DE19860802A1 - Herstellung eines Mittels gegen Hepatitis B-, HI-, Paramyxo und Orthomyxo-Viren - Google Patents

Herstellung eines Mittels gegen Hepatitis B-, HI-, Paramyxo und Orthomyxo-Viren

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Abstract

Eine Substanz der allgemeinen Formel I DOLLAR F1 worin DOLLAR A (A) R¶1¶ und R¶2¶ jeweils Wasserstoff sind und R¶3¶ ein Halogen, -CF¶3¶, Alkoxy mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen oder halogensubstituiertes Alkoxy mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen ist, DOLLAR A (B) R¶2¶ Wasserstoff ist und R¶2¶ und R¶3¶, die gleich oder unterschiedlich sind, ein Halogen oder -CF¶3¶ sind, DOLLAR A (C) R¶1¶ Wasserstoff ist, R¶2¶ Alkyl mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen ist und R¶3¶ ein Halogen ist, oder DOLLAR A (D) R¶1¶ Wasserstoff ist und R¶2¶ und R¶3¶ 3',4'-Methylendioxy sind, wird zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Hepatitis-B-Viren, HI-Viren, Viren der Paramyxogruppe oder/und der Orthomyxogruppe, bzw. zum Behandeln einer Infektion derartiger Viren, oder zum Nachweis derartiger Viren verwendet.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Substanz der allgemeinen Formel I zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Hepatitis-B-Viren (HBV), HI-Viren, Viren der Paramyxogruppe oder/und der Orthomyxogruppe, ein Verfahren zum Vermindern oder Inhibieren des Wachstums oder Vermehrung derartiger Viren, und ein Verfahren zum Nachweis derartiger Viren.
Hepatitis-B-Virus-Infektion führt zu akuter und in bestimmten Fällen chronischer Erkrankung der Leber. Weltweit sind nach Schätzungen der WHO etwa 350 Millionen Menschen persistent mit HPB infiziert. Chronisch Infizierte tragen ein hohes Risiko, an chronischer aktiver Hepatitis, Leberzirrhose oder hepatozellulärem Carcinom zu erkranken. Obwohl hochwirksame HV Vaccine seit 1982 verfügbar sind, können bereits infizierte Patienten damit nicht therapiert werden. Die verfügbare antivirale Therapie mit Interferon alpha ist mit Nebenwirkungen verbunden und nur bei einem Teil der Patienten einsetzbar und wirksam. Neuere Behandlungs­ möglichkeiten mit Nucleosidanalogen wie 3'Thiacytidin erscheinen erfolgversprechend und verträglich, aber die Langzeitwirksamkeit ist bisher unbekannt, vor allem in Anbetracht bereits beobachteter Resistenzbildung. Die Bereitstellung von Mitteln mit geringen Nebenwirkungen, die nicht zur Resistenzbildung führen, ist daher wünschenswert. Die zunehmende Bedeutung von Kombinationstherapien erfordert die Entwicklung zusätzlicher Mittel, die mit anderen Stadien des Infektionszyklus oder des Krankheitsver­ laufs interferieren.
Eine HIV-Infektion führt in den meisten Fällen nach unterschiedlich langen Latenzphasen zur Ausprägung von AIDS (acquired immune deficiency syndrome), dessen Krankheitsbild und -verlauf neben den Auswirkungen der Primärinfektion durch den HI-Virus in erheblichem Maß von Sekundärin­ fektionen bestimmt wird. Die Kombinationstherapie mit mehreren Wirk­ stoffen (Nucleosidanaloge, Proteaseinhibitoren) spielt auch in der Therapie HIV-infizierter Patienten die entscheidende Rolle, allerdings ist damit nur eine Verzögerung und Erleichterung des Krankheitsverlaufs möglich, keine Heilung von AIDS. Ein Impfstoff steht derzeit nicht zur Verfügung.
