DE19916638A1 - Oberflächen zur Verbesserung des Bindungsverhaltens von Analytmolekülen auf der Basis kovalent gebundener hydrophiler Spacer an Hydrogelen - Google Patents

Oberflächen zur Verbesserung des Bindungsverhaltens von Analytmolekülen auf der Basis kovalent gebundener hydrophiler Spacer an Hydrogelen

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Gegenstand mit einer Oberfläche, umfassend ein Hydrogel, bei dem Rezeptormoleküle ungerichtet gebunden sind.

Description

Während der letzten zehn Jahre hat sich die Technologie der optischen Biosensoren auf der Basis von Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie (SPR) stark entwickelt, so daß heutzutage eine Reihe solcher Geräte einen festen Platz auf dem Markt erobert haben (Biacore, Texas Instruments, Intersens, BioTuL). Die Sensoroberflächen dieser und anderer Biosensoren, die für die Transduktion einer biospezifischen Erkennungsreaktion eines Analyten verantwortlich sind, sind häufig mit einer funktionalisierten Polysaccharidschicht oder einer Schicht eines anderen hydrophilen Polymeren versehen, die zum einen über funktionelle Gruppen die kovalente Bindung von Rezeptormolekülen ermöglichen (B. Johnsson, S. Löfås & G. Lindquist, Anal. Biochem. 198 (1991), 268), zum anderen die Aufgabe erfüllen, unspezifische Adsorption von Probenbestandteilen zu verhindern (EP-B-589 867 bzw. Deutsche Patentanmeldung 198 17 180.3). Die hydrophile Polymerschicht an der Oberfläche besitzt den Charakter eines Hydrogels, ist also quellbar und zudem flexibel. Beide Eigenschaften sind für die Funktion dieser Schicht erwünscht, da auf und in ihr Rezeptormoleküle fixiert werden, die so flexibel angebunden sein müssen, daß sie nach der Immobilisierung noch zur Bindung von Analytmolekülen in der Lage sind.
Neben der Verwendung von Hydrogelen ist es ebenfalls üblich, Rezeptormoleküle über flexible Moleküle - sogenannte Spacer - direkt kovalent an Sensoroberflächen zu binden. Von Bindungsexperimenten an Monoschichtsystemen, die aufgrund ihres Aufbauprinzips wesentlich unflexibler sind als Hydrogele, ist bekannt, daß die Spacerlänge sowohl für die Reaktivität funktioneller Gruppen als auch für das spezifische Bindungsverhalten maßgeblich ist (D. D. Schlereth, J. Electroanal. Chem. 425 (1997), 77; L. Bertilsson, H. J. Butt, G. Nelles, D. D. Schlereth, Biosensors & Bioelectronics 12 (1997), 839; T. Wink, S. J. van Zuilen, A. Bult, W. P. von Bennekom, Analyst 122, 43R (1997)).
Anders als bei solchen unquellbaren und nur moderat flexiblen Monoschicht­ systemen wurde der Spacerlänge zwischen Hydrogel und Rezeptoren bisher keine Beachtung geschenkt. Ein Einfluß der Kettenlänge auf das Bindungsverhalten der Ligandmoleküle an den Rezeptor wurde nicht vermutet, da das Hydrogel an sich ohnehin flexibel ist. Die bisher bekannten Hydrogele auf Biosensoroberflächen haben daher den in Fig. 1 gezeigten schematischen Aufbau. Die Oberfläche des Sensors umfaßt eine Metallschicht 14, auf die ggf. eine oder mehrere Zwischen­ schichten 13 aufgebracht sind. Der Rezeptor 11 ist über einen kurzen, unflexiblen Spacer an das Hydrogel 12 gebunden.
