeptid, das eine Homologie von mindestens 90% besitzt, gerichtet. Sie
sind nicht kreuzreaktiv mit Polypeptiden, die z. B. eine Homologie von
weniger als 80% aufweisen.
Ausgehend von einer Zellinie, die einen Polypeptid-spezifischen
monoklonalen Antikörper produziert, kann aus dem kodierenden Gen eines
solchen Antikörpers, chimäre Gene geschaffen werden, die Antikörper
determinieren, bestehend aus einer Antigen bindenden Domäne aus der
Maus und dem Fc-Teil eines Antikörpers des Menschen. Diese Antikörper
können in Zellinien oder transgenen Tieren produziert werden.
Anstelle von Antikörpern, die im Tier generiert wurden, können auch
Antikörper-Fragmente, Miniantikörper, verwendet werden, die z. B. in einem
heterologen System wie Bakterien hergestellt werden. Diese Miniantikörper
können entweder monovalent oder bivalent sein und bestehen aus
dimerisierten Einzelketten-Molekülen (Kujau et al., 1998; Kalinke et al.,
1996; Pack et al., 1993).
Antikörper gegen die immunogenen Polypeptide der Erfindung können auch
in Pflanzen generiert werden. Beispiele hierzu sind z. B. von Hiatt und Ma
(1993), von Engelen et al. (1994) und Ma et al. (1994) beschrieben worden.
Entsprechend der jeweilig verwendeten Pflanze können diese z. B. direkt zum
Verzehr und damit als orales Vakzin verwendet werden.
Eine weitere, sehr breit anwendbare Weise, Antikörper herzustellen, ist in
Milch und Eiern immunisierter Tiere. Verabreicht man z. B. trächtigen Kühen,
Schafen oder Pferden geeignete Antigene, so finden sich in der Milch
Immunoglobuline, die zur Entwicklung eines Vakzins verwendbar sind. Die
Milch kann dann entweder direkt als Vakzin verabreicht werden, oder ein
konzentriertes Immunglobulin-Extrakt hergestellt werden. Auf die gleiche
Weise können auch Antikörper (Hyperimmunantikörper) in Hühnereiern
produziert werden (Ling et al., 1998; Sasse et al., 1998). Die beschriebenen
immunogenen Polypeptide der Erfindung können daher auch zur Entwicklung
eines Milchprodukts oder Hühnereiern verwendet werden, die als orales
Vakzin verwendet werden können.
Erfindungsgemäß werden die generierten Antikörper oder deren Fragmente
auf ihre Anwendbarkeit getestet. Sie können dazu durch bekannte Verfahren
aufgereinigt werden (Präzipitation, chromatographische Verfahren) und bei
spielsweise darauf untersucht werden, ob sie den Infektionsvorgang von H.
pylori inhibieren können (Adhäsionsassays) oder aktivierend auf Komple
ment oder ADCC ("antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity", anti
körperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität) wirken.
Zur passiven Immunisierung werden die Antikörper, die mit Hilfe der
Polypeptide der Erfindung generiert wurden, entweder oral oder intra
gastrisch verabreicht. Hierfür werden die Antikörper mit einem Bicarbonat-
Puffer gemischt. Sie können aber auch systemisch verabreicht werden,
wobei sie nicht gepuffert werden müssen.
Antikörper werden bevorzugt allein oder auch in Kombination mit anderen
nicht-immunologischen Wirkstoffen verwendet, z. B. mit Antibiotika oder
Protonenblockern.
Aktive Vakzinierung beruht auf einer Immunreaktion, die vom geimpften
Organismus selbst ausgelöst wird. Bevorzugt sind Darreichungsformen von
Impfstoffen als Antigene, Antigenfragmente, Subunit-Vakzin, als DNA-
Vakzin, als Lebend-Vakzin oder als Lebensmittel-Vakzin.
Antigene sind diejenigen Polypeptide oder deren Fragmente, die in vivo eine
Immunreaktion hervorrufen können.
Wenn ein Polypeptid als Subunit-Vakzin bereitgestellt werden soll, wird es
zunächst in seine Untereinheiten bzw. Strukturdomänen gemäß seines
Antigenitätsmusters zerlegt (z. B. T- und B-Zell-Epitope). Dieses
Antigenitätsmuster kann mit Hilfe eines Computerprogramms erstellt
werden, wobei immunogene Regionen, die aus einer kurzen Polypeptid
sequenz von ca. 8 bis 10 Aminosäuren bestehen, erkannt werden können
(Hughes et al., 1992). Die einzelnen Polypeptidstücke können dann
anschließend auf ihre Immunogenität in der Maus oder in Primaten bzw. den
Menschen getestet werden. Sie können dazu entweder als gereinigte
Polypeptide, die synthetisch hergestellt wurden, in Kombination mit
entsprechenden Zusatzstoffen wie einem Adjuvans, Toxin oder Cytokin
verabreicht werden, oder als Fusionsprotein an ein bekannt immunogenes
Protein bzw. Proteinuntereinheit wie z. B. die Cholera Toxin B Untereinheit
(Liljeqvist et el., 1997) gekoppelt. Weiterhin können die immunogenen
Peptide in äußere Membranproteine wie z. B. dem OmpS Maltoporin von
E. coli eingebaut und heterolog in einem Vakzin-Trägerstamm exprimiert
werden (Lang und Korhonen, 1997).
Zur Entwicklung eines DNA-Vakzins können die in der Erfindung
charakterisierten Polynukleinsäure-Moleküle "nackt" in Fusion mit einem
eukaryontischen gewebespezifischen Promoter oder in Form eines Plasmids
verabreicht werden. Die "nackte" DNA oder das entsprechende Plasmid
wird in Kombination mit einem Zusatzstoff wie einem Reagenz, das die
zelluläre Permeabilität verändert wie z. B. Bupivacain (WO94/16737),
kationischen Lipiden wie z. B. DOTMA (N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-
trimethyl-ammoniumchlorid, DOTAP (1,2-bis(oleyloxy)-3-trimethyl-
ammonio)propan), DDAB (dimethyl-dioctadecyl-ammoniumbromid), DOGS
(dioctadecyl-amidolglycyl-spermidin) bzw. Cholesterinolderivaten, Silica,
Gold oder Wolfram (Tang et al. 1992) bzw. in Liposomen (WO93/18759,
WO93/19768, WO94/25608, WO95/2397) oder Mikropartikeln verpackt,
verabreicht. Beispiele für brauchbare Promoteren und Genfähren sind von
Hartikka et al. (1996) beschrieben worden. Zur Applikation der
Polynukleotid-Moleküle können jedoch auch z. B. attenuierte Salmonellen
verwendet werden. Die Bakterien werden hierfür mit eukaryontischen
Expressionsvektoren, die ein Polynukleotid-Molekül der Erfindung beinhalten,
transformiert und dann oral verabreicht. Die Plasmid-DNA wird anschließend
vom Bakterium auf den Wirt übertragen (Darji et al., 1997). Zur
Transformation attenuierter Trägerbakterien können jedoch auch filamentöse
Phagen verwendet werden. Der Vorteil dieser liegt darin, daß sie eine
extrem hohe Anzahl von Plasmiden übertragen können.
