DE19817180C2 - Biosensor mit modifizierter Edelmetalloberfläche und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents
Biosensor mit modifizierter Edelmetalloberfläche und Verfahren zu seiner HerstellungInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Biosensor (Affinitätssensor), bei dem ein
Hydrogel über einen kurzkettigen Linker an die Edelmetalloberfläche des Sensors
gebunden ist und ein Verfahren zu seiner Herstellung.
Oberflächen von Affinitätssensoren auf der Basis von Oberflächen
plasmonenresonanz (surface plasmon resonance, SPR) müssen für die
Erzeugung eines Signals eine ca. 50 nm dicke Edelmetallschicht, meist aus Gold,
aufweisen. Es hat sich jedoch als unzweckmäßig erwiesen, Rezeptoren,
typischerweise Proteine, unmittelbar an die Edelmetalloberfläche zu binden, da
sie in dieser Umgebung leicht denaturieren und auf diese Weise ihre
Rezeptorfunktion verlieren. Hinzu kommt, daß an unbedeckten Teilen der
Edelmetalloberfläche unspezifische Adsorptionsphänomene stattfinden können,
die dann das Meßergebnis erheblich verfälschen.
Dieser Nachteil wird in der Regel dadurch umgangen, daß man an die
Edelmetallschicht eine mehrere Nanometer dicke Dextranschicht kovalent
ankoppelt, die in wäßrigem Milieu zu einer Dicke von ca. 100 nm aufquillt und die
Edelmetalloberfläche vollständig bedeckt. Die gequollene Polymerschicht ahmt
die natürliche Umgebung von Biomolekülen nach und ist geeignet, eine
Denaturierung und somit Inaktivierung der Rezeptoren zu verhindern. Zusätzlich
wird die Adsorption von anderen als den zu analysierenden Molekülen wirksam
unterdrückt. Außerdem ist die gequollene Dextranschicht in der Lage,
Unregelmäßigkeiten der Oberfläche auszugleichen: Die Anbindung von
Rezeptormolekülen findet in der gequollenen Matrix und nicht nur unmittelbar an
der Oberfläche statt. Hierdurch verringert sich die Bedeutung von
Oberflächenunebenheiten, die sonst zu einer schlecht definierten Oberfläche und
dadurch zu schlecht quantifizierbaren Meßergebnissen beitragen.
Es sind Beschichtungen bekannt, die auf Sensoroberflächen aufgebracht werden
können und die sowohl unspezifische Adsorption verhindern als auch als Matrix
für Rezeptormoleküle dienen sollen (Molecular Resolution Imaging of Dextran
Monolayers Immobilized on Silica by Atomic Force Microscopy, Langmuir, 1996,
12, 6436). Solche Strukturen weisen aber häufig aufgrund ihres molekularen
Aufbaus Defektstellen auf und verhindern dadurch die unspezifische Adsorption
nur unzureichend.
In EP-B-589 867 ist eine Biosensor-Meßoberfläche beschrieben, bei der eine
poröse Matrix, z. B. ein Hydrogel, wie Dextran, über eine Monoschicht aus
organischen Molekülen (Linker) an eine Metalloberfläche gebunden ist. Diese
Beschichtungen werden bei der Herstellung von Disposables für kommerzielle
SPR-Sensoren verwendet. Um eine vollständige Bedeckung der
Biosensoroberfläche mit der porösen Matrix und gute Stabilität zu erreichen,
verlangt EP-B-589 867 die Verwendung von Molekülen mit einer
Kohlenwasserstoffkette mit einer Länge von mehr als 10 Atomen als Linker. Als
funktionelle Gruppe, an die die poröse Matrix gebunden wird, werden für die
Linker Hydroxyl-, Carboxyl-, Amino-, Aldehyd-, Hydrazid-, Carbonyl-, Epoxy- oder
Vinylgruppen angegeben. Bevorzugter Linker ist 16-Mercaptohexadecanol,
dessen Hydroxylgruppe durch Umsetzung mit Epichlorhydrin aktiviert werden
muß, bevor Dextran an die Sensoroberfläche gebunden wird. Hinsichtlich der
Bedingungen der weiteren Umsetzung der übrigen funktionellen Gruppen mit
einer porösen Matrix finden sich in EP-B-589 867 keine Angaben.