Die Anbindung von Rezeptormolekülen an die Hydrogelschicht kann entweder gerichtet oder ungerichtet erfolgen. Bei einer gerichteten Anbindung weist das Rezeptormolekül meistens nur einen Rest oder evtl. nur wenige (z. B. weniger als drei) gleichartige Reste auf, die mit dem ggf. derivatisiertem Hydrogel umgesetzt werden können. Die entstehende gerichtete Bindung ist folglich räumlich genau definiert. Häufig müssen die Rezeptormoleküle vor der Umsetzung derivatisiert werden, damit sie einen geeigneten, reaktiven Rest aufweisen. Bei einer ungerichteten Anbindung dagegen weist das Rezeptormolekül eine Vielzahl (z. B. mindestens drei) gleichartiger Reste auf, die mit dem ggf. derivatisierten Hydrogel umgesetzt werden können. Da nur einer dieser Reste mit dem Hydrogel reagiert, ist die Lage der Bindung räumlich nicht vorhersehbar. Als Konsequenz befindet sich die Bindungsstelle bzw. die Bindungsstellen des Rezeptors in einer undefinierten sterischen Anordnung zum Hydrogel, was wiederum die Zugänglichkeit dieser Bindungsstellen für Analytmoleküle beeinträchtigt und dementsprechend die Bindungskinetik der Analyt/Rezeptorwechselwirkungen beeinflussen kann.
In der US-Patentschrift US-A-5,395,587 werden zur Anbindung von Biotin als Rezeptormolekül kurz- und langkettige Spacer verwendet. Es wird jedoch kein Einfluß der Länge des Spacers beschrieben. Es wird zudem ausschließlich die gerichteten Anbindung von Rezeptormolekülen und nicht die ungerichtete Anbindung untersucht.
Ziel der Erfindung war es, einen Gegenstand, bevorzugt einen Biosensor, bereitzustellen, an den eine Vielzahl von Rezeptormolekülen angebunden werden können. Vorzugsweise sollte keine Vorbehandlung der Rezeptormoleküle nötig sein.
Überraschenderweise zeigte sich, daß bei Gegenständen mit einer Hydrogelschicht die Länge des Spacers zwischen Hydrogel und Rezeptor für das Bindungsverhalten von Analytmolekülen bei ungerichteten Bindungen eine Rolle spielt. Dies eröffnet die Möglichkeit, Gegenstände bereitzustellen, die ein an bestimmte Problem­ stellungen verbessertes Bindungsverhalten ermöglichen. Durch verbesserte Zugänglichkeit auf Grund erhöhter Flexibilität wird das Bindungsverhalten der Analytmoleküle trotz ungerichteter Bindung der Rezeptoren einheitlicher und dem Verhalten der beiden freien Spezies in Lösung ähnlicher.
Die Erfindung betrifft somit einen Gegenstand mit einer Oberfläche, umfassend ein Hydrogel, erhältlich durch:
  • a) Anbinden von organischen Molekülen an das Hydrogel, wobei die gebundenen organischen Moleküle jeweils eine Kettenlänge von mindestens 8 Atomen besitzen und einen terminalen Rest A, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe oder deren Derivate, aufweisen; und
  • b) Umsetzen des terminalen Restes mit einem Rezeptormolekül mit mindestens drei gleichartigen Resten B, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe, Sulfonsäurerest, Phosphorsäurerest, Phosphonsäurerest und deren Derivate.
In Fig. 2 ist eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Gegenstandes gezeigt. Er unterscheidet sich von dem herkömmlichen in Fig. 1 gezeigten Gegenstand, dadurch daß der Rezeptor über einen langkettige Spacer an das Hydrogel gebunden ist.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Gegenstandes mit einer funktionalisierten Hydrogeloberfläche, umfassend die Schritte:
  • a) Anbinden von organischen Molekülen an das Hydrogel, wobei die gebundenen organischen Moleküle jeweils eine Kettenlänge von mindestens 8 Atomen besitzen und einen terminalen Rest A, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe oder deren Derivate, aufweisen; und
  • b) Umsetzen des terminalen Restes A mit einem Rezeptormolekül mit mindestens drei gleichartigen Resten B, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe, Sulfonsäurerest, Phosphorsäurerest, Phosphonsäurerest und deren Derivate.
Die Erfindung beschreibt weiter die Verwendung eines erfindungsgemäßen Gegen­ standes bei der Detektion von Analytmolekülen.