Viren der Familie Orthomxyviridae umfassen Influenzaviren der Gruppen A, B und C. Influenza A und B Viren verursachen in infizierten Patienten ein Spektrum an klinischen Symptomen, das von asymptomatisch bis zu viraler Pneumonie mit tödlichem Ausgang reicht. Diese Viren können, bedingt durch reassortment genetischer Information zwischen verschiedenen Stämmen, weltweite Epidemien mit exzessiver Mortalitätsrate auslösen. Impfung von Risikogruppen mit der jährlich von der WHO empfohlenen Zusammensetzung inaktivierter Vaccine wird routinemäßig durchgeführt. Amantadine und Rimantadine stehen zur Prophylaxe und Therapie als Antivirals zur Verfügung, sind allerdings nur gegen Influenza A wirksam, nicht gegen Influenza B, das in einem Viertel der Fälle für Hospitalisierung verantwortlich ist, oder gegen resistente Stämme. Zu den Paramyxoviren gehören Mumps-, Masern-, Hundestaupe-, Rinderpest- und Respiratory Syncytial Virus.
Daher besteht seit langem das Bedürfnis für wirksame Mittel gegen Hepatitis-B-Viren, HI-Viren, Viren der Paramyxo- und Orthomyxogruppe, die geringe Nebenwirkungen aufweisen und kostengünstig in geeigneten Darreichungsformen bereitgestellt werden können.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, Mittel zur Behandlung von Hepatitis-B-Viren, HI-Viren, Viren der Paramyxo- oder/und der Orthomyxogruppe bereitzustellen, die eine gute Wirksamkeit gegen diese Viren haben sowie geringe Nebenwirkungen aufweisen.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch die Verwendung einer Substanz der allgemeinen Formel I
worin
  • A) R1 und R2 jeweils Wasserstoff sind und R3 ein Halogen, -CF3, Alkoxy mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen oder ein halogensubstituiertes Alkoxy mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen ist,
  • B) R2 Wasserstoff ist und R2 und R3, die gleich oder unterschiedlich sind, ein Halogen oder -CF3 sind,
  • C) R1 Wasserstoff ist, R2 Alkyl mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen ist und R3 ein Halogen ist, oder
  • D) R1 Wasserstoff ist und R2 und R3 3',4'-Methylendioxy sind, zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Hepatitis-Viren, HI-Viren, Viren der Paramyxogruppe oder/und der Orthomyxogruppe.
Die Verbindungen der Formel I fassen sich unter die Leflunomide einordnen. Leflunomid bezeichnet eine Substanzgruppe von N-(4-Trifluoromethyl­ phenyl)-5-methylisoxazol-4-carboxamiden, die ursprünglich als Herbizide in der Landwirtschaft zum Einsatz kamen. Für sie wurde mittlerweile auch eine entzündungshemmende und immunsuppressive Wirkung festgestellt, sodass ihr Einsatz, insbesondere bei Transplantationspatienten, zur Unterdrückung einer Transplantatabstoßung möglich erscheint. Eine antivirale Aktivität für Leflunomide oder seine Derivate wurde bisher jedoch nicht berichtet.
Es war überraschend, dass die erfindungsgemäß verwendeten Substanzen neben einer Herbizidaktivität und einer entzündungshemmenden sowie einer immunsuppressiven Wirkung auch eine gute Wirksamkeit insbesondere gegen Hepatitis-B-Viren, HI-Viren, Viren der Paramyxogruppe und der Orthomyxogruppe zeigen.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Mittel mit Substanzen gemäß Formel I als Wirkstoffe zeichnen sich durch ihre hohe Wirksamkeit aus, sodass bereits geringe Mengen für eine erfolgreiche Behandlung ausreichend sind.
Andererseits sind Substanzen gemäß Formel I gut verträglich, sodass die in dem erfindungsgemäß erhaltenen Mittel verwendete Dosis nicht durch nachteilige Nebenwirkungen beschränkt wird. Darüber hinaus sind die erfindungsgemäß verwendeten Substanzen unproblematisch in ihrer Herstellung und somit in großen Mengen leicht und kostengünstig verfüg­ bar.
In der Substanz gemäß Formel I liegt der Oxazolring geschlossen oder offen vor. Nach Einnahme eines erfindungsgemäß erhaltenen Mittels, das die Substanz gemäß Formel I mit geschlossenem Oxazolring beinhaltet, wird diese im Körper metabolisiert und der Oxazolring geöffnet, wodurch eine physiologisch wirksamere Form der Substanz (Grundstruktur: N-(4- Trifluoromethylphenyl)-2-cyano-3-hydroxycrotonamid (A771726)) entsteht.