EP-A-485 874 beschreibt einen immunsensorischen Wandler, der einen Träger
aus Gold besitzt, auf dessen Oberfläche eine monomolekulare organische
Zwischenschicht und eine auf dieser immobilisierten Liganden- oder
Antiligandenschicht ausgebildet ist.
WO 97/41425 betrifft einen Biosensor zur Detektion der Bindungen zwischen
einem Liganden und einem Rezeptor. Das Gerät umfaßt eine Elektrode, die mit
einer hochdielektrischen Kohlenwasserstoffmonoschicht bedeckt ist, an die
Liganden gebunden sind. Die Anbindung eines Rezeptors an die Monoschicht
gebundenen Liganden und die resultierende Änderung in der Monoschichtstruktur
führt zu einem ionenunterstützten Elektronenfluß durch die Monoschicht.
Die Notwendigkeit, langkettige Linker zur Anbindung der porösen Matrix an die
Edelmetalloberfläche zu verwenden, ist im Hinblick auf die aufwendige
Herstellung solcher Verbindungen von Nachteil. Ein weiterer Nachteil ist die
Verwendung des toxischen und karzinogenen Epichlorhydrins zur Aktivierung der
funktionellen Gruppe des Linkers.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, einen Biosensor mit
modifizierter Edelmetalloberfläche bereitzustellen, in dem ein Hydrogel über
einfacher aufgebaute, möglichst kommerziell erhältliche Linkermoleküle mit der
Edelmetalloberfläche verbunden ist.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines
Biosensors mit einer modifizierten Edelmetalloberfläche der genannten Art
bereitzustellen, das kostengünstiger und einfacher durchzuführen ist als die im
Stand der Technik bekannten Verfahren.
Diese Aufgaben konnten auf der Basis des Befundes gelöst werden, daß auch
bei Verwendung von Linkermolekülen, die eine Kohlenwasserstoff-Kettenlänge
von bis zu 10 Atomen aufweisen, eine vollständige Bedeckung der
Edelmetalloberfläche durch Hydrogel erreicht werden kann, wenn die
Monoschicht aus Linkermolekülen durch Wasserstoffbrückenbindungen,
Aromaten-Aromaten-Wechselwirkungen oder kovalente Bindungen stabilisiert
wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Biosensor, dessen
Oberfläche eine Edelmetallschicht umfaßt, an die über eine Monoschicht aus
organischen Molekülen ein Hydrogel gebunden ist, wobei die eingesetzten
organischen Moleküle die Formel A-R-B aufweisen, in der A ein(e) an das
Edelmetall bindende(s) Atom oder Gruppe bedeutet; R eine verzweigte oder
unverzweigte Kohlenwasserstoffkette mit einer Kettenlänge von bis zu 10
Kohlenstoffatomen ist, wobei die Kohlenwasserstoffkette bis zu zweimal jeweils
durch eine Phenylengruppe oder ein Heteroatom unterbrochen sein kann; und B
ein(e) an das Hydrogel bindende(s) Atom oder Gruppe bedeutet.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung des
obengenannten Biosensors gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14.
Die erfindungsgemäßen Biosensoren mit einer modifizierten Edelmetalloberfläche
finden bevorzugt in der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) Verwendung.
Um unspezifische Adsorptionen von Rezeptormolekülen zu vermeiden, ist es
nötig, die Biosensoroberfläche vollständig mit Hydrogel zu bedecken. Eine der
Voraussetzungen für eine stabile Hydrogelschicht ist, daß die darunterliegende
Linkermolekülschicht eine hinreichende Stabilität aufweist. Diese Stabilität kann
durch Wasserstoffbrückenbindungen, Aromaten-Aromaten-Wechselwirkungen (π-
π-Wechselwirkungen) oder, gegebenenfalls über eine Metalloxid umfassende
Zwischenschicht, durch kovalente Bindungen gewährleistet werden. Die
Wechselwirkungen bzw. Bindungen treten zwischen den Linkermolekülen oder
zwischen den Linkermolekülen und dem Hydrogel auf.