Desweiteren wird die Verwendung eines Gegenstandes mit einer funktionalisierten Hydrogeloberfläche umfassend an das Hydrogel gebundene organische Moleküle, wobei die gebundenen organischen Moleküle jeweils eine Kettenlänge von mindestens 8 Atomen besitzen und einen terminalen Rest A, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe oder und deren Derivate, aufweisen, zur ungerichteten Anbindung eines Rezeptormoleküls mit mindestens drei gleichartigen Resten B, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe, Sulfonsäurerest, Phosphorsäurerest, Phosphonsäurerest und deren Derivate, beschrieben.
Verzeichnis der Figuren
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung eines herkömmlichen Gegenstandes mit einer Hydrogeloberfläche, bei dem die Rezeptoren durch kurze Spacer an das Hydrogel gebunden sind.
Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Gegen­ standes mit einer Hydrogeloberfläche, bei dem die Rezeptoren durch flexible, langkettige Spacer an das Hydrogel gebunden sind.
Fig. 3 zeigt den zeitlichen Verlauf der kovalenten Bindung von Lysozym bei dem erfindungsgemäßen Sensor (b) und dem Vergleichssensor (a) des Beispiels 1.
Fig. 4 zeigt den zeitlichen Verlauf der Assoziationsreaktion eines Einzelketten­ fragmentantikörpers an Lysozym bei dem erfindungsgemäßen Sensor (b) und dem Vergleichssensor (a) des Beispiels 1.
Um eine klarere Darstellung des relevanten Effektes zu ermöglichen, ist in den Fig. 1 und 2 der Effekt durch den veränderten Bulk-Brechungsindex bei Zugabe des Analyten rechnerisch entfernt. Die Effekte durch veränderte Brechungsindices wurden an inerten, nicht funktionalisierten Oberflächen (d. h. Hydrogel ohne funk­ tionelle Gruppen und Rezeptoren) gemessen und subtrahiert.
Die erfindungsgemäßen Gegenstände finden z. B. als Sensoren, vor allem Biosensoren, bei den verschiedensten analytischen Meßverfahren Verwendung. Beispiele für geeignete Einsatzgebiete der Gegenstände sind in der affinitäts­ basierenden Sensorik, wie die Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR) und Quarzwaagen sowie bei interferometrischen Meßmethoden, z. B. Reflektions­ interferenzkontrastmikroskopie und Reflektionsinterferenzspektroskopie. Besonders eignen sie sich zum Einsatz in der SPR. Der Aufbau der nicht funktionalisierten Oberfläche richtet sich nach dem analytischen Verfahren, in dem der erfindungs­ gemäße Gegenstand angewendet werden soll, und ist dem Fachmann bekannt (Journal of Biomedical Materials Research, 18 (953-959) (1984) und J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1990, 1526). Im Rahmen der Erfindung wird der Begriff "nicht funktionalisierte Oberfläche" verwendet, um die Oberfläche eines Gegenstandes mit der Hydrogelschicht vor der Anbindung der organischen Moleküle mit dem Rest A zu bezeichnen. Der Begriff "funktionalisierte Oberfläche" wird verwendet, um die Oberfläche eines Gegenstandes mit der Hydrogelschicht nach der Anbindung der organischen Moleküle mit dem Rest A zu bezeichnen. Der erfindungsgemäße Gegenstand besitzt eine Grundoberfläche, umfassend z. B. eine Glas-, Halbleiter- oder Metallschicht. Bevorzugt sind Metallschichten vor allem Edelmetallschichten z. B. aus Gold oder Silber wie sie z. B. in der SPR Verwendung finden.
Der nicht funktionalisierte Gegenstand weist eine Hydrogelschicht an der Oberfläche auf. Diese Schicht dient zur Verhinderung unspezifischer Adsorptionen, die das Meßsignal verfälschen. Hydrogele sind mit Wasser quellbare Polymere. Bei den Hydrogelen kann es sich z. B. um ein Polysaccharid, ein Derivat davon oder um ein quellbares organisches Polymer wie Poly{N-[tris-(hydroxymethyl)-methyl]-acrylsäure­ amid}, Polyvinylalkohol oder Polyethylenglykol handeln. Bevorzugt sind Poly­ saccharide. Als Derivate sind Aminoderivate oder Carboxyalkylderivate zu nennen, wobei der Alkylrest bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweist. Beispiele für Polysaccharide sind Amylose, Inulin, Pullulan oder Dextran. Bevorzugt sind Pullulan oder Dextran und deren Derivate. Besonders bevorzugt ist Dextran und dessen Derivate. Bevorzugt wird Carboxymethyldextran verwendet.
