EP1169478A2 - Method for identifying organisms by means of comparative genetic analysis and primers and hybridisation probes for carrying out this method - Google Patents

Abstract

The invention comprises methods, primers and hybridisation probes for identifying organisms by means of comparative genetic analysis and is characterised in that coding, non-coding areas and/or functionally significant areas of highly conserved genes, pseudogenes or homologues are amplified using the PCR and then genotyped and analysed. The comparison of coding and non-coding areas of highly conserved genes, pseudogenes or homologues ensures that a single oligonucleotide pair bonds to DNA sequences that are highly conserved between different species, hereby allowing the amplification of a gene segment that is identical for all of the species. The oligonucleotides include one or more gene areas with the greatest possible sequence differences between different species. The determination of the gene sequence of this highly polymorphous area in a subsequent reaction step enables the gene sequence to be allocated to a specific species. In particularly preferred variants of embodiments of the invention, oligonucleotide pairs enabling the amplification of the highly conserved tumour suppresser gene PTEN/MMAC1, its pseudogene and their homologues were found.

Description

WO 00/55361 PCTtEPOO/02330 WO 00/55361 PCTtEPOO / 02330

Verfahren zur Identifizierung von Organismen durch vergleichende genetische Analyse sowie Primer und Hybridisationssonden zur Durchführung desProcess for the identification of organisms by comparative genetic analysis as well as primers and hybridization probes for carrying out the

VerfahrensProcedure

Beschreibungdescription

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur genetischen Analyse von Organismen verschiedener Tier- und /oder Pflanzenspezies durch die Untersuchung von kodierenden und nichtkodierenden Bereichen hochkonservierter Gene oder Pseudogene und ihrer Homologe bei verschiedenen Tier- und Pflanzenspezies Die bekannten Verfahren zur einfachen, schnellen und präzisen Bestimmung von Gensequenzen zur Ermittlung von Verwandschaftsbeziehungen und zur Identifizierung von Organismen beruhen auf der Verwendung von Oligonukleotiden, die für eine Spezies spezifisch sind Diese Oligonukleotide werden benotigt um mittels Polymerase-Kettenreaktion oder anderer Verfahren ausreichend genetisches Material für die anschließende Sequenzierungsreaktion bereitzustellen Ein O gonukleotid ist ein meist kurzes synthetisch hergestelltes Molekül, das an einen spezifischen Genabschnitt anlagert und eine zu diesem Strang komplementäre spezifische Sequenz aufweist Der Nachteil von Methoden, die sich auf die Verwendung von Oligonukleotiden stutzen liegt dann begründet, daß sich Gensequenzen zwischen verschiedenen Spezies meist sehr stark unterscheiden Um Organismen verschiedener Spezies zu sequenzieren müssen in der Regel mittels kosten- und zeitaufwendiger Verfahren speziesspezifische DNA-Sequenzen bestimmt und in einem zweiten Schritt die entsprechenden Oligonukleotide die spezifisch an diese DNA-Sequenzen binden, synthetisiert werden Diese beiden Schπtte sind in der Regel für jeden zu untersuchenden Organismus unbekannter Herkunft jeweils erforderlich Für die spatere Analyse zur Bestimmung der Identität oder des Verwandschaftsgrades aufgrund der Gensequenz muß dann die DNA der zu untersuchenden Organismen mit einer meist großen Anzahl von verschiedenen Oligonukleotiden getestet werden Da meist nur Oligonukleotide von wenigen Spezies zur Verfugung stehen fuhrt die Untersuchung vornehmlich bei seltenen Tierarten oft nicht zum Erfolg Daruberhinaus ist die Untersuchung zeitaufwendig und teuer Andere Verfahren, die beispielsweise Restriktionslängenpolymorphismen derThe invention relates to a method for the genetic analysis of organisms of various animal and / or plant species by examining coding and non-coding areas of highly conserved genes or pseudogenes and their homologs in various animal and plant species. The known methods for the simple, fast and precise determination of gene sequences for the determination of kinship relationships and for the identification of organisms are based on the use of oligonucleotides which are specific for a species. These oligonucleotides are required in order to provide sufficient genetic material for the subsequent sequencing reaction by means of a polymerase chain reaction or other methods. An o-nucleotide is usually a short synthetic produced molecule that attaches to a specific gene segment and has a specific sequence complementary to this strand. The disadvantage of methods that relate to the use of n Trimming oligonucleotides is then justified that gene sequences usually differ very greatly between different species. In order to sequence organisms of different species, species-specific DNA sequences must generally be determined by means of costly and time-consuming methods and, in a second step, the corresponding oligonucleotides that are specific to them Binding DNA sequences, synthesized These two shells are usually required for each organism of unknown origin to be examined. For the later analysis to determine the identity or the degree of relationship based on the gene sequence, the DNA of the organisms to be examined must usually be large are tested by different oligonucleotides Since mostly only oligonucleotides of a few species are available, the investigation often does not lead to success, especially in rare animal species. Furthermore, the investigation is time-consuming and expensive Other methods that, for example, restriction length polymorphisms of

Organismen ausnutzen oder Verfahren, die für die Amplifikation eine Mischung aus kurzen Oligonukleotiden verwenden, die in ihrer Sequenz randomisiert sind (random amplified polymorphic DNA, RAPD), führen nicht zur genauen und eindeutigenTaking advantage of organisms or methods that use a mixture of short oligonucleotides for the amplification, which are randomized in their sequence (random amplified polymorphic DNA, RAPD), do not lead to the precise and unambiguous

Analyse der Gensequenz der einzelnen Tiere. Dies macht es schwierig, mittels dieser Verfahren den Grad der Verwandschaft zwischen Organismen zu ermitteln.Analysis of the gene sequence of the individual animals. This makes it difficult to determine the degree of relationship between organisms using these methods.

Somit liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur genetischenThe invention is therefore based on the object of a method for genetic engineering

Analyse von Organismen bereitzustellen, das hochempfindlich ist, bei geringemProvide analysis of organisms that is highly sensitive, with little

Zeitaufwand zuverlässige Ergebnisse liefert, auch für große Reihenuntersuchungen und Routinetests geeignet ist, und gegebenfalls auch automatisch durchgeführt werden kann. Ferner liegt die Aufgabe der Erfindung darin, Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens zu entwickeln.Time expenditure provides reliable results, is also suitable for large series examinations and routine tests, and can also be carried out automatically if necessary. Furthermore, the object of the invention is to develop means for carrying out this method.

Die Erfindung wird gemäß der Ansprüche realisiert, die Unteransprüche sindThe invention is implemented according to the claims, which are sub-claims

Vorzugsvarianten.Preferred variants.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren, mit dem die Gensequenz einesThe invention relates to a method by which the gene sequence of a

Genbereiches von verschiedenen Spezies schnell, einfach und sicher reproduzierbar ermittelt werden kann. Es müssen hierbei drei Bedingungen erfüllt sein: Die alsGenes of different species can be determined quickly, easily and safely reproducibly. Three conditions have to be fulfilled: The as

Primer dienenden Oligonukleotide für die Amplifikation der DNA müssen an Bereiche des Genoms binden, die hochkonserviert sind, um eine Amplifikation von genetischem Material mittels eines identischen Oligonukleotidpaares bei allen oder einer möglichst hohen Zahl von verschiedenen Organismen zu gewährleisten. DiesePrimer-serving oligonucleotides for the amplification of the DNA have to bind to regions of the genome that are highly conserved in order to ensure amplification of genetic material by means of an identical pair of oligonucleotides in all or the greatest possible number of different organisms. This

Oligonukleotide müssen einen Bereich umspannen, der eine hohe Sequenzdiversität zwischen verschiedenen Spezies aufweist, um eine Differenzierung zu ermöglichen.Oligonucleotides must span an area that has a high sequence diversity between different species in order to enable differentiation.

Der Bereich, der durch die als Primer eingesetzten Oligonukleotide umspannt wird, sollte möglichst klein sein, um die Ausbeute an Amplifikaten zu maximieren und zu gewährleisten, daß auch von stark degradierter DNA im Ausgangsmateria!The area that is spanned by the oligonucleotides used as primers should be as small as possible in order to maximize the yield of amplificates and to ensure that DNA degraded in the starting material!

Abschriften erzielt werden können.Copies can be achieved.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Bereitstellung eines Verfahrens zurAccording to the invention, this object is achieved by providing a method for

Bestimmung der Identität oder der Verwandschaft durch den Vergleich von kodierenden und nicht kodierenden Bereichen von hochkonservierten Genen oderDetermination of identity or kinship by comparing coding and non-coding areas of highly conserved genes or

Pseudogenen und Homologen gelöst. Dadurch wird gewährleistet, daß ein einzigesPseudogenes and homologues solved. This ensures that a single one