Wasserstoffbrückenbindungen sind z. B. zwischen Amidbindungen (z. B. B =
Amingruppe, carboxyfunktionalisiertes Hydrogel) oder zwischen Hydroxy- und
Carboxygruppen (z. B. B = Epoxygruppe, carboxyfunktionalisiertes Hydrogel)
vorhanden. In Systemen, die Wasserstoffbrückenbindungen aufweisen, können
Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Linkermolekülen und dem Hydrogel
ausgebildet werden. Hierdurch werden lokale Fehlstellen überspannt oder
vermieden.
Aromaten-Aromaten-Wechselwirkungen werden zwischen aromatischen
Ringsystemen in den Linkermolekülen beobachtet. Diese Wechselwirkungen
führen zu Anziehungskräften zwischen den Linkermolekülen, die die Monoschicht
stabilisieren. Geeignete aromatische Gruppen sind Phenylengruppen. Besonders
bevorzugt sind Phenylengruppen, die in para-Stellung in das Linkermolekül
eingebaut sind. Die Phenylengruppen können gegebenenfalls mit kleineren nicht
sperrigen Alkylgruppen wie z. B. Methyl- oder Ethylgruppen substituiert sein.
Eine weitere Möglichkeit eine stabile Linkermolekülschicht zu erzeugen, ist durch
Einführen von kovalenten Bindungen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird
nach Anbindung eines erfindungsgemäßen niedermolekularen kurzkettigen
Linkers an die Edelmetallschicht zuerst, vorzugsweise über einen Sol-Gel-
Prozeß, eine dichte Metalloxid umfassende Zwischenschicht aufgebaut
(Stepwise Adsorption of Metal Alkoxides on Hydrolyzed Surfaces: A Surface Sol-
Gel Process, Chemistry Letters, 1996, 831), die dann über die darin vorhandenen
Hydroxygruppen mit dem Hydrogel verknüpft wird (Surface Modification for Direct
Immunoprobes, Biosensors & Bioelectronics, 1996, 11, 579; Dissertation G.
Elender, TU München, 1996, S. 113).
Im Stand der Technik wird bisher die Stabilisierung der Linkermolekülschicht
durch die Verwendung langer Alkylketten im Linker erreicht, die durch
Kristallisation der Alkylketten eine dichte stabile Schicht bilden (EP-B-589 867).
Die Verwendung eines Schichtaufbaus unter Ausnutzung von
Wasserstoffbrückenbindungen oder Aromaten-Aromaten-Wechselwirkungen hat
insbesondere den Vorteil einer sehr einfachen Herstellung. Demgegenüber sind
Schichtaufbauten unter Verwendung einer Metalloxidzwischenschicht zwar
aufwendiger zu fertigen, bieten aber die Möglichkeit, die Schichtdicke des
Gesamtsystems gezielt einzustellen, in dem gegebenenfalls mehrere Sol-Gel-
Prozeßschritte hintereinander ausgeführt werden. Über die Schichtdicke läßt sich
dann wiederum Einfluß auf die Lage des Oberflächenplasmonenresonanzsignals
nehmen, was aus meßtechnischer Sicht erstrebenswert sein kann.
Der erfindungsgemäße Biosensor umfaßt eine Edelmetallschicht. Im Rahmen der
Erfindung können beispielsweise Silber oder Gold verwendet werden. Die Dicke
der Schicht beträgt zwischen 30 und 70 nm, vorzugsweise zwischen 40 und
60 nm.
Als Linkermolekül werden kurzkettige organische Moleküle A-R-B eingesetzt, die
ein an Edelmetall bindendes Atom oder Gruppe A aufweisen. Bevorzugt finden
Thiole, Disulfide, Selenide und Diselenide mit einer weiteren funktionellen Gruppe
Verwendung. Das Linkermolekül weist eine verzweigte oder unverzweigte
Kohlenwasserstoffkette mit einer Kettenlänge von bis zu 10 Kohlenstoffatomen
auf, wobei die Kohlenwasserstoffkette bis zu zweimal durch jeweils eine
Phenylengruppe oder durch ein Heteroatom, wie z. B. -O- oder -NH-,
unterbrochen sein kann. Bei der Berechnung der Kettenlänge werden die
Heteroatome bzw. die Kohlenstoffe der Phenylengruppen nicht mitgezählt. Die
Kohlenwasserstoffkette weist bevorzugt eine Kettenlänge von bis zu 6
Kohlenstoffatome auf. Die Kohlenwasserstoffkette ist vorzugsweise unverzweigt.