Die Hydrogelschicht sollte trocken mehrere Nanometer dick sein und quillt im wäßrigen Milieu zu einer Dicke von ca. 100 nm auf, wodurch die Oberfläche vollständig bedeckt wird. Die gequollene Polymerschicht ahmt die natürliche Umgebung von Biomolekülen nach und ist geeignet, eine Denaturierung und somit Inaktivierung der Biomoleküle zu verhindern. Zusätzlich wird die Adsorption von anderen als den zu analysierenden Molekülen wirksam unterdrückt. Außerdem ist die gequollene Hydrogelschicht in der Lage, Unregelmäßigkeiten der Oberfläche auszugleichen. Die Anbindung von Biomolekülen findet auch in der gequollenen Matrix und nicht nur unmittelbar an der Oberfläche statt. Hierdurch verringert sich die Bedeutung von Oberflächenunebenheiten, die sonst zu einer schlecht definierten Oberfläche und dadurch zu schlecht quantifizierbaren Meßergebnissen beitragen.
Verfahren zur Beschichtung von Oberflächen mit Hydrogelen sind bekannt (J. of Biomedical Materials Research, 18, 953 (1984), DE-A 198 17 180). Beispielsweise wird eine entsprechend vorbereitete Oberfläche (DE-A 198 17 180, EP-B-0 589 867) zwischen 1 h und 5 h, typischerweise 3 h, in eine entsprechende, frisch bereitete wäßrige Hydrogellösung hergestellt aus Hydroxypolymer gegeben. Die Konzentration des Hydroxypolymers in der Lösung liegt zwischen 10 und 500 mg.m-1.
An diese nicht funktionalisierte Hydrogelschicht werden organische Moleküle, die einen Rest A aufweisen, gebunden. Die gebundenen organischen Moleküle weisen einen terminalen Rest A, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe und deren Derivate, auf. Obwohl primäre Aminreste bevorzugt sind, können sekundäre Aminreste mit einem C1-4-Kohlenwasserstoffrest ebenfalls verwendet werden. Neben Carbonsäuregruppen können z. B. Anhydride und Carbonsäurehalogenide, wie Carbonsäurechloride, verwendet werden. Bevorzugt ist der terminale Rest A eine Carbonsäuregruppe.
Die gebundenen organischen Moleküle besitzen jeweils eine Kettenlänge von mindestens 8 Atomen. Über die Länge der Kette kann das Bindungsverhalten von Analytmolekülen beeinflußt werden. Bevorzugt hat die Kette 8 bis 40 Atome, stärker bevorzugt 10 bis 20 Atome. Die Kette kann eine substituierte oder nicht substituierte verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffkette sein. Die Kette ist bevorzugt linear. Bevorzugt sind diese Ketten ihrerseits hydrophil. Lange Alkylketten oder aromatische Reste in der Kette oder als Substituenten daran sind weniger geeignet, da diese über hydrophobe Wechselwirkungen auch unspezifische Adsorption verursachen könnten. Der hydrophile Charakter der Spacer kann durch den Einbau von Oligoethylenoxideinheiten (K. L. Prime & G. M. Whitesides, J. Am. Chem. Soc. 115 (1993), 10714, A. J. Pertsin, M. Grunze & I. A. Garbuzova, J. Phys. Chem. B 102 (1998), 4843) oder durch die Integration von hydrophilen Resten wie Amidgruppen eingestellt werden. So können z. B. bis zu 70% der Kohlenstoffatome zur Erhöhung der Hydrophilie der Kette durch N, S oder nicht peroxidischem O, bevorzugt N oder nicht peroxidischem O, ersetzt sein. Bevorzugt sind 10 bis 50% der Kohlenstoffatome durch die genannten Heteroatome ersetzt. Mögliche Substituenten sind C1-4-Kohlenwasserstoffreste, wie Alkyl- oder Alkylenreste, und bekannte hydrophile Substituenten wie Hydroxygruppen und carbonylisch gebundene Sauerstoffatome, vorzugsweise sind die Substituenten hydrophil. Sofern sie nicht als terminale Reste A verwendet werden können Aminreste, Carbon­ säuregruppen und deren Derivate ebenfalls als Substituenten verwendet werden. Die im Rahmen der Erfindung verwendeten Substituenten dürfen weder in Art noch Zahl so ausgewählt werden, daß sie die erfindungsgemäß wichtige Flexibilität der organischen Moleküle beeinträchtigen.