Oligonukleotidpaar an DNA-Sequenzen, die zwischen verschiedenen Spezies hochgradig konserviert sind, bindet und damit die Amplifikation eines für alle Spezies identischen Genabschnittes erlaubt. Die Oligonukleotide schließen einen oder mehrere Genbereiche ein, die zwischen verschiedenen Spezies möglichst große Sequenzunterschiede aufweisen. Die Bestimmung der Gensequenz dieses hochgradig polymorphen Genbereiches in einem darauf folgenden Reaktionsschritt erlaubt es, die Gensequenz einer spezifischen Spezies zuzuordnen. Die Genotypisierung erfolgt durch Sequenzierung oder durch andere Methoden, die für die Detektion von Sequenzvarianten geeignet sind. Dazu gehören Polymerase- Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) gestützte Genotypisierungsverfahren wie z.B. allelspezifische PCR, andere Genotypisierungsverfahren unter Verwendung von Oligonukleotiden (Beispiele wären „dot blotting", oder „Oligonucleotide Ligation Assays" (OLA)), Verfahren unter Verwendung von Restriktionsenzymen, Analyse von Längenpolymorphismen und „Single Nucleotide Polymorphism" (SNP), Analyse mittels spektroskopischer Verfahren wie z.B. „Matrixassisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectroscopy" (MALDI), chromatographische Verfahren wie z.B. DHPLC zur Separierung von DNA-Strängen unterschiedlicher Länge und Sequenz sowie prinzipiell jedwede gegenwärtig und zukünftig zur Verfügung stehende Methode zur Variantendetektion einschließlich DNA-, RNA- und PNA-Hybridisierungsverfahreπ, Light Cycler Technologie, TaqMan und Molecular Beacon-Technologie und der Chip-Technologie in all ihren technologischen Ausführungen.Binds oligonucleotide pair to DNA sequences that are highly conserved between different species, thus allowing the amplification of a gene segment that is identical for all species. The oligonucleotides include or several gene regions that have the greatest possible sequence differences between different species. The determination of the gene sequence of this highly polymorphic gene region in a subsequent reaction step allows the gene sequence to be assigned to a specific species. Genotyping is carried out by sequencing or by other methods that are suitable for the detection of sequence variants. These include polymerase chain reaction (PCR) supported genotyping methods such as allele-specific PCR, other genotyping methods using oligonucleotides (examples would be “dot blotting” or “oligonucleotide ligation assays” (OLA)), methods using restriction enzymes, Analysis of length polymorphisms and "Single Nucleotide Polymorphism" (SNP), analysis using spectroscopic methods such as "Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization Mass Spectroscopy" (MALDI), chromatographic methods such as DHPLC for the separation of DNA strands of different lengths and sequences, and in principle any currently and in the future available method for variant detection including DNA, RNA and PNA hybridization processes, light cycler technology, TaqMan and molecular beacon technology and chip technology in all their technological versions.

Vorzugsweise werden im erfindungsgemäßen Verfahren folgende Schritte durchgeführt: a) DNA-Isolierung: Aus Blutproben, Geweben, Haaren, Nahrungsmitteln und Proben, die DNA enthalten, wird DNA isoliert und aufgereinigt. b) Polymerase-Kettenreaktion: Die Polymerase-Kettenreaktion dient zur Amplifikation von DNA für die nachfolgende Sequenzierungsreaktion. Bei der Polymerase-Kettenreaktion lagern sich ein oder mehrere Oligonukleotidpaare an die zu analysierende DNA (Template-DNA) von Genen, die zwischen Organismen verschiedener Spezies hochkonserviert sind, an. Jeweils eines der Moleküle eines Oligonukleotidpaares (sense und antisense Oligonukleotid) ist komplementär zu einem der beiden Template-DNA Stränge an der 5^'- bzw. 3^' - Flanke einer DNA- Sequenz. Die Anlagerung erfolgt in solcher Orientierung, daß die bei einer Oiigoπukieotid-gesteuerten Polymerase-Kettenreaktion mit jeweils einem der beiden Oligonukleotide gewonnenen Syπtheseprodukte nach einer Denaturierung als Matritze zur Anlagerung des jeweils anderen Oligonukleotids dienen können. Das Oligonukleotidpaar flankiert den Bereich, der vervielfältigt werden soll. Es werden mittels einer Polymerase und nach Zugabe von Nukleotidbausteinen diese Oligonukleotide entsprechend der Nukleotidabfolge des Matritzenstranges verlängert. Die Anlagerung, Verlängerung und Denaturierung erfolgt bei unterschiedlichen Temperaturen und wird in der Regel 20 bis 35 Mal hintereinander durchgeführt, so daß der durch die Oligonukleotide umspannte Bereich exponentiell vervielfacht wird. c) Agarose-Gelelektrophorese: In einem Agarosegel werden die DNA-Fragmente unter einem Spannungsfeld von den Oligonukleotiden getrennt und die für das PCR- Produkt spezifische Bande mittels Skalpell ausgeschnitten und aufgereinigt. d) Sequenzierungsreaktion: Es wird eine weitere Polymerase zugegeben, sowie alle Nukleotidbausteine und spezielle Nukleotidbausteine, die zum Kettenabbruch bei der Verlängerungsreaktion führen. Dadurch entstehen DNA-Fragmente, die sich in ihrer Länge jeweils um ein Nukleotid unterscheiden. Es werden Bereiche innerhalb des Gens sequenziert, die in ihrer Gensequenz zwischen den verschiedenen Spezies polymorph sind. Dadurch läßt sich die für eine Spezies charakteristische DNA-Sequenz bestimmen und einer Spezies zuordnen e) Polyacrylamidgelelektrophorese Trennt man nach Abschluß der Sequenzierreaktionen die unterschiedlich langen DNA-Strange auf einem hochauflösenden PolyaciNiamidgel in einem elektrischen Feld auf, wandern kürzere DNA-Stränge schneller als längere Strange In dem entstehenden Bandenmuster entspricht die Reihenfolge von kürzerer zu jeweils nachstlangerer Bande - den entsprechenden Basen A, C, G oder T zugeordnet - der komplementären DNA- Sequenz des Templats Dadurch wird die Sequenz des DNA-Stranges, der vorher mittels Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert wurde, lesbar f) Vergleichende Analyse der Geπsequenz zwischen den Tierspezies und Speicherung der SequenzierdatenThe following steps are preferably carried out in the method according to the invention: a) DNA isolation: DNA is isolated and purified from blood samples, tissues, hair, foods and samples which contain DNA. b) Polymerase chain reaction: The polymerase chain reaction serves to amplify DNA for the subsequent sequencing reaction. In the polymerase chain reaction, one or more pairs of oligonucleotides attach to the DNA to be analyzed (template DNA) of genes that are highly conserved between organisms of different species. One of the molecules of an oligonucleotide pair (sense and antisense oligonucleotide) is complementary to one of the two template DNA strands on the 5 ^' or 3 ^' flank of a DNA sequence. The addition takes place in such an orientation that the polymer products obtained in an oligonucleotide-controlled polymerase chain reaction with in each case one of the two oligonucleotides, after denaturation, can serve as a template for the attachment of the other oligonucleotide. The The pair of oligonucleotides flank the area to be duplicated. These oligonucleotides are extended in accordance with the nucleotide sequence of the matrix strand by means of a polymerase and after addition of nucleotide building blocks. The addition, extension and denaturation take place at different temperatures and are usually carried out 20 to 35 times in succession, so that the area spanned by the oligonucleotides is multiplied exponentially. c) Agarose gel electrophoresis: In an agarose gel, the DNA fragments are separated from the oligonucleotides under a tension field and the band specific for the PCR product is cut out with a scalpel and purified. d) Sequencing reaction: Another polymerase is added, as well as all nucleotide building blocks and special nucleotide building blocks that lead to chain termination in the extension reaction. This creates DNA fragments that differ in length by one nucleotide each. Areas within the gene are sequenced which are polymorphic in their gene sequence between the different species. In this way, the DNA sequence characteristic of a species can be determined and assigned to a species. E) Polyacrylamide gel electrophoresis If, after completing the sequencing reactions, the DNA strands of different lengths are separated on an high-resolution PolyaciNiamide gel in an electric field, shorter DNA strands migrate faster than longer strands In the resulting band pattern, the sequence from the shorter to the following longer band - assigned to the corresponding bases A, C, G or T - corresponds to the complementary DNA sequence of the template. This results in the sequence of the DNA strand that was previously amplified by means of the polymerase chain reaction , readable f) Comparative analysis of the gene sequence between the animal species and storage of the sequencing data

Vorzugsweise werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Amplifikation Oligonukleotidpaare verwendet, die sich an kodierenden oder nichtkodierenden Bereichen von hochkonservierten Genen oder Pseudogenen und deren Homologen anlagern, das heißt an Genen oder Pseudogenen und deren Homologen, die keine oder nur geringe Sequenzuπterschiede zwischen den einzelnen Spezies aufweisen Dadurch wird gewährleistet, daß in dem jeweils zu analysierenden Genabschnitt mittels eines Primerpaares ein Amplifikat bei verschiedensten Spezies gebildet werden kann.Oligonucleotide pairs which attach to coding or non-coding regions of highly conserved genes or pseudogens and their homologs, that is to say to genes or pseudogens and their homologs which have little or no sequence differences between the individual species, are preferably used in the method for amplification according to the invention it is ensured that in the gene segment to be analyzed in each case an amplificate can be formed in a wide variety of species by means of a pair of primers.

Vorzugsweise werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Bereiche des Gens oder Pseudogens und ihren Homologen analysiert, die sich in ihrer Gensequenz zwischen Organismen verschiedener Spezies unterscheiden. Es können dies Sequenzen kodierender oder nicht kodierender DNA sein.In the method according to the invention, regions of the gene or pseudogen and their homologs are preferably analyzed which differ in their gene sequence between organisms of different species. These can be sequences of coding or non-coding DNA.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden in bestimmten Ansätzen für die Polymerase-Kettenreaktion mehrere verschieden lange Oligonukleotidpaare in einem Reaktionsgemisch (Multiplex-PCR) verwendet, die alle teilweise mit einer Ausgangssequenz übereinstimmen. Hierbei unterscheiden sich jeweils die sense bzw. antisense Oligonukleotide bezüglich der Nukleotidsequenz dahingehend, daß einige Oligonukleotide im 3^'- Bereich um ein oder mehrere Nukleotide in ihrer Länge differieren. Die Verwendung von mehreren, in ihrer Länge unterschiedlichen Oligonukleotide soll gewährleisten, daß eine Anlagerung der Oligonukleotide an die Template-DNA auch dann möglich ist, wenn die Template-DNA sich in dem 3^'- Bereich von einigen verwendeten Oligonukleotiden unterscheidet. Die Übereinstimmung am 3^'- Bereich der Oligonukleotide mit der Template-DNA ist für die spezifische Amplifikation wesentlich und sollte daher in diesem Bereich möglichst genau sein. Beispiel: sense:In the process according to the invention, in certain batches for the polymerase chain reaction, several pairs of oligonucleotides of different lengths are used in a reaction mixture (multiplex-PCR), all of which partially match an initial sequence. The sense or antisense oligonucleotides differ with respect to the nucleotide sequence in that some oligonucleotides differ in length in the 3 ^' region by one or more nucleotides. The use of several oligonucleotides with different lengths is intended to ensure that an attachment of the oligonucleotides to the template DNA is possible even if the template DNA differs in the 3 ^' region from some of the oligonucleotides used. The agreement at the 3 ^' region of the oligonucleotides with the template DNA is essential for the specific amplification and should therefore be as precise as possible in this region. Example: sense:

5^'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gac - 3^',5 ^' - cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gac - 3 ^' ,

5^'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat - 3^',5 ^' - cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat - 3 ^' ,

5^'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat t - 3^', antisense:5 ^' - cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat t - 3 ^' , antisense:

5^'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt c- 3^',5 ^' - cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt c- 3 ^' ,

5^'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta c - 3^',5 ^' - cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta c - 3 ^' ,

5^'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc t - 3^'. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform im erfindungsgemäßen Verfahren werden multiple Oligonukleotidpaare in einer Multiplex-PCR verwendet, die bezüglich ihrer Länge gleich sind, sich jedoch an einer oder mehreren Positionen am 3^' - Ende der Oligonukleotide bezüglich der Nukleotidsequenz unterscheiden. Die Verwendung eines Reaktionsgemisches von mehreren, in der Basenfolge am 3^'- Ende des Oligonukleotids unterschiedlichen Oligonukleotide soll gewährleisten, daß eine5 ^' - cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc t - 3 ^' . In another preferred embodiment in the method according to the invention, multiple pairs of oligonucleotides are used in a multiplex PCR which are identical in terms of their length, but differ in one or more positions at the 3 ^' end of the oligonucleotides with respect to the nucleotide sequence. The use of a reaction mixture of several oligonucleotides which differ in the base sequence at the 3 ^' end of the oligonucleotide is intended to ensure that one

HETZBLATT (REGEL 26) mittels eines Primerpaares ein Amplifikat bei verschiedensten Spezies gebildet werden kann.HETZBLATT (RULE 26) an amplificate can be formed in a wide variety of species by means of a pair of primers.

Vorzugsweise werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Bereiche des Gens oder Pseudogens und ihren Homologen analysiert, die sich in ihrer Gensequenz zwischen Organismen verschiedener Spezies unterscheiden. Es können dies Sequenzen kodierender oder nicht kodierender DNA sein.In the method according to the invention, regions of the gene or pseudogen and their homologs are preferably analyzed which differ in their gene sequence between organisms of different species. These can be sequences of coding or non-coding DNA.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden in bestimmten Ansätzen für die Polymerase-Kettenreaktion mehrere verschieden lange Oligonukleotidpaare in einem Reaktionsgemisch (Multiplex-PCR) verwendet, die alle teilweise mit einer Ausgangssequenz übereinstimmen. Hierbei unterscheiden sich jeweils die sense bzw. antisense Oligonukleotide bezüglich der Nukleotidsequenz dahingehend, daß einige Oligonukleotide im 3^'- Bereich um ein oder mehrere Nukleotide in ihrer Länge differieren. Die Verwendung von mehreren, in ihrer Länge unterschiedlichen Oligonukleotide soll gewährleisten, daß eine Anlagerung der Oligonukleotide an die Template-DNA auch dann möglich ist, wenn die Template-DNA sich in dem 3^'- Bereich von einigen verwendeten Oligonukleotiden unterscheidet. Die Übereinstimmung am 3^'- Bereich der Oligonukleotide mit der Template-DNA ist für die spezifische Amplifikation wesentlich und sollte daher in diesem Bereich möglichst genau sein. Beispiel: sense:In the process according to the invention, in certain batches for the polymerase chain reaction, several pairs of oligonucleotides of different lengths are used in a reaction mixture (multiplex-PCR), all of which partially match an initial sequence. The sense or antisense oligonucleotides differ with respect to the nucleotide sequence in that some oligonucleotides differ in length in the 3 ^' region by one or more nucleotides. The use of several oligonucleotides with different lengths is intended to ensure that an attachment of the oligonucleotides to the template DNA is possible even if the template DNA differs in the 3 ^' region from some of the oligonucleotides used. The agreement at the 3 ^' region of the oligonucleotides with the template DNA is essential for the specific amplification and should therefore be as precise as possible in this region. Example: sense:

5^'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gac - 3^',5 ^' - cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gac - 3 ^' ,

5^'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat - 3^',5 ^' - cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat - 3 ^' ,

5^'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat t - 3^', antisense:5 ^' - cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat t - 3 ^' , antisense:

5^'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt c- 3^',5 ^' - cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt c- 3 ^' ,

5^'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta c - 3^',5 ^' - cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta c - 3 ^' ,

5^'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc t - 3^'. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform im erfindungsgemäßen Verfahren werden multiple Oligonukleotidpaare in einer Multiplex-PCR verwendet, die bezüglich ihrer Länge gleich sind, sich jedoch an einer oder mehreren Positionen am 3^' - Ende der Oligonukleotide bezüglich der Nukleotidsequenz unterscheiden. Die Verwendung eines Reaktionsgemisches von mehreren, in der Basenfolge am 3^'- Ende des Oligonukleotids unterschiedlichen Oligonukleotide soll gewährleisten, daß eine5 ^' - cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc t - 3 ^' . In another preferred embodiment in the method according to the invention, multiple pairs of oligonucleotides are used in a multiplex PCR which are identical in terms of their length, but differ in one or more positions at the 3 ^' end of the oligonucleotides with respect to the nucleotide sequence. The use of a reaction mixture of several oligonucleotides which differ in the base sequence at the 3 ^' end of the oligonucleotide is intended to ensure that one

ERSAT ATT (REGEL 26) Anlagerung der Oligonukleotide an die Template-DNA auch dann erfolgt, wenn sich die Template-DNA Sequenz an der 3^'- Bindungsstelle des Oligonukleotids von dem üblicherweise verwendeten Oligonukleotid unterscheidet. Dazu wird ein Gemisch von verschiedenen Oligonukleotiden, die am 3^'- Ende alle denkbaren Nukleotidsequenzen aufweisen, für die Amplifikation bereitgestellt.ERSAT ATT (RULE 26) The oligonucleotides are also attached to the template DNA if the template DNA sequence at the 3 ^′ binding site of the oligonucleotide differs from the oligonucleotide that is usually used. For this purpose, a mixture of different oligonucleotides, which have all conceivable nucleotide sequences at the 3 ^' end, is provided for the amplification.

Beispiel: sense:Example: sense:

5^'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gaa - 3^',5 ^' - cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gaa - 3 ^' ,

5^'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gac - 3^',5 ^' - cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gac - 3 ^' ,

5^'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gag - 3^',5 ^' - cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gag - 3 ^' ,

5^'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gat - 3^', antisense:5 ^' - cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gat - 3 ^' , antisense:

5^'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt a- 3^',5 ^' - cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt a- 3 ^' ,

5^'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt c- 3^',5 ^' - cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt c- 3 ^' ,

5^'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt g - 3^',5 ^' - cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt g - 3 ^' ,

5^'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt t - 3^'. Vorzugsweise wird im erfindungsgemäßen Verfahren bei der Auswahl von geeigneten Oligonukleotidsequenzen darauf geachtet, daß möglichst viele der Oligonukleotide am 3^'- Ende mit dem ersten Nukleotid des Codons übereinstimmen, das für die hochkonservierte Aminosäure kodiert. Aus theoretischen Überlegungen und auch aufgrund von Beobachtungen ergibt sich, daß jeweils das zweite Nukleotid innerhalb eines Codons einen größeren Grad der Übereinstimmung zwischen Organismen verschiedener Spezies aufweist als das erste oder dritte Nukleotid des Codons. Da die Amplifikation normalerweise nur dann funktioniert, wenn neben anderen Voraussetzungen auch das am 3^'- Ende des Oligonukleotids befindliche Nukleotid exakt komplementär zum gegenüberliegenden Nukleotid des Template- DNA-Stranges ist - also einem A ein T oder einem G ein C gegenübersteht - , wird die Sequenz der eingesetzten Oligonukleotide so gewählt, daß das letzte Nukleotid am 3^'- Ende des Oligonukleotids sich möglichst an das am höchsten konservierte Nukleotid des Codons, das für eine Aminosäure kodiert, anlagert. Vorzugsweise wird im erfindungsgemäßen Verfahren für verschiedenen Abschnitte des Gens, der Pseudogene und seiner Homologe jeweils ein einziges Oligonukleotidpaar eingesetzt, das sich an das hochkonservierte Tumorsuppressorgen PTEN/MMAC1 , dessen Pseudogen und ihrer Homologe bei verschiedenen Spezies anlagert, und zwar in dem Bereich des Gens, der eine große Übereinstimmung zwischen den Spezies aufweist [Steck et al., 1997]. Dieser Bereich betrifft die gesamte kodierende Sequenz des Gens, Pseudogens und ihrer Homologe sowie Exon-Intronübergänge und 5'- und 3'-untranslatierten Regionen des Gens, des Pseudogens und ihrer Homologe.5 ^' - cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt t - 3 ^' . When selecting suitable oligonucleotide sequences in the method according to the invention, care is preferably taken to ensure that as many of the oligonucleotides at the 3 ^' end as possible match the first nucleotide of the codon which codes for the highly conserved amino acid. From theoretical considerations and also from observations it follows that the second nucleotide within a codon has a greater degree of correspondence between organisms of different species than the first or third nucleotide of the codon. Since the amplification normally only works if, among other requirements, the nucleotide at the 3 ^' end of the oligonucleotide is also exactly complementary to the opposite nucleotide of the template DNA strand - that is, an A is a T or a G is a C - the sequence of the oligonucleotides used is chosen such that the last nucleotide at the 3 ^' end of the oligonucleotide is attached to the most conserved nucleotide of the codon which codes for an amino acid. Preferably, in the method according to the invention, a single pair of oligonucleotides is used for different sections of the gene, the pseudogenes and its homologues, which pairs with the highly conserved tumor suppressor gene PTEN / MMAC1, its pseudogen and their homologues different species, namely in the region of the gene that shows a high degree of agreement between the species [Steck et al., 1997]. This area concerns the entire coding sequence of the gene, pseudogen and their homologs as well as exon-intron transitions and 5 'and 3' untranslated regions of the gene, the pseudogen and their homologs.

