DE19842991A1 - Novel methods and primers for genetic analysis of biological material by polymerase chain reaction using specific primer pairs useful in, e.g. forensic medicine - Google Patents

Abstract

Determining the origin of biological material by PCR using specific primers pairs, which are exclusively complementary to the respective animal or plant DNA is new. Detecting the origin of biological material comprises: (a) isolating the DNA from the investigation material; (b) use of \- 1 specific primer pair where each pair comprises primers, which are exclusively complementary to the detected DNA; (c) duplicating the animal, or preferably plant DNA by PCR; and (d) detecting of the specific PCR-products by means of electrophoresis.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft tier- und pflanzenartspezi­ fische Primerpaare sowie ein analytisches Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung tierischer und pflanzlicher Bestandteile durch Untersuchung der in den Materialien vorhandenen DNA. Hierbei werden nach Isolation der Erbsubstanz DNA bestimmte artspezifische DNA-Bereiche vervielfältigt.The present invention relates to animal and plant species fish primer pairs and an analytical method for detection and to identify animal and vegetable components by examining the DNA present in the materials. Here, DNA is determined after isolation of the genetic material Species-specific DNA areas reproduced.

In der Nahrungsmittel- aber auch beispielsweise in der Futter­ mittelindustrie gewinnt die eindeutige Identifizierbarkeit von biologischen Materialien im Rahmen der Qualitätssicherung eine zunehmende Bedeutung. Zur Zeit wird in der Analytik für der­ artige Untersuchungen vorwiegend die Spezifität der Proteine herangezogen. Das bedeutet, die Analyse erfolgt mittels immun­ chemischer Methoden durch die Verwendung entsprechender Anti­ körper gegen die nachzuweisenden tierischen oder pflanzlichen Bestandteile. Nicht selten sind jedoch die antigen-wirkenden Komponenten, gegen die die Antikörper gerichtet sind, durch die Vorbehandlung der tierischen und pflanzlichen Bestandteile in den Nahrungs- oder Futtermitteln nicht mehr vorhanden oder nicht mehr intakt, so daß keine oder keine ausreichende Antikörper- Antigen-Wechselwirkung stattfinden kann und somit eine immun­ chemische Detektion schlecht oder gar nicht funktioniert. In food - but also in feed, for example Mittelindustrie gains the unique identifiability of biological materials as part of quality assurance increasing importance. Currently, analytics for the like investigations mainly the specificity of the proteins used. This means that the analysis is carried out using an immune system chemical methods through the use of appropriate anti body against the animal or vegetable to be detected Components. However, the antigen-acting are not uncommon Components against which the antibodies are directed through which Pretreatment of animal and vegetable components in the food or feed no longer exists or not intact so that no or insufficient antibody Antigen interaction can take place and is therefore immune chemical detection works poorly or not at all.  

Ein weiteres Identifizierungsverfahren auf Proteinniveau beruht auf dem Vergleich der Isoenzymmuster. Bei diesem Verfahren beobachtet man bei den auftretenden Proteinmustern jedoch eine starke Abhängigkeit vom Gewebetyp. Im Untersuchungsmaterial jedoch ist der Gewebetyp, aus dem das Material stammt, häufig nicht mehr feststellbar. Darüberhinaus wird auch dieses Verfahren durch die Veränderungen der Enzyme bei Verarbeitungs­ prozessen eingeschränkt.Another protein level identification method is based on the comparison of the isoenzyme patterns. With this procedure however, one is observed in the protein patterns that occur strong dependence on the tissue type. In the test material however, the type of fabric from which the material originates is common no longer ascertainable. In addition, this too Process by changing the enzymes during processing processes restricted.

Bereits Ende der 80er Jahre wurde von Bauer et al. (Empfind­ licher elektrophoretischer Nachweis von Schweinefleisch in erhitzten Rindfleisch/Schweinefleisch-Mischungen, Fleischwirt­ schaft 67, 1141 (1987)) gezeigt, daß die Erbsubstanz DNA durch Hitze oder andere Verarbeitungsschritte und Zusatzstoffe nur gering beeinflußt wird.As early as the late 1980s, Bauer et al. (Sens electrophoretic detection of pork in heated beef / pork mixes, meat host shaft 67, 1141 (1987)) showed that the genetic material DNA by Heat or other processing steps and additives only is slightly influenced.