Da Thiole und Disulfide kostengünstiger sind als die entsprechenden
Selenverbindungen, werden sie vorzugsweise in den erfindungsgemäßen
Biosensoren mit einer modifizierten Edelmetalloberfläche verwendet.
Die zweite funktionelle Gruppe B des Linkermoleküls dient der Verknüpfung mit
dem Hydrogel oder der Verbindung zur dichtenden Metalloxidschicht.
Grundsätzlich können alle aus dem Stand der Technik bekannten Gruppen B
verwendet werden. Beispiele sind Hydroxyl-, Carboxyl-, Epoxy- oder
Aminogruppen. Im Falle der Metalloxid umfassende Zwischenschicht ist die
Verwendung von Hydroxylgruppen besonders bevorzugt, während bei der
direkten Anbindung des Hydrogels an den niedermolekularen Linker die
Verwendung von Epoxy- oder Aminogruppen besonders vorteilhaft ist.
Bei den Hydrogelen kann es sich um ein Polysaccharid, ein Derivat davon oder
um ein quellbares organisches Polymer wie Poly{N-[tris-(hydroxymethyl)-methyl]-
acrylsäureamid}, Polyvinylalkohol oder Polyethylenglykol handeln. Bevorzugt sind
Poly{N-[tris-(hydroxymethyl)-methyl]-acrylsäureamid} und Polyethylenglykol.
Beispiele für Polysaccharide sind Amylose, Inulin, Pullulan oder Dextran.
Bevorzugt sind Pullulan oder Dextran. Besonders bevorzugt ist Dextran.
Um eine Ankopplung des Hydrogels an die Linkermoleküle zu erleichtern, kann
das Hydrogel derivatisiert werden, so daß es beispielsweise Hydroxyl-, Carboxyl-,
Amino- oder Carbonylgruppen aufweist. Besonders bevorzugt ist ein
Carboxymethyl-derivatisiertes Hydrogel.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von zwei bevorzugten
Ausführungsformen näher erläutert. In der ersten Ausführungsform wird das
Hydrogel direkt an die Linkermoleküle gebunden, d. h. ohne daß weitere Atome
zwischen dem Hydrogel und den Linkermolekülen eingefügt werden. Ein Beispiel
hierfür zeigt Reaktionsschema 1. Zunächst wird eine Monoschicht eines
Aminothiols auf eine Edelmetalloberfläche aufgebracht. An diese Monoschicht
aus Linkermolekülen wird anschließend direkt über Amidbindungen ein
Carboxyalkyl-derivatisiertes Polysaccharid gebunden.
Typischerweise erfolgt die Amid-Kopplung unter Verwendung von Ethyl-3-
dimethylamino-propyl-carbodiimid und N-Hydroxysuccinimid. Nach diesem Schritt
ist die Funktionalisierung so weit abgeschlossen, daß der Endanwender die
Anbindung von Rezeptormolekülen vornehmen kann.
Bei dieser Ausführungsform werden für die Herstellung einer carboxyalkylierten
Polysaccharidoberfläche also nur zwei Schritte benötigt. Außerdem kann die
Verwendung von hochtoxischen und karzinogenen Substanzen vermieden
werden. Der Einsatz einer hochkonzentrierten Polymerlösung ist nicht
erforderlich. Als weiterer Vorteil kommt hinzu, daß in der hier beschriebenen
Ausführungsform nur wäßrige Lösungen verwendet werden.
In der zweiten bevorzugten Ausführungsform wird das Hydrogel über eine
Metalloxidzwischenschicht an die Linkermoleküle gebunden. Ein Beispiel hierfür
zeigt Reaktionsschema 2. Zunächst wird eine Monoschicht eines Hydroxythiols
an eine Edelmetallschicht gebunden. Diese Linkermoleküle werden anschließend
mit einem Metallalkoxid, vorzugsweise Ti(IV)butoxid, umgesetzt. Um eine
hydroxyfunktionalisierte Oberfläche zu erhalten, wird nachfolgend hydrolysiert.