Die mit oben beschriebenen Verfahren amplifizierten Bereiche beinhalten Sequenzabschnitte, die mehr oder weniger große Sequenzunterschiede zwischen den einzelnen Spezies aufweisen. Dies gilt insbesondere für Intronbereiche und speziell für das Intron 4. Das für die Amplifikation verwendete Oligonukleotidpaar kann sich an die Exons 4 und 5 binden, da das PTEN/MMAC1 Gen, das Pseudogen und ihre Homologe zwischen den Spezies in Exon 4 und Exon 5 keine oder nur sehr geringe Unterschiede aufweist. Der von beiden Oligonukleotiden umspannte Intronbereich 4, der im Gegensatz zu dem Exonbereich 4 und 5 zwischen den Spezies wesentlich größere Sequenzunterschiede aufweist, wird amplifiziert. Anschließend wird vorzugsweise mittels einer Sequenzierungsreaktion ein Teil dieses Intronbereiches sequenziert (siehe Figur 1). Durch vergleichende Analysen kann aufgrund der Übereinstimmung von Intronsequenzen bestimmt werden, ob verschiedene Proben einer identischen Spezies angehören. Desweiteren kann durch vergleichende Analyse eines von wenigen bis mehreren hundert Basen umfassenden Intronbereiches des PTEN/MMAC1 Gens und seiner Homologe aufgrund der Ähnlichkeit der Sequenzen der Verwandschaftsgrad von verschiedenen Spezies bestimmt werden. Allgemein gilt, daß für die Differenzierung von eng verwandten Spezies längere Intronabschnitte untersucht werden müssen als bei entfernt verwandten Spezies. Dieses für Exon 4/5 und Intron 4 beschriebene Vorgehen kann auch auf alle anderen Introns angewendet werden, die von Exons umschlossen werden. Es gilt auch für reine Exonbereiche, Pseudogene und die 5'- und 3'-untranslatierte Region, sowie deren Homologe wobei in diesen Fällen die Sequenzunterschiede zwischen den einzelnen Spezies geringer sind als in den Intronbereichen.The regions amplified with the methods described above contain sequence sections which have more or less large sequence differences between the individual species. This is particularly true for intron regions and especially for intron 4. The pair of oligonucleotides used for the amplification can bind to exons 4 and 5, since the PTEN / MMAC1 gene, the pseudogen and their homologs between the species in exon 4 and exon 5 do not or shows very little difference. The intron region 4 spanned by both oligonucleotides, which, in contrast to the exon region 4 and 5, has significantly larger sequence differences between the species, is amplified. A part of this intron region is then preferably sequenced by means of a sequencing reaction (see FIG. 1). Comparative analyzes can be used to determine whether different samples belong to an identical species based on the agreement of intron sequences. Furthermore, the comparative analysis of an intron region of the PTEN / MMAC1 gene and its homologs comprising a few to several hundred bases can determine the degree of kinship of different species based on the similarity of the sequences. In general, longer intron sections have to be examined for the differentiation of closely related species than for distantly related species. This procedure described for exon 4/5 and intron 4 can also be applied to all other introns that are enclosed by exons. It also applies to pure exon regions, pseudogenes and the 5'- and 3'-untranslated region, as well as their homologues, in which case the sequence differences between the individual species are smaller than in the intron regions.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden hochkonservierte Pseudogene und deren Homologen bei verschiedenen Organismen untersucht und zur Bestimmung der speziesspezifischen Gensequenz verwendet. Diese Pseudogene und deren Homologe bieten den Vorteil, daß diese ebenfalls in hohem Maße in ihrer Nukleotidsequenz konserviert sind und in bestimmten Spezies eine Amplifikation erlauben. Die Sequenz unterscheidet sich jedoch in manchen Bereichen des Pseudogens und seiner Homologe zwischen verschiedenen Spezies, so daß Pseudogene und deren Homologen zur speziesspezifischen Charakterisierung von Organismen genutzt werden können. Da die Intronbereiche fehlen, eignen sich diese, ebenso wie reine Exonbereiche und die 5'- und 3'-untranslatierte Regionen aufgrund ihrer geringen Größe für die Analyse besonders von DNA, die durch Umwelteinflüsse degradiert vorliegt.In a preferred embodiment of the method according to the invention, highly conserved pseudogenes and their homologs are examined in various organisms and to determine the species-specific gene sequence used. These pseudogenes and their homologs offer the advantage that they are also highly conserved in their nucleotide sequence and allow amplification in certain species. However, the sequence differs in some areas of the pseudogen and its homologues between different species, so that pseudogenes and their homologues can be used for the species-specific characterization of organisms. Since the intron regions are missing, these, like pure exon regions, and the 5'- and 3'-untranslated regions, due to their small size, are particularly suitable for the analysis of DNA which is degraded due to environmental influences.

Eine vorteilhafte Durchführung des Verfahrens nutzt die von den Erfindern identifizierte 9 Basenpaar große Deletion in einem PCR-Produkt (siehe Figur 3 und Beispiel 2), das einer Gensequenzvariante von PTEN/MMAC1 entspricht und von DNA aus Zellen des Schweines amplifiziert wurde. Diese 9 Basenpaar große Deletion findet sich typischerweise beim Hausschwein und allen untersuchten Wildschweinen und sonst bei keiner der untersuchten Spezies. In einer Ausführungsvariante der Erfindung dient dieser Längenunterschied zum Nachweis von Schweinefleisch in Nahrungsmitteln. Die Genotypisierung dieser Längenvariante erfolgt durch Sequenzierung oder durch andere Methoden, die für den Nachweis dieser Deletion geeignet sind. Dazu gehören PCR - gestützte Genotypisierungsverfahren wie z.B PCR mittels speziesspezifischer Oligonukleotide. Hybridisierungstechniken wie z.B. der Light Cycler Technologie aber auch andere Genotypisierungsverfahren unter Verwendung von Restriktionsenzymen, sowie prinzipiell jedwede derzeit und zukünftig zur Verfügung stehende Methode zur Variantendetektion einschließlich der Chip-Technologie in all ihren technologischen Ausführungen. Darüber hinaus können Deletionen und Insertionen, wie sie bei verschiedenen Spezies in Intron 4, Exon 8 und in der 5'-untranslatιerten Region gefunden wurden, entsprechende Verwendung zur Speziesidentifizierung finden (siehe Anhang: „Zusammenstellung der Spezies-Sequenzen").An advantageous implementation of the method uses the 9 base pair deletion identified by the inventors in a PCR product (see FIG. 3 and example 2) which corresponds to a gene sequence variant of PTEN / MMAC1 and was amplified by DNA from pig cells. This 9 base pair deletion is typically found in domestic pigs and all examined wild boars and otherwise not in any of the examined species. In one embodiment variant of the invention, this difference in length is used to detect pork in food. This length variant is genotyped by sequencing or by other methods which are suitable for the detection of this deletion. This includes PCR-supported genotyping methods such as PCR using species-specific oligonucleotides. Hybridization techniques such as the light cycler technology but also other genotyping methods using restriction enzymes, as well as in principle any currently and future available method for variant detection including the chip technology in all its technological versions. In addition, deletions and insertions, such as those found in various species in intron 4, exon 8 and in the 5'-untranslated region, can be used appropriately for species identification (see Appendix: “Compilation of the species sequences”).