Die Kettenlänge ist die Anzahl der C, N, O und S Atome ab dem Hydrogel in der Hauptkette bis zum terminalen Rest, wobei dieser eingeschlossen ist. Wird ein Teil des terminalen Restes bei der Anbindung des Rezeptormoleküls abgespalten, so werden die abgespaltenen Atome nicht mitgezählt. Bei der Zählung werden nur die Atome der organischen Moleküle und die Atome, die z. B. durch die Derivatisierung des Hydrogels bedingt sind, mitgezählt.
Die Reaktionsbedingungen zur Kopplung der organischen Moleküle an die Hydrogelschicht variieren in Abhängigkeit von der gewählten Verbindung. Beispiele für diese Reaktionsbedingungen werden nachstehend in den bevorzugten Ausführungsformen und den Beispielen beschrieben.
Das Rezeptormolekül dient zur spezifischen Anbindung des Analytmoleküls. Deshalb ist es in der Regel ein Biomolekül. Beispiele geeigneter Rezeptormoleküle sind Proteine, Nucleinsäuren und biologisch aktive Oligo- oder Polysaccharide. Bevorzugt sind Proteine. Die Erfindung betrifft die ungerichtete Anbindung von Rezeptoren an eine Hydrogeloberfläche. Folglich weisen die Rezeptormoleküle mindestens 3, bevorzugt mindestens 5, stärker bevorzugt mindestens 10 gleich­ artige Reste B auf. Die maximale Anzahl der Reste B ist nicht beschränkt, das Rezeptormolekül sollte jedoch in dem verwendeten Lösungsmittel löslich sein. Bevorzugt weist das Rezeptormolekül höchstens 10000, stärker bevorzugt höchstens 1000 Reste B auf. Die Reaktivität der gleichartigen Reste muß nicht identisch sein, liegt aber in derselben Größenordnung. Die Reste B werden aus Aminrest, Carbonsäuregruppe, Sulfonsäurerest, Phosphorsäurerest, Phosphon­ säurerest und deren Derivate ausgewählt. Mögliche Derivate dürfen die Reaktion mit dem terminalen Rest A der organischen Moleküle nicht behindern, Geeignete Derivate sind z. B. Esterderivate der genannten Säuren mit mindestens einer -OH Gruppe, um die Reaktion mit dem Rest A zu ermöglichen. Es ist selbstverständlich, daß aktivierte Formen, die z. B. aus der Umsetzung von Aminresten mit Ethyl-3,3'- dimethylaminopropylcarbodiimid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) erhalten werden, ebenfalls verwendet werden können.
Analytmoleküle reagieren selektiv mit den verwendeten Rezeptoren. Sie sind deshalb ebenfalls meistens Biomoleküle. Geeignete Analytmoleküle sind Proteine, Nucleinsäuren und biologisch aktive Oligo- oder Polysaccharide. Bevorzugt sind Proteine.
Die Bedingungen, bei der die kovalente Anbindung des Analytmoleküls an den Rezeptor erfolgt, variieren in Abhängigkeit von dem gewählten System. Typischer­ weise erfolgt die Anbindung bei Raumtemperatur und in gepufferten, wässrigen Lösungen, die eine Analytkonzentration im Bereich von 0,5 bis 200 µg/ml und eine etwa 100 mM Pufferkonzentration, z. B. eines Phosphatpuffers, aufweisen. Typischerweise beträgt die Dauer der Umsetzung 10 Minuten bis 2 Stunden.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist in dem folgenden Schema gegeben (siehe auch das Beispiel).
Zunächst wird die Edelmetalloberfläche (z. B. Gold) mit einer Monoschicht aus Cysteamin belegt, in dem die Edelmetalloberfläche 12 bis 36 h in eine wässrige Lösung von 10-3 bis 5.10-2 mol.I-1 Cysteaminiumhydrochlorid gegeben wird.
