DE19911626A1

DE19911626A1 - Induktion antiinflammatorisch wirkender Proteine durch Ammoniumionen bzw. Amino-Reste

Info

Publication number: DE19911626A1
Application number: DE1999111626
Authority: DE
Inventors: Ute Bohlmann; Bert Behnke; Birgit Peters
Original assignee: Strathmann GmbH and Co KG
Current assignee: Strathmann GmbH and Co KG
Priority date: 1999-03-16
Filing date: 1999-03-16
Publication date: 2000-09-28

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung mindestens einer physiologisch annehmbaren Ammoniumionen bildenden oder einen Amino-Rest tragenden Verbindung zur Induktion antiinflammatorisch wirkender Proteine bzw. zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung mindestens einer physiologisch annehmbaren, Ammoniumionen bildenden oder einen Amino-Rest tragenden Verbindung zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen sowie ein Verfahren zur Herstellung antünflammatorisch wirkender Proteine.

Therapeutisch wirksame Proteine wie beispielsweise Insulin oder Interferone sind seit langem bekannt und werden zur Behandlung verschiedener Erkrankungen in großem Umfang eingesetzt. Wegen ihrer guten Körperverträglichkeit sind dabei autologe, d. h. körpereigene Proteine von besonderer Bedeutung.

Es ist bekannt, daß proinflammatorische Cytokine von Bedeutung bei entzündlichen Erkrankungen sind. So wird beispielsweise in Springer Semin. Immunopathol. 1998, 20 (1-2), 229-246 und Int. J. Tissue React. 1992, 14(2), 65-75 darüber berichtet, daß die protinflammatorischen Cytokine Interleukin-1 (IL-1) und Tumor-Nekrose-Faktoren (TNF) eine wesentliche Rolle bei der fortschreitenden Gelenkzerstörung bei entzündlichen Erkrankungen spielen. IL-1 und TNF sind Proteine, die durch Bindung an ihre spezifischen Rezeptoren auf der Oberfläche von beispielsweise Monocyten/Makrophagen die Ausschüttung von weiteren Entzündungsmediatoren und von gelenkzerstörenden Enzymen induzieren. Eine Blockade dieser Bindung würde den Fortschritt der entzündlichen Erkrankung unterbrechen. Die natürlichen Antagonisten von IL-1 und TNF sind die Proteine Interleukin-1-Rezeptorantagonist (IL-1RA) und/oder lösliche Tumor- Nekrose-Faktoren Rezeptor I und II (sTNF RI/RII). Somit wirken IL-1RA und sTNF (RI/RII) potentiell antünflammatorisch. Die Proteine IL-10 und IL-4 verschieben das Gleichgewicht zwischen den Gegenspielern IL-1 und IL-1RA zu Gunsten des Antagonisten und wirken auf diese Weise ebenfalls antiinflammatorisch; siehe beispielsweise J. Immuniol. 1995, 154(3), 1432-1439 sowie Rheum. Dis. Clin. North Am. 1998, 24(3), 629-639.

In Adv. Immuno1.1993, 54, 167-227 und Immunol. Today 1991, 12(11), 404-410 wird über vorläufige Ergebnisse klinischer Studien berichtet, die mit rekombinant hergestelltem IL-1RA durchgeführt worden sind. Gemäß diesen Studien wurden Probanden mit entzündlicher Arthritis, Sepsis und anderen entzündlichen oder Autoimmunerkrankungen erfolgreich mit dem synthetischen Antagonisten behandelt.

Die rekombinante bzw. synthetische Herstellung der zuvorgenannten therapeutisch wirksamen Proteine ist aufwendig und kostenintensiv. Es besteht daher ein Bedarf nach vereinfachten Verfahren zur Herstellung dieser therapeutisch wirksamen Proteine.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, ein vereinfachtes Verfahren zur Herstellung antünflammatorisch wirkender Proteine anzugeben. Eine weitere Aufgabe liegt darin, Mittel zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgaben werden gelöst durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche.

Die abhängigen Ansprüche definieren vorteilhafte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.

In den der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Untersuchungen wurde überraschend gefunden, daß sich die Bildung antiinflammatorischer Proteine in Körperflüssigkeiten, insbesondere Blutproben, induzieren läßt, indem man der Körperflüssigkeit eine Ammoniumionen bildende oder einen Amino-Rest tragende Verbindung zusetzt. Die auf diese Weise in vitro gebildeten antiinflammatorischen Proteine können zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen verwendet werden. Hierzu wird dem zu behandelnden Patienten eine Körperflüssigkeit, wie beispielsweise Blut, Synovialflüssigkeit oder Lymphflüssigkeit entnommen. Anschließend wird die Körperflüssigkeit mit der Ammoniumionen bildenden oder einen Amino-Rest tragenden Verbindung versetzt und inkubiert. Infolge der Inkubation werden die antiinflammatorisch wirkenden Proteine gebildet. Anschließend wird die auf diese Weise angereicherte Körperflüssigkeit dem Patienten wieder zugeführt.