Für die Entwicklung eines Lebendvakzins stehen unter anderem virale, wie
z. B. adenovirale oder Windpocken-Virus-Vektoren, bzw. bakterielle Vektoren
wie etwa Salmonella, Shigella oder Lactobacillus zur Verfügung. Attenuierte,
nichtvirulente Salmonella typhimurium-Stämme, die zur rekombinanten
Expression heterologer Antigene benutzt werden können und oral
verabreicht werden, wurden vielfach charakterisiert (Mekalanos, 1994,
WO92/11361, Cirillo et al., 1995 und Dorner (1995). Weitere bakterielle
Vektoren, die als Vakzinvektoren verwendet werden können, sind von Cirillo
et al. (1995) und Dorner (1995) beschrieben worden. Ein Polynukleotid-
Molekül der Erfindung, das für ein therapeutisch oder prophylaktisch
wirksames Polypeptid kodiert, wird hierzu entweder in das bakterielle
Genom stabil integriert und einem Transportsystem unterworfen, das die
Darbietung an der bakteriellen Oberfläche ermöglicht (PCT/EP94/04286;
WO97/35022). Das entsprechende Polynukleotid-Molekül kann im
Bakterium aber auch als Plasmid in freiem Zustand vorliegen.
Impfstoffe werden in der Regel mit geeigneten Zusatzstoffen wie z. B.
Adjuvantien, bakteriellen Toxinen, Zytokinen etc. verabreicht, die das
immunogene Polypeptid in seiner protektiven oder therapeutischen Wirkung
unterstützen. Adjuvantien mit geringen Nebenwirkungen zur Verwendung
im Menschen, die für Subunit-Vakzine und Lebend-Vakzine, aber zum Teil
auch für DNA-Vakzine in Frage kommen, sind z. B. Aluminiumhydroxid,
Aluminiumphosphat, Calciumphosphat, N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-
isoglutamin, N-Acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin, N-Acetyl-
muramyl-L-alanyl-D-isoglutamyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-
hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin, Liposomen, Monophosphoryl-Lipid A,
Trehalosedimicoloat, Pilz-Polysaccharide wie z. B. Schizophyllan, Muramyl-
Dipeptid, Muramyl-Dipeptid-Derivate, sowie Phorbolester, Saponine und
immunstimulierende Komplexe (ISCOMS) (Gupta und Siber, 1995). Als
bakterielles Toxin kann z. B. Cholera Toxin bzw. dessen Untereinheiten oder
das hitzelabile Toxin aus E. coli verwendet werden. Obwohl diese
hochpotent als Adjuvantien aktiv sind, können sie aufgrund ihrer Toxizität
nur begrenzt auf den Menschen angewendet werden. Mit Hilfe bestimmter
Mutagenesetechniken können jedoch Moleküle entwickelt werden, die aktiv,
aber ungiftig sind (O' Hagan, 1998).
Eine weitere Möglichkeit, die Immunantwort auf die prophylaktisch und/oder
therapeutisch wirksamen Substanzen der Erfindung zu optimieren, ist, das
entsprechende Polypeptid als Fusionsprotein mit einer immunogenen
Proteindomäne zu exprimieren. Eine Möglichkeit besteht z. B. darin, die Pilin
DSL-Domäne aus Pseudomonas aeruginosa als Fusionspartner zu
verwenden. Weiterhin beschrieben sind Fusionsproteine, die an Glutathion
S-Transferase oder Thioredoxin fusioniert wurden (Hill et al., 1997;
Gabelsberger et al., 1997). Das entsprechende Fusionsprotein kann jeweils
als Subunit- oder Lebendvakzin hergestellt und verabreicht werden.
Die Immunantwort der identifizierten immunologisch wirksamen Substanzen
kann auch insofern moduliert werden, indem diese in Kombination mit
bestimmten Zytokinen verabreicht werden. Zur simultanen Verabreichung
bietet sich eine Co-Expression der Polynukleotid-Sequenzen der Erfindung
mit einem bestimmten Cytokin in Salmonella oder einem anderen
Wirtsbakterium an. Das entsprechende Cytokin kann hierzu entweder auf
einem separaten Plasmid, in Reihe oder als Fusionsprotein mit der
gewünschten Polynukleotid-Sequenz der Erfindung kodiert sein und dann in
das Wirtsbakterium transformiert werden. In Frage kommen Cytokine, die
wie z. B. Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-10 (IL-10) oder Interleukin-12 (IL-12)
das Immunsystem stimulieren.
Zur weiteren Optimierung können einzelne immunogen wirksame
Substanzen der Erfindung miteinander oder in Kombination mit bekannten
immunogenen Substanzen wie z. B. VacA bzw. dessen einzelne
Untereinheiten kombiniert werden. Das entsprechende Polypeptid kann also
gemeinsam mit mindestens einem weiteren Helicobacter Antigen, wie z. B.
der nativen Urase oder deren Untereinheiten, Fragmenten Homologen,
Mutanten oder Derivaten derselben exprimiert werden. Außerdem können
z. B. verschiedene Subunit-Vakzine einzeln oder als Fusionsprotein wie
weiter oben beschrieben gemeinsam verabreicht werden. Hierfür können
wiederum z. B. gereinigte Polypeptid-Moleküle in Kombination mit einem
geeigneten Adjuvans, bakteriellen Toxin oder Cytokin verwendet werden.
Weiterhin können diverse Kombinationen von Nukleotid-Sequenzen
immunogener Untereinheiten der beschriebenen Polypeptid-Moleküle auf
einem gemeinsamen Plasmid hergestellt und als Lebendvakzin verabreicht
werden. Ein Vakzinvektor der Erfindung kann also ein oder mehrere
Polypeptide der Erfindung, Derivate bzw. Fragmente dergleichen enthalten.
Außerdem besteht die Möglichkeit der Kombination eines DNA-Vakzins mit
ein oder mehreren gereinigten Subunit-Vakzinen in einer geeigneten
Trägersubstanz, wie bereits weiter oben beschrieben wurde.
Zur Identifizierung neuer pharmakologischer Wirkstoffe aus dem Pool der
identifizierten essentiellen Gene eines Pathogens bzw. zur
Weiterentwicklung dieser Wirkstoffe können ebenfalls bakterielle Träger sehr
wirksam eingesetzt werden, da die identifizierten Gene direkt in diese
Trägersysteme kloniert und dort exprimiert werden können. Das Wirkstoff-
Screening erfolgt dann direkt mit Hilfe dieser rekombinanten, bakteriellen
Träger.
Display-Systeme dienen dazu, ein exprimiertes Polypeptid der Erfindung an
der Zelloberfläche von Bakterien zu präsentieren. Den Transport von
Polypeptiden durch die innere Membran ermöglicht ein Signalpeptid am
Aminoende, während andere Anteile die Einlagerung und Verankerung in der
äußeren Membran übernehmen. Als Trägeranteile sind verschiedene äußere
Membranproteine von E. coli beschrieben worden wie z. B. PhoE (Agterberg
et al., (1990) oder OmpA (Francisco et al., 1992). Es können jedoch auch
Fusionen mit der Transportdomäne des IgA-Proteasevorläufers IgAß
verwendet werden (Klauser et al, 1990). Beispiele für Display-Systeme sind
z. B. das DsbA-System (PCT/EP 94/02486) oder das Autotransporter-System
(AIDA; WO97/35022). Die an der Oberfläche präsentierten Polypeptide
können dann für Bindungsstudien mit Peptid- oder kombinatorischen
chemischen Substanzenbanken verwendet werden. Die Bindungsstudien
können mit Hilfe eines "High Through Put" Systems, das hohe Testraten
ermöglicht, in Flüssigkeit oder aber gebundener Form durchgeführt werden.
Hierfür werden die präsentierten Polypeptide z. B. an ein Chromatophor
gekoppelt, das in Kombination mit einem weiteren Chromatophor, das an
das Wirkstoff-Peptid oder die chemische Substanz gekoppelt ist, eine
Farbreaktion ermöglicht. Die entsprechende Wirkstoffkomponente kann
jedoch auch z. B. mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert oder an eine feste
Trägermatrix gekoppelt sein. Bei Verwendung eines "Solid Phase Systems"
wird vorher entweder das verwendete Polypeptid der Erfindung oder aber
umgekehrt die Peptid- bzw. kombinatorische Wirkstoffbank an die
Trägermatrix gekoppelt. Die jeweilige farbstoffmarkierte Komponente bindet
dann an die immobilisierte Komponente, wodurch wieder eine Farbreaktion
ermöglicht wird. Nach der Bindungsreaktion müssen dann mehrere
Waschvorgänge vollzogen werden, bevor die entsprechende Substanz
isoliert wird. Vorteil des "Solid Phase Systems" gegenüber der Bindung in
Flüssigkeit ist, daß die wirksame Substanz schneller isoliert werden kann,
da die ungebundenen Substanzen weggewaschen sind.