Das erfindungsgemäße Verfahren wurde mit DNA von verschiedenen Spezies als Modellsystem ausgeführt und die Gensequenz im Bereich zweier Abschnitte in Intron 4 des PTEN/MMAC1 Gens und seiner Homologe bestimmt. Es gelang, alle Spezies mit nur einem Oligonukleotidpaar zu amplifizieren In der Sequenzierungsreaktion 10 mittels nur einem Oligonukleotid und in den nachfolgenden analytischen Polyacrylamidgelelektrophoresen wurde ersichtlich, daß alle untersuchten Spezies sich in der Nukleotidsequenz im Intronbereich unterscheiden (siehe Anhang: „Zusammenstellung der Spezies-Sequenzen"). Das Verfahren ist aufgrund der Konserviertheit des PTEN/MMAC1 Tumorsuppressorgens sowie seines Pseudogens und deren Homologen bei anderen Spezies geeignet, auch die entsprechenden Gensequenzen bei niederen Organismen und eventuell Pflanzen erfolgreich mittels eines Oligonukleotidpaares zu amplifizieren. Somit ist das erfindungsgemäße Verfahren für die Identitäts- und Verwandschaftsbestimmung von verschiedenen Organismen geeignet. Es wurde eine Datenbank etabliert, auf die bei der Identifizierung von verschiedenen Spezies und des Menschen zurückgegriffen werden kann. Sie beinhaltet PCR-Primer, Sequenzierprimer und Hybridisierungssonden, sowie Sequenzen der kodierenden und nichtkodierenden Bereiche einschließlich ausgewählter hochvarianter Intronbereiche, von Exonbereichen, der 5'- untranslatierten Region des Gens und seiner Homologe sowie des Pseudogens und seiner Homologe von verschiedensten Vertebraten (siehe Anhang: „Zusammenstellung der Spezies-Sequenzen"). Einerseits ist das erfindungsgemäße Verfahren geeignet, um bei bestimmten Spezies, die eindeutig klassifiziert sind, schnell, einfach und sicher reproduzierbar den Grad der Verwandheit zu bestimmen (phyiogenetische Analysen). Andererseits kann durch den Vergleich mit Gensequenzen, die eindeutig einer Spezies zugeordnet werden können, die Identität von Gewebeproben, Blutproben und Nahrungsmittel und allen Proben, die DNA enthalten und unbekannter Herkunft sind, ermittelt werden. Daher ist das Verfahren auch für Anwendungen in der forensischen Medizin geeignet. Da in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens als Ausgangsmaterial DNA benutzt wird, können organische Proben (z.B. Blut, Speichel, Gewebereste) aufgrund ihrer Gensequenz eindeutig menschlicher oder tierischer Herkunft zugeordnet werden. Aufgrund der Möglichkeit, die gewonnene DNA- Sequenz mit einer bereits etablierten Datenbank mit DNA-Sequenzen bekannter Spezies zu vergleichen, können Aussagen bezüglich der Spezies getroffen werden. Ist die Gensequenz unbekannt, so können aufgrund von Sequenzähnlichkeiten Aussagen getroffen werden, welchen Grad der Verwandheit die zu untersuchenden Spezies mit einer Vergieichs-DNA aufweist. Eine vorteilhafte Ausfuhrungsform der Erfindung benutzt Hybridisationssonden zur Unterscheidung der DNA verschiedener Spezies untereinander Das Verfahren nutzt verschiedene Methoden zur Unterscheidung der Spezies auf der Basis des LightCycler-Analysesystems (Röche Molecular Biochemicals) unter Anwendung von Hybridisationssonden (Patente WO 97/46714, WO 97/39008)The method according to the invention was carried out using DNA from various species as a model system and the gene sequence in the region of two sections in intron 4 of the PTEN / MMAC1 gene and its homologs was determined. It was possible to amplify all species with only one pair of oligonucleotides in the sequencing reaction 10 using only one oligonucleotide and in the subsequent analytical polyacrylamide gel electrophoresis, it was evident that all the examined species differ in the nucleotide sequence in the intron region (see Appendix: "Compilation of the species sequences"). The method is due to the conservatism of the PTEN / MMAC1 tumor suppressor and Its pseudogen and its homologues in other species are also suitable for successfully amplifying the corresponding gene sequences in lower organisms and possibly plants using an oligonucleotide pair. The method according to the invention is therefore suitable for determining the identity and relationship of different organisms. A database has been established on which can be used in the identification of different species and humans and includes PCR primers, sequencing primers and hybridization probes, as well as sequences of the coding and non-coding regions including ch selected highly variant intron regions, exon regions, the 5'-untranslated region of the gene and its homologues as well as the pseudogen and its homologues from various vertebrates (see Appendix: "Compilation of the species sequences"). On the one hand, the method according to the invention is suitable for quickly, easily and reliably reproducibly determining the degree of relatedness in certain species which are clearly classified (phyiogenetic analyzes). On the other hand, the identity of tissue samples, blood samples and food and all samples which contain DNA and are of unknown origin can be determined by comparison with gene sequences which can be clearly assigned to a species. The method is therefore also suitable for applications in forensic medicine. Since DNA is used as the starting material in a preferred embodiment of the method according to the invention, organic samples (eg blood, saliva, tissue residues) can be clearly assigned to human or animal origin based on their gene sequence. Because of the possibility of comparing the DNA sequence obtained with an already established database with DNA sequences of known species, statements regarding the species can be made. If the gene sequence is unknown, statements can be made on the basis of sequence similarities as to what degree of relationship the species to be examined has with a comparative DNA. An advantageous embodiment of the invention uses hybridization probes to distinguish the DNA of different species from one another. The method uses different methods to differentiate the species based on the LightCycler analysis system (Röche Molecular Biochemicals) using hybridization probes (patents WO 97/46714, WO 97/39008 )

Mit dem LightCycler-Analysesystem ist in kürzester Zeit und relativ geringem Aufwand die Amplifikation, Detektion und spezifische Analyse von DNA verschiedener Spezies und deren Unterscheidung möglich Der LightCycler ist ein Mikro-Volumen-Fluoπmeter mit einem Thermocycler, das schnelles Thermocyceln mit Real-time-Fluoreszenzbeobachtung wahrend der PCR vereint (Wittwer et al , 1997a) Mit dieser Technologie verkürzt sich die Zeit für die Amplifikation und Detektion von Nukleinsäuren von ca 5 Stunden auf ca 30 Minuten Zur spezifische Detektion wahrend der PCR-Reaktion kann die Synthese auf der Basis des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers (FRET) über zwei benachbarte mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Hybridisationssonden beobachtet werden Dabei ist die eine Sonde am 3^'-Ende mit einem Donorfluorophor (in der Regel Fluorescem) und die benachbarte Sonde am 5'-Ende mit einem Akzeptorfluorophor markiert Wahrend des FRET wird der Donor-Farbstoff über eine externe Lichtquelle angeregt und emittiert Licht, welches durch das Akzeptorfluorophor absorbiert wird Dieser wiederum emittiert Licht einer anderen Wellenlange, das spezifisch gemessen wird Dieser FRET kann nur erfolgen wenn die beiden Sonden nebeneinander innerhalb des Amplifikationspaares in einem Abstand von ca 1-5 bp, auf der Target-DNA hybridisieren Dabei ist die Sequenz der Sonden komplementär zum Zielbereich gewählt [Wittwer et al 1997b, Lay, 1997, Bernard, 1998, Riπe, 1997, Bernard, 1999 Nauck 1999a Nauck, 1999b Kreuzer 1999 Kyger 1998 Mangasser-Stephan 1999 Aslandis 1999]With the LightCycler analysis system, the amplification, detection and specific analysis of DNA of different species and their differentiation is possible in a very short time and with relatively little effort. The LightCycler is a micro-volume fluorometer with a thermocycler that enables fast thermocycling with real-time fluorescence observation combined during the PCR (Wittwer et al, 1997a) With this technology, the time for the amplification and detection of nucleic acids is reduced from approx. 5 hours to approx. 30 minutes. For specific detection during the PCR reaction, the synthesis can be based on the fluorescence Resonance energy transfers (FRET) can be observed via two adjacent hybridization probes labeled with fluorescent dyes. One of the probes at the 3 ^' end is marked with a donor fluorophore (usually fluorescence) and the neighboring probe at the 5' end with an acceptor fluorophore of the FRET, the donor dye is applied via an external light source excites and emits light which is absorbed by the acceptor fluorophore which in turn emits light of a different wavelength which is specifically measured This FRET can only be carried out if the two probes side by side within the amplification pair at a distance of approx. 1-5 bp on the target Hybridize DNA The sequence of the probes is complementary to the target area [Wittwer et al 1997b, Lay, 1997, Bernard, 1998, Riπe, 1997, Bernard, 1999 Nauck 1999a Nauck, 1999b Kreuzer 1999 Kyger 1998 Mangasser-Stephan 1999 Aslandis 1999]

Um das spezifische Amplifikationsprodukt nachzuweisen und zur Differenzierung von Unterschieden in der Zielsequenz besteht mit dem LightCycler die Möglichkeit Schmelzpunktanalysen durchzufuhren Die Schmeizpunktanalyse basiert darauf dass sich zwei komplementäre DNA-Strange bei einer charakteristischen Temperatur, der Schmelztemperatur in zwei Einzelstrange trennen Diese Schmelztemperatur ist von der Basenzusammensetzung abhangig indem GC-reiche Sequenzen einen höheren Schmelzpunkt besitzen, als Sequenzen mit vorwiegend AT-Basen. Führt man eine Schmelzpunktanalyse durch, indem man mehr oder weniger gut komplementär passende Hybridisationssonden unter bestimmtenIn order to detect the specific amplification product and to differentiate differences in the target sequence, the LightCycler can be used to carry out melting point analyzes. The melting point analysis is based on the fact that two complementary DNA strands separate at a characteristic temperature, the melting temperature into two single strands.This melting temperature depends on the base composition in that GC-rich sequences have a higher melting point than sequences with predominantly AT bases. If you carry out a melting point analysis by choosing more or less complementary hybridization probes under certain

Temperaturbedingungen von der Template-DNA ablöst, ergibt sich ein für dieDetaching temperature conditions from the template DNA results in a for

Passung zwischen Sonde und zu analysierender Zielsequenz charakteristischesCharacteristic fit between probe and target sequence to be analyzed

Schmelzprofil in Form einer Fluoreszenzintensitätsmessung. Dadurch lassen sichMelting profile in the form of a fluorescence intensity measurement. This allows

Veränderungen in der Zielsequenz detektieren. Sind die Sequenzen vollständig komplementär zueinander, hybridisieren die Sonden vollständig. Enthält dieDetect changes in the target sequence. If the sequences are completely complementary to one another, the probes hybridize completely. Contains the

Zielsequenz in ihrer Basenfolge Veränderungen, erniedrigt sich der Schmelzpunkt der Sonden entsprechend. Durch kontinuierliche Detektion der Fluoreszenz bis zumTarget sequence in their base sequence changes, the melting point of the probes lowers accordingly. By continuous detection of fluorescence up to

Abschmelzen der Sonden kann eine Schmelzkurve in Form der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Temperatur für jede Probe erstellt werden. Das Vergleichen der durch die erste negative Ableitung der Fluoreszenz zur Temperatur (-dF/dt vs T) erstellten Schmelzpeaks ermöglicht die Verifizierung und Differenzierung unterschiedlicher DNAs. Fragmente mit einer niedrigeren oder höherenWhen the probes are melted, a melting curve in the form of the fluorescence intensity as a function of the temperature can be created for each sample. Comparing the melting peaks created by the first negative derivative of the fluorescence to temperature (-dF / dt vs T) enables the verification and differentiation of different DNAs. Fragments with a lower or higher

Schmelztemperatur können eindeutig unterschieden werden.Melting temperature can be clearly differentiated.