Bei der entnommenen Körperflüssigkeit handelt es sich vorzugsweise um Blut, das erfindungsgemäß mit der Ammoniumionen bildenden oder einen Amino-Rest tragenden Verbindung versetzt und anschließend inkubiert wird, beispielsweise über einen Zeitraum von 24 Stunden. Dann läßt man die Blutzellen sedimentieren und entnimmt den Überstand (Blutplasma), das dann durch einen Sterilfilter z. B. in Gelenke des Patienten reinjiziert wird.

Erfindungsgemäß kann jede Ammoniumionen bildende oder einen Amino-Rest tragende Verbindung zur Induktion und damit auch zur Herstellung der antiinflammatorisch wirksamen Proteine verwendet werden. Wenn die Körperflüssigkeit, in der die antiinflammatorischen Proteine angereichert worden sind, dem Patienten wieder zugeführt wird, muß die Ammoniumionen bildende oder einen Amino-Rest tragende Verbindung physiologisch annehmbar sein. Bevorzugt werden gemäß der vorliegenden Erfindung Ammoniumchlorid und/oder Ammonium-Heparin verwendet; ebenfalls geeignet sind beispielsweise Aminosäuren, insbesondere Glycin, sowie Peptide und dergleichen. Das Ammoniumchlorid und/oder Ammonium-Heparin können der Körperflüssigkeit in fester oder gelöster Form zugesetzt werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält das Gefäß, in das die Körperflüssigkeit überführt wird, Ammonium chlorid und/oder Ammonium-Heparin. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungs form handelt es sich bei dem Gefäß um eine Spritze. Zusätzlich kann in dem Gefäß, z. B. einer Spritze, ein mit den vorgenannten Verbindungen beschichtetes Füllmaterial wie beispielsweise Kugeln, Gele, Glaswolle und dergleichen enthalten sein. Die Beschichtung des erfindungsgemäß verwendeten Füllmaterials kann erfolgen, indem die Ammonium ionen bildende oder einen Amino-Rest tragende Verbindung in Lösung gebracht, das Füllmaterial mit dieser Lösung benetzt wird und das Lösungsmittel anschließend verdampft wird.

Die Inkubation der mit der Ammoniumionen bildenden oder einen Amino-Rest tragenden Verbindung versetzten Körperflüssigkeit ist an sich unproblematisch und kann bei Temperaturen zwischen Raumtemperatur und um 37°C erfolgen. Die Dauer der Inkubation kann zwischen 10 und 48 Stunden liegen und kann ggf. unter leichtem Schwenken erfolgen.

Die folgenden Beispiele verdeutlichen die Erfindung ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1 Ammonium-Heparin als Induktor für Interleukin-1-Rezeptorantagonist (IL-1RA)

In einem Versuch wurden 22 Probanden jeweils 10 ml Blut mit Hilfe einer handels üblichen Heparin-Monovette, erhältlich beispielsweise von der Firma Sarstedt, entnommen. Diese Monovette enthält Ammonium-Heparin, entsprechend einer Konzentration von 30 I. E. Ammonium-Heparin/ml Blut. Das so entnommene Vollblut wurde direkt in dem Entnahmegefäß unter Schwenken bei 37°C 24 Stunden inkubiert.

Nach dem Sedimentieren der Blutzellen wird das Blutplasma entnommen. Die Konzentration von IL-1RA wurde vor der Inkubation und nach der Inkubation bestimmt, wobei die in Tabelle 1 aufgeführten Werte gemessen wurden.

Tabelle 1

Diese Zahlenwerte zeigen, daß die Konzentration des antünflammatorisch wirkenden IL-1RA im Blutplasma nach Inkubation mit Ammonium-Heparin sprunghaft ansteigt. Das so mit IL-1RA angereicherte Blutplasma kann unter Entzündungserkrankungen leidenden Patienten als Entzündungshemmer reinjiziert werden.

Beispiel 2 Ammoniumchlorid als Induktor für IL-1RA

In einer weiteren Studie wurden 6 Probanden jeweils 5 Blutproben entnommen. Von diesen Blutproben wurden jeweils 4 mit unterschiedlichen Mengen Ammoniumchlorid versetzt und über 24 Stunden unter leichtem Schwenken bei 37°C inkubiert; die jeweils fünfte Blutprobe wurde ohne Zusatz von Ammoniumchlorid unter den selben Bedingungen inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben zur Sedimentation stehengelassen und das Blutplasma entnommen. Dann wurden die Konzentrationen an dem antünflammatorisch wirkenden Protein IL-1RA sowie dem proinflammatorisch wirkenden Protein IL-1ß in den jeweiligen Plasmaproben bestimmt. Aus den erhaltenen Meßergebnissen, die unten in Tabelle 2 zusammengefaßt sind, wurde auch das molare Verhältnis zwischen IL-1RA und IL-1ß in den jeweiligen Proben berechnet, diese berechneten Werte sind ebenfalls in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2