Weitere Verfahren zur Identifizierung neuer pharmakologischer Wirkstoffe
basieren auf den Kenntnisse aus der Primärstruktur der identifizierten
essentiellen Gene bzw. benutzen die aufgereinigten gentechnisch
hergestellten Genprodukte.
Eine alternative Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
besteht darin, spezifische Bindepartner der von den identifizierten Genen
kodierten Polypeptide zu finden.
Es können bevorzugt Homologiestudien mit Helicobacter und anderen
Organismen durchgeführt werden, z. B. mit Hilfe von Computer-Alignments,
Southern Blots, PCR und dgl. und anschließender Zuordnung der
Sequenzen. Aufgrund von Homologien kann dann auf potentielle
Bindepartner der Proteine geschlossen werden.
Ebenfalls bevorzugt können auch kombinatorische Bindungsstudien über
Target-gerichtetes-Screening-Verfahren mit Hilfe von Substanzen-
Bibliotheken durchgeführt werden. Die potentiellen bindenden Substanzen
werden in einer speziellen Anordnung gebunden vorgelegt, z. B. in
Mikrotiterplatten oder anderen Trägermaterialien. Anschließend wird das
"Target", in der Regel aufgereinigte, gegebenenfalls rekombinante
Helicobacter-Proteine, in löslicher Form hinzugegeben, was den Nachweis
einer Wechselwirkung zwischen dem Target und bestimmten Substanzen
ermöglicht. Ein indirekter Nachweis kann durch markierte Antikörper, die
gegen die Substanz gerichtet sind, oder durch Einführen zusätzlicher
Elemente ("Tags") in das Target erbracht werden.
Eine weitere Variante der Bindungsstudien besteht in der Expression von
Helicobacter-Proteinen in rekombinanten Bakterien (z. B. solche, die das
fluoreszierende Protein GFP oder bestimmte Enzyme herstellen), welche die
Proteine auf der Oberfläche präsentieren, und anschließendes Testen einer
Substanzen-Bibliothek.
Weiterhin kann die dreidimensionale Struktur der von den
erfindungsgemäßen identifizierten Genen 30268 00070 552 001000280000000200012000285913015700040 0002019934029 00004 30149kodierten Polypeptide oder deren
Fragmente auch durch kristallographische Analyse ermittelt werden. Bei
ausreichender Auflösung können eventuelle "Taschen" oder sonstige
Bindestellen in ihrer dreidimensionalen Struktur exakt charakterisiert werden.
Aufgrund dieser Daten kann die Struktur potentieller Bindepartner berechnet
werden.
Mit Verfahren, wie etwa "Two-hybrid System", Display-Systemen, "High
Throughput Screening" oder kombinatorischen Bindungsstudien können
zufällig generierte Polypeptide identifiziert werden, die an die Helicobacter
Polypeptide der Erfindung oder deren Fragmente, oder an weitere
erfindungsgemäß identifizierte Polypeptide binden. Wird auf diese Weise ein
entsprechendes Peptid gefunden, kann dieses chemisch weiter modifiziert
werden, bis die optimale mögliche Bindung erreicht ist. Das identifizierte
Polypeptid kann z. B. als Inhibitor verwendet werden, indem es z. B. an ein
Toxin und ein Internalisierungssignal gekoppelt wird, das den pathogenen
Keim zerstört oder aber als Peptidmimetikum, um das Binden des Keims an
die zelluläre Oberfläche zu verhindern (EP-412,762A und EP-B31,080A). Mit
Hilfe des "Two Hybrid Systems" können aber auch Aktivatoren des
Immunsystems generiert werden. Die identifizierten Peptide, die an die
Helicobacter Polypeptide der Erfindung binden, können hierzu an bestimmte
Liganden z. B. für den T-Zell-Rezeptor gekoppelt werden. Werden also einem
von Pathogenen befallenen Tier oder Menschen diese so ausgestatteten
Peptide verabreicht, wird das körpereigene Immunsystem spezifisch
angelockt und aktiviert.
Die Einhaltung der einzelnen Schritte ist hierbei nicht zwingend, sondern
kann durch weitere Schritte ergänzt bzw. ersetzt werden.
Die jeweiligen Prototypen eines immunologischen bzw. pharmakologischen
Wirkstoffs werden nachfolgend weiterentwickelt und verbessert.
Die Weiterentwicklung eines Impfstoffes kann dahingehend erfolgen, indem
mehrere antigene Genprodukte oder Teile davon in einem Wirkstoff
kombiniert werden und/oder mit verschiedenen Trägern bzw. Zusatzstoffen
verabreicht werden. Als Träger fungieren verschieden attenuierte bakterielle
oder virale Organismen und als Zusatzstoffe Adjuvantien und/oder Cytokine.
Zur Weiterentwicklung eines pharmakologischen Wirkstoffs wird eine als
wirksam charakterisierte Leadstruktur chemisch weiter modifiziert, so daß
eine optimale Bindung und Inhibierung des identifizierten Genprodukts
erfolgt. Weiterhin sollte der Wirkstoff vom Patienten gut vertragen werden
und geringe Nebenwirkungen besitzen.
Zur Identifizierung von Wirkstoffen, die an Polynukleotide binden, kann ein
Polynukleotid der Erfindung z. B. an eine Trägermatrix vorgekoppelt werden
bzw. umgekehrt, die Wirkstoffe der Polypeptide- bzw. kombinatorischen
Substanzenbank. Das verwendete darauffolgende Schema ist das gleiche
wie das, das für die Polypeptide schon beschrieben wurde.
Solche inhibitorischen Substanzen können Polypeptide, Peptide, aber auch
chemische Substanzen sein, wie etwa Antibiotika. Die inhibitorische
Wirkung kann dabei in verschieden Stadien der Replikation der zu
bekämpfenden Mikroorganismen eingreifen. Beispiele sind
Expressionsinhibitoren oder Enzyminhibitoren oder sonstige Inhibitoren,
welche die natürliche Funktion der Polypeptide von Helicobacter und
verwandten Mikroorganismen beeinflussen können. Solche inhibitorischen
Substanzen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Eine weitere Möglichkeit, einen optimalen Wirkstoff gegen Helicobacter und
andere bakterielle Infektionen zu finden, ist mit Hilfe von speziellen
Computerprogrammen. Aufgrund von kristallographischen Daten, die von
den in der Erfindung beschriebenen Polypeptiden gewonnen wurden kann
ein Modell erstellt werden, das sterische, elektronische, hydrophobe und
sogenannten "resultierende Bindungsmomente" (RBMs) miteinander
verbindet (Ray et al., 1998). Anhand dieses Modells können im weiteren
Substanzen am Computer modelliert werden, die zwar die bereits
identifizierten Leadstrukturen enthalten können, aber mit besseren
Bindungseigenschaften ausgestattet sind. Es können jedoch auch völlig
neuartige Wirkstoffe entworfen werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für
ein essentielles sekretorisches Gen aus Helicobacter pylori kodiert, das
durch das oben beschriebene erfindungsgemäße Verfahren identifiziert
wurde. Es wurden essentielle Helicobactergene mit dem vorliegenden
Verfahren identifiziert, deren Nukleinsäuresequenzen in den SEQ ID NO. 1
bis 113 (ungerade Zahlen) angegeben sind. Eine erfindungsgemäße
Nukleinsäure ist beispielsweise dadurch gekennzeichnet, daß sie
- a) eine der in SEQ ID NO: n, wobei n eine ungerade ganze Zahl von 1 bis 1 13 einschließlich ist, dargestellten Nukleinsäuresequenzen oder einen proteinkodierenden Abschnitt davon,
- b) eine einer der Sequenzen aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder
- c) eine mit einer der Sequenzen aus (a) und/oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt.