Das erfindungsgemäß erhaltene Mittel kann weiterhin übliche Träger-, Hilfs- oder/und Zusatzstoffe enthalten, die dem Fachmann bekannt sind und deshalb nicht explizit genannt werden müssen. Besonders bevorzugt sind Träger-, Hilfs- oder/und Zusatzstoffe, die die Lagerfähigkeit, die Resorption, Kinetik oder/und die Verträglichkeit des erfindungsgemäßen Mittels erhöhen.
Vorzugsweise enthält das Mittel mindestens ein Pyrimidin, vorzugsweise ein Uridin, Cytidin oder/und Thymidin. Durch die Verwendung von Pyrimidin in dem erfindungsgemäßen Mittel wird die Verträglichkeit für die verwendete Substanz gemäß Formel I weiter erhöht und mögliche Nebenwirkungen können vermindert werden. Darüber hinaus wird es dadurch möglich, die Dosis der erfindungsgemäß verwendeten Substanz zu erhöhen. Somit kann auch eine schwerwiegende Virusinfektion wirksam bekämpft werden. Der Gehalt des Pyrimidins kann bis zu 90 Gew.-% betragen, bevorzugt 5 bis 70 Gew.-%, mehr bevorzugt 10 bis 60 Gew.-% und am meisten bevorzugt 30 bis 40 Gew.-%.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Substanz gemäß Formel I zur Herstellung von Mitteln zur Bekämpfung von Viren aus der Gruppe Hepatitis B-Virus, HIV-1 oder HIV-2-Virus, aviäres Paramyxovirus, Parainfluenzavirus, bevorzugt vom Typ 1, Mumps-Virus, Masern-Virus, Hundestaupe-Virus, Rinderpest-Virus, Pneumovirus und Influenzavirus, bevorzugt Influenza-A- Virus, verwendet.
Als Substanz gemäß Formel I für das Mittel werden (A) N-(4-Trifluoro­ methylphenyl)-5-methylisoxazol-4-carboxamid, (B) die Form mit offenem Oxazolring von (A) N-(4-Trifluoromethylphenyl)-2-cyano-3-hydroxycroton­ amid, (C) ein Natriumsalz von N-(4-Trifluoromethylphenyl)-2-cyano-3- hydroxy-crotonamid, (D), (E), (F) oder/und ein Gemisch davon, verwendet.
Der Gehalt der Substanz gemäß Formel I in dem erfindungsgemäßen Mittel kann je nach dem zu behandelnden Virustyp und gegebenenfalls der Schwere der Virusinfektion ausgewählt und angepaßt werden.
Das erfindungsgemäß hergestellte Mittel wird im allgemeinen in solcher Menge verabreicht, die 0,1 bis 100 mg/Tag an Substanz der Formel I entspricht, abhängig von der Proteinbindung der jeweiligen Substanz.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Mittel weitere antiviral wirksame Substanzen enthalten. Vorteilhaft ist die Auswahl von Sub­ stanzen, die die gleiche Virustypspezifität wie die erfindungsgemäß verwendete Substanz haben. Dies hat den Vorteil, dass die Wirksamkeit gegenüber einem bestimmten Virustyp, gegebenenfalls durch synergistische Effekte der Substanzen erhöht werden kann. Gegebenenfalls zeigt diese Substanz eine andere Virustyp-Spezifität als die Substanz gemäß Formel I, sodass andererseits neben dem Primärvirus gleichzeitig auch Sekundärvirus- Infektionen bekämpft werden können.
Das erfindungsgemäß hergestellte Mittel kann in jeder geeigneten Darrei­ chungsform zubereitet werden. Vorzugsweise wird das Mittel in Form einer Tablette, einer Retardtablette, eines Dragees, einer Kapsel, eines Granulats, einer Ampulle, einer Infusionslösung, einer Injektionslösung oder eines Konzentrats zur Herstellung einer Infusionslösung oder einer Injektions­ lösung zubereitet.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Vermindern oder inhibieren des Wachstums von Hepatitis-B-Viren, HI-Viren, Viren der Paramyxogruppe oder/und der Orthomyxogruppe in mit diesen Viren infizierten Zellen, umfassend Inkonktaktbringen der Zellen mit einer ausreichend wirksamen Menge einer Substanz gemäß Formel I, um die Virusvermehrung zu verlangsamen oder zu inhibieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens wird das Vermindern bzw. Inhibieren des Wachstums oder der Vermehrung der Viren durch eine Verlangsamung oder Inhibierung der Virusassemblierung erreicht.