In besonders bevorzugten Ausführungsvarianten der Erfindung wurden Oligonukleotidpaare für die Polymerase Kettenreaktion (PCR) gefunden, die sich an das hochkonservierte Tumorsuppressorgen PTEN/MMAC1 , seines Pseudogens und ihrer Homologe in Bereichen anlagert, die eine große Übereinstimmung zwischen den Spezies aufweist. Es handelt sich meist um Exonbereiche bzw. untranslatierte Bereiche des 3'- und 5'-Endes des Genes, seines Pseudogens und ihrer Homologe.In particularly preferred embodiment variants of the invention, oligonucleotide pairs for the polymerase chain reaction (PCR) have been found which attach to the highly conserved tumor suppressor gene PTEN / MMAC1, its pseudogen and their homologues in areas which show a great match between the species. These are mostly exon regions or untranslated regions of the 3 'and 5' end of the gene, its pseudogen and their homologues.

Diese Oligonukleotidpaare gestatten es, kleine Genabschnitte zu amplifizieren, welche Bereiche beinhalten, die unterschiedliche Basensequenzen zwischen den einzelnen Spezies aufweisen einschließlich Basenaustausche, Basendeletionen und Baseninsertionen. In den Beispielen 4, 5 und 6 wird eine 9-Basenpaar-Deletion des Schweinehomologs des PTEN/MMAC ^"/-Pseudogens und zahlreiche weitere Sequenzvarianten des Gens, des Pseudogens und ihrer Homologe bei verschiedenen Spezies benutzt, um mit Hilfe spezifischer Hybridisationssonden unterschiedliche Schmelzprofile bei unterschiedlichen Spezies zu erzeugen, die die Spezies eindeutig voneinander unterscheiden. Dieser bevorzugte Bereich der Beispiele 4-6 betrifft ausschließlich das Exon 5 des Gens, des Pseudogens und ihrerThese pairs of oligonucleotides allow small gene segments to be amplified which contain regions which have different base sequences between the individual species, including base exchanges, base deletions and base insertions. Examples 4, 5 and 6 use a 9-base pair deletion of the pig homolog of the PTEN / MMAC ^" / pseudogen and numerous other sequence variants of the gene, the pseudogen and their homologs in different species to use different hybrid profiles with the help of specific hybridization probes to produce different species that clearly differentiate the species from each other, and this preferred range of Examples 4-6 only concerns exon 5 of the gene, pseudogen and their

ERSATZBLÄTT (REGEL 26) Homologe. Die verwendeten PCR-Primer für die Amplifikation des entsprechenden Genabschnitts lauten:SPARE BLADE (RULE 26) Homologue. The PCR primers used for the amplification of the corresponding gene section are:

Sense-Primer: PTEN se 5^X- atc ttg acc aat ggc taa gtg - 3^' Sense primer: PTEN se 5 ^X - atc ttg acc aat ggc taa gtg - 3 ^'

Antisense-Primer: Zoo44aRV 5^'- ttgt ctc tgg tcc tta ctt c-3^' Antisense primer: Zoo44aRV 5 ^' - ttgt ctc tgg tcc tta ctt c-3 ^'

Erfindungsgemäße Hybridisationssonden wurden zum einen mit dem Zielbereich der 9-Basenpaardeletion des Schweinepseudogenes ausgewählt. Die Sonde A1/A2 ermöglicht die Unterscheidung der Schweine-DNA von allen anderen Spezies.Hybridization probes according to the invention were selected on the one hand with the target region of the 9-base pair deletion of the pig pseudogenes. The A1 / A2 probe enables pig DNA to be distinguished from all other species.

Da mit obigem PCR-Primerpaar nicht nur das Pseudogen, sondern auch der Genbereich von Exon 5 des Schweinhomologs von PTEN/MMAC1 amplifiziert wird, wurde ein weiteres Sondenpaar mit der komplementären Sequenz des Schweinehomologs bereitgestellt. Es handelt sich um die Sonde C1 /C2.Since not only the pseudogen but also the gene region of exon 5 of the pig homolog from PTEN / MMAC1 is amplified with the above PCR primer pair, a further pair of probes with the complementary sequence of the pig homolog was provided. It is the C1 / C2 probe.

Da die verschiedenen Spezies in diesem Genbereich geringe Sequenzunterschiede aufweisen, die für eine detailliertere Differenzierung untereinander genutzt werden sollten, wurde ein drittes Sondenpaar, welches der Sequenz des menschlichen Pseudogenes im ausgewählten Bereich entspricht, konstruiert (Sonde B1/B2).Since the different species in this gene area have small sequence differences, which should be used for a more detailed differentiation, a third pair of probes was constructed, which corresponds to the sequence of the human pseudogenes in the selected area (probe B1 / B2).

Gemäß der Erfindung handelt es sich um dieAccording to the invention, it is the

Sonden A1/A2: spezifisch für PTE/V-Pseudogen Schwein:Probes A1 / A2: specific for PTE / V pseudogene pig:

A1 : 5^' - tgc ata ttt gtt tca tcc ggg caa att - Fluorescein - 3^' A1: 5 ^' - tgc ata ttt gtt tca tcc ggg caa att - fluorescein - 3 ^'

A2: 5^"- LC Red 705 - tta aag gca caa g t ttc tat ggg ga - ph - 3^' A2: 5 ^" - LC Red 705 - tta aag gca caa gt ttc tat ggg ga - ph - 3 ^'

Sonden B1/B2: spezifisch für PTE/V-Pseudogen Mensch:Probes B1 / B2: specific for PTE / V pseudogene human:

B1 : 5^'- tgc ata ttt att aca tcg ggg caa att - Fluorescein - 3^' B1: 5 ^' - tgc ata ttt att aca tcg ggg caa att - fluorescein - 3 ^'

B2: 5^'- LC Red 640 - aag gca caa gag gcc cta gat ttc ta -ph - 3^' B2: 5 ^' - LC Red 640 - aag gca caa gag gcc cta gat ttc ta -ph - 3 ^'

Sonden C1/C2: spezifisch für PTE/V-Homolog Schwein: C1 : 5^'- tgc ata ttt gtt aca tcg ggg taa att - Fluorescein - 3~ C2: entspricht Sonde B2Probes C1 / C2: specific for PTE / V homologue pig: C1: 5 ^' - tgc ata ttt gtt aca tcg ggg taa att - fluorescein - 3 ~ C2: corresponds to probe B2

Die Positionen der Sonden A1 , A2, B1 , B2, C1 und C2 im Exon 5 werden in Figur 4 wiedergegeben. Die Anwendung dieser drei Sondenpaare einzeln und die Anwendung von verschiedenen Kombinationsmogiichkeiten der Sonden untereinander (1 Donorfarbstoff+1 Akzeptorfarbstoff) ergibt für jede einzelne Spezies ein charakteristisches Panel von unterschiedlichen Schmelzpunkten, die eine eindeutige Unterscheidung der Spezies voneinander ermöglicht (siehe Figuren 5 und 7) Desweiteren erlaubt der Einsatz dieser Hybridisationssondenkombinationen Untersuchungen in Reaktionsgemischen von zwei und mehreren unterschiedlichen SpeziesThe positions of the probes A1, A2, B1, B2, C1 and C2 in exon 5 are shown in FIG. 4. The use of these three pairs of probes individually and the use of different combinations of the probes with one another (1 donor dye + 1 acceptor dye) results in a characteristic panel of different melting points for each individual species, which enables a clear differentiation of the species from one another (see FIGS. 5 and 7) The use of these hybridization probe combinations allows investigations in reaction mixtures of two and more different species

Eine parallele Analyse/Detektion der Fluoreszenz von zwei verschiedenen Wellenlangen (640nm und 705nm) ist in einer Multiplexreaktion mit zwei verschiedenen Sondenpaaren derart möglich, dass die jeweiligen Donorsonden unterschiedlich markiert sind Die Akzeptorsonden können in ihrer Sequenz identisch oder unterschiedlich sein Nach angeschlossener Schmelzpunktanalyse erhalt man für jede der beiden Wellenlangen einen für die entsprechende Sonde und der von ihr abgedeckten Zielsequenz spezifischen SchmelzpunktA parallel analysis / detection of the fluorescence from two different wavelengths (640nm and 705nm) is possible in a multiplex reaction with two different pairs of probes in such a way that the respective donor probes are marked differently.The sequence of the acceptor probes can be identical or different.After melting point analysis is obtained for each of the two wavelengths has a melting point specific to the corresponding probe and the target sequence it covers

Die alternative Kombination aus zwei verschiedenen Donorsonden und einer Akzeptorsonde einer Wellenlange ergibt für ein Reaktionsgemisch von zwei unterschiedlichen Spezies mit geringen Sequenzunterschieden im Zielbereich zwei Schmelzpunkte innerhalb einer WellenlangeThe alternative combination of two different donor probes and one acceptor probe of one wavelength results in two melting points within one wavelength for a reaction mixture of two different species with small sequence differences in the target region

Generell sind folgende allgemeine Multiplex-Reaktionsansatze möglich, die dadurch gekennzeichnet sind, dass mindestens ein Hybridisationssondenpaar eingesetzt wird und mindestens ein Genabschnitt amplifiziert wird, unterschiedliche Hybridisationssondenpaare an unterschiedliche Genabschnitte hybridisieren, und die Schmelzpunkte von den verschiedenen Kombinationen bestimmt und für jede Spezies zu einem Panel zusammengestellt bzw zur Identifizierung verwendet werdenIn general, the following general multiplex reaction approaches are possible, which are characterized in that at least one pair of hybridization probes is used and at least one gene section is amplified, different pairs of hybridization probe hybridize to different gene sections, and the melting points are determined by the different combinations and put together for each species to form a panel or used for identification

Diese allgemeinen Multiplex-Reaktionsansatze können weiterhin dadurch gekennzeichnet sein, dass nicht nur mindestens ein Hybridisationssondenpaar eingesetzt und nicht nur mindestens ein Genabschnitt amplifiziert wird sondern auch von mindestens einer Spezies DNA eingesetzt wird und damit unterschiedliche Hybridisationssondenpaare an unterschiedliche Genabschnitte unterschiedlicher Spezies hybridisieren, und die Schmelzpunkte von den verschiedenen Kombinationen bestimmt und für jede Spezies zu einem Panel zusammengestellt bzw. zur Identifizierung verwendet werdenThese general multiplex reaction approaches can furthermore be characterized in that not only is at least one pair of hybridization probes used and not only is at least one gene section amplified but also at least one species of DNA is used and thus different ones Hybridization probe pairs hybridize to different gene segments of different species, and the melting points are determined by the different combinations and put together for each species to form a panel or used for identification