Neben den im Sequenzprotokoll gezeigten erfindungsgemäßen
Nukleotidsequenzen und diesen Sequenzen im Rahmen der Degeneration
des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenzen umfaßt die
vorliegende Erfindung auch Nukleotidsequenzen, die mit einer der zuvor
genannten Sequenzen hybridisieren. Der Begriff "Hybridisierung" gemäß
vorliegender Erfindung wird bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-
1.104) verwendet. Vorzugsweise spricht man von einer stringenten
Hybridisierung, wenn nach dem Waschen für eine Stunde mit 1 × SSC und
0,1% SDS bei 50°C, vorzugsweise wie 55°C, besonders bevorzugt bei
62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C, insbesondere für 1 h in 0,2 ×
SSC und 0,1% SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 55°C, besonders
bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C noch ein positives
Hybridisierungssignal beobachtet wird. Eine unter derartigen
Waschbedingungen mit einer oder mehreren der erfindungsgemäßen
Nukleotidsequenzen oder einer diesen Sequenzen im Rahmen der
Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenz
hybridisierende Nukleotidsequenz ist eine erfindungsgemäße Nukleotidse
quenz.
Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz eine DNA. Sie
kann jedoch auch eine RNA oder ein Nukleinsäureanalogon, wie etwa eine
peptidische Nukleinsäure, umfassen. Besonders bevorzugt umfaßt die
erfindungsgemäße Nukleinsäure einen Protein-kodierenden Abschnitt der in
Sequenzprotokoll dargestellten Nukleotidsequenzen oder eine Sequenz, die
eine Homologie von mehr als 80%, vorzugsweise mehr als 90% und
besonders bevorzugt mehr als 95% zu den dargestellten Nukleotidse
quenzen oder einen vorzugsweise mindestens 20 Nukleotide (nt) und
besonders bevorzugt mindestens 50 nt langen Abschnitt davon aufweist.
Die Homologie wird in Prozent identischer Positionen beim Vergleich zweier
Nukleinsäuren (bzw. Peptidketten) angegeben, wobei 100% Homologie die
völlige Identität der verglichenen Kettenmoleküle bedeutet (Herder: Lexikon
der Biochemie und Molekularbiologie, Spektrum Akademischer Verlag
1995).
Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann für ein sekretiertes Polypeptid mit
Signalpeptid kodieren oder für ein sekretiertes Polypeptid ohne Signalpeptid.
Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure umfaßt sowohl die Sequenz des
kodierenden Strangs als auch die dazu komplementäre Sequenz. Letztere
kann beispielsweise bei der Herstellung von Antisense-Nukleinsäuren
Anwendung finden.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist natürlich auch eine Genbank, die
mindestens 2, bevorzugt mindestens 20, stärker bevorzugt mindestens 100
der genannten Nukleinsäuren in Vektoren kloniert enthält.
Eine Auflistung der hierin und im Sequenzprotokoll angegebenen
erfindungsgemäßen Nukleinsäuren samt ihrer Genprodukte und deren
Funktionen und putativen Funktionen ist in den Tabellen I und II angegeben.
Bei den Genen, die im Sequenzprotokoll in ihrer Nukleinsäure- und
Aminosäuresequenz angegeben sind, handelt es sich um bakterielle Gene.
Prokaryoten verwenden außer dem AUG-Codon (mRNA) auch noch andere
(alternative) Start-Codons. Diese sind AUU (codiert normalerweise für
Isoleucin, Ile), UUG (codiert normalerweise für Leucin, Leu) und GUG
(kodiert normalerweise für Valin, Val). Im Sequenzprotokoll wurden die
Aminosäuresequenzen gemäß dem normalerweise verwendeten
Translationscode translatiert. Es wird darauf hingewiesen, daß beim Lesen
des Sequenzprotokolls die prokaryontische Verwendung alternativer
Startcodons berücksichtigt werden muß, und daß somit hierin auch von den
Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO. 35, 49, 61, 69, 75, 81, 103
und 105 kodierte Aminosäuresequenzen offenbart sind, welche anstatt mit
einem im Sequenzprotokoll dargestellten jeweiligen Leu-, Val- oder Ile-Rest,
mit einem Methioninrest (Met) anfangen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor, der eine
erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen Abschnitt davon enthält. Die
Nukleinsäure oder der Nukleinsäureabschnitt kann so in den Vektor kloniert
sein, daß sie entweder in Sense- oder Antisense Richtung exprimiert werden
kann. Der Nukleinsäureabschnitt hat bevorzugt eine Mindestlänge von 15
Nukleotiden, stärker bevorzugt 20 Nukleotiden, stärker bevorzugt 50
Nukleotiden. Dieser Vektor kann ein beliebiger prokaryontischer oder
eukaryontischer Vektor sein, auf dem sich die erfindungsgemäße DNA-
Sequenz vorzugsweise in Verbindung mit Expressionssignalen befindet, wie
z. B. Promoter, Operator, Enhancer etc. Beispiele für prokaryoritische
Vektoren sind chromosomale Vektoren, wie etwa Bakteriophagen (z. B.
Bakteriophage 1) und extrachromosomale Vektoren wie etwa Plasmide,
wobei zirkuläre Vektoren besonders bevorzugt sind. Geeignete
prokaryontische Vektoren sind z. B. bei Sambrook etal., Molecular Cloning
(1987), Kapitel 1-4, beschrieben. Andererseits kann der erfindungsgemäße
Vektor auch ein eukaryontischer Vektor sein, z. B. ein Hefevektor oder ein
für höhere Zellen geeigneter Vektor (z. B. ein Plasmidvektor, viraler Vektor,
Pflanzenvektor). Derartige Vektoren sind beispielsweise bei Sambrook et al.,
supra, Kapitel 16 beschrieben. CAI- und SRM-Vektoren, wie oben
beschrieben, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die mit
einem erfindungsgemäßen Vektor oder einer erfindungsgemäßen
Nukleinsäure transformiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist
diese Zelle eine prokaryontische Zelle, vorzugsweise ein gram-negatives
Bakterium, z. B. E. coli. Andererseits kann die erfindungsgemäße Zelle jedoch
auch eine eukaryontische Zelle sein, wie etwa eine Pilzzelle, eine Hefezelle,
eine tierische oder eine pflanzliche Zelle. Besonders bevorzugt handelt es
sich bei der Zelle um einen Mikroorganismus, z. B. Helicobacter oder
Salmonellen. Mit CAI- oder SRM-Vektoren transformierte Mikroorganismen
sind oben bereits beschrieben worden. Diese sind, wie auch mit den obigen
Verfahren herstellbare Mutantenbanken, ebenfalls Gegenstand der
Erfindung.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein essentielles und bevorzugt
sekretiertes Polypeptid von H. pylori. Insbesondere ist dies ein Polypeptid,
das
- a) eine der in SEQ ID NO: m, wobei m eine gerade ganze Zahl von 2 bis 114 einschließlich ist, dargestellten Aminosäuresequenzen oder
- b) eine mit einer der Sequenzen gemäß (a) immunologisch kreuzreagierende Sequenz umfaßt.