Die wirksame Menge einer Substanz gemäß Formel I wird dabei an den jeweiligen Virustyp und die infizierten Zellen in geeigneter Weise angepasst. Im Allgemeinen liegt die wirksame Menge der Substanz gemäß Formel I in einer Konzentration von 1 bis 1000 µM.
In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Hepatitis-B-Virus, eines HI-Virus oder eines Virus der Paramyxogruppe oder der Orthomyxogruppe, das dadurch gekennzeichnet ist, dass 1. zu Patientenzellen in Kultur eine Substanz gemäß Formel I zu dem Kulturmedium zugegeben wird und 2. cytopathische oder zellver­ ändernde Effekte im Vergleich mit einer Kontrollkultur ohne Zugabe dieser Substanz gemessen werden. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass durch einfache visuelle Kontrolle ein Nachweis der oben genannten Viren möglich ist.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Infektionen durch Hepatitis-B-Viren, HI-Viren, Viren der Paramyxogruppe oder/und der Orthomyxogruppe durch Verabreichung eines Mittels an einen Patienten, das eine Substanz der allgemeinen Formel I enthält. Die Menge der Substanz gemäß Formel I wird an den jeweils vorliegenden Virus-Typ und die Schwere der Virusinfektion angepasst. Zweckmäßig wird dem Patienten eine Tagesdosis von 0,1 bis 100 mg der Substanz gemäß Formel I verabreicht. Die Verabreichung des erfindungsgemäß erhaltenen Mittels kann auf jede geeignete Weise erfolgen, wobei bevorzugt eine systemische Applikation durch z. B. orale, intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Applikation erfolgt. Das Mittel mit der Substanz gemäß Formel I kann dem Patienten auch in Form eines Aerosols verabreicht werden. Eine andere mögliche Art der Applikation ist topisch, z. B. in Form von Tropfen, Cremes, Pflaster oder Suppositorien.
Als Substanz gemäß Formel I werden (A) N-(4-Trifluoromethylphenyl)-5- methylisoxazol-4-carboxamid, (B) die Form mit offenem Oxazolring von (A) N-(4-Trifluoromethylphenyl)-2-cyano-3-hydroxycrotonamid, (C) ein Natrium­ salz von N-(4-Trifluoromethylphenyl)-2-cyano-3-hydroxy-crotonamid oder ein Gemisch davon bevorzugt.
Um die Wirksamkeit oder/und die Verträglichkeit der Substanz gemäß Formel I weiter zu erhöhen, kann das erfindungsgemäße Mittel weiterhin mindestens ein Pyrimidin, vorzugsweise ein Uridin, Cytidin oder/und Thymidin enthalten.
Die Substanz gemäß Formel I kann zusammen mit weiteren antiviral wirksamen Mitteln verabreicht werden, wobei dies gleichzeitig oder nacheinander erfolgen kann. Beispiele für weitere antiviral wirksame Substanzen beinhalten Acyclovir, Gancyclovir, Vidaravidin, Foscarnet, Cidovir, Amantadin, Ribavirin, Trifluorthymidin, Interferon-α, Cidovudin, Didanosin oder Calcitabin.
Die Erfindung wird durch die folgenden Figuren und Beispiele weiter erläutert.
In den Figuren zeigt:
Fig. 1 die Verminderung des cytopathischen Effekts (CPE) von HIV-1 bei C8166-Zellen durch die Substanzen N-(4-Trifluoromethylphenyl)-5- methylisoxazol-4-carboxamid (A), der metabolisierten, aktiven offenen Ringform von (A) N-(4-Trifluoromethylphenyl)-2-cyano-3-hydroxycrotonamid (B) und dessen Natriumsalz N-(4-Trifluoromethylphenyl)-2-cyano-3-hydroxy­ crotonamid (C) in verschiedenen Verdünnungen,
Fig. 2 den Einfluss der Substanzen A, B und C in verschiedenen Verdünnungen auf die Ausbildung des CPE (Syuncytien-Bildung),
Fig. 3, Fig. 4 und Fig. 5 die Auswirkung von N-(4-Trifluormethyl­ phenyl)-5-methylisoxazol-4-carboxamid in verschiedenen Verdünnungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten (Tag 2-5, 5-9 bzw. 9-12) auf die Enten- Hepatitis-B-Virus-Produktion in primären Entenhepatozyten.