Anschließend wird die Monoschicht mit Polyacrylsäure umgesetzt und diese mit EDC und NHS aktiviert. Typischerweise erfolgt diese Umsetzung mit einer Lösung bestehend aus 10-2 bis 10-1 mol.I-1 Polyacrylsäure mit einem Zahlenmittel des Molekulargewichts von 20 000 bis 500 000 und entsprechende Mengen EDC und NHS, die äquimolar zu den COOH-Gruppen des Polymers sind. Als Lösungsmittel dient vorzugsweise ein polares Lösungsmittel, wie DMSO und/oder Wasser. Die Reaktionsdauer beträgt in der Regel 30 min bis 2 h.
In einem Folgeschritt wird die Polyacrylsäure typischerweise 15 min bis 2 h mit einer wäßrigen Lösung eines Hydrogels umgesetzt. In dem Schema ist als Beispiel für das Hydrogel Carboxymethyldextran gezeigt. In dieser Ausführungsform werden die organischen Moleküle in zwei Reaktionsschritten aufgebaut. Zunächst werden vor der Anbindung des Carboxymethyldextrans an die Oberfläche die Carboxygruppen mit 1,2-Diaminoethan umgesetzt. Anschließend wird nach der Anbindung des Hydrogels an die Oberfläche die terminale Carbonsäure-Endgruppe durch Umsetzung der Aminogruppe mit Bromessigsäure eingeführt. Üblicherweise dient eine 0,5 mol.I-1 bis 3 mol.I-1 Bromessigsaurelösung mit einem pH-Wert von etwa 14 zur Derivatisierung Die Derivatisierung dauert in der Regel 10 bis 20 h. Es ist selbstverständlich möglich, die organischen Moleküle auch in einem einzigen Reaktionsschritt mit dem Hydrogel zu verknüpfen. Diese Funktionalisierung kann entweder vor oder nach der Anbindung des Hydrogels an die Oberfläche erfolgen. In dieser bevorzugten Ausführungsform beträgt die Länge des Spacers 8 Atome. Gezählt werden die C, N und O Atome des Spacers bestehend aus -CH2-CO-NH-CH2-CH2-NH-CH2-CO-OH, wobei das O der -C(O)OH Gruppe nicht mitgezählt wird, da es bei der anschließenden Umsetzung z. B. mit einer Amingruppe des Analyten ersetzt wird.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist:
Die Umsetzung mit Bernsteinsäureanhydrid kann in einer 10-2 bis 10-1 mol.I-1 Bernsteinsäureanhydridlösung erfolgen. Die Reaktionsdauer beträgt üblicherweise 4 bis 24 h. Als Lösungsmittel dienen z. B. polare, aprotische Lösungsmittel, wie trockenes DMSO.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist weiterhin:
Typischerweise erfolgt die Umsetzung mit Oligoethylenoxid in einer wässrigen Lösung mit einer Oligoethylenoxidkonzentration im Bereich von 10-2 bis 5.10-1 mol.I-1 und einer äquimolaren Menge EDC und NHS. Die Umsetzung kann 10 min bis 2 h dauern. Vorzugsweise besitzt das Oligoethylenoxid n = 4 bis 15 Wieder­ holungseinheiten.
Beispiel
Um den Effekt des längeren Spacers zu verdeutlichen, werden zwei Sensoren für die Oberflächenplasmonenresonanz hergestellt. Der erfindungsgemäße Sensor besitzt die in dem ersten Ausführungsbeispiel beschriebene Struktur. Als Vergleichs­ beispiel wird ein Sensor mit einem kurzen Spacer verwendet:
Als Rezeptor wird in beiden Sensoren Lysozym verwendet, als Ligand dient ein Einzelkettenfragment eines korrespondierenden Antikörpers (HyHel 10-Antikörper).
Zunächst wird ein Glasträger mit einer Goldoberfläche 12 h in eine wässrige 2. 10-2 mol.I-1 Cysteaminiumhydrochloridlösung gegeben. Anschließend wird der Träger mit Reinstwasser gespült, 5 min mit 1 N NaOH inkubiert und wieder mit Reinstwasser gespült. Eine Inkubationslösung wird durch Mischen einer wässrigen 5.10-2 mol.I-1 Polyacrylsäurelösung (Molekulargewicht 30 000) mit Lösungen von 3,19 mg EDC bzw. 4,115 mg NHS, jeweils in 1 ml Reinstwasser, hergestellt. Der Träger wird 1 h in diese Lösung inkubiert und dann mit Reinstwasser gespült.