Unter immunologische kreuzreagierenden Sequenzen sind somit auch
Muteine, Varianten und Fragmente der in den SEQ ID NO. 2 bis 114
dargestellten Sequenzen umfaßt. Darunter sind Sequenzen zu verstehen, die
sich durch Substitution, Deletion und/oder Insertion einzelner Aminosäuren
oder kurzer Aminosäureabschnitte von den obigen Sequenzen
unterscheiden.
Aufgrund von Homologieanalysen mit Hilfe des FASTA Proteinprogramms
konnten den identifizierten Polypeptiden, deren Sequenz mit der
Nukleinsäuresequenz gefunden werden konnte, bestimmte Merkmale bzw.
eine mutmaßliche Lokalisation im Bakterium zugewiesen werden. Einige der
von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodierten Polypeptide besitzen
ein Signalpeptid und werden durch den Sec-abhängigen Transport
mechanismus an ihre Zielstelle exportiert, während andere kein Signalpeptid
besitzen und daher wahrscheinlich über einen Sec-unabhängigen
Transportmechanismus, z. B. durch das ABC-Transporter-System, sekretiert
werden (siehe Tabellen I und II).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der
erfindungsgemäßen Polypeptide und -fragmente. Die Herstellung von
erfindungsgemäßen Polypeptiden erfolgt vorzugsweise dadurch, daß man
eine Zelle mit einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül oder Vektor
transformiert, die transformierte Zelle unter Bedingungen kultiviert, bei
denen eine Expression des Polypeptids stattfindet, und das Polypeptid aus
der Zelle oder/und aus dem Kulturüberstand isoliert. Dabei kann das
erfindungsgemäße Polypeptid sowohl als Fusionspolypeptid als auch als
Nichtfusionspolypeptid gewonnen werden.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann als Immunogen zur Herstellung von
Antikörpern verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch einen Antikörper, der gegen
ein erfindungsgemäßes Polypeptid gerichtet ist. Ebenfalls Gegenstand der
Erfindung sind Fragmente solcher Antikörper, wie z. B. Fab-Fragmente oder
Fc-Fragmente.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Inhibitor der
erfindungsgemäßen Polypeptide, deren Fragmente, bzw. deren Expression,
Präsentation oder/und natürlichen Funktion. Dies ist bevorzugt ein Molekül,
welches in der Lage ist, spezifisch an ein Polypeptid oder Fragment davon
zu binden oder/und dessen Expression, Präsentation oder/und natürliche
Funktion zu beeinflussen. Die Identifizierung von solchen spezifischen
Bindepartnern wurde oben bereits beschrieben. Besonders geeignet als
Inhibitoren sind Proteine oder Peptide, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid
in seinen natürlichen Funktion hemmen, z. B. können Enzyme durch
Blockieren des aktiven Zentrums gehemmt werden.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine
pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff ein
erfindungsgemäßes DNA-Molekül, einen erfindungsgemäßen Vektor, eine
erfindungsgemäße Zelle, ein erfindungsgemäßes Polypeptid, einen
erfindungsgemäßen Antikörper oder Fragment davon oder/und ein
inhibitorisches Molekül, das in der Lage ist, spezifisch an ein
erfindungsgemäßes Polypeptid zu binden, gegebenenfalls zusammen mit üb
lichen pharmazeutischen Hilfs-, Verdünnungs-, Zusatz- und Trägermitteln
enthält.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auf ver
schiedene Art und Weise und unter Verwendung einzelner ihrer Bestandteile
als wirksame Substanzen zur Hemmung der Reproduktion von Hellcobacter
Organismen in einem Wirt, speziell im Menschen verwendet werden.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann einerseits
zur Diagnostik einer Helicobacter-Infektion verwendet werden. Die
Diagnostik auf Nukleinsäureebene erfolgt vorzugsweise durch Verwendung
von Hybridisierungssonden, bzw. Primern, welche eine spezifische DNA-
Sequenz aufweisen, die zu mindestens einen Abschnitt einer der in SEG ID
NO. 1 bis 113 (ungerade Zahlen) dargestellten Sequenzen komplementär ist,
so daß sie eine Amplifikation der erfindungsgemäßen Sequenzen erlauben.
Wir bereits erwähnt, können diese Amplifikationsprimer oder Sonden auch
zur Amplifikation und damit zur Detektion von verwandten Mikroorganismen
verwendet werden, wenn diese Gensequenzen aufweisen, die für dasselbe
essentielle Gen kodieren. Auf Proteinebene erfolgt die Diagnostik
vorzugsweise mit Hilfe der erfindungsgemäßen Antikörper.
Des weiteren ist die pharmazeutische Zusammensetzung zur Prophylaxe und
Bekämpfung von Helicobacter-Infektionen und Infektionen mit verwandten
Mikroorganismen geeignet.
Ein weiterer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die
Verwendung der identifizierten essentiellen Gene von Hellcobacter pylori zur
Prävention oder Bekämpfung einer Infektion mit Helicobacter oder
verwandten Mikroorganismen. Insbesondere können diese identifizierten
essentiellen Gene zur Herstellung von Impfstoffen (Vakzinen) verwendet
werden (siehe oben).
Eine weitere Verwendung der Polypeptide der Erfindung besteht in der
Aufreinigung der Antikörper gegen H. pylori Polypeptide und gegen
entsprechende Polypeptide aus verwandten und anderen Mikroorganismen.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele, Abbildungen und das
Sequenzprotokoll näher erläutert. Im Sequenzprotokoll sind die folgenden
Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen dargestellt.
Abb. 1 zeigt eine schematische Darstellung eines CAI-Vektors.
Abb. 2 zeigt eine schematische Darstellung eines Verfahrens der
konditionalen Antisense-Hemmung (CAI).
Abb. 3 zeigt eine schematische Darstellung der Untersuchung der
Lebendfähigkeitvon defizienten Mikroorganismen anhand ihrer
Überlebensraten mit Hilfe des CIA-Verfahrens.
Abb. 4 zeigt eine schematische Darstellung des subtraktiven CAI-
Verfahrens (CAI).
Abb. 5 zeigt eine schematische Darstellung eines SRM-Vektors.
Abb. 6 zeigt eine schematische Darstellung der reversiblen
Inaktivierung eines Gens durch die Insertion/Excision eines
konditional replizierenden SRM-Plasmids.
Abb. 7 zeigt eine schematische Darstellung eines SRM-Verfahrens.
Abb. 8 zeigt eine schematische Darstellung der Anreicherung von
Fragmenten essentieller Gene durch subtraktive Hybridisierung.
Die Anwendung des dargestellten Gesamtverfahrens ist exemplarisch am
Beispiel des Pathogens Helicobacter dargestellt, läßt jedoch auch mit
anderen pathogenen Keimen durchführen.
Anreicherung von H. pylori Genen kodierend für sekretorische/exkretorische
Polypeptide
Herstellung einer H. pylori Genbank im Minimalvektor pMin2: Als
Ausgangsstamm dient der H. pylori Wildtyp Stamm 69A. Die Bakterien
werden auf Serumplatten oder einem anderen adäquaten Medium
(Westblom et at., 1991) bei einer Temperatur von 37°C in einer
Atmosphäre von 5% O2, 10% CO2, 85% N2 angezüchtet. Die Isolierung der
chromosomalen DNA erfolgt nach der Methode von Leying et al., (1992),
wobei die DNA anschließend über einen Cäsium-Chlorid-Gradienten
aufgereinigt wird. 50 µg der gereinigten, chromosomalen DNA wird mit den
Restriktionsendonukleasen Sau3A und HpaII partiell gespalten, die DNA
Fragmente in einem Agarosegel aufgetrennt und die Fragmente in einer
Größe von 3 bis 6 kbp aus dem Gel mit Hilfe des Geneclean II Kits (Bio101)
eluiert. Die isolierten DNA-Fragmente werden in den Bg/II und ClaI
geschnittenen pMin2-Vektor (Kahrs et al., 1995) kloniert und über
Elektroporation in den E.coli-Stamm E181 transformiert, dem zuvor das
Plasmid pTnMax9 übertragen wurde. Insgesamt werden über einen solchen
Ansatz ca. 4000 Klone generiert. Der E.coli-Stamm E181 ist ein Derivat des
Stammes HB101 (Boyer und Roulland-Dussoix, 1969) und enthält den
lysogenen-Phagen CH616 zur Replikation des pTnMax9-Plasmids.
