DE19907448A1

DE19907448A1 - Verfahren zur druckflußmodulierten Konzentrationsanalyse

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Publication number: DE19907448A1
Application number: DE1999107448
Authority: DE
Inventors: Uwe Spohn; Bodo Fuhrmann
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-02-22
Filing date: 1999-02-22
Publication date: 2000-08-31

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur durchflußmodulierten Konzentrationsanalyse in Probenlösungsvolumina, bei dem in einem oder mehreren Durchflußkanälen mit mindestens einem Übergang zu einem kleineren Durchflußquerschnitt ausschließlich durch präzise zeitliche Steuerung von Pumpgeschwindigkeiten vorher voneinander getrennte Proben-, Verdünnungs-, Konditionier- und Reagenzlösungen in einem weiten, durch die Pumpgeschwindigkeiten und die Pumpzeiten festgelegten Volumenbereich mit hoher Genauigkeit dosiert sowie Verweilzeiten und durch dispersionsfreie Vermischung Konzentrationen, Konzentrationsverhältnisse und -gradienten präzis und stationär eingestellt und die Konzentrations-Zeit-Verläufe der Probensubstanz, einer Indikatorsubstanz oder eines Reaktionsproduktes kontinuierlich, bevorzugt durch einen Durchflußdetektor aufgezeichnet werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur durchflußmodulierten Konzentrationsanalyse in Pro benlösungsvolumina. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die naßchemische Konzentra tionsanalytik in Prozeßmedien chemischer und biotechnischer Stoffwandlungsprozesse, flüs sigen Lebensmitteln, Oberflächen-, Grund- und Trinkwässern sowie diversen Lösungsmittel systemen.

Bisher bekannte Verfahren zur Durchflußanalyse definierter Probenlösungsvolumina beruhen entweder auf dem Prinzip der kontinuierlichen Durchflußanalyse in luftsegmentierten und lösungsmittelsegmentierten Reagenzflüssen (L. T. Skeggs, Am. J. Pathol. 28 (1957) 311.) oder auf dem Prinzip der Fließinjektionsanalyse (J. Ruzicka und E. H. Hansen, Flow Injection Analysis, John Wiley & Sons, New York, 1988) sowie der von der Fließinjektionsanalyse abgeleiteten sequentiellen Injektionsanalyse (J. Ruzicka, G. D. Graham and G. D. Christian, Anal. Chem. 62 (1990) 1861.; J. Ruzicka and G. D. Marshall, Anal. Chim. Acta 237 (1990) 329.). Bei der kontinuierlichen Durchflußanalyse wird die zu analysierende Probenlösung durch eine Schlauchpumpe aus dem Probenreservoir angesaugt und durch Luft oder eine mit der Probenlösung nicht mischbare Flüssigkeit segmentiert. Diese Methode benötigt relativ große Probenlösungsvolumina und lange Spülzeiten zwischen zwei Analysen. Bei der häu figer angewendeten Segmentierung durch Luftpolster beeinträchtigt die Gaskompressibilität die Reproduzierbarkeit der Analysen. Sowohl die Luft- als auch die Lösungsmittelsegmen tierung erfordern spezielle Anordnungen zur Segmentierung im Durchfluß sowie meistens spezielle Anordnungen zur Phasentrennung, was die Analysatoranordnungen unnötig kompli ziert und entsprechend störanfällig macht.

Bei der Fließinjektionsanalyse werden diskrete, mehr oder weniger präzis definierte Volumina einer Proben- oder Reagenzlösung mittels Injektionsventil oder hydrodynamischer Injektion in einen nichtsegmentierten Trägerstrom injiziert, wobei sich nach dem Prinzip der nach Ruzicka und Hansen (J. Ruzicka and E. H. Hansen, Flow Injection Analysis, John Wiley & Sons, 1988) definierten kontrollierten Dispersion reproduzierbare Konzentrations-Zeit- Profile, sogenannte Peakprofile herausbilden und durch einen Durchflußdetektor kontinu ierlich aufgezeichnet werden. Die Nachteile des Einsatzes von Injektionsventilen liegen im mechanischem Verschleiß, der Verblockungsgefahr und im mehr oder weniger vorgegebenen Injektionsvolumen. Die hydrodynamische Injektion beruht auf dem intermittierenden Aus- und Einschalten von mindestens zwei Pumpen, wobei ein sich zwischen zwei Verzweigungen befindlicher Kanalabschnitt reproduzierbar mit Proben- oder Reagenzlösung gefüllt wird, wozu für praktische Anwendungen ein zusätzliches Schließventil notwendig ist. Die Dosier- und Injektionsgenauigkeit ist oft wesentlich schlechter als beim Einsatz von Injektionsven tilen. Die aufgezeichneten Peaksignale werden außer durch die Konzentration der Proben substanz, Diffusion, Konvektion und Verweilzeit durch die Viskosität der Probenlösung und die Reaktionswärme der angewendeten Bestimmungsreaktionen beeinflußt. Flow Injection Analysis Verfahren müssen deshalb sehr häufig und sehr sorgfältig unter Berücksichtigung der Probenmatrix in einem definierten, oft engen Konzentrationsbereich der Probenlösung kalibriert werden. Dies resultiert aus der Tatsache, daß in den allermeisten Anwendungsfällen transiente, d. h. sehr oft kinetisch kontrollierte Meßsignale aufgezeichnet und ausgewertet werden.