Das Hydrogel Dextran wird zunächst nach dem folgenden Verfahren derivatisiert:
10,00 g (0,062 mol Wiederholungseinheit) Dextran werden mit 0,99 g NaOH (0,025 mol) und 1,71 g Bromessigsäure (0,012 mol) in 50 ml Reinstwasser gelöst und 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird der Ansatz 3 Tage gegen destilliertes Wasser dialysiert, wobei das Wasser mindestens fünfmal gewechselt wird. Zur weiteren Umsetzung wird der dialysierte Ansatz mit 2,40 g Ethyl-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimid (0,0125 mol) und 1,44 g N-Hydroxysuccinimid versetzt und 12 h bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird der Ansatz erneut 3 Tage gegen destilliertes Wasser dialysiert, wobei das Wasser mindestens fünfmal gewechselt wird. Anschließend wird 90% des Wasser mit einem Rotations­ verdampfer bei reduziertem Druck entfernt und das Polymer durch Eintragen in das 10fache Volumen Methanol gefällt. Die Ausbeute beträgt 9,06 g (81,5%).
1H-NMR (D2O, 200 MHz), δ [ppm]: 3,25 (m,Hh); 3,35 (m, Hg) 3,5 bis 4,1 (mehrere m, Hb, Hc, Hd, He, Hb', Hc', Hd', He', 5,05 (d, Ha, Ha'), 5,2 und 5,4 (breite Signale, Hf).
Anschließend wird das erhaltene Aminodextran in Wasser gelöst, so daß eine 10 Gew.-%ige Lösung resultiert. Der Träger wird 30 min in diese Lösung gegeben und im Anschluß wieder mit viel Reinstwasser gespült. Danach wird der Träger 12 h in eine Lösung von 1 mol.I-1 Bromessigsäure und 2 mol.I-1 NaOH gegeben.
Bei beiden Sensoren wird das Hydrogel 10 min in 10 mM 4'-(2-Hydroxyethyl)-1- piperazinethansulfonsäure-Puffer (Hepespuffer) und 150 mM NaCl bei pH 7,4 in Anwesenheit von 77 mg.ml-1 EDC und 12 mg.ml-1 NHS aktiviert. Anschließend wird eine 0,1 mg.ml-1 Lösung Lysozym in Acetatpuffer bei pH 4,7 mit dem Hydrogel kontaktiert, um das Lysozym durch Reaktion zwischen den freien Aminogruppen des Proteins und aktivierten Carboxylgruppen des Hydrogels kovalent an das Hydrogel zu binden.
Der funktionalisierte Sensor wird in ein SPR-Gerät eingebaut. Bei dem verwendeten SPR-Gerät handelt es sich um einen Eigenbau mit θ/2θ-Aufbau (analog E. Kretschmann und H. Raether, "Radiative Decay of Non-Radiative Surface Plasmons Exicted by Light", Z. Naturforsch., Band 23a, S. 2135 (1968)), der über einen Infrarotlaser (Wellenlänge 784 nm) als Lichtquelle verfügt.
Fig. 3 zeigt den zeitlichen Verlauf der kovalenten Bindung von Lysozym bei dem Vergleichsbeispiel (a) und bei dem erfindungsgemäßen Sensor (b). Die Verschiebung des Minimums zu höheren Winkeln dient als Indikator für die Zunahme der Schichtdicke.
Die beobachtete Verschiebung in SPR-Minimumswinkel (ΔΘpl) zeigt, daß der erfindungsgemäße Sensor eine geringere maximale Funktionalisierungsdichte aufweist (ΔΘpl = 0,18°) als der Vergleichssensor (ΔΘpl = 0,31°). Wesentlich ist aber, daß die Geschwindigkeit beider Bindungssreaktionen sich voneinander unter­ scheiden. Bei dem erfindungsgemäßen Sensor ist die Bindungsreaktion nach etwa 20 Minuten abgeschlossen, während bei dem Vergleichssensor nach dieser Zeit erst 71% der möglichen Belegungskapazität erreicht ist. Dieses Verhalten läßt auf eine schlechtere Zugänglichkeit zumindest eines Teils der terminalen Reste bei dem Vergleichssensor schließen.