Aus den tabellierten Daten wird deutlich, daß direkt nach der Blutentnahme ex vivo eine spontane Sezernierung von IL-1RA und IL-1ß erfolgen kann. Die Konzentration an IL-1RA im Blutplasma nimmt nach Inkubation mit Ammoniumchlorid leicht zu, wobei ein Konzentrationsmaximum nach Inkubation mit 0,25 bzw. 0,75 mmol/l Ammoniumchlorid beobachtet wird. Aus den tabellierten Daten geht auch hervor, daß die spontane Sezernierung des proinflammatorisch wirkenden IL-1β durch Inkubation mit Ammoniumchlorid deutlich gehemmt wird, wobei die maximale Hemmwirkung bei Zusatz von 0,75 mmol/l Ammoniumchlorid beobachtet wird.

Schließlich wird aus den tabellierten Daten deutlich, daß das Verhältnis zwischen dem antiinflammatorisch wirkenden IL-1RA und dem protinflammatorisch wirkenden IL-1ß bei Zusatz deutlich zu Gunsten von IL-1RA verschoben wird. Da IL-1RA und IL-1ß an den selben Rezeptor binden, beruht die antünflammatorische Wirkung von IL-1RA auf der Blockade dieses Rezeptors. Nach erfolgter Bindung löst IL-1RA im Gegensatz zu IL-1ß keine physiologische Zellantwort aus, es wird somit eine antagonistische Wirkung erzielt. Ist der Rezeptor durch IL-1RA besetzt, kann IL-1ß nicht mehr an diesen Rezeptor binden, so daß die Entzündungskaskade unterbrochen wird. Je größer also das molare Verhältnis von IL-1RA zu IL-1ß ist, desto ausgeprägter ist der antientzündliche Effekt des erfindungsgemäß angereicherten Blutplasmas. Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß dieser antientzündliche Effekt bei Zugabe von 0,75 mmol Ammoniumchlorid/l maximal ist.

Beispiel 3 Hemmung der Sezernierung von Interleukin-6 (IL-6) durch Ammoniumchlorid

In diesem Beispiel wird der Einfluß von Ammoniumchlorid auf die Sezernierung von Interleukin-6 (IL-6) untersucht. IL-6 wird wie alle hier diskutierten Proteine von Monocyten sekretiert und führt unter anderem lokal zu einer vermehrten Antikörper- Produktion der Lymphozyten und systemisch zu Fieber.

Gemäß der in Beispiel 2 beschriebenen Studie wurde die Konzentration an IL-6 im Blutplasma von 6 Probanden in Abhängigkeit der zugesetzten Menge an Ammonium chlorid bestimmt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.

Tabelle 3

Die tabellierten Daten zeigen, daß sich durch Zugabe von Ammoniumchlorid die Sezernierung des proinflammatorisch wirkenden IL-6 zurückdrängen läßt, wobei die Hemmwirkung bei einem Zusatz von 0,75 mmol Ammoniumchlorid ihr Maximum erreicht.

Claims

1. Verwendung mindestens einer physiologisch annehmbaren, Ammoniumionen bildenden oder einen Amino-Rest tragenden Verbindung zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die entzündliche Erkrankung entzündliche Arthritis, Sepsis, eine entzündliche Autoimmunerkrankung und/oder eine rheumatoide Gelenkerkrankung ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die physiologisch annehmbare, Ammoniumionen bildende Verbindung Ammoniumchlorid und/oder Ammonium-Heparin ist.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß durch die Ammoniumionen bildende oder einen Amino-Rest tragende Verbindung die Bildung mindestens eines antünflammatorischen Proteins in vitro in einer Körperflüssigkeit des Menschen oder eines anderen Säugetiers induziert wird.

5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit Blut ist.

6. Verwendung nach den Ansprüchen 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das antiinflammatorische Protein Interleukin-1-Rezeptorantagonist, Tumor-Nekrose- Faktor-Rezeptor Typ I oder Typ II, Interleukin-4 und/oder Interleukin-10 ist.

7. Verfahren zur Herstellung antünflammatorisch wirkender Proteine, dadurch gekennzeichnet, daß eine Körperflüssigkeit eines Menschen oder eines anderen Säugetiers mit mindestens einer Ammoniumionen bildenden oder einen Amino-Rest tragenden Verbindung versetzt wird, wobei das antünflammatorisch wirkende Protein in der Körperflüssigkeit gebildet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit Blut ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Ammoniumionen bildende Substanz Ammoniumchlorid und/oder Ammonium- Heparin ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das antünflammatorisch wirkende Protein Interleukin-1-Rezeptorantagonist, Tumor- Nekrose-Faktor-Rezeptor Typ I oder Typ II, Interleukin-4 und/oder Interleukin-10 ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es in einem Gefäß durchgeführt wird, das die die Ammoniumionen bildende oder einen Amino-Rest tragende Verbindung enthält und/oder mit dieser beschichtet ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Gefäß aus Glas oder einem Kunststoff besteht.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Gefäß eine Spritze ist.