36 g GC-Agar (Basis) in 910 ml Aqua dest. suspendieren und autoklavieren
- - auf ca. 45°C abkühlen lassen
- - Zugabe von 10 ml Vitaminmix
- - Zugabe von jeweils 1 ml der Antibiotikastammlösung:
- - Vancomycin (10 mg/l, in Aqua bidest)
- - Nystatin (0,793 mg/l in DMF*)
- - Trimethoprim (5 mgh in DMF*)
- - Amphotericin (5 mg/l in DMF*)
*DMF = Dimethylformamid
- - Zugabe von 90 ml Serum oder
- - Zugabe von 8% Pferdeblut = 80 ml
- - oder gleiche Menge Humanblut
Vancomycin | 100 mg in 10 ml Aqua bidest |
Nystatin | 7,93 mg in 10 ml DMF (je 1 ml pro Liter GC-Agar zusetzen) |
Trimethoprim | 50 mg in 10 ml DMF |
Amphotericin | 50 mg in 10 ml DMF |
AL=L<(Lagerung im Kühlschrank bis max. 8 Wochen) |
Dextrose (D-Glucose) | 100 g |
L-Glutamin | 10 g |
Cystein HCl (C3H7NO2S x HCl x H2O) | 26 g |
Cocarboxylase | 100 mg in 50 ml |
Fe (NO3)3 | 20 mg Aquabidest. lösen |
Thiamin HCl | 3 mg |
DPN NAD | 250 mg |
Vitamin B,12 | 10 mg |
L-Cystein C6H12N2O4S2) | 1,1 g |
Adenin | 1,0 g in 15 ml HCl |
Guanin Cl | 30 mg (32%ig) lösen |
Uracil | 500 mg |
L-Arginin HCl | 150 mg |
p-Aminobenzoesäure | 13 mg |
AL=L<(sterilfiltrieren, in 10 ml Portionen abfüllen und einfrieren) |
Genetische Anreicherung sekretorischer/exkretorischer H. pylori
Genorodukte: Das auf pTnMax9 liegende Transposon TnMax9 ist mit dem
genetischen Marker β-Lactamase ausgestattet. Dieser Marker ist auf dem
Transposon so angelegt, daß damit die Selektion erfolgreicher Transposon-
Insertionen ermöglicht wird, wenn dieses im korrekten Leserahmen solcher
Gene vorliegt, deren Produkte von E.coli-Stamm E145rif sekretiert bzw.
exportiert werden. Die Insertion des Transposons in ein solches Gen führt
zu einer Genfusion zwischen dem Zielgen und dem Marker, wobei durch ein
im Zielgen determiniertes Sekretions- und/oder Exportsignal das
Fusionsprotein aus der Zelle geschleust wird und die Aktivität des integralen
Reportergens entfaltet wird. Im Fall der β-Lactamase können die Klone
direkt über die Entwicklung einer Resistenz gegen Ampicillin nachgewiesen
werden. Das TnMax9 Transposon auf pTnMax9 wird über IPTG aktiviert.
Die Transposon-Mutagenese der Genbank wird in Pools von bis zu 20
Einzelklonen durchgeführt. Die jeweiligen Pools weren auf LB-Platten
ausplattiert, die mit 100 µM IPTG, 15 µg/ml Chloramphenicol und 15 µg/ml
Tetrazyklin versetzt sind. In einem zweiten Schritt werden die TnMax9
mutagenisierten pMin2-Plasmide über Konjugation in den E.coli Stamm
E145rif überführt, da diese mit einem entsprechenden mob-Signal (oriT)
ausgestattet sind. Die pTnMax9-Plasmide werden dagegen nicht übertragen.
Folglich kommt es in E.coli E145rif zu einer spezifischen Vervielfältigung der
mutagenisierten pMin2 Genbank. Die entsprechenden Transkonjuganten
werden auf LB-Medium mit 15 µg/ml Chloramphenicol, 15 µg/ml Tetrazyklin
und 100 µg/ml Rifampicin selektioniert. Insgesamt werden 500 bis 1000
Transkonjuganten in 2 ml LB-Medium zusammengefaßt und in
entsprechenden Verdünnungen (10-1 bis 10-2) auf LB-Platten angezüchtet,
die mit 50 µg/ml Ampicillin versetzt sind. Nach einer Kultivierung der Platten
über 36 Stunden bei 37°C erhält man im gesamten Ansatz 200 bis 300
Ampicillin-resistente Klone mit Transposon inserierten Plasmiden.
Herstellung Gen-defizienter H. pylori , die in sekretorische/exkretorische
Polypeptide kodierende Gene mutiert sind und die Identifizierung solcher
Gene mit essentieller biologischer Funktion.
Herstellung Gen-defizienter H. pylori Mutanten: Durch Einbringung der
gewonnenen Plasmide mit den TnMax9-mutierten H. pylori Genen, kodierend
für sekretierte/exkretierte Polypeptide in einen H. pylori Wildtyp Stamm
können Gen-spezifische Mutanten erzeugt werden. Bedingt durch die
klonierten H. pylori Gensequenzen auf den Plasmiden kommt es im Falle
eines doppelten homologen Rekombinationsereignisses zu der genomischen
Insertion des TnMax9-Transposons in das chromosomale Zielgen und damit
zu dessen Inaktivierung. Durch den genetischen Marker auf dem Transposon
kann dieser Vorgang selektioniert werden, da das pMin2 Plasmid in H. pylori
nicht repliziert wird.
In der Durchführung wird der H. pylori Wildtyp Stamm 69A in Einzelansätzen
mit den gewonnenen individuellen Plasmiden transformiert, wobei die
natürliche Kompetenz des Bakteriums, DNA aufzunehmen, ausgenutzt wird.
Entsprechend den Standard Kultivierungsbedingungen werden die Bakterien
in BHI-Medium aufgenommen und bis zu einer optischen Dichte bei 550 nm
von 0,1 bei 37°C unter mikoraerophilen Bedingungen angezüchtet. Die
einzelnen Kulturansätze werden jeweils mit 200 bis 599 ng gereinigte
Plasmid-DNA versetzt und die Kultur über Nacht fortgesetzt.
Charakterisierung der biologischen Funktion der Gen-defizienten H. pylori
Mutanten im Wachstumstest: Die einzelnen Ansätze werden nach der
Kultivierung auf Serumplatten ausplattiert, welche mit 4 µg/ml
Chloramphenicol versetzt sind. Hinsichtlich der Wachsumseigenschaften der
einzelnen Mutanten im Vergleich zum Wildtyp Stamm können 3 Kategorien
unterschieden werden: (1) Mutanten, die nicht wachsen; (2) Mutanten, die
kleinere Kolonien ausbilden; (3) Mutanten, die eine normale Koloniegröße
entwickeln. Diese Ergebnisse können für jedes Ausgangsplasmid
reproduzierbar erzielt werden. Zur eindeutigen Beurteilung der biologischen
Bedeutung der Gen-defizienten Mutanten der Kategorie 1 werden diese dem
CAI-Verfahren zugeführt. Die Gen-defizienten Mutanten der Kategorie 2 und
3 werden in den anderen biologischen Testsystemen analysiert.
Ermittlung der Identität der H. pylori Gene kodierend für
sekretorische/exportierte Polypeptide.