Weiterhin hat Meyer et al. (DNA-Sonden zur Tierartidentifizier­ ung in verarbeiteten Lebensmitteln, Fleischwirtschaft, 74 (11), 1237-1238 und 1542-1551 (1994)) DNA-Sonden beschrieben, die für die Identifizierung der gängigen Fleischsorten eingesetzt werden können. Dabei werden tierart-spezifische DNA-Sonden zur Identi­ fizierung von DNA aus tierischen Gewebeproben verwendet. Die Isolation tierart-spezifischer DNA-Sonden und das Verfahren selbst sind relativ arbeits- und zeitaufwendig, so daß es als Routine-Untersuchungsmethode wenig praktikabel ist. Darüber­ hinaus liegt die Nachweisgrenze in Abhängigkeit vom Sondentyp meistens bei ca. 5%, bestenfalls bei ca. 1%. Das heißt, die Nachweisempfindlichkeit ist vielfach nicht ausreichend.Furthermore Meyer et al. (DNA probes for animal species identification in processed foods, meat industry, 74 (11), 1237-1238 and 1542-1551 (1994)) DNA probes described for identification of common types of meat can be used can. Species-specific DNA probes become identi DNA from animal tissue samples. The Isolation of Species-Specific DNA Probes and the Method themselves are relatively labor and time consuming, so it is considered Routine examination method is not very practical. About it the detection limit depends on the type of probe mostly around 5%, at best around 1%. That is, the Detection sensitivity is often not sufficient.

Ein anderes Identifizierungsverfahren, welches erstmals von Meyer et al. (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism: A simple Method for Species Identification in Food, Journal of AOAC International, 78, 1542-1551 (1995)) für Fleischsorten beschrieben wurde, arbeitet mit "universellen" PCR-Primern, die die Vervielfältigung von DNA-Abschnitten verschiedener Tierarten ermöglichen, sofern die PCR-Primer ein hohes Maß an Übereinstimmung zu den Zielbereichen der DNA der betreffenden Tierart(en) aufweisen. Bei diesem PCR-Verfahren werden gleiche DNA-Bereiche vervielfältigt, die - unabhängig von der Tierart-DNA - gleich lang sind, aber innerhalb dieses Moleküls tierart-spezifische Sequenzunterschiede aufweisen. Diese vervielfältigten DNA-Bereiche, sog. PCR-Produkte, werden in einem zweiten Schritt einer Spaltung mit Restriktionsendo­ nukleasen unterzogen. Aufgrund von Sequenzunterschieden zwischen den PCR-Produkten der DNA verschiedener Tierarten entstehen nach enzymatischer Spaltung DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, die nach elektrophoretischer Trennung für die Identifizierung von Tierarten herangezogen werden können. Die Analyse der tier­ artspezifischen DNA-Fragmentmuster wird auch als RFLP-Analyse (RFLP = restriction fragment lenght polymorphism) bezeichnet. Zwecks Identifizierung der Tierarten werden die DNA-Fragment­ muster mit Fragmentmustern definierter Referenzarten verglichen. Dieses Verfahren ist bei Vorhandensein nur einer einzigen Art im zu untersuchenden Material anwendbar, scheitert jedoch bei komplexen Vermischungen, wie sie zum Beispiel bei Lebens- bzw. Futtermittelproben häufig auftreten. Da "universelle" Primer in Abhängigkeit von der Tier- und Pflanzenart unterschiedlich gut binden, werden die Mischungen, DNA-Moleküle bestimmter Arten, unter Umständen nur schwach amplifiziert und entziehen sich somit einer RFLP-Analyse. Selbst bei vergleichbarer Ampli­ fikation jeder vorliegenden Tier-DNA ist eine RFLP-Analyse bei komplexen Mischungen schwierig, da sich einzelne Fragmente oder Fragmentgruppen häufig nicht mehr einer bestimmten Tierart zuordnen lassen. Bei hocherhitzten Produkten stößt das Verfahren ebenfalls an seine Grenzen. Es stehen nur noch wenig hinreichend große DNA-Bruchstücke zur Verfügung, die als Bindungsstellen für die beiden PCR-Primer dienen können. Außerdem gestalten sich RFLP-Analysen als zeitaufwendig und sind daher als schnelle und verläßliche Routine-Untersuchungsmethoden ebenfalls geeignet.Another identification procedure, which was first used by Meyer et al. (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism: A simple Method for Species Identification in Food, Journal of AOAC International, 78, 1542-1551 (1995)) described for meat types, works with "universal"  PCR primers that duplicate DNA sections different animal species, provided the PCR primer is a high degree of agreement with the target areas of the DNA of the have the relevant animal species. With this PCR method identical DNA areas are reproduced which - regardless of the animal species DNA - are of equal length, but within this Molecule have species-specific sequence differences. These duplicated DNA areas, so-called PCR products, are in a second step a split with restriction end undergone nucleases. Due to sequence differences between the PCR products of the DNA of different animal species are created enzymatic cleavage DNA fragments of different lengths, that after electrophoretic separation for identification can be used by animal species. Analysis of the animal Species-specific DNA fragment pattern is also called RFLP analysis (RFLP = restriction fragment length polymorphism). In order to identify the animal species, the DNA fragment patterns compared with fragment patterns of defined reference types. This procedure is only available in the presence of a single species material to be investigated applicable, but fails complex mixes, such as those found in life or Feed samples occur frequently. Because "universal" primers in Depends on the animal and plant species differently well bind, the mixtures, DNA molecules of certain types, under certain circumstances only weakly amplified and elude thus an RFLP analysis. Even with comparable ampli An RFLP analysis is included with each animal DNA complex mixtures difficult because individual fragments or Fragment groups often no longer belong to a certain animal species assign. In the case of highly heated products, the process comes across also to its limits. There is not much left Large fragments of DNA are available that serve as binding sites for the two PCR primers can serve. In addition, shape  RFLP analyzes are time consuming and are therefore considered to be fast and reliable routine examination methods are also suitable.