Beispiel 1
Testprinzip: Durchführung von Infektionsreihen von C8166-Zellen mit HIV-1 und anschließende Auswertung des cytopathischen Effekts (CPE = Riesenzellbildung durch virusbedingte Zellverschmel­ zungen (Syncytien)), wobei jeweils eine Virus-Verdünnungs­ reihe ohne Substanz als Kontrolle verwendet wurde. Bei diesen Experimenten wurden die Infektionen mit HIV jeweils ohne Substanz in einem Falconröhrchen durchgeführt, nach 1 Stunde Adsorption wurde abzentrifugiert und gewaschen, um die Zellen dann auf die Platte auszubringen. Das Waschen verringert die Zahl der ungebundenen Viren im Überstand auf ca. 100/ml. Auf der Platte sind weitere Indikatorzellen und Medium mit entsprechender Substanz vorgelegt.
Zellinie: C8166, humane T-Lymphozyten, Indikatorzelllinie für HIV-1
Virus: HIV-1 stammte aus dem Kulturüberstand von infizierten H9 Zellen (Isolat aus einem männlichen homosexuellen Münchner; Zur Verfügung gestellt von Herrn Prof. L. Gürtler, München).
Virustiter: ca. 3 × 103-1,6 × 104/ml (festgestellt über CPE nach 3-4 Tagen)
Der Cytopathische Effekt wurde jeweils nach 3-4 Tagen ausgewertet.
Testsubstanzen
A = N-(4-Trifluormethylphenyl)-5-methylisoxazol-4-carboxamide
B = metabolisierte, aktive offene Ringform von (A): N-(4-Trifluor­ methylphenyl)-2-cyano-3-hydroxycrotonamide
C = das Natriumsalz von B: N-(4-Trifluormethylphenyl)-2-cyano-3- hydroxy-crotonamid
Der Test wurde für Substanz A auf 24-Well-Platten durchgeführt, alle weiteren Tests wurden auf 48-Well-Platten durchgeführt. Die Zahl der eingesetzten C8166 Zellen war ca. 103-104/Well. Die erste Spalte der Platte blieb virusfrei; die weiteren Spalten enthalten von links nach rechts HIV-1 Überstand in zunehmender Verdünnung (1 : 5, 1 : 25, 1 : 125, 1 : 625, 1 : 3125, 1 : 15 625; 1 : 78 125). Die erste Zeile der Platte war in der Regel der Kontrollverdünnungsreihe vorbehalten, in den weiteren Reihen wurden die entsprechenden Substanzen ins Medium gegeben (EK im Medium: 100 µM, 50 µM und 20 µM). Nach drei-vier Tagen, wenn der cytopathische Effekt in der Kontrollreihe voll ausgebildet war, wurden die Syncytien in jedem Well ausgewertet.
Ergebnisse
Substanz A: Rückgang des CPE um den Faktor 5 bis 25; es ist keine deutliche Konzentrationsabhängigkeit zu erkennen.
Substanz B: Rückgang des CPE um den Faktor 25 bis 125; es ist nur eine schwache Konzentrationsabhängigkeit zu erkennen.
Substanz C: Rückgang des CPE um den Faktor 5 bis 125; es ist nur eine schwache Konzentrationsabhängigkeit zu erkennen.
Diese Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt.
Durch die erfindungsgemäße Verwendung der Substanzen A, B bzw. C konnte jeweils eine deutliche reproduzierbare Verringerung des cytophati­ schen Effekts von HIV-1 Viren auf C8166 Indikatorzellen festgestellt werden.
Beispiel 2 Verminderung des cytopathischen Effekts von HIV-1 (IIIb) auf C8166-Zellen durch die Substanzen A, B und C
Testprinzip: Durchführung von Infektionsreihen von C8166-Zellen mit HIV-1 und anschließender Auswertung des cytopathischen Effekts. Eine Virus-Verdünnungsreihe wurde als Kontrollwert ver­ wendet, wobei jeweils eine Virus-Verdünnungsreihe pro getesteter Substanz angesetzt wurde.