Auf dieser Basis sind folgende Analysenansätze möglich, wobei Schmelzpunktüberschneidungen zu vermeiden sindThe following analytical approaches are possible on this basis, whereby melting point overlaps should be avoided

a) Analyse einer unbekannten Speziesprobe mit zwei verschiedenen Donorsonden und einer Akzeptorsonde einer oder unterschiedlicher Wellenlänge b) Analyse zwei oder mehrerer unbekannter Speziesproben mit zwei verschiedenen Donorsonden und einer Akzeptorsonde einer oder unterschiedlicher Wellenlangen c) Analyse einer unbekannten Speziesprobe mit einem Gemisch von jeweils zwei oder mehreren Donorsonden und Akzeptorsonden d) Analyse von einem Gemisch unbekannter Speziesproben mit einer Donorsonde und einer Akzeptorsonde e) Analyse von einem Gemisch unbekannter Speziesproben mit zwei oder mehreren verschiedenen Donorsonden und zwei oder mehreren Akzeptorsonden einer oder mehrerer verschiedener Wellenlängena) Analysis of an unknown species sample with two different donor probes and one acceptor probe of one or different wavelengths b) Analysis of two or more unknown species samples with two different donor probes and one acceptor probe of one or different wavelengths c) Analysis of an unknown species sample with a mixture of two or more Donor probes and acceptor probes d) Analysis of a mixture of unknown species samples with a donor probe and one acceptor probe e) Analysis of a mixture of unknown species samples with two or more different donor probes and two or more acceptor probes of one or more different wavelengths

Dieses Vorgehen ist auf alle hochkonservierten Abschnitte des PTEN/MMAC1 Gens, des Pseudogens und ihrer Homologe sowie auch auf andere hochkonservierte Gene übertragbar, wenn das Ziel die Speziesunterscheidung istThis procedure can be applied to all highly conserved sections of the PTEN / MMAC1 gene, the pseudogen and their homologues, as well as to other highly conserved genes, if the goal is to differentiate between species

Ausgewählte Pπmer für die Amplifikation sind unter den Patentansprüchen Nr 18-25 und ausgewählte Hybridisationssonden-Sequenzen für die LightCycler-Anwendung sind unter den Patentansprüchen Nr 35-42 für verschiedene Exons des PTEN/MMAC1 Gens, des Pseudogens und ihrer Homologe aufgeführt Aufgrund der hohen Konservierung des Gens in der Evolution sind Pπmer und Hybridisationssonden auch in allen denkbaren anderen Bereichen des Gens, des Pseudogens und ihrer Homologe möglich, die nach oben beschriebenem Prinzip zur Spezies-Unterscheidung verwendet werden könnenSelected amplifiers are listed under claims 18-25 and selected hybridization probe sequences for the LightCycler application are listed under claims 35-42 for various exons of the PTEN / MMAC1 gene, the pseudogen and their homologues due to the high level of conservation of the gene in evolution, peptides and hybridization probes are also possible in all other conceivable areas of the gene, the pseudogen and their homologs, which can be used to differentiate species according to the principle described above

Diese Sonden und/oder Pπmer lassen sich entsprechend dem Multiplexprinzip mit dem Ziel der Speziesunterscheidung beliebig kombinieren Generell gilt, daß alle beschriebenen als auch alle derzeit und zukünftig denkbaren Verfahren zur Analyse der DNA-Sequenzvarianten sowohl auf den Sense- als auch den Antisensestrang angewendet werden können. Dieses Äquivalenzprinzip gilt auch für sämtliche PCR-, Sequenzierprimer und Hybridisierungssonden, die in dieser Patentanmeldung beschrieben werden sowie die beschriebenen Gensequenzen der einzelnen Tjerspezies.These probes and / or Pπmer can be combined according to the multiplex principle with the aim of species differentiation In general, it applies that all of the methods described, as well as all currently and in the future conceivable methods for analyzing the DNA sequence variants, can be applied to both the sense and the antisense strand. This principle of equivalence also applies to all PCR, sequencing primers and hybridization probes which are described in this patent application and the gene sequences described for the individual species.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern.The following examples are intended to explain the invention further.

Beispiel 1example 1

In diesem Versuch wird die Sequenzdiversität zwischen menschlicher und Elefanten- DNA bestimmt. Es wurde die in Figur 1 wiedergegebene Anordnung gewählt. Die vergleichende Sequenzanalyse wurde durchgeführt, indem die speziesspezifischen Sequenzen des Introns 4 des Tumorsuppressorgens PTEN/MMAC1 und seiner Homologe bestimmt wurden. Ein Oligonukleotidpaar, das für Bereiche innerhalb von Exon 4 und 5 der DNA-Sequenz dieses Gens für die Maus spezifisch ist, wurde ausgewählt und anschließend synthetisiert (Amersham Pharmacia).In this experiment the sequence diversity between human and elephant DNA is determined. The arrangement shown in FIG. 1 was chosen. The comparative sequence analysis was carried out by determining the species-specific sequences of intron 4 of the tumor suppressor gene PTEN / MMAC1 and its homologues. An oligonucleotide pair that is specific for regions within exon 4 and 5 of the DNA sequence of this gene for the mouse was selected and then synthesized (Amersham Pharmacia).

Oligonukleotid 1 : 5^'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gac - 3^' Oligonukleotid 2: 5^'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt c- 3^' Oligonucleotide 1: 5 ^' - cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gac - 3 ^' Oligonucleotide 2: 5 ^' - cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt c- 3 ^'

Die Oligonukleotide für die Polymerase-Kettenreaktion wurden so konstruiert, daß sie an ihrem 5^'- Ende jeweils eine Sequenz aufweisen (unterstrichen), die zu den zwei Oligonukleotiden, die bei der Sequenzierungsreaktion eingesetzt werden, komplementär ist. Dadurch wird gewährleistet, daß die spezifischen Oligonukleotidteile an die Template-DNA (nicht unterstrichen) jeweils spezifisch binden, jedoch für die Sequenzierung andere Oligonukleotide als für die Polymerase- Kettenreaktion verwendet werden können, was ganz allgemein die Qualität der Sequenzierungsreaktion erhöht. Der spezifische Anteil der Oligonukleotide bindet jeweils an Exon 4 und Exon 5 des PTEN/MMAC1 Tumorsuppressorgens und seiner Homologe. Es wurden von einem Tierarzt im Rahmen eines Routineeingriffes 3 ml anfallendesThe oligonucleotides for the polymerase chain reaction were constructed so that they each have (underlined) a sequence at their 5 ^' end that is complementary to the two oligonucleotides used in the sequencing reaction. This ensures that the specific parts of the oligonucleotide bind specifically to the template DNA (not underlined), but that other oligonucleotides can be used for the sequencing than for the polymerase chain reaction, which generally increases the quality of the sequencing reaction. The specific proportion of the oligonucleotides binds to exon 4 and exon 5 of the PTEN / MMAC1 tumor suppressor gene and its homologues. As part of a routine procedure, 3 ml of the resulting amount were removed by a veterinarian

Restblut eines afrikanischen Elefanten zur Verfügung gestellt. Mittels des QIAgenRested blood from an African elephant provided. Using the QIAgen

Kits (QIAGen) wurde die DNA aus Blut vom Elefanten und aus Blut vom Menschen entsprechend den Protokollen des Herstellers isoliert und bis zum Gebrauch bei -Kits (QIAGen) DNA was isolated from elephant blood and human blood according to the manufacturer's protocols and used until -

20°C gelagert.Stored at 20 ° C.

Um ausreichende Mengen an DNA für die Sequenzierungsreaktion zu generieren, wurde eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt. Es wurden 3A polymerase chain reaction (PCR) was carried out to generate sufficient amounts of DNA for the sequencing reaction. There were 3

Probenansätze bereitgestellt und folgende Volumina und Endkonzentrationen bzw.Sample batches provided and the following volumes and final concentrations or

Mengen an Substraten und Einheiten an Polymerase verwendet: Reaktionsgefäß 1 :Amounts of substrates and units of polymerase used: reaction vessel 1:

Elefanten-DNA 1 μl (50 ng); Reaktionsgefäß 2: menschliche DNA 1 μl (50 ng);Elephant DNA 1 µl (50 ng); Reaction tube 2: human DNA 1 μl (50 ng);

Reaktionsgefäß 3: keine DNA, statt dessen 1 μl Aqua dest. (Negativkontrolle). AllenReaction tube 3: no DNA, instead 1 μl distilled water. (Negative control). all

Probenansätzen wurde jeweils beigefügt: 14,35 μl Aqua dest.; dNTPs (Promega): 4 μl (200 μM); MgCI₂ (InViTek): 1 μl (2 mM); 10 x Puffer (InViTek) bestehend aus 160 mM (NH₄)₂SO₄, 500 mM Tris-HCI pH 8,8, 0, 1% Tween 20: 2,5 μl; Oligonukleotid 1 und 2: 1 μl (0,2 μM); Taq Polymerase (InViTek): 0, 15 μl (0,75 Units).Sample batches were added: 14.35 μl aqua dest .; dNTPs (Promega): 4 µl (200 µM); MgCI ₂ (InViTek): 1 ul (2 mM); 10 x buffer (InViTek) consisting of 160 mM (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 500 mM Tris-HCl pH 8.8, 0.1% Tween 20: 2.5 μl; Oligonucleotide 1 and 2: 1 µl (0.2 µM); Taq polymerase (InViTek): 0.15 ul (0.75 units).