Das der Erfindung zugrundeliegende Problem besteht darin, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem es gelingt, in relativ kurzer Zeit die Abstammung biologischer Materialien, die beispielsweise als Nahrungs- oder Futtermittel Verwendung finden, zu bestimmen. Folgende Schritte werden nacheinander durchgeführt:
The problem underlying the invention is to provide a method with which it is possible to determine the lineage of biological materials, which are used, for example, as food or feed, in a relatively short time. The following steps are carried out one after the other:

• - Isolation der Gesamt DNA aus dem Untersuchungsmaterial,Isolation of the total DNA from the test material,
• - Einsatz mindestens eines artspezifischen Primerpaares,- use of at least one species-specific primer pair,
• - Vervielfältigung der tierischen bzw. pflanzlichen DNA mittels PCR,- Reproduction of animal or vegetable DNA by means of PCR,
• - Detektion des jeweils artspezifischen PCR-Produktes mittels Elektrophorese, wobei das lösungsspezifische Primerpaar jeweils aus solchen Primern besteht, die ausschließlich komplementär zur nachzuweisenden tierischen bzw. pflanzlichen DNA sind- Detection of the species-specific PCR product using Electrophoresis, the solution-specific primer pair each consists of such primers that exclusively complementary to the animal or vegetable to be detected Are DNA

Der Nachweis der jeweiligen Tier- bzw. Pflanzenart wird durch die Verwendung entsprechender Primerpaare bei der Verviel­ fältigung mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) ermöglicht. Die in der Probe befindliche Tier- bzw. Pflanzenart wird durch die Synthese des artspezifischen DNA-Fragmentes bei der PCR direkt in der sich anschließenden Elektrophorese angezeigt. Die Sicht­ barmachung der spezifischen DNA-Fragmente im Agarose- oder Polyacrylamidgel erfolgt durch Anfärbung der entsprechenden DNA- Syntheseprodukte.Evidence of the respective animal or plant species is provided by the use of corresponding pairs of primers in the replication Fulfillment by means of polymerase chain reaction (PCR). The The animal or plant species in the sample is identified by the Synthesis of the species-specific DNA fragment in the PCR directly displayed in the subsequent electrophoresis. The view Creation of specific DNA fragments in agarose or Polyacrylamide gel is made by staining the corresponding DNA Synthesis products.

Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen angegeben. Geeignete artspezifische Primerpaare sind in den Nebenansprüchen spezifiziert. Advantageous embodiments are in the subclaims specified. Suitable species-specific primer pairs are in the Auxiliary claims specified.  

Für die Primerauswahl zur Identifizierung tierischer DNA einzelner Tierarten wurden DNA-Bereiche des mitochondrialen Cytochrom b-Gens gewählt.For the selection of primers for the identification of animal DNA Individual animal species became mitochondrial DNA regions Cytochrome b gene selected.