Zellinie: C8166, humane T-Lymphozyten, Indikatorzelllinie für HIV-1
Virus: HIV-1 (HIV IIIb) stammte aus dem Kulturüberstand von infizierten HUT78 Zellen;
Virustiter: ca. 5 × 102-1 × 103/ml
Testsubstanzen: A, B, C (50 mM), wurden in einer 1 : 500 Verdünnung verwendet.
A = N-(4-Trifluormethylphenyl)-5-methylisoxazol-4-carboxamid
B = metabolisierte, aktive offene Ringform von (A) N-(4-Trifluor­ methylphenyl)-2-cyano-3-hydroxycrotonamid
C = das Natriumsalz von (B) N-(4-Trifluormethylphenyl)-2-cyano-3- hydroxy-crotonamid
Der Test wurde auf 24-Well-Platten durchgeführt. Die Zahl der eingesetzten C8166-Zellen war ca. 103-104/Well. Die erste Spalte der Platte blieb virusfrei; die weiteren Spalten enthalten von links nach rechts HIV IIIb Überstand in zunehmender Verdünnung (1 : 5, 1 : 25, 1 : 125, 1 : 625; 1 : 3125). Die erste Reihe der Platte war jeweils der Kontrollverdünnungsreihe vorbehalten, in den weiteren drei Reihen wurden die Substanzen A, B und C ins Medium gegeben. Nach drei Tagen, wenn der CPE in der Kontrollreihe voll ausgebildet war, wurden die Syncytien in jedem Well ausgezählt. Der Versuch wurde dreimal wiederholt. Fig. 2 zeigt die gemittelten Werte.
Das Ergebnis zeigt deutlich, dass die Syncytienbildung von HIV IIIb bei C8166-Zellen durch Anwendung der erfindungsgemäßen Substanzen um einen Faktor von ca. 100 unterdrückt wird. Aufgrund des geringen Virustiters sind die erhaltenen Werte jedoch an der Auflösungsgrenze des Tests.
Beispiel 3 Verminderungen der Vermehrung von Ortho- und Paramyxoviren durch die Substanzen A, B, C
Testprinzip: Durchführung von Infektionen von Zellen in Gegenwart der einzelnen Substanzen und Quantifizierung der freigesetzten Viren durch HA-Test (Orthomyxoviren) bzw. TCID-Test (Paramoxyviren). Zusätzliche mikroskopische Beurteilung des durch die Substanzen allein oder durch Viren in Gegenwart der Substanzen ausgelösten cytopathischen Effekts (CPE).
Viren: Influenza A Virus, 2560 HA/ml; Parainfluenza Typ 1 (Sendai) Virus, 6,4 × 105 TCID50/ml;
Zellinien: MDCK-Zellen für Influenza A Viren; MCF-10A Zellen und HeLa- Zellen für Sendai-Viren;
Experiment: Zellen in 6-Well-Platten wurden mit 128 HA Influenza A Virus, 1,6 × 104 TCID50 Sendai-Virus für zwei Stunden infiziert; nicht aufgenommene Viren wurden durch Waschen entfernt und die Zellen in Serumfreien Medium in Gegenwart der Testsub­ stanzen für 24 oder 48 Std. inkubiert; anschließend wurde die Anzahl der in den Zellkulturüberstand freigesetzten Viren im HA- bzw. TCID50-Test bestimmt.
Ergebnisse: In mehreren unabhängigen Versuchsreihen konnte eine Reduktion der Replikation von Ortho- und Paramyxoviren in Abhängigkeit von der Konzentration der eingesetzten Sub­ stanzen (z. B. Substanz B) festgestellt werden:
Die Substanz B zeigte eine um den Faktor 2 bessere Hemmung der Virusreplikation im Vergleich zu den Substanzen A und C.
In Gegenwart der Substanz B verringerte sich der durch die Virusinfektion bedingte CPE auf 90%-75% gegenüber der Positivkontrolle, insbesondere die Veränderung der Zellform in Richtung "spindelförmig" war reduziert.