Insgesamt wurden 35 Zyklen in einem Perkin Eimer Thermocycler 9600 durchgeführt, wobei jeweils 50 Sekunden bei 94°C denaturiert wurde, 50 Sekunden lang sich die Oligonukleotide bei 53°C an die DNA-Stränge anlagerten und 60A total of 35 cycles were carried out in a Perkin Elmer thermal cycler 9600, denaturing 50 seconds each at 94 ° C, the oligonucleotides attaching to the DNA strands at 53 ° C for 50 seconds and 60

Sekunden lang (pro Zyklus eine Sekunde länger) bei 72°C verlängert wurden. VorAt 72 ° C for seconds (one second longer per cycle). In front

Beginn des ersten Zyklus wurde 3 Minuten lang bei 94°C denaturiert und nach dem letzten Zyklus wurde eine letzte Verlängerungsphase von 10 Minuten bei 72°C durchgeführt.Beginning of the first cycle was denatured at 94 ° C for 3 minutes and after the last cycle a final extension phase of 10 minutes was carried out at 72 ° C.

Um den Erfolg der PCR zu überprüfen, die amplifizierte DNA zu isolieren und dieTo check the success of the PCR, isolate the amplified DNA and the

Negativkontrolle zu überprüfen, wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt:To check negative control, agarose gel electrophoresis was performed:

Es wurde ein 0,8% Agarose-Gel unter Zugabe von Ethidiumbromid hergestellt und 1 x TAE-Puffer zugegeben. Jeweils 13 μl PCR-Produkt unter Zusatz von 2 μl Farbstoff wurde in vorbereitete Probentaschen in die Gelmatrix pipettiert und eine Spannung von 100 V angelegt. Nach 20 bis 30 Minuten wurde die Elektrophorese gestoppt, dieA 0.8% agarose gel was prepared with the addition of ethidium bromide and 1 x TAE buffer was added. Each 13 μl PCR product with the addition of 2 μl of dye was pipetted into prepared sample pockets in the gel matrix and a voltage of 100 V was applied. After 20 to 30 minutes, the electrophoresis was stopped

DNA-Banden unter einer UV-Lampe sichtbar gemacht und anschließend mit einemDNA bands visualized under a UV lamp and then with a

Skalpell ausgeschnitten. Die Aufreinigung der PCR-Produkte gelang durch Auftragen der ausgeschnittenen Banden auf MicroSpin Colums (Amersham Pharmacia) undCut out scalpel. The PCR products were purified by applying the cut bands to MicroSpin Colums (Amersham Pharmacia) and

Zentrifugation bei 1020 g für 10 Minuten. Das Eluat wurde je nach Stärke der Bande auf dem Agarose-Gel mit bis zu 30 μl Aqua dest. verdünnt. Die aufgereinigten PCR-Produkte wurden einer Cycle-Sequenzierungsreaktion unterCentrifugation at 1020 g for 10 minutes. Depending on the strength of the band, the eluate was washed with up to 30 μl distilled water on the agarose gel. diluted. The purified PCR products were subjected to a cycle sequencing reaction

Gebrauch von Oligonukleotiden mit der Sequenz 5^'- Cy-5 - cag gaa aca gct atg ac -Use of oligonucleotides with the sequence 5 ^' - Cy-5 - cag gaa aca gct atg ac -

3^' unterworfen. Die Oligonukleotide waren am 5^'-Ende mit dem Farbstoff Cy-5 markiert. Pro PCR-Produkt wurden 4 Reaktionsgefäße (A,C,G,T) bereitgestellt und folgende Volumina und Konzentrationen gewählt: Je 3 μl PCR-Produkt für A,C,G,T; je 1 μl A,C,G,T, -Reagenz (Amersham Pharmacia) bestehend aus Tris-HCL (pH 9.5),3 ^' subjected. The oligonucleotides were labeled with the dye Cy-5 at the 5 ^' end. 4 reaction vessels (A, C, G, T) were provided for each PCR product and the following volumes and concentrations were selected: 3 μl PCR product for A, C, G, T; 1 μl each of A, C, G, T, reagent (Amersham Pharmacia) consisting of Tris-HCL (pH 9.5),

MgCI₂, Tween 20, Nonidet P-40, 2-mercaptoethanoi, dATP, dCTP, 7-deaza-dGTP, dTTP, thermostabile Pyrophosphatase und Thermo Sequenase DNA Polymerase, wobei in Reaktionsgefäß A,C,G und T entsprechend ddATP, ddCTG, ddGTP und ddTTP enthalten war. Anschließend erfolgt die Zugabe von 1 μl Oligonukleotid der oben angegebenen Sequenz (0,5 μM). Folgende Reaktionsbedingungen wurden gewählt: Insgesamt wurden 25 Zyklen in einem Perkin Eimer Thermocycler 9600MgCI ₂ , Tween 20, Nonidet P-40, 2-mercaptoethanoi, dATP, dCTP, 7-deaza-dGTP, dTTP, thermostable pyrophosphatase and Thermo Sequenase DNA polymerase, whereby in reaction vessel A, C, G and T corresponding to ddATP, ddCTG, ddGTP and ddTTP was included. Subsequently, 1 μl of oligonucleotide of the sequence given above (0.5 μM) is added. The following reaction conditions were chosen: A total of 25 cycles in a Perkin Elmer thermal cycler 9600

(Perkin Eimer) durchgeführt, wobei jeweils 20 Sekunden bei 94°C denaturiert wurde,(Perkin Elmer), denaturing at 94 ° C. for 20 seconds,

30 Sekunden lang sich die Oligonukleotide bei 54°C an das Amplifikat anlagerten und die DNA-Stränge beim Hochheizen zur Denaturierungstemperatur verlängert wurden. Vor Beginn des ersten Zyklus wurde 3 Minuten und 30 Sekunden lang beiThe oligonucleotides attached to the amplificate at 54 ° C. for 30 seconds and the DNA strands were extended to the denaturation temperature when heating up. Before the start of the first cycle, 3 minutes and 30 seconds were applied

94°C denaturiert und nach dem letzten Zyklus wurde eine letzte Verlängerungsphase von 5 Minuten bei 72°C durchgeführt.94 ° C denatured and after the last cycle a final extension phase of 5 minutes was carried out at 72 ° C.

Um die Sequenz sichtbar zu machen, wurden die Produkte auf einemTo make the sequence visible, the products were placed on a

Polyacrylamidgel im elektrischen Feld aufgetrennt. Hierfür wurde das automatischePolyacrylamide gel separated in an electric field. For this, the automatic

Laser Fluoreszenzdetektionssystem A.L.F.express der Firma Amersham Pharmacia gewählt. Die Gelmatrix setzte sich zusammen aus: 16,8 g Urea (Gibco BRL), 5,2 mlLaser fluorescence detection system A.L.F.express selected by Amersham Pharmacia. The gel matrix was composed of: 16.8 g urea (Gibco BRL), 5.2 ml

50% Long Ranger Gel Solution (FMC) und 4 ml 10 x TBE (Gibco BRL), die mittels50% Long Ranger Gel Solution (FMC) and 4 ml 10 x TBE (Gibco BRL) using

Aqua dest. auf 40 ml verdünnt wurden. Die Polymerisation des Gels erfolgte unterAqua dest. were diluted to 40 ml. The gel was polymerized under

Zugabe von 140 μl 10% APS (Merck) und 20 μl TEMED (Serva). Zu jedemAdd 140 μl 10% APS (Merck) and 20 μl TEMED (Serva). To each

Reaktionsgefäß A,C,G,T, wurden 5 μl Formamide loading dye gegeben und in die vorbereiteten Probentaschen pipettiert. Folgende Elektrophoresebedingugnen wurden gewählt: 1000 V, 40 mA, 40 W.Reaction tube A, C, G, T, 5 μl formamide loading dye were added and pipetted into the prepared sample pockets. The following electrophoresis conditions were selected: 1000 V, 40 mA, 40 W.

Nach der Gelelektrophorese wurden die Sequenzen vom A.L. Fexpress SystemAfter gel electrophoresis, the sequences from A.L. Fexpress system

(Amersham Pharmacia) generiert und konnten nun miteinander verglichen werden. In(Amersham Pharmacia) and could now be compared. In

Figur 2 werden die ermittelten Nukleotidsequenzunterschiede dargestellt. DerFIG. 2 shows the nucleotide sequence differences determined. The

Vergleich der Sequenzen zwischen Elefanten- und menschlicher DNA imComparison of sequences between elephant and human DNA in

Exonbereich ergab große Übereinstimmung und diente als Kontrolle für dieExon area revealed great agreement and served as a control for that

PTEN/MMAC1 Spezifität, während der Intronbereich hochgradig unterschiedlich war.PTEN / MMAC1 specificity, while the intron range was highly different.

ERSATZBIATT (REGEL 26) Beispiel 2REPLACEMENT BOOK (RULE 26) Example 2

In diesem Versuch wird ein Sequenzvergleich von Schweineleber, die von einer Metzgerei zur Verfügung gestellt wurde, mit bereits vorhandener DNA eines Schweines durchgeführt. Als Kontroll-DNA diente Rindersalami. Es wurden aus 50 bis 60 mg Schweineleber und 50 bis 60 mg Rindersalami mittels QIAgen Kits (QIAGen) DNA gewonnen und aufgereinigt. Für die vergleichende Analyse wurde das unter Beispiel 1 durchgeführte Vorgehen unter Verwendung der Oligonukleotide 1 und 2 für die Polymerase-Kettenreaktion gewählt. Für die Sequenzanalyse wurde eine Bande mit etwa 300 bp Länge aus dem Agarosegel ausgeschnitten. Diese Bande entspricht in ihrer Länge dem PTEN/MMAC1 Pseudogen. Nach Aufreinigung des ausgeschnittenen Amplifikats wurde mit Cy-5 markierten Oligonukleotiden mit der Sequenz 5^'- Cy-5- cag gaa aca gct atg ac -3^' sequenziert. Die vergleichende Analyse von Schweineleber aus der Metzgerei mit bereits in diesem Bereich sequenzierter DNA eines Schweines ergab eine komplette Übereinstimmung. Die Kontroll-DNA (Rindersalami) weist eine von der Schweine-DNA deutlich unterschiedliche Sequenz auf (siehe Figur 3).In this