Die Identifizierung pflanzlicher DNA erfolgt mittels spezi­ fischer PCR-Primer für das Soja-Lectin-Gen sowie Primer für die intergenetische Region von Weizen, die zwischen den Genen für die ribosomale 25S- und 18S-RNA liegt. Durch umfangreiche Sequenzvergleiche mit aus der Literatur bekannten Cytochrom b- Sequenzen ließen sich verschiedene tierartspezifische Primer identifizieren, die für das erfindungsgemäße Identifizierungs­ verfahren genutzt werden. Bei der Suche nach pflanzenart­ spezifischen Primern für den Soja- bzw. Weizennachweis wurde analog verfahren. Durch die Verfügbarkeit von teilweise mehreren Primerpaaren, die PCR-Produkte unterschiedlicher Fragmentlängen bilden, lassen sich in Abhängigkeit vom Degradationsgrad der Probe und damit auch der DNA die meisten analytischen Frage­ stellungen lösen. Insbesondere bei hochdegradiertem Unter­ suchungsmaterial (z. B. Vollkonserven, Fertiggerichten) empfiehlt sich der Einsatz dichter beieinanderliegender Primer­ paare. Da in solchen Proben auch die DNA-Moleküle verhältnis­ mäßig kurz sind, lassen sich somit bei der PCR noch DNA- Syntheseprodukte erzielen. Voraussetzung ist, daß sich in der Probe zumindest einige DNA-Bruchstücke mit der Mindestlänge der Primerabstände befinden.Plant DNA is identified using speci fischer PCR primer for the soybean lectin gene and primer for the intergenic region of wheat that is between the genes for the 25S and 18S ribosomal RNA is located. Through extensive Sequence comparisons with cytochrome b- known from the literature Sequences could be different species-specific primers identify that for the identification according to the invention procedures can be used. When looking for plant species specific primers for soy and wheat detection proceed analogously. Due to the availability of several Primer pairs, the PCR products of different fragment lengths can be formed depending on the degree of degradation of the Sample and thus also the DNA most analytical question solve positions. Especially in the case of highly degraded sub search material (e.g. canned food, ready meals) the use of denser primers is recommended couples. Because the DNA molecules in such samples also have a ratio are moderately short, DNA can still be Achieve synthesis products. The prerequisite is that in the Sample at least some DNA fragments with the minimum length of Primer distances.

Die Tatsache, daß die für die Primerauswahl genutzten Gene bzw. DNA-Abschnitte mit denen die Primer bei der Vervielfältigungs­ reaktion PCR eine Paarung (Hybridisierung beim Annealing während des PCR-Zyklus) eingehen in vielfacher Kopienzahl im Genom dieser Organismen vorkommen, ist für die Empfindlichkeit des Analyseverfahrens enorm vorteilhaft. Je nach Ausgestaltung der PCR läßt sich die Nachweisempfindlichkeit bis auf 0,01% ein­ stellen. Für die Analyse sind Gesamt-DNA-Mengen in ng-Maßstab ausreichend. Das bedeutet, daß je nach Verarbeitung und Komplexität der Probe Untersuchungsmaterial im mg- bis g-Bereich erforderlich ist. Mit diesem erfindungsgemäßen Verfahren können praktisch alle Nahrungs- und Futtermittel überprüft werden.The fact that the genes used for the primer selection or DNA sections with which the primers are used for duplication reaction PCR a pairing (hybridization during annealing during of the PCR cycle) are received in multiple copies in the genome of these organisms occurs for the sensitivity of the Analysis method enormously advantageous. Depending on the design of the PCR can detect sensitivity down to 0.01% put. For the analysis, total amounts of DNA are on the ng scale  sufficient. This means that depending on the processing and Complexity of the sample Test material in the mg to g range is required. With this method according to the invention practically all food and feed are checked.

Weitere Anwendungsfelder des Verfahrens sind beispielsweise in der forensischen Medizin oder bei Reinheitsüberprüfungen von Rohstoffen oder Endprodukten der kosmetischen oder pharma­ zeutischen Industrie. Prinzipiell lassen sich alle Materialien biologischen Ursprungs auf Authentizität bzw. auf Kontaminationen tierischer/pflanzlicher Herkunft überprüfen - vorausgesetzt es befinden sich zumindest DNA-Reste im Untersuchungsmaterial.Further fields of application of the method are, for example, in forensic medicine or for purity checks by Raw materials or end products of cosmetic or pharmaceutical ceutical industry. In principle, all materials can be biological origin for authenticity respectively Check contaminations of animal / vegetable origin - provided there are at least DNA residues in the Examination material.

Die Fig. 1-3 zeigen schematisch die Position der artspezi­ fischen PCR-Primer im Cytochrom b-Gen, im Soja-Lectin-Gen sowie im intergenetischen Bereich der ribosomalen 25S- und 18S-RNA- Gene. Figs. 1-3 show schematically the position of the fishing artspezi PCR primers in the cytochrome b gene in the soybean lectin gene and in the intergenic region of the ribosomal 25S and 18S RNA genes.

Fig. 4 zeigt die tierartspezifischen PCR-Produkte, die bei Verwendung der jeweiligen Primerpaare bei der PCR synthetisiert werden. FIG. 4 shows the species-specific PCR products which are synthesized when the respective primer pairs are used in the PCR.

Die Fig. 5 zeigt die pflanzenartspezifischen PCR-Produkte, die bei Verwendung der weizen- bzw. sojaspezifischen Primerpaare bei der PR synthetisiert werden. FIG. 5 shows the plant-specific PCR products which are synthesized when the wheat or soy-specific primer pairs are used in PR.