Beispiel 4 Reduktion der Druck Hepatitis B Virus (DHBV) Sekretion aus primären Entenhepatozyten durch N-(4-Trifluormethylphenyl)-5-methylisoxazol-4- carboxamid (Substanz A)
Methoden: Ein Entenküken wurde einen Tag nach dem Schlüpfen intravenös mit 200 µl Entenserum injiziert, das 1010 DHBV DNA-Genom Äquivalente/ml enthielt. Zwei Wochen nach Infektion wurden primäre Enten-Hepatozyten (PDH) wie beschrieben präpariert und kultiviert (JV (1986) 58, 17-251; JV (1992) 66, 2829-2836): Hepatozyten wurden durch Zwei-Schritt Collagenase-Perfusion isoliert und in Six-well-Platten mit ca. 106 Zell/well ausgesät. Zellen wurden bei 37°C in 5% CO2 in William's medium E (Gibco BRL) gehalten, das mit Gentamycin (50 µg/ml), L-Glutamin (2,25 mM), Glucose (0,06%), HEPES pH 7,4 (23 mM), Hydrocortison (4,8 µg/ml), Inosin (1 µg/ml), Penicillin (50 IU/ml), Streptomycin (50 µg/ml) und Dimethylsulfoxid (1,7%) supplementiert worden war. Mediumwechsel erfolgte an den Tagen 2, 5, 9 und 12 nach Ausplattieren.
Substanz A wurde am Tag 5 bzw. am Tag 9 nach Platieren zugegeben. Kulturüberstände wurden am Tag 5, 9 und 12 nach Platieren gesammelt. Pro Well wurde ein Viertel des Kulturmediums (entspricht 2,5 × 105 Zellen) mit Hilfe von Dot-Blot-Hybridisierung relativ zu einem DNA-Standard analysiert. Ein linearisiertes Plasmid, das eine Kopie des DHBV-Genoms trägt, wurde mit "random priming" auf eine spezifische Aktivität von etwa 108 cpm/µg markiert und als Sonde zur Hybridisierung eingesetzt. Die Quantifizierung der Signale erfolgte mit einem Molecular Dynamics Phosphoimager.
Erläuterung zu den Figuren
Fig. 3 zeigt den DNA-Dot-blot der PDH-Überstände. PDH wurden mit Substanz A (comp. A, comp. A rev) in den angezeigten Konzentrationen 5 Tage nach Platieren behandelt. "Control" zeigt die DMSO-Kontrolle (die Substanz wurde in DMSO gelöst). Am Tag 9 nach Platieren wurde frisches Medium mit (comp. A) oder ohne Substanz A (comp. A rev) zu den Zellen gegeben. Der DNA-Standard, der zur Umrechnung der Daten in das Diagramm von Fig. 4 diente, ist ebenfalls gezeigt. Die Zahlen in Fig. 4 repräsentieren die Medianwerte aus 3 (A rev), 6 (untreated d9, untreated d12) oder 12 individuellen Wells (untreated d5, A), von denen der unspezifische Background (7,7 × 106 DNA Äquivalente/ml) bereits abgezogen wurde. "d2-5" steht für Überstände, die am Tag 5 gesammelt wurden, "d5-9" am Tag 9 und "d9-12" am Tag 12.
Das Diagramm eines Dot-blots mit Überständen von PDH, die mit Substanz A in Konzentrationen von 5 bis 200 µM behandelt wurden, ist in Fig. 5 dargestellt. Zahlen repräsentieren hier Medianwerte von zwei (mit A behandelt) oder drei (unbehandelt) individuellen Wells, der unspezifische Background entsprach 4,3 × 106 DNA Äquivalenten/ml.