Die so erhaltene Metalloxidschicht ist in ihrer chemischen Reaktivität mit
gereinigtem Glas äquivalent. Nun kann z. B. ein Epoxysilan an die
Hydroxygruppen gebunden werden, das dann wiederum die Bindung eines
Hydroxypolymers erlaubt. Als Hydroxypolymer können Polysaccharide oder
synthetische Polymere, die Hydroxygruppen tragen wie z. B. Dextran oder dessen
Derivate, Polyvinylalkohol, Pullulan und Poly{N-[tris-(hydroxymethyl)-methyl]-
acrylsäureamid} verwendet werden. Die Metalloxid umfassende Zwischensicht
besteht bevorzugt ausschließlich aus Metalloxid.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Biosensoroberfläche wird zunächst ein
mit einer Goldschicht bedampfter Glasträger in eine, vorzugsweise wäßrige,
Lösung erfindungsgemäßer Linkermoleküle gegeben. Die Dauer dieser
Funktionalisierung beträgt zwischen 2 h und 24 h, typischerweise 12 h. Die
Temperatur kann zwischen 15°C und 35°C betragen. Die Konzentration der
Linkermoleküle in der Lösung reicht von 5 . 10-4 bis 2 . 10-1 mol.l-1, bevorzugt von
5 . 10-3 bis 5 . 10-2 mol.l-1.
Das so hergestellte Zwischenprodukt weist eine Monoschicht aus
erfindungsgemäßen organischen Linkermolekülen auf. Die Anbindung des
Hydrogels kann entweder direkt oder über eine Metalloxid umfassende Schicht
erfolgen.
Zur direkten Anbindung des Hydrogels an die Monoschicht aus Linkermolekülen
wird der Träger zwischen 1 h und 5 h, typischerweise 3 h, in eine frisch bereitete
wäßrige Hydrogellösung gegeben. Die Hydrogelkonzentration liegt zwischen 10
und 50 mg.ml-1. Gegebenenfalls kann das Hydrogel nach bekannten Methoden
derivatisiert werden.
Zur Erzeugung einer Metalloxidzwischenschicht wird dagegen zunächst eine
Metallalkoxidlösung aus Metallalkoxid, Wasser und organische Lösungsmittel, wie
z. B. Ethanol und Toluol, hergestellt. Zur Herstellung der Metalloxidschicht
können z. B. Titan(IV)butoxid, Tetramethoxysilan, Aluminium(III)butoxid,
Zirkon(IV)propoxid oder Niobium(V)butoxid verwendet werden. Bevorzugt ist
Titan(IV)butoxid. Das Zwischenprodukt wird dann 5 bis 20 Minuten in diese
Metallalkoxidlösung getaucht.
Um eine Anbindung des Hydrogels zu ermöglichen, muß die so hergestellte
Metalloxidschicht funktionalisiert werden. Dies kann durch
Epoxysilanverbindungen, wie z. B. (3-(2,3-Epoxypropoxy)propyl)triethoxysilan,
nach bekannten Verfahren geschehen. Dieser Funktionalisierungsschritt kann bei
Raumtemperatur erfolgen und dauert zwischen 10 und 40 Minuten.
Die Ankopplung eines Hydroxypolymers erfolgt ähnlich wie bei der ersten
Ausführungsform, wobei allerdings die Verweilzeit in der Hydroxypolymerlösung
auf 12 h bis 48 h, typischerweise 24 h, erhöht wird.
Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel näher erläutert.
Ein mit Gold beschichteter Glasträger (Schichtdicke: ca. 50 nm) wird 12 h in eine
2 . 10-2 mol.l-1 wäßriger Cysteaminiumhydrochloridlösung getaucht. Nach Spülen
mit 100 ml Reinstwasser und mit 10 ml 0,1 mol.l-1 NaOH wird der Träger 3 h in
eine Lösung von 22 mg Carboxymethyldextran-Natriumsalz (Fluka), 77 mg Ethyl-
3-dimethylamino-propyl-carbodiimid (EDC) und 12 mg N-Hydroxysuccinimid
(NHS) in 1 ml Reinstwasser gestellt. Abschließend wird dreimal mit 20 ml
Reinstwasser gespült.
Der carboxymethylfunktionalisierte Sensor wird in ein SPR-Gerät eingebaut. Bei
dem verwendeten SPR-Gerät handelt es sich um einen Eigenbau mit θ/2θ-
Aufbau (analog E. Kretschmann und H. Raether, "Radiative Decay of Non-
Radiative Surface Plasmons Exicted by Light", Z. Naturforsch., Band 23a, S.