In Fig. 1 sind die Positionen artspezifischen Primer im Cytochrom b-Gen dargestellt, die die daraus resultierenden PCR- Produkte links und rechts begrenzen.In Fig. 1 the positions of type-specific primers in the cytochrome b gene are shown, which limit the resulting PCR products left and right.

Das Basenpaar "Huhn 1" ergibt ein resultierendes PCR-Produkt mit einer Länge von 159 bp.The base pair "Chicken 1" results in a resulting PCR product a length of 159 bp.

Das Basenpaar "Huhn 2" ergibt ein resultierendes PCR-Produkt mit einer Länge von 416 bp.The base pair "Chicken 2" results in a resulting PCR product a length of 416 bp.

Das Basenpaar "Pute 1" ergibt ein resultierendes PCR-Produkt mit einer Länge von 149 bp.The base pair "Turkey 1" also results in a resulting PCR product a length of 149 bp.

Das Basenpaar "Pute 2" ergibt ein resultierendes PCR-Produkt mit einer Länge von 550 bp.The base pair "Turkey 2" results in a resulting PCR product a length of 550 bp.

Das Basenpaar "Rind 1" ergibt ein resultierendes PCR-Produkt mit einer Länge von 166 bp.The base pair "Rind 1" results in a resulting PCR product a length of 166 bp.

Das Basenpaar "Rind 2" ergibt ein resultierendes PCR-Produkt mit einer Länge von 431 bp.The base pair "Rind 2" results in a resulting PCR product a length of 431 bp.

Das Basenpaar "Schwein 1" ergibt ein resultierendes PCR-Produkt mit einer Länge von 182 bp.The base pair "Pig 1" results in a resulting PCR product with a length of 182 bp.

Das Basenpaar "Schwein 2" ergibt ein resultierendes PCR-Produkt mit einer Länge von 769 bp.The base pair "Pig 2" results in a resulting PCR product with a length of 769 bp.

Das Basenpaar "Pferd 1" ergibt ein resultierendes PCR-Produkt mit einer Länge von 146 bp.The base pair "horse 1" results in a resulting PCR product with a length of 146 bp.

Das Basenpaar "Weizen" ergibt ein resultierendes PCR-Produkt mit einer Länge von 109 bp.The base pair "wheat" results in a resulting PCR product a length of 109 bp.

Das Basenpaar "Soja" ergibt ein resultierendes PCR-Produkt mit einer Länge von 118 bp.The base pair "soy" results in a resulting PCR product a length of 118 bp.

In Fig. 2 sind die PCR-Primer, die bei Position 1215-1236 bzw. 1310-1332 im Lectin-gen wirksam sind, dargestellt. Das resultierende PCR-Produkt weist eine Länge von 118 Basenpaaren auf.In FIG. 2, the PCR primers, the gene lectin at position 1215 to 1236 or 1310 to 1332 in the effective shown. The resulting PCR product is 118 base pairs in length.

In Fig. 3 sind schematisch die Primer, des intergegenischen Bereiches der 25S- und 18S-RNA Gene dargestellt. Das daraus resultierende PCR-Produkt weist eine Länge von 109 Basenpaaren auf.In Fig. 3 the primers of the inter-opposite region of the 25S and 18S RNA genes are shown schematically. The resulting PCR product has a length of 109 base pairs.

In Fig. 4 werden die tierartspezifischen PCR-Produkte, die bei Verwendung der jeweiligen Primerpaare bei der Polymerase­ kettenreaktion synthetisiert werden, gezeigt.In FIG. 4, the species-specific PCR products, the chain reaction using the respective primer pairs in the polymerase will be synthesized is shown.

Tierartspezifische PCR-Produkte aus je 1%igen Fleischzu­ mischungen der jeweiligen Tierarten.Species-specific PCR products from 1% meat each mixtures of the respective animal species.

In den Spuren:
1: Rind 2
2: Schwein 2
3: Huhn 2
4: Pute 2
5: Pferd 1
6: Rind 1
7: Schwein 1
8: Huhn 1
9: Pute 1.In the tracks:
1: beef 2
2: pig 2
3: Chicken 2
4: Turkey 2
5: Horse 1
6: beef 1
7: Pig 1
8: Chicken 1
9: Turkey 1.

Links, rechts und in der Mitte sind DNA-Längenstandards aufgetragen. Die Fragmentlängen sind in Basenpaaren (bp) angegeben.Left, right and in the middle are DNA length standards applied. The fragment lengths are in base pairs (bp) specified.

In Fig. 5 werden die pflanzenartspezifischen PCR-Produkte, die bei Verwendung der weizen- bzw. sojaspezifischen Primerpaare bei der Polymerasekettenreaktion synthetisiert werden, gezeigt.In FIG. 5, the pflanzenartspezifischen PCR products that are synthesized when using the wheat or soy-specific primer pairs in the polymerase chain reaction are shown.