Ergebnisse
Die Virusabgabe der unbehandelten PDH war in den ersten Tagen nach Platierung niedrig, stieg jedoch bei Tag 12 auf 3,8 × 108 DNA Äquivalente/ml an (Fig. 4 (-), vgl. d2-5, d5-9, d9-12). Im Gegensatz dazu verblieb die Produktion von Nachkommenviren in PDH, die mit 20 oder 50 µM Substanz A behandelt worden waren, selbst am Tag 12 auf dem niedrigen Anfangsniveau von 5 bzw. 7 × 107 DNA Äquivalenten/ml (Fig. 4 20 µM A, 50 µM A). Vergleichbare Ergebnisse wurden in einem Konzen­ trationsbereich von 5 µM bis 200 µM A (Fig. 5) erzielt. Das Entfernen von Substanz A am Tag 9 (Fig. 4A rev) führte zu höherer Virusfreisetzung zwischen Tag 9 und 12 im Vergleich zu weiterhin behandelten Zellen (Fig. 4A), was darauf hinweist, dass die Wirkung von Substanz A reversibel ist. Zusammenfassend zeigte sich, dass Substanz A den Anstieg an Virussekre­ tion verhinderte, der bei nicht behandelten Zellen ungefähr 1,5 Wochen nach Platierung beobachtet wird.

Claims (13)

1. Verwendung einer Substanz der allgemeinen Formel I
worin
  • A) R1 und R2 jeweils Wasserstoff sind und R3 ein Halogen, -CF3, Alkoxy mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen oder ein halogensubstituier­ tes Alkoxy mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen ist,
  • B) R2 Wasserstoff ist und R2 und R3, die gleich oder unterschiedlich sind, ein Halogen oder -CF3 sind,
  • C) R1 Wasserstoff ist, R2 Alkyl mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen ist und R3 ein Halogen ist, oder
  • D) R1 Wasserstoff ist und R2 und R3 3',4'-Methylendioxy sind, zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Hepatitis-B-Viren, HI- Viren, Viren der Paramyxogruppe oder/und der Orthomyxogruppe,
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel weiterhin übliche Träger-, Hilfs- oder/und Zusatzstoffe umfasst.
3. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel mindestens ein Pyrimidin umfasst.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Pyrimidin ein Uridin, Cytidin oder/und Thymidin ist.
5. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das HI-Virus ein HIV-1 oder HIV-2 Virus ist.
6. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus der Paramyxogruppe ein aviäres Paramyxovirus, ein Parainfluenzavirus, ein Mumps-Virus, ein Masern-Virus, ein Hunde­ staupe-Virus, ein Rinderpest-Virus oder ein Pneumovirus ist.
7. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus der Orthomyxogruppe ein Influenza-Virus ist.
8. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz von Formel I ausgewählt ist unter (A) N-(4- Trifluoromethylphenyl)-5-methylisoxazol-4-carboxamid, (B) der Form mit offenem Oxazolring von (A) N-(4-Trifluoromethylphenyl)-2-cyano- 3-hydroxycrotonamid, (C) dem Natriumsalz von N-(4-Trifluoromethyl­ phenyl)-2-cyano-3-hydroxy-crotonamid oder einem Gemisch davon.
9. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel wenigstens eine weitere antiviral wirksame Substanz enthält.
10. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel in Form einer Tablette, einer Retardtablette, eines Dragees, einer Kapsel, eines Granulats, einer Ampulle, einer Infu­ sionslösung, einer Injektionslösung oder eines Konzentrats zur Herstellung einer Infusionslösung oder einer Injektionslösung zubereitet wird.
11. Verfahren zum Vermindern oder Inhibieren des Wachstums von Hepatitis-B-Viren, HI-Viren, Viren der Paramyxogruppe oder/und der Orthomyxogruppe in mit diesen Viren infizierten Zellen, umfassend Inkonktaktbringen der Zellen mit einer ausreichend wirksamen Menge einer Substanz der allgemeinen Formel I von Anspruch 1, um die Virusvermehrung zu verlangsamen oder zu inhibieren.
12. Verfahren zur Behandlung einer Infektion von Hepatitis-B-Viren, HI- Viren, Viren der Paramyxogruppe oder/und der Orthomyxogruppe durch Verabreichung einer ausreichend wirksamen Menge einer Substanz der allgemeinen Formel I von Anspruch 1.
13. Verfahren zum Nachweis eines Hepatitis-Virus, eines HI-Virus oder eines Virus der Paramyxogruppe oder der Orthomyxogruppe, dadurch gekennzeichnet, dass
  • 1. zu Patientenzellen in Kultur eine Substanz gemäß Formel I von Anspruch 1 zu dem Kulturmedium zugegeben wird, und
  • 2. cytopathische oder zellverändernde Effekte im Vergleich mit einer Kontrollkultur ohne Zugabe dieser Substanz gemessen werden.
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