2135 (1968)), der über einen Infrarotlaser (Wellenlänge 784 nm) als Lichtquelle
verfügt.
Fig. 1 zeigt die Messung der Oberflächenplasmonenresonanz nach der
Aminofunktionalisierung (durchgezogene Linie) und nach der Kopplung des
Carboxymethyldextrans (gestrichelte Linie).
Die Verschiebung des Minimums zu höheren Winkeln dient als Indikator für die
Zunahme der Schichtdicke.
Zur Aktivierung der Carboxylgruppen der Dextranschicht wird die Oberfläche 10
Minuten mit 77 mg EDC und 12 mg NHS kontaktiert. Anschließend wird eine
Rinderserumalbuminlösung (BSA) (16,7 µmol.l-1) in Kontakt mit der Oberfläche
gebracht. Nach 20 Minuten wird mit 1 ml Wasser und dann mit 1 ml 0,01 mol.l-1
Salzsäure gespült, um nur unspezifisch gebundenes BSA zu entfernen.
Anschließend erfolgt eine Oberflächenplasmonenresonanzmessung, um das
Schichtdickenwachstum zu verfolgen (s. Fig. 2).
Ein mit Gold beschichteter Glasträger (Schichtdicke: ca. 50 nm) wird 12 h in eine
wäßrige 2 . 10-2 mol/l-1 Mercaptoethanollösung getaucht. Nach gründlichem Spülen
mit Reinstwasser wird der Träger in eine frisch bereitete Titan(IV)butoxidlösung
gegeben. Hierzu werden 7 ml Wasser und 34 mg Titan(IV)-butoxid (Aldrich) unter
Rühren zu einer Mischung von 0.5 ml Ethanol und 0.5 ml Toluol gegeben. Nach
einer Verweilzeit von 10 Minuten, wird der Träger mit viel Reinstwasser
gewaschen. Danach wird die weitere Funktionalisierung mit (3-(2,3-
Epoxypropoxy)propyl)triethoxysilan (Wacker GF 82) vorgenommen.
Hierzu werden 7 ml des Silans und 3 ml H2O gemischt, mit 190 ml Isopropanol
verdünnt, und bei Raumtemperatur gerührt. Die Verweildauer des Trägers in
dieser Lösung beträgt wiederum 20 Minuten. Anschließend wird der Träger mit
viel Reinstwasser gewaschen und danach 24 h, in eine 30 Gew.-% Lösung von
Dextran (Dextran T500, Pharmacia) in Wasser gestellt.
Nach dem Waschen wird der Träger anschließend zur Carboxymethylierung in
eine frisch bereitete Lösung von Bromessigsäure in wäßriger NaOH gestellt.
Diese Lösung hat eine Bromessigsäurekonzentration von 1 mol.l-1 und eine
Natriumhydroxidkonzentration von 2 mol.l-1. Die Verweildauer beträgt 20 h.
Der carboxymethylfunktionalisierte Sensor wird in das in Beispiel 1 beschriebene
SPR-Gerät eingebaut. Die Sensoroberfläche wird durch Inkubation in einer
wäßrigen Lösung von 77 µg.ml-1 Ethyl-3-dimethylamino-propyl-carbodiimid und
12 µg/ml N-Hydroxysuccinimid 10 Minuten aktiviert.
Zur Anbindung des Rezeptors wird eine Lösung von Protein A (10 µg.ml-1) in
PBS-Puffer (0,15 mol.l-1 NaCl, 0,38 mmol.l-1 NaH2PO4 . H2O, 1,67 mmol.l-1
Na2HPO4, pH 7,4) auf die so vorbehandelte Oberfläche gegeben. Die
Inkubationszeit beträgt 60 Minuten. Zur Deaktivierung nicht umgesetzter
aktivierter Carboxylgruppen wird 20 Minuten eine Inkubation mit einer 1 mol.l-1
Lösung von Ethanolamin in Wasser durchgeführt.