Pflanzenartspezifische PCR-Produkte aus jeweils 0,01%igen Zumischungen von Weizen (Spur 1) und Soja (Spur 2). Links ist ein DNA-Längenstandard aufgetragen. Die Fragmentlängen sind in Basenpaaren (bp) angegeben. Plant-specific PCR products of 0.01% each Mixtures of wheat (lane 1) and soy (lane 2). Left is a DNA length standard is plotted. The fragment lengths are in Base pairs (bp) indicated.  

Beim beschriebenen Verfahren werden vorteilhafterweise Standard­ techniken der Gentechnologie wie DNA-Isolierung, PCR und Gel­ elektrophorese miteinander kombiniert. Die DNA-Isolierung erfolgt mittels Standard-Isolationsmethoden durch Zellaufschluß, Extraktion von Fett- und Proteinen und anschließender Ausfällung der Nukleinsäuren. Aufgrund der Anwendung des Amplifikations­ verfahrens PCR und den erfindungsgemäßen Primern sind hohe Nach­ weisempfindlichkeiten gegeben. Diese liegen in Abhängigkeit der gewählten PCR-Bedingungen und Art der Probe bei 0,01 bis 1%. Der Wegfall weitergehender Analysen im Anschluß an die PCR durch enzymatische Spaltung der PCR-Produkte, wie es bei der üblichen PCR-RFLP-Analyse notwendig ist, ergibt einen hohen Zeitgewinn, so daß mit diesem erfindungsgemäßen Verfahren ein hoher Proben­ durchsatz möglich ist.The method described advantageously becomes standard genetic engineering techniques such as DNA isolation, PCR and gel electrophoresis combined. DNA isolation is carried out using standard isolation methods by cell disruption, Extraction of fat and proteins and subsequent precipitation of nucleic acids. Due to the application of the amplification PCR and the primers according to the invention are high sensitivity to the given. These are dependent on the selected PCR conditions and type of sample at 0.01 to 1%. The elimination of further analysis after the PCR enzymatic cleavage of the PCR products, as is the case with the usual PCR-RFLP analysis is necessary, saves a lot of time, so that with this method according to the invention a high sample throughput is possible.