Ein analoges Verhalten wird bei der Anbindung des Analyten beobachtet. In dem Beispiel wird ein Einzelkettenfragment eines Lysozymantikörpers verwendet. Der erfindungsgemäße Sensor zeigt wiederum eine geringere absolute Belegungsdichte (ΔΘpl = 0,08°) als der Vergleichssensor (ΔΘpl = 0,31°). Bei dem erfindungsgemäßen Sensor, bei dem die Rezeptormoleküle über flexible, langkettige Spacer gebunden sind, ist die Assoziationsreaktion nach ca. 15 Minuten abgeschlossen, während bei dem Vergleichssensor bis zum Erreichen der Sättigung etwa 60 Minuten vergehen (s. Fig. 4).
Beide Ergebnisse deuten auf eine deutliche Verbesserung der Reaktivität bei den erfindungsgemäßen Sensoren hin. Die Zugänglichkeit terminaler Reste und kovalent gebundener Rezeptoren wird also durch flexible, langkettige Spacer merklich erhöht.

Claims (9)

1. Gegenstand mit einer Oberfläche, umfassend ein Hydrogel, erhältlich durch:
  • a) Anbinden von organischen Molekülen an das Hydrogel, wobei die gebundenen organischen Moleküle jeweils eine Kettenlänge von mindestens 8 Atomen besitzen und einen terminalen Rest A, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe und deren Derivate, aufweisen; und
  • b) Umsetzen des terminalen Restes mit einem Rezeptormolekül mit mindestens drei gleichartigen Resten B, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe, Sulfonsäurerest, Phosphorsäurerest, Phosphon­ säurerest und deren Derivate.
2. Gegenstand nach Anspruch 1, wobei die Kette eine substituierte oder nicht substituierte, verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffkette ist, in der bis zu 70% der Kohlenstoffatome durch N, S oder nicht peroxidischem O ersetzt sein können.
3. Gegenstand nach Anspruch 1 oder 2, wobei die gebundenen organischen Moleküle jeweils eine Kettenlänge von 8 bis 40 Atome besitzen.
4. Gegenstand nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Rezeptormolekül mindestens 5 Reste B aufweist.
5. Gegenstand nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Gegenstand ein Biosensor ist.
6. Verfahren zur Herstellung eines Gegenstandes mit einer funktionalisierten Hydrogeloberfläche, umfassend die Schritte:
  • a) Bereitstellen eines Gegenstandes mit einer Oberfläche, umfassend ein Hydrogel;
  • b) Anbinden von organischen Molekülen an das Hydrogel, wobei die gebundenen organischen Moleküle jeweils eine Kettenlänge von mindestens 8 Atomen besitzen und einen terminalen Rest A, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe oder deren Derivate, aufweisen; und
  • c) Umsetzen des terminalen Restes A mit einem Rezeptormolekül mit mindestens drei gleichartigen Resten B, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe, Sulfonsäurerest, Phosphorsäurerest, Phosphon­ säurerest und deren Derivate.
7. Verwendung eines Gegenstandes mit einer funktionalisierten Hydrogelober­ fläche, umfassend an das Hydrogel gebundene organische Moleküle, wobei die gebundenen organischen Moleküle jeweils eine Kettenlänge von mindestens 8 Atomen besitzen und einen terminalen Rest A, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe oder deren Derivate, aufweisen, zur ungerichteten Anbindung eines Rezeptormoleküls mit mindestens drei gleich­ artigen Resten B, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe, Sulfonsäure­ rest, Phosphorsäurerest, Phosphonsäurerest und deren Derivate.
8. Verwendung eines Gegenstandes nach einem der Ansprüche 1 bis 5 bei der Detektion von Analytmolekülen.
9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Detektion mit einem Oberflächen­ resonanzspektrometer, Quarzwaage, Reflektionsinterferenzspektrometer oder Reflektionsinterferenzkontrastmikroskop durchgeführt wird.
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