Bei der Sequential Injection Analysis (J. Ruzicka, G. D. Marshall and G. D. Christian, Anal. Chem. 62 (1990) 1861-1866, J. Ruzicka, G. D. Marshall, Anal. Chim. Acta 237 (1990) 329-343) oder sequentiellen Durchflußanalyse nach Probeninjektion werden die Proben-, die Reagenzlösung und gegebenenfalls weitere Lösungen sequentiell, durch Umschalten eines Mehrwegeventils oder durch Anwahl verschiedener Lösungsreservoire mittels Schlauch quetschventilen und einer Verzweigung in einen einer Pumpe vorgelagerten Kanalabschnitt sequentiell eingesaugt, angeordnet und durch späteres, oft mehrfaches Umschalten der Flußrichtung reproduzierbar vermischt. Außer der verbesserten Durchmischung resultiert eine erhöhte Dispersion, die die Empfindlichkeit verringert. Die Sequential Injection Analysis beruht wie die Flow Injection Analysis auf dem Prinzip der kontrollierten Dispersion, ist also auf die Einstellung einer mehr oder weniger hohen Dispersion zur Erzielung einer ausrei chenden Vermischung zwischen Analyt und Reagenz angewiesen und kann die durch Dispersion verursachte Verdünnung nicht vermeiden.

Nachteilig ist bei den bisher bekannten Verfahren zur Konzentrationsanalyse, daß der der Pumpe vorgelagerte Kanalabschnitt sich nur unvollständig reinigen, d. h. ausspülen läßt oder die Pumpe mit der Probenlösung kontaktiert werden muß, was die Anwendbarkeit bezüglich der Auswahl der analysierbaren Probenlösungen stark einschränkt. Obwohl die Vermi schungsverhältnisse, d. h. z. B. die Probenlösungsverdünnung in weiten Bereichen einstellbar sind, ist dies immer von der Intensität der Vermischung bei den zum Teil extremen Volumen verhältnissen abhängig, die ihrerseits die effiziente Vermischung sehr erschweren können oder sogar ausschließen. Die Vermischungsverhältnisse sind zudem zwar reproduzierbar einstellbar jedoch sehr schlecht vorausberechenbar, was einen hohen Kalibrieraufwand bedingt. Bei allen FIA- und SIA-Verfahren und abgeleiteten Methoden hängen die Dispersion, die Verdün nung, die Vermischung und damit die Analysenergebnisse von der Viskosität von Proben-, Träger- und Reagenzlösung ab. Selbst bei der Anwendung kalibrierarmer und besonders sig nalstabil arbeitender Durchflußdetektoren muß häufig und unter Berücksichtigung der Pro benmatrix kalibriert werden. Die Probenlösungsinjektion ist wie bei der Flüssigchroma tographie eine Verdrängungsinjektion, die die nachfolgende Vermischung mit der Reagenzlö sung voraussetzt, um störende Blindpeaks oder andere Artefakte zu umgehen.