Verschiedene neue tierart- und pflanzenartspezifische Primer sowie das damit verbundene analytische Verfahren zur Abstammungsüberprüfung biologischer Materialien tierischer und pflanzlicher Herkunft durch Analyse der in den Materialien vorhandenen Erbsubstanz DNA durch artspezifische Amplifizierung und nachfolgender Identifizierung der mittels Polymeraseketten­ reaktion (PCR) synthetisierten PCR-Produkte sind Gegenstand des Verfahrens. Die für den Nachweis eingesetzten PCR-Primer sind artspezifisch, und das Vorhandensein der jeweiligen DNA tierischer und pflanzlicher Herkunft wird direkt nach der Vervielfältigungsreaktion PCR angezeigt. Das Entstehen der artspezifischen PCR-Produkte wird beispielsweise mittels Elektrophorese im Agarose- oder Polyacrylamidgel einfach überprüft. Für die Überprüfung auf Vorhandensein von DNA der entsprechenden Spezies im Untersuchungsmaterial werden die unten aufgeführten Primer benötigt. Die Nukleotidsequenzen der artspezifischen Primer lauten in der gebräuchlichen Einbuch­ staben-Schreibweise wie folgt:
Tierartspezifische PCR-Primer:
Huhn 1U: 5'-GAC ACA TCC CTA GCC-3'
Huhn 1R: 5'-CTT GTA GAG GTA GGA G-3'
Huhn 2U: 5'-CTC CTA CCT CTA CAA G-3'
Huhn 2R: 5'-GGC TAG TGT TAG GAA T-3'
Pute 1U: 5'-TTG CAT TCT CTT CTG TG-3'
Pute 1R: 5'-TTT ATA TAG GTA CGA ACC A-3'
Pute 2U: 5'-TTG CAT TCT CTT CTG TG-3'
Pute 2R: 5'-GGG TTA ATG TGA GTA AG-3'
Rind 1U: 5'-CAT CAT AGC AAT TGC CAT-3'
Rind 1R: 5'-GTA CTA GTA GTA TTA GAG C-3'
Rind 2U: 5'-CTT AGG GGC CCT CTT AC-3'
Rind 2R: 5'-CGA TTG TGC CGG CCG-3'
Schwein 1U: 5'-TGT TGG CCC TAG TAG C-3'
Schwein 1R: 5'-GCC GAT GAT GAT GAA C-3'
Schwein 2U: 5'-GTC CTA CTA TTT ACC GTT-3'
Schwein 2R: 5'-TTC GAT GAT GAT AGT GA-3'
Pferd 1U: 5'-CAC AGC CCT GGT AGT-3'
Pferd 1R: 5'-GCA AGA TCA GGA GGA GGA GT-3'.Various new primer-specific and plant-type-specific primers as well as the associated analytical method for the descent check of biological materials of animal and plant origin by analysis of the genetic material DNA present in the materials by species-specific amplification and subsequent identification of the PCR products synthesized by polymerase chain reaction (PCR) are the subject of the Procedure. The PCR primers used for the detection are species-specific, and the presence of the respective DNA of animal and vegetable origin is indicated immediately after the PCR amplification reaction. The origin of the species-specific PCR products is easily checked, for example, using electrophoresis in agarose or polyacrylamide gel. The primers listed below are required to check for the presence of DNA of the corresponding species in the test material. The nucleotide sequences of the species-specific primers are in the common one-letter notation as follows:
Species-specific PCR primers:
Chicken 1U: 5'-GAC ACA TCC CTA GCC-3 '
Chicken 1R: 5'-CTT GTA GAG GTA GGA G-3 '
Chicken 2U: 5'-CTC CTA CCT CTA CAA G-3 '
Chicken 2R: 5'-GGC TAG TGT TAG GAA T-3 '
Turkey 1U: 5'-TTG CAT TCT CTT CTG TG-3 '
Turkey 1R: 5'-TTT ATA TAG GTA CGA ACC A-3 '
Turkey 2U: 5'-TTG CAT TCT CTT CTG TG-3 '
Turkey 2R: 5'-GGG TTA ATG TGA GTA AG-3 '
Beef 1U: 5'-CAT CAT AGC AAT TGC CAT-3 '
Beef 1R: 5'-GTA CTA GTA GTA TTA GAG C-3 '
Beef 2U: 5'-CTT AGG GGC CCT CTT AC-3 '
Cattle 2R: 5'-CGA TTG TGC CGG CCG-3 '
Pig 1U: 5'-TGT TGG CCC TAG TAG C-3 '
Pig 1R: 5'-GCC GAT GAT GAT GAA C-3 '
Pig 2U: 5'-GTC CTA CTA TTT ACC GTT-3 '
Pig 2R: 5'-TTC GAT GAT GAT AGT GA-3 '
Horse 1U: 5'-CAC AGC CCT GGT AGT-3 '
Horse 1R: 5'-GCA AGA TCA GGA GGA GGA GT-3 '.

Pflanzenartspezifische POR-Primer:
Soja 1U: 5'-GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C-3'
Soja 1R: 5'-GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG-3'
Weizen 1U: 5'-GCG GCG TGT GCC ACG TAC GTG GTT T-3'
Weizen 1R: 5'-GAA CGG GCG TTA CGT GGA CAC GGG A-3'.Plant-specific POR primers:
Soy 1U: 5'-GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C-3 '
Soy 1R: 5'-GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG-3 '
Wheat 1U: 5'-GCG GCG TGT GCC ACG TAC GTG GTT T-3 '
Wheat 1R: 5'-GAA CGG GCG TTA CGT GGA CAC GGG A-3 '.

In Abhängigkeit von der Ausgestaltung der POR ist eine hohe Nachweisempfindlichkeit auch in thermisch behandelten oder anderweitig prozessierten Materialien gegeben. Die Nachweis­ empfindlichkeit läßt sich im Bedarfsfall bis auf ca. 0,01% einstellen.Depending on the design of the POR is high Detection sensitivity also in thermally treated or given otherwise processed materials. The proof sensitivity can be reduced to approx. 0.01% if necessary to adjust.

Claims (8)

1. Verfahren zum Abstammungsnachweis biologischer Materialien, bei dem folgende Schritte nacheinander ausgeführt werden:

• - Isolation der Gesamt DNA aus dem Untersuchungsmaterial,
• - Einsatz mindestens eines artspezifischen Primerpaares,
• - Vervielfältigung der tierischen bzw. pflanzlichen DNA mittels PCR,
• - Detektion des jeweils artspezifischen PCR-Produktes mittels Elektrophorese, dadurch gekennzeichnet, daß jedes Primerpaar jeweils aus solchen Primern besteht, die ausschließlich komplementär zur nachzuweisenden tierischen bzw. pflanzlichen DNA sind

1.Procedure for the provenance of biological materials, in which the following steps are carried out in succession:

• Isolation of the total DNA from the test material,
• - use of at least one species-specific primer pair,
• - duplication of animal or vegetable DNA by means of PCR,
• - Detection of the species-specific PCR product by means of electrophoresis, characterized in that each pair of primers consists in each case of those primers which are exclusively complementary to the animal or plant DNA to be detected