Zur Ermittlung der Primärstruktur der identifizierten H. pylori Gene, werden
die jeweiligen Ausgangsplasmide aus dem E.coli Stamm verwendet. Die
Plasmide werden aus diesen Stämmen isoliert und die Nukleotidsequenz der
Zielgene durch Sequenzierung der Bereiche oberhalb und unterhalb der
Insertionsstelle des Transposons im Zielgen bestimmt. Das Leseraster des
Zielgens kann direkt ermittelt werden, da das Transposon-kodierte β-
Laktamase Gen eine aktive Fusion mit dem Genprodukt des Zielgens eingeht
(s. o.). Die Sequenzierung wird mit Hilfe eines ABI-Sequenz-Automaten nach
Angaben des Herstellers mit folgenden Sequenzprimern durchgeführt: M 13-
F (GTAAAACGACGGCCAGT) und M13-RP1 (CAGGAAACAGCTATGACC).
Zur weiteren Charakerisierung der Gene wird die Datenbank Genebank des
GCG-Programms herangezogen, z. B. zur Identifizierung bekannter,
homologer Gene anderer Mikroorganismen (FASTA), zur Identifizierung
potentieller Signalpeptidbereiche (SPSCAN) oder zur Identifizierung von
Lipoproteinen (MOTIFS).
Bei einem Teil der charakterisierten Klone konnte nicht die vollständige
Gensequenz ermittelt werden, da das klonierte DNA-Fragment nicht das
gesamte Gen enthielt. Das verfügbare DNA-Fragment wird dazu eingesetzt,
um aus der Original-Genbank ein DNA-Fragment mit vollständigen Gen zu
isolieren. Aus diesen Klonen können dann mit einem Gen-spezifischen
Primer und einem Vektor-spezifischen Primer die fehlenden Gensequenzen
amplifiziert und anschließend direkt sequenziert werden.
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Claims (57)
1. Verfahren zur Bereitstellung von Mitteln zum Nachweis, zur
Prävention oder/und zur Therapie von mikrobiellen Infektionen,
dadurch gekennzeichnet,
daß es die Schritte umfaßt:
- A) Identifizieren von essentiellen Genen und den entsprechenden Polypeptiden durch Herstellung gendefizienter Mikroorganismen durch konditionale Antisense-Hemmung (CAI) oder/und subtraktive Rekombinations-Mutagenese (SRM) und Bestimmung der Lebens- oder/und Überlebensfähigkeitder gendefizienten Mikroorganismen in einem Testsystem.
- B) Identifizieren von spezifischen Wirkstoffen, welche gegen die essentiellen Polypeptide gerichtet sind und die Inaktiviertung der Mikroorganismen oder verwendeter Mikroorganismen herbeiführen.
- C) Testen der identifizierten Wirkstoffe auf ihre Anwendbarkeit als Bestandteile von diagnostischen, präventiven oder/und therapeutischen Mitteln,
- D) Formulieren der anwendbaren Wirkstoffe als diagnostische, präventive oder/und therapeutische Mittel.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß obligat essentielle Gene durch CAI identifiziert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß fakultativ essentielle Gene durch SRM identifiziert werden.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß vor Schritt (A) eine Selektion auf Gene durchgeführt wird, die für
Polypeptide mit einer bestimmten Funktionalität kodieren oder/und die
für Polypeptide kodieren, die in einer bestimmten Entwicklungsstufe
exprimiert werden.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Selektion mit Hilfe von Hybridisierungsverfahren durchgeführt
wird, ausgewählt aus Subtraktions- und Array-Verfahren.
6. Verfahren nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Selektion auf spezifische subtrahierte apathogene oder
pathogene Gene durchgeführt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Selektion auf spezifische subtrahierte Gene von H. pylori oder
H. heilmannii durchgeführt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß für exportierte Polypeptide kodierende Gensequenzen selektiert
werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8,
dadurch gekennzeichnet,
daß für sekretierte Polypeptide kodierende Gensequenzen selektiert
werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9,
dadurch gekennzeichnet,
daß für Polypeptide kodierende Gene selektiert werden, welche zur
Entwicklung der vitalen Form aus der Überdauerungsform notwendig
sind.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9,
dadurch gekennzeichnet,
daß für Polypeptide kodierende Gene selektiert werden, welche zur
Entwicklung der Überdauerungsform aus der vitalen Form notwendig
sind.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß in Schritt (A) zur Bestimmung der Lebens- und
Überlebensfähigkeit der gendefizienten Mikroorganismen
Testsysteme, ausgewählt aus In-vitro-Systemen, Zellkultursystemen,
Gewebekultursystemen und Tiermodellen als natürliche Umgebung
verwendet werden.
13. Verfahren nach Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet,
daß diejenigen defizienten Gensequenzen, welche zu nicht
kultivierbaren und in natürlicher Umgebung nicht überlebensfähigen
gendefizienten Mikroorganismen führen, der Kategorie der obligat
essentiellen Gene zugeordnet werden.
14. Verfahren nach Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet,
daß diejenigen defizienten Gensequenzen, welche zu kultivierbaren
aber in natürlicher Umgebung nicht überlebensfähigen defizienten
Mikroorganismen führen, der Kategorie der fakultativ essentiellen
Gene zugeordnet werden.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die identifizierten Gene zur Herstellung von Primern verwendet
werden, mit Hilfe derer entsprechende Gene aus verwandten
Mikroorganismen, Subspezies oder/und Arten identifiziert werden.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß in Schritt (B) spezifische Wirkstoffe identifiziert werden, welche
die Expression, Präsentation oder/und Funktion der essentiellen
Polypeptide beeinflussen, insbesondere immunologisch wirksame
Substanzen, Bindepartner der Polypeptide oder deren Fragmente
oder/und inhibitorische Substanzen.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß Schritt (B) eine Bestimmung des immunogenen Potentials der
Polypeptide oder/und deren Fragmente umfaßt, wobei die
identifzierten Gene exprimiert werden und anschließend eine
Western-Blot-Analyse durchgeführt wird oder/und daß mit den
identifzierten Polypeptiden oder Fragmenten davon eine Vakzinierung
in Zellkultur oder im Tiermodell durchgeführt und die Auslösung einer
spezifischen Immunreaktion beobachtet wird.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß Schritt (B) eine Bestimmung des Bindungspotentials der
Polypeptide oder deren Fragmente durch Screening von
Substanzenbibliotheken, Oberflächendisplayverfahren, kristallo
graphische Analyse oder/und Computer-Modelling umfaßt.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die diagnostischen, präventiven oder/und therapeutischen Mittel
in Form von passiven Impfstoffen oder aktiven Impfstoffen
bereitgestellt werden.
20. Verfahren nach Anspruch 19,
dadurch gekennzeichnet,
daß die passiven Impfstoffe in Form von Antikörpern oder/und
Antikörperfragmenten und die aktiven Impfstoffe in Form von
heterologen Trägersystemen oder/und in Form von Antigenen,
Antigenfragmenten, Subunit-Vakzinen, Lebendvakzinen, DNA-
Vakzinen oder/und Lebensmittelvakzinen bereitgestellt werden.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 19,
dadurch gekennzeichnet,
daß die diagnostischen, präventiven oder/und therapeutischen Mittel
inhibitorische Substanzen umfassen, insbesondere Expressionsinhibi
toren oder/und Enzyminhibitoren.
22. Verfahren zur Identifizierung essentieller mikrobieller Gene,
dadurch gekennzeichnet,
daß es die Schritte umfaßt:
- a) Herstellen von gendefizienten Mikroorganismen,
- b) Bestimmen der Lebens- oder/und Überlebensfähigkeit der gendefizienten Mikroorganismen aus (i),
- c) Identifizieren eines proteinkodierenden Abschnitts einer mikrobiellen DNA-Sequenz, in der die gendefizienten Mikroorganismen defizient sind.