Bei reaktionskinetischen Untersuchungen und oft geforderten, höheren Genauigkeiten ist es oft notwendig, stationäre Konzentrationen mit hoher Präzision und ausreichend schnell einzu stellen. Aus den eingesetzten Konzentrationen von Standard- oder einer Reagenzlösungen und den bei ihrer Dosierung eingestellten Durchflußgeschwindigkeiten können die Ausgangs konzentrationen in einfacher Weise berechnet werden können. Bei langsamen Bestimmungs reaktionen ist es oft notwendig, bei präzis definierten Konzentrationsverhältnissen die Reaktions- bzw. die Verweilzeiten in weiten Bereichen genau einzustellen. Bei herkömm lichen Stopped-Flow-Anordnungen (Q. H. Gibson, in: K. Kustin (Ed.), S. P. Colowick, N. O. Kaplan (Series Eds.), Methods in Enzymology, Vol. 16, 1969, 187-228) ist es not wendig, die Kolben der eingesetzten Präzisionspumpen vor jedem Experiment zu spülen, zu reinigen und neu zu füllen, was einen hohen manuellen Arbeitsaufwand und oft auch zu hohen Verbrauch an Reagenzien und Probenlösungen bedeutet.

Bisher sind keine Meßanordnungen bekannt, in denen diskrete und kleine Probenvolumina, vorzugsweise kleiner 200 µl unabhängig von der Dispersion, d. h. dispersionsfrei, des dif fusiven Stoffaustauschs, von Viskositätsgradienten zwischen der Probenlösungen und anderen Lösungen sowie gegebenenfalls unabhängig von der Temperatur analysiert werden können. Gerade für die automatische Kalibrierung von z. B. in Durchflußkanälen ablaufenden Ana lysen und Messungen würde es von Vorteil sein, durch einfache Programmierung eines computergesteuerten Zeitablaufs Standardlösungen mit zeitlich-konstanter Konzentration in situ aus einer Stammlösung zu erzeugen, zu kalibrieren und gleich anschließend zur Analyse der Probenlösungen überzugehen.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren zur genauen Konzentra tionsanalyse in diskreten Probenlösungsvolumina in Durchflußkanälen zu realisieren, das un abhängig von der durch Diffusion, Konvektion und laminaren Strömungsprofilen verur sachten Dispersion, von Viskositäts- und Temperaturdifferenzen ist und die präzise Einstellung von Verweilzeiten, Konzentrationen und Konzentrationsgradienten sowie wahlweise von sta tionären und transienten Konzentrations-Zeit-Funktionen ermöglicht.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst.

Bei diesem Verfahren zur durchflußgesteuerten Konzentrationsanalyse in Probenlösungsvolu mina werden in einem oder mehreren Durchflußkanälen mit mindestens einem Übergang zu einem kleinerem Durchflußquerschnitt ausschließlich durch präzise zeitliche Steuerung von Pumpgeschwindigkeiten vorher voneinander getrennte Proben-, Verdünnungs-, Konditionier- und Reagenzlösungen in einem weiten, durch die Pumpgeschwindigkeiten und die Pump zeiten festgelegten Volumenbereich mit hoher Genauigkeit dosiert sowie Verweilzeiten und durch dispersionsfreie Vermischung Konzentrationen, Konzentrationsverhältnisse und -gra dienten präzis und stationär eingestellt und die Konzentrations-Zeit-Verläufe der Proben substanz, einer Indikatorsubstanz oder eines Reaktionsproduktes kontinuierlich, bevorzugt durch einen Durchflußdetektor aufgezeichnet.

Das Verfahren ist in unterschiedlicher Weise durchführbar. So ist es möglich, daß in einem einfachen Durchflußkanalsystem mit einem Übergang zu kleineren Durchflußquerschnitten bei einem kontinuierlichem Fluß von Reagenz-, Konditionier- oder Verdünnungslösung eine die Probenlösung transportierende Pumpe für eine definierte Zeit angeschaltet und die Pumpgeschwindigkeit V_R,o der eine der anderen Lösungen transportierenden Pumpe um den Betrag der Durchflußgeschwindigkeit der Probenlösung V_S auf V_R verkleinert wird, so daß ein konstant fließendes, durch die Anschaltzeit der Probenlösungspumpe und die gewählte Durchflußgeschwindigkeit V_S definiertes Volumen eine für die stabile Detektion ausreichend lange Zone stationärer Konzentrationsverhältnisse bewirkt. Durch einen nachfolgenden Durchflußkanalabschnitt mit genügend verkleinertem Durchflußquerschnitt wird erreicht, daß sich schon bei kleinen zudosierten Probenlösungsvolumina eine durch die Dispersion, d. h. durch Konvektion, laminare Strömungsprofilbildung und Diffusion unbeeinflußte Fließzone mit vorzugsweise konstanten oder stationären Konzentrationsverhältnissen ausbildet. In Ab wesenheit eines Stoffumsatzes liegt ein konstantes Konzentrationsverhältnis vor. Dies ermög licht die Anpassung des Meßbereiches eines nachfolgenden Durchflußdetektors an die zu bestimmende Probensubstanzkonzentration.