Nach Spülen mit PBS-Puffer kann das Studium der Ligand/Rezeptor-
Wechselwirkung erfolgen. Hierzu wird eine Lösung von Schaf-anti-Maus-IgG (270
µg.ml-1) in PBS-Puffer in Kontakt mit der Sensoroberfläche gebracht. Der zeitliche
Verlauf der Ligandanbindung von Schaf-anti-Maus-IgG (Kreise) läßt sich durch
Verfolgung der Lage des Plasmonenminimums in Abhängigkeit von der Zeit
verfolgen (Fig. 3). Hierbei dient die Verschiebung des Minimums zu höheren
Winkeln als Indikator für die Zunahme der Schichtdicke. Nach erfolgter Bindung
kann die Sensoroberfläche durch zweimaliges Spülen mit verdünnter Salzsäure
regeneriert werden (Dreiecke). Eine Kontrollmessung mit Rinderserum
albuminlösung vergleichbarer Konzentration (270 µg.ml-1) zeigt, daß die
Wechselwirkung mit Schaf-anti-Maus-IgG spezifischer Natur ist: eine Anbindung
des sehr stark zu unspezifischer Adsorption neigenden Rinderserumalbumins
erfolgt nicht (Rauten).
Claims (14)
1. Biosensor, dessen Oberfläche eine Edelmetallschicht umfaßt, an die über
eine Monoschicht aus organischen Molekülen ein Hydrogel gebunden ist,
wobei die eingesetzten organischen Moleküle die Formel A-R-B aufweisen,
in der
- 1. A ein(e) an das Edelmetall bindende(s) Atom oder Gruppe bedeutet;
- 2. R eine verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffkette mit einer Kettenlänge von bis zu 10 Kohlenstoffatomen ist, wobei die Kohlenwasserstoffkette bis zu zweimal jeweils durch eine Phenylengruppe oder ein Heteroatom unterbrochen sein kann; und
- 3. B ein(e) an das Hydrogel bindende(s) Atom oder Gruppe bedeutet,
2. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Edelmetall
Gold ist.
3. Biosensor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß A eine
Thio-, Disulfid-, Selenid- oder Diselenidgruppe bedeutet.
4. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R eine
Alkylengruppe mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen bedeutet.
5. Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß
B eine Hydroxyl-, Epoxy- oder Aminogruppe bedeutet.
6. Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß
das Hydrogel ein Polysaccharid, ein Derivat davon, oder ein quellbares
organisches Polymer ist.
7. Biosensor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrogel ein
Polysaccharidderivat ist, wobei das Polysaccharidderivat Hydroxyl-,
Carboxyl-, Amino- oder Carbonylgruppen aufweist.
8. Biosensor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrogel
Carboxymethyldextran ist.
9. Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß
das Hydrogel direkt an die organischen Moleküle der Formel A-R-B
gebunden ist.
10. Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß
das Hydrogel über eine Metalloxid umfassende Zwischenschicht an die
organischen Moleküle der Formel A-R-B gebunden ist.
11. Verfahren zur Herstellung eines Biosensors, umfassend die Erzeugung
einer Monoschicht aus organischen Molekülen auf einer Edelmetallschicht
und Bindung eines Hydrogels an diese Monoschicht, wobei die eingesetzten
organischen Moleküle die Formel A-R-B aufweisen, in der
- 1. A ein(e) an das Edelmetall bindende(s) Atom oder Gruppe bedeutet;
- 2. R eine verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffkette mit einer Kettenlänge von bis zu 10 Kohlenstoffatomen ist, wobei die Kohlenwasserstoffkette bis zweimal jeweils durch eine Phenylengruppe oder ein Heteroatom unterbrochen sein kann; und
- 3. B ein(e) an das Hydrogel bindende(s) Atom oder Gruppe bedeutet,
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrogel
direkt an die organischen Moleküle der Formel A-R-B gebunden ist.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die
Bindung des Hydrogels an die Monoschicht über eine Metalloxid
umfassende Zwischenschicht bewirkt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Metalloxid
umfassende Zwischenschicht über einen Sol-Gel-Prozeß aufgebaut wird.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1998117180 DE19817180C2 (de) | 1998-04-17 | 1998-04-17 | Biosensor mit modifizierter Edelmetalloberfläche und Verfahren zu seiner Herstellung |
US09/292,555 US6472224B1 (en) | 1998-04-17 | 1999-04-15 | Biosensor with modified precious metal surface and process for the preparation thereof |
Applications Claiming Priority (1)
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