- d) Charakterisieren derjenigen DNA-Abschnitte, die essentiell für die Überlebensfähigkeit sind.
23. Verfahren nach Anspruch 22,
dadurch gekennzeichnet,
daß die gendefizienten Mikroorganismen hergestellt werden, indem
ein DNA-Abschnitt in einem mikrobiellen Genom mutagenisiert wird.
24. Verfahren nach Anspruch 22,
dadurch gekennzeichnet,
daß der DNA-Abschnitt durch Transposon-Mutagenese mutagenisiert
wird.
25. Verfahren nach Anspruch 23,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Mutagenisierung des DNA-Abschnitts auf dem mikrobiellen
Genom durch homologe Rekombination erfolgt.
26. Verfahren nach Anspruch 25,
dadurch gekennzeichnet,
daß das SRM-Verfahren angewendet wird.
27. Verfahren nach Anspruch 23,
dadurch gekennzeichnet,
daß die gendefizienten Mikroorganismen hergestellt werden, indem
in Mikroorganismen ein DNA-Abschnitt oder eine Teilsequenz davon
in Form von Antisense-RNA exprimiert wird.
28. Verfahren nach Anspruch 27,
dadurch gekennzeichnet,
daß das CAI-Verfahren angewendet wird.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 28,
dadurch gekennzeichnet,
daß zur Bestimmung der Lebens- oder/und Überlebensfähigkeit der
gendefizienten Mikroorganismen Testsysteme ausgewählt aus In-
vitro-Systemen, Zellkultursystemen, Gewebekultursystemen und
Tiermodellen als natürliche Umgebung verwendet werden.
30. Verfahren nach Anspruch 29,
dadurch gekennzeichnet,
daß diejenigen defizienten Gensequenzen, welche zu nicht
kultivierbaren und in natürlicher Umgebung nicht überlebensfähigen
gendefizienten Mikroorganismen führen, der Kategorie der obligat
essentiellen Gene zugeordnet werden.
31. Verfahren nach Anspruch 29,
dadurch gekennzeichnet,
daß diejenigen defizienten Gensequenzen, welche zu kultivierbaren
aber in natürlicher Umgebung nicht überlebensfähigen defizienten
Mikroorganismen führen, der Kategorie der fakultativ essentiellen
Gene zugeordnet werden.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 31,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Identifizieren des proteinkodierenden DNA-Abschnitts durch
Expression in einem Wirtsorganismus und Nachweis des
Vorhandenseins eines Expressionsproduktes erfolgt.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 32,
dadurch gekennzeichnet,
daß es weiterhin umfaßt:
- a) Herstellen von Primern zur Amplifikation und Detektion von homologen Gensequenzen in heterologen Mikroorganismen
- b) Identifizieren der homologen Gensequenzen.
34. Nukleinsäure, kodierend für ein essentielles sekretorisches Gen aus
Helicobacter, identifiziert durch das Verfahren nach einem der
Ansprüche 22 bis 33.
35. Nukleinsäure nach Anspruch 34,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie für ein sekretiertes Polypeptid mit Signalpeptid kodiert.
36. Nukleinsäure nach Anspruch 34,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie für ein sekretiertes Polypeptid ohne Signalpeptid kodiert.
37. Nukleinsäure,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie
- a) eine der in SEQ ID NO: n, wobei n eine ungerade ganze Zahl von 1 bis 113 einschließlich darstellt, dargestellten Nukleinsäuresequenzen, oder einen proteinkodierenden Abschnitt davon,
- b) eine einer der Sequenzen aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder
- c) eine mit einer der Sequenzen aus (a) und/oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt.
38. Genbank, umfassend mindestens zwei Nukleinsäuren nach einem der
Ansprüche 34 bis 37.
39. Vektor,
dadurch gekennzeichnet,
daß er mindestens eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 34
bis 37 oder einen Abschnitt davon enthält.
40. Vektor nach Anspruch 39,
dadurch gekennzeichnet,
daß er ein CAI-Vektor ist.
41. Vektor nach Anspruch 39,
dadurch gekennzeichnet,
daß er ein SRM-Vektor ist.
42. Zelle,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 34 bis 37
oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 39 bis 41 transformiert
ist.
43. Mutantenbank,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie aus mindestens zwei Mikroorganismen besteht, die mit einem
Vektor nach Anspruch 40 oder einem Vektor nach Anspruch 41
transformiert sind.
44. Polypeptid,
dadurch gekennzeichnet,
daß es von einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 34 bis 37
kodiert ist.
45. Polypeptid nach Anspruch 44,
dadurch gekennzeichnet,
daß es
- a) eine der in SEQ ID NO: m, wobei m eine gerade ganze Zahl von 2 bis 114 einschließlich darstellt, dargestellten Aminosäuresequenzen oder
- b) eine mit einer der Sequenzen gemäß (a) immunologisch kreuzreagierende Sequenz umfaßt.
46. Polypeptid nach Anspruch 45,
dadurch gekennzeichnet,
daß es ein essentielles sekretiertes Polypeptid ist.
47. Polypeptidfragment,
dadurch gekennzeichnet,
daß es einen immunogenen Abschnitt einer der Sequenzen nach
Anspruch 45 aufweist.
48. Inhibitorisches Molekül, erhältlich durch das Verfahren nach
Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß es in der Lage ist, spezifisch an ein Polypeptid oder Fragment
davon nach einem der Ansprüche 44 bis 47 zu binden oder/und
dessen Expression, Präsentation oder/und natürliche Funktion zu
beeinflussen.
49. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids oder Polypeptidfragments
nach einem der Ansprüche 44 bis 47,
dadurch gekennzeichnet,
daß man eine Zelle mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche
34 bis 37 oder einem Vektor nach Anspruch 39 transformiert, die
transformierte Zelle unter Bedingungen kultiviert, bei denen eine
Expression des Polypeptids stattfindet und das Polypeptid aus der
Zelle oder/und dem Kulturüberstand isoliert.
50. Verwendung eines Polypeptids oder eines Fragmentes davon nach
einem der Ansprüche 44 bis 47 davon als Immunogen zur Erzeugung
von Antikörpern.
51. Antikörper oder Fragment davon,
dadurch gekennzeichnet,
daß er spezifisch ist für ein Polypeptid oder ein Fragment davon nach
einem der Ansprüche 44 bis 47.
52. Pharmazeutische Zusammensetzung,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie als Wirkstoff
- a) eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 34 bis 37,
- b) einen Vektor nach Anspruch 39,
- c) eine Zelle nach Anspruch 42,
- d) ein Polypeptid oder ein Fragment davon nach einem der Ansprüche 44 bis 47,
- e) einen Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 51 und/oder
- f) ein inhibitorisches Molekül nach Anspruch 48, gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmazeutischen Hilfs-, Verdünnungs-, Zusatz- und Trägermitteln, enthält.
53. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach
Anspruch 52 zur Diagnostik, Prävention oder/und Therapie einer
Helicobacter-Infektion.
54. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach
Anspruch 52 zur Hemmung der Reproduktion von Helicobacter-
Organismen und/oder anderen anthrogenen Mikroorganismen in
einem Wirt.
55. Verwendung nach Anspruch 54,
dadurch gekennzeichnet,
daß eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 34 bis 37 als DNA-
Vakzin formuliert wird.
56. Verwendung nach Anspruch 54,
dadurch gekennzeichnet,
daß ein Polypeptid oder Polypeptidfragment nach einem der
Ansprüche 44 bis 47 als Subunit-Vakzin oder als Lebendvakzin
formuliert wird.
57. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach
Anspruch 52 zur Herstellung eines Mittels für die Diagnostik,
Prävention oder/und Therapie einer Helicobacter-Infektion.
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