Bei einem Stoffumsatz, zum Beispiel zwischen der Probensubstanz S und dem Reagenz R entsprechend der Reaktion (1) bestimmt diese in Abhängigkeit von der Verweilzeit, d. h. der Längskoordinate des Durchflußkanals die sich stationär einstellenden Konzentrationsver hältnisse.

aS + bR → Reaktionsprodukte (1)

Wird ein Reaktionsprodukt P detektiert, berechnet sich die Probensubstanzkonzentration [S] aus der gemessenen Konzentration [P], der Stöchiometrie von Reaktion (1) und dem Reak tionsumsatz U, der seinerseits von der Reaktionsgeschwindigkeit anhängt. Sind die Proben- [S] und die Reagenzkonzentration [R] bekannt, können aus den bei verschiedenen Verweil zeiten gemessenen Produktkonzentrationen Geschwindigkeitsgesetze abgeleitet und Ge schwindigkeitskonstanten berechnet werden, wobei keine durch Diffusion und/oder Konvek tion verursachte oder sekundär durch Temperatur und Viskositätsdifferenzen beeinflusste Dispersion berücksichtigt werden muß.

Bei vollständigem Umsatz der Probensubstanz resultieren wiederum konstante Konzentra tionsverhältnisse, aus denen ausgehend von der Stöchiometrie der Bestimmungsreaktion mit den Stöchiometriefaktoren a und b und dem Reagenzverbrauch [R]_oU, der sich durch Multi plikation der Ausgangsreagenzkonzentration [R]_o mit dem Umsatzgrad U des Reagenzes ergibt, die zu bestimmende Analytkonzentration nach Gleichung (2) berechnet werden kann.

[S] = a/b.U[R]_o.V_R/V_S (2)

Der Durchflußdetektor mißt die resultierende Konzentration [R]_t des Reagenzes oder die Konzentration des Reaktionsproduktes [P] über eine Kalibrierfunktion der Form (3) mit dem Anstieg m und dem Blindwert h_o, wobei h die jeweilige Meßgröße ist.

h = m.f([P])+h_o (3)

Weiterhin ist es möglich, die Pumpen dann anzuhalten, wenn sich nach dem Zusam menfluß Y im Durchflußkanal ein stationärer Konzentrations-Zeit-Verlauf eingestellt hat, was eine praktisch unbegrenzte Verlängerung der Verweilzeit bedeutet, ohne daß sich Diffusion, Konvektion und Thermokonvektion auf die an einer Ortskoordinate des Durchflußkanals ein gestellte Konzentration auswirken.

Um die durch vorausgehende Vermischung der stehenden Probenlösung mit der fließenden Reagenzlösung verursachte Meßfehler auszuschließen, ist es möglich, daß am Zusammenfluß zwischen jeweils zwei Lösungen ein empfangsseitig und dosierseitig todvolu menfreies Umschaltventil die jeweils zuzumischende Lösung von der empfangenden Lösung abtrennt und zur Zumischung während einer definierten Zeit mit der empfangenden Lösung verbindet.

Darüberhinaus ist es möglich, daß zwei Pumpen so angesteuert werden, daß sich recht eckförmige Pumpgeschwindigkeits-Zeit-Profile ausbilden, die bei der Vermischung der durch die Pumpen transportierten Lösungen zweier oder mehrerer nicht miteinander reagierender Substanzen in einem Abschnitt des sich ausbildenden Konzentrationsprofils zu konstanten Konzentrationsverhältnissen zwischen den Substanzen führen.

Es ist auch möglich, mehr als zwei Pumpen einzusetzen, um außer der Probenlösung mehrere andere Lösungen, die Reagenzien oder Puffer enthalten, in einem auf einen gemein samen Zusammenfluß folgenden Durchflußkanal so zu vermischen, daß sich stationäre Konzentrations-Zeit-Verläufe ausbilden, die sich anschließend infolge chemischer Umset zungen verändern.

Bei mehreren hintereinander geschalteten Mischpunkten und unmittelbar nachfolgend angeschlossenen Durchflußkanälen ist es möglich, der Probenlösung nacheinander verschie dene Reagenz-, Indikator-, Konditionier- und/oder Standardlösungen zuzumischen, um z. B. mehrere sequentiell ablaufende Bestimmungs- und Derivatisierungsreaktionen zu realisieren.

Das Verfahren soll in der Folge mit Hilfe der Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigen:

Fig. 1a-d ein Verfahren zur durchflußgesteuerten Analyse von Ethanolkonzentrationen, beruhend auf

- a - einer Durchflußanalysenanordnung mit Aufnahme diskreter Probenlösungsvolumina,
- b - einem Zeitablaufschema,
- c - einem Pumpgeschwindigkeits-Zeit-Profil und von
- d - Konzentrations-Zeit-Verläufen für eine bis zum vollständigen Analytumsatz laufende Bestimmungsreaktion.

Fig. 2a, b ein Verfahren zur amperometrischen Analyse von Thioglycolat beruhend auf

- a - einer Durchflußanalysenanordnung und
- b - einem Zeitablaufschema

Fig. 3a, b ein Verfahren zur durchflußgesteuerten Analyse von Saccharosekonzentrationen beruhend auf

- a - einer Durchflußanalysenanordnung und
- b - einem Zeitablaufschema.

Fig. 4 ein Verfahren zur durchflußgesteuerten enzymatischen Bestimmung von Glutamin beruhend auf

- a - einer Durchflußanalysenanordnung und
- b - einem Zeitablaufschema.

In der Fig. 1a ist eine Durchflußanalysenanordnung dargestellt, die zwei rechnergesteuerte Präzisionspumpen 1 und 2, einen Zusammenfluß 3, ein Umschaltventil 4, einen als geknotetes Strömungsrohr ausgeführten Durchflußkanal 6 mit reduziertem Innenquerschnitt und einen an diesen Querschnitt angepaßten, photometrischen Durchflußdetektor 7 aufweist. Der Übergang 5 zum kleineren, durchflossenen Querschnitt ist unmittelbar nach dem Umschaltventil 4 lokalisiert. Zunächst wird über das Umschaltventil 4 ein durch das Produkt aus der Pump geschwindigkeit V_P1 der Pumpe 1 und der Saugzeit t_DOS definiertes Probenlösungsvolumen V_S in den Probenvorlagekanal 8 transportiert. Nach Umschaltung von Pumpe 1 auf die andere Pumprichtung und des Ventils 4 sowie Anschalten der Pumpe 2 werden die Durchflußge schwindigkeiten V_P1 und V_P2 eingestellt. Auf diese Weise werden die ethanolhaltige Pro benlösung und als Reagenzlösung dienende schwefelsaure Dichromatlösung simultan im Verhältnis ihrer Durchflußgeschwindigkeiten V_P1/V_P2 in den Durchflußkanal 6 gedrückt und zum Durchflußdetektor 7 gepumpt. Als Verdrängungslösung dient destilliertes Wasser. Der Durchflußdetektor zeichnet den gesamten Konzentrationsverlauf der entsprechend der Bestim mungsreaktion (4) entstehenden Cr(III)-Ionen bei einer Absorptionswellenlänge von 605 nm

C₂H₅OH + 2 C₂O₇ ^2-+ 16 H⁺ → 2 CO₂ + 4 Cr³⁺ + 11 H₂O (4)

auf. Durch den Auswerterechner wird nur die nicht durch die Dispersion beeinflußte Zone des Konzentrations-Zeit-Verlaufes, in der sich ein konstanter oder stationärer Konzentration- Zeit-Verlauf ausbildet, aufgezeichnet und zur Berechnung der Ethanolkonzentration herange zogen.

Fig. 1b zeigt das entsprechende Zeitablaufschema dieses Verfahrens zur photometri schen Ethanolbestimmung.

Es ist auch möglich, die Dichromatlösung kontinuierlich durch den Durchflußkanal 6 und den Detektor 7 zu pumpen. Entsprechend dem in Fig. 1c dargestellten Schema wird gleichzeitig mit der Einschaltung von Pumpe 1 die Durchflußgeschwindigkeit V_P2 der Pumpe 2 um den Betrag 0.1 ml/min^-1 von V_P1 verringert. Dadurch wird eine über die Zeit t gleich mäßige Verteilung der dosierten Probenlösung über die betreffende Reagenzfließzone gewährleistet. Durch den Übergang in den verjüngten, eng geknoteten Durchflußkanal 6 wird hierbei die Mischzone von injizierter Probenlösung mit der Reagenzzone soweit auseinander gezogen und vermischt, daß in Abwesenheit jeglicher Reaktion eine Zone konstanter Konzen trationsverhältnisse entsteht.

Die Bestimmungsreaktion (4) bewirkt bei beiden Verfahrensvarianten den Aufbau einer fast nur durch die Reaktionskinetik bestimmten Konzentrationszone von Analyt- und Reagenzsubstanz. Fig. 1d zeigt die sich dabei einstellenden Konzentrations-Zeit-Verläufe von Dichromat, Chrom(III)ionen und Ethanol im Vergleich zum Dichromatkonzentrations verlauf in Abwesenheit von Ethanol.

Die Überschreitung einer Mindestverweilzeit bewirkt vollständigen Umsatz des Ethanols zum Kohlendioxid und des Dichromats zu Cr(III)Ionen, die photometrisch bei einer Wellenlänge von 605 nm detektiert werden. Den Durchflußdetektor durchfließt unter anderem eine Zone konstanter Konzentrationen des Cr(III)Ions. Aus dem sich auf einen konstanten Wert einstellenden Detektorsignal wird über die photometrisch gemessene Produktkonzen tration und die Stöchiometrie der Bestimmungsreaktion (4) die Ethanolkonzentration berechnet.

In der Fig. 2a ist eine nach dem gleichen Prinzip arbeitende Durchflußanordnung zur ampe rometrischen Bestimmung von Thioglycolat dargestellt, die mit dem todvolumenarmen Um schaltventil 9, bei dem das Ventiloberteil zwischen den Positionen P1 und P2 umgeschaltet wird, und mit pulsationsarmen oder -gedämpften Schlauchpumpen 1 und 2 arbeitet. Zunächst fließt die als Reagenz dienende Trijodidlösung über das Ventil 9 und den Durchflußkanal 6 zum Durchflußdetektor 7 und die Probenlösung über den Ventilkanal 10 in den Abfluß. Nach Umschaltung des Ventils 9 in die Dosierposition P2 wird ein durch das Produkt aus Pumpge schwindigkeit V_P1 und der Dosierzeit t_DOS definiertes Volumen V_S in den Durchflußkanal 6 transportiert. Im Moment der Ventilumschaltung wird die Pumpgeschwindigkeit V_P2 der Pumpe 2 auf V_P2-V_P1 auf V_P2* verringert, so daß der strömungsabhängige amperometrische Durchflußdetektor 7 stets mit der gleichen Geschwindigkeit durchflossen wird. Fig. 2b zeigt das Zeitablaufschema des Bestimmungsverfahren. Eingezeichnet sind die entsprechenden Pumpgeschwindigkeits-Zeit-Verläufe, die zur Einstellung der Volumenverhältnisse V_S/V_R zwecks Einstellung des Bestimmungsbereiches verändert werden können.

Im Durchflußkanal 6 reagiert das zu bestimmende Thioglycolat nach Reaktion (5) mit Trijodid zum entsprechenden Disulphid. Das verbleibende Trijodid wird an einer Glaskohlenstoffelektrode

2 HS-CH₂-COO^- + I₃ ^- → ^-OOC-CH₂-S-S-CH₂-COO^- + 3I^- (5)

kathodisch bei einem Potential von 0 mV gegen die Ag/AgCl/0.1 M KCl- Referenzelektrode detektiert. Die zu bestimmende Thioglycolatkonzentration wird aus der Differenz zwischen vor und nach Zudosierung der Probenlösung stationär gemessenen Trijo didkonzentration, den Stöchiometriefaktoren der nach (5) ablaufenden Bestimmungs reaktion, dem eingestellten Verhältnis V_S/V_R der für die Probenlösung V_S zu der für die Reagenzlösung eingestellten Pumpgeschwindigkeit V_R berechnet.

Fig. 3a zeigt die Durchflußmeßanordnung zur Durchführung der enzymatischen Be stimmung von Saccharose, die sich von der in Fig. 1a gezeigten nur dadurch unterscheidet, daß sich am Zusammenfluß 3 vier Flüssigkeitsströme treffen. Ein definiertes Volumen der saccharosehaltige Probenlösung PL wird über das Umschaltventil 4 in den Probenlösungs vorlagekanal 8 transportiert. Nach Flußumkehr der Pumpe 1 und Umschaltung von Ventil 4 wird die Probenlösung über die verjüngte Verbindungskapillare 11 zum Zusammenfluß 3 transportiert. Kurz vor der Ankunft der Probenlösung werden die Pumpen 2, 12 und 13 gestar tet, so daß eine Invertaselösung R1, ein Konditionierpuffer R2 und gegebenenfalls eine Glu coseoxidase/Mutarotaselösung R3 simultan mit der Probenlösung in den Durchflußkanal 6 gedrückt werden. Sinnvollerweise werden die Pumpgeschwindigkeiten V_P2, V_P12 und V_P13 so eingestellt, daß sich im Durchflußkanal die optimalen Reaktionsbedingungen, pH 6.3, 1.5 U Invertase pro ml, 5 U Glucoseoxidase pro ml und 20 U Mutarotase pro ml einstellen. In dem Moment, in dem die Probenlösung zugemischt wird, werden die Pumpgeschwindigkeiten V_P2, V_P12 und V_P13 proportional um den summarischen Betrag V_P1 verringert, so daß der als amperometrische Durchflußmeßzelle ausgeführte Detektor 7 mit konstanter Geschwindigkeit durchströmt wird. Nach Kalibrierung des Detektors 7 und vollständigem Umsatz kann aus dem stationären amperometrischen Signalstrom die vorliegende Wasserstoffperoxidkonzen tration und aus dieser und der Stöchiometrie der Bestimmungsreaktionen (6-8) die Saccha rosekonzentration berechnet werden. Fig. 3b zeigt das Zeitablaufschema dieses Bestim mungsverfahrens.

Saccharose + H₂O → Fructose + α-D-Glucose (6)

α-D-Glucose ⇆ β-D-Glucose (7)

β-D-Glucose + O₂ → D-Gluconat + H₂O₂ + H⁺ (8)

Fig. 4a zeigt die Durchflußanalysenanordnung zur enzymatischen Bestimmung von Glutamin mittels zweistufiger enzymatischer Umsetzung und Fluoreszenzdetektion. Die auf pH 4.9 eingestellte Cofaktorlösung C: 1 mM NAD⁺, 0.1 M Natriumacetat/Essigsäure wird durch Pumpe 1 kontinuierlich durch die Ventile 9 und 14, die Durchflußkanäle 6 und 15 sowie den Fluoreszenzdetektor transportiert. Durch zeitgesteuerte Umschaltung des Ventils 9 wird ein durch die Dosierzeit t_DOS und die Pumpgeschwindigkeit V_P2 definiertes Probenlö sungsvolumen in den Durchflußkanal 6, der in diesem Anwendungsbeispiel immobilisierte Glutaminase enthält, gedrückt. Im Moment der Ventilumschaltung wird die Pumpgeschwin digkeit V_P1 um den Betrag von V_P2 verringert, so daß die resultierende Durchflußge schwindigkeit gleich V_P1 also im Durchflußanalysenkanal konstant bleibt. Im Durchflußkanal 6 erfolgt die durch Glutaminase katalysierte Hydrolyse von Glutamin zu Glutamat

Glutamin + H₂O + H⁺ → Glutamat + NH₄ ⁺ (9)

entsprechend Reaktion (9). Entsprechend dem in Fig. 4b gezeigten Zeitplan erfolgt im zwei ten Analysenschritt die Dosierung von 0.3 M Natriumphosphatpuffer, pH 8.1 durch zeitgesteuerte Umschaltung von Ventil 14. Das auf diese Weise konditionierte Reaktions gemisch passiert nun den Durchflußkanal 15, der immobilisierte Glutamatdehydrogenase enthält. Entsprechend der Reaktion (10) erfolgt die Bildung von NADH, das fluorimetrisch bei einer Anregungswellenlänge von 365 nm und einer Emissionswellenlänge von 440 nm detektiert wird. Der Vorteil dieser speziellen Ausführung des Verfahrens besteht darin, daß die bei konventionellen Durchflußverfahren unvermeidliche hohe Verdünnung der Proben lösung auf das Verhältnis der zudosierten Lösungen minimiert ist. Wird dem Reagenz R ein Redoxfarbstoff, z. B. Jodnitrotetrazoliumchlorid INT und Diaphorase zugesetzt, läuft zu sätzlich die Reaktion (11) ab, bei der ein Formazan gebildet wird, das bei 492 nm photo metriert wird. Ausgehend von der molaren Formazankonzentration, die über das Lambert- Beersche Gesetz zugänglich ist, kann die zu bestimmende Glutaminkonzentration über die Stöchiometrie der Reaktionen 9-11 berechnet werden.

Glutamat + NAD⁺ → α-Ketoglutarat + NH₄ ⁺ + NADH (10)

NADH + INT + H⁺ → NAD⁺ + Formazan (11)

Liste der Bezugszeichen

1

,

2

,

12

,

13

Präzisionspumpen

3

Zusammenfluß

4

Umschaltventil

5

Übergang zu kleinerem durchflossenem Querschnitt

6

Durchflußkanal

7

Durchflußdetektor

8

Probenvorlagekanal

9

todvolumenarmes Umschaltventil

10

Abfluß

11

verjüngte Verbindungskapillare

14

zweites todvolumenarmes Umschaltventil

15

zweiter Durchflußkanal

Claims

1. Verfahren zur durchflußmodulierten Konzentrationsanalyse, bei dem in einem oder mehreren Durchflußkanälen (6, 14) mit mindestens einem Übergang (3, 5, 11) zu einem kleinerem Durchflußquerschnitt durch präzise zeitliche Steuerung von Pump geschwindigkeiten vorher voneinander getrennte Proben-, Verdünnungs-, Konditio nier- und Reagenzlösungen in einem weiten, durch die Pumpgeschwindigkeiten und die Pumpzeiten festgelegten Volumenbereich mit hoher Genauigkeit dosiert sowie Verweilzeiten und durch dispersionsfreie Vermischung Konzentrationen, Konzentra tionsverhältnisse und -gradienten präzis und stationär eingestellt und die Konzentra tions-Zeit-Verläufe der Probensubstanz, einer Indikatorsubstanz oder eines Reaktions produktes kontinuierlich, bevorzugt durch einen Durchflußdetektor (7) aufgezeichnet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei bei kontinuierlichem Fluß einer Reagenz-, Konditionier- oder Verdünnungslösung die die Probenlösung transportierende Pumpe (1) so lange angeschaltet und die Pumpgeschwindigkeit der anderen Pumpe um den Betrag der Durchflußgeschwindigkeit der Probenlösung verringert wird, so daß sich bei resultierender, konstanter Durchflußgeschwindigkeit eine ausreichend lange Zone sta tionärer Konzentrationen oder Konzentrationsverhältnisse ausbildet.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, wobei nach der Vermischung der dosierten Probenlösung und der Reagenzlösung eine chemische Reaktion die Einstellung statio närer Konzentrations-Zeit-Verläufe der Probensubstanz, des Reagenzes und der Reak tionsprodukte bewirkt.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, wobei nach Einstellung stationärer Kon zentrations-Zeit-Verläufe, die die Proben- und Reagenzlösung transportierenden Pum pen (1, 2) angehalten werden, um eine bestimmte Verweilzeit zur Erreichung eines ge wünschten Umsatzgrades der Bestimmungsreaktion einzustellen.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, wobei zur Vermeidung von der Konzen trationsanalyse vorausgehenden Vermischungen zwischen der Proben- und der Rea genz-, Konditionier- und der Verdünnungslösung ein empfangs- und donorseitig tod volumenfreies Umschaltventil (9, 14) die jeweils zu zu mischende Lösung von der empfangenen Lösung abtrennt und zur Zumischung während einer bestimmten Zeit mit der empfangenden Lösung verbindet.

6. Verfahren nach Anspruch 1 und mindestens einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die die Probenlösung und eine der anderen Lösungen transportierende Pumpe so ange steuert werden, daß bei konstanter Summe der Durchflußgeschwindigkeiten das Ver hältnis beider Durchflußgeschwindigkeiten so geändert wird, daß das gewünschte Volumenmischungsverhältnis, z. B. eine Verdünnung über eine ausreichend lange Zeit stationär eingestellt wird.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, wobei mehr als zwei Pumpen eingesetzt werden, um außer der Proben- und der Reagenzlösung weitere Reagenzlösungen zu einem gemeinsamen Mischpunkt (3) zu transportieren und im nachfolgenden Durch flußkanal (6) zu vermischen.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, wobei zu einer kontinuierlich fließenden Träger- oder der Probenlösung selbst über in Serie geschaltete todvolumenfreie oder -arme Umschaltventile (9, 14) nacheinander mehrere Reagenzlösungen oder andere Lösungen in jeweils einem zugeordneten Durchflußkanal (6, 15), vorzugsweise bei konstanter resultierender Durchflußgeschwindigkeit zugemischt werden.