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis von Huhn-DNA als Primerpaar
Huhn 1U: 5'-GAC ACA TCC CTA GCC-3'
Huhn 1R: 5'-CTT GTA GAG GTA GGA G-3' und/oder
Huhn 2U: 5'-CTC CTA CCT CTA CAA G-3'
Huhn 2R: 5'-GGC TAG TGT TAG GAA T-3' eingesetzt wird.2. The method according to claim 1, characterized in that for the detection of chicken DNA as a pair of primers
Chicken 1U: 5'-GAC ACA TCC CTA GCC-3 '
Chicken 1R: 5'-CTT GTA GAG GTA GGA G-3 'and / or
Chicken 2U: 5'-CTC CTA CCT CTA CAA G-3 '
Chicken 2R: 5'-GGC TAG TGT TAG GAA T-3 'is used. 3. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis von Puten-DNA als Primerpaar
Pute 1U: 5'-TTG CAT TCT CTT CTG TG-3'
Pute 1R: 5'-TTT ATA TAG GTA CGA ACC A-3' und/oder
Pute 2U: 5'-TTG CAT TCT CTT CTG TG-3'
Pute 2R: 5'-GGG TTA ATG TGA GTA AG-3' eingesetzt wird.3. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that for the detection of turkey DNA as a pair of primers
Turkey 1U: 5'-TTG CAT TCT CTT CTG TG-3 '
Turkey 1R: 5'-TTT ATA TAG GTA CGA ACC A-3 'and / or
Turkey 2U: 5'-TTG CAT TCT CTT CTG TG-3 '
Turkey 2R: 5'-GGG TTA ATG TGA GTA AG-3 'is used. 4. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis von Rind-DNA als Primerpaar
Rind 1U: 5'-CAT CAT AGC AAT TGC CAT-3'
Rind 1R: 5'-GTA CTA GTA GTA TTA GAG C-3' und/oder
Rind 2U: 5'-CTT AGG GGC CCT CTT AC-3'
Rind 2R: 5'-CGA TTG TGC CGG CCG-3' eingesetzt wird.4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that for the detection of bovine DNA as a pair of primers
Beef 1U: 5'-CAT CAT AGC AAT TGC CAT-3 '
Beef 1R: 5'-GTA CTA GTA GTA TTA GAG C-3 'and / or
Beef 2U: 5'-CTT AGG GGC CCT CTT AC-3 '
Beef 2R: 5'-CGA TTG TGC CGG CCG-3 'is used. 5. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis von Schwein-DNA als Primerpaar
Schwein 1U: 5'-TGT TGG CCC TAG TAG C-3'
Schwein 1R: 5'-GCC GAT GAT GAT GAA C-3' und/oder
Schwein 2U: 5'-GTC CTA CTA TTT ACC GTT-3'
Schwein 2R: 5'-TTC GAT GAT GAT AGT GA-3' eingesetzt wird.5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that for the detection of pig DNA as a pair of primers
Pig 1U: 5'-TGT TGG CCC TAG TAG C-3 '
Pig 1R: 5'-GCC GAT GAT GAT GAA C-3 'and / or
Pig 2U: 5'-GTC CTA CTA TTT ACC GTT-3 '
Pig 2R: 5'-TTC GAT GAT GAT AGT GA-3 'is used. 6. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis von Pferd-DNA als Primerpaar
Pferd 1U: 5'-CAC AGC CCT GGT AGT-3'
Pferd 1R: 5'-GCA AGA TCA GGA GGA GGA GT-3' eingesetzt wird.6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that for the detection of horse DNA as a primer pair
Horse 1U: 5'-CAC AGC CCT GGT AGT-3 '
Horse 1R: 5'-GCA AGA TCA GGA GGA GGA GT-3 'is used. 7. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis von Soja-DNA als Primerpaar
Soja 1U: 5'-GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C-3'
Soja 1R: 5'-GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG-3' eingesetzt wird. 7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that for the detection of soy DNA as a pair of primers
Soy 1U: 5'-GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C-3 '
Soy 1R: 5'-GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG-3 'is used. 8. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis von Weizen-DNA als Primerpaar
Weizen 1U: 5'-GCG GCG TGT GCC ACG TAC GTG GTT T-3'
Weizen 1R: 5'-GAA CGG GCG TTA CGT GGA CAC GGG A-3' eingesetzt wird.8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that for the detection of wheat DNA as a pair of primers
Wheat 1U: 5'-GCG GCG TGT GCC ACG TAC GTG GTT T-3 '
Wheat 1R: 5'-GAA CGG GCG TTA CGT GGA CAC GGG A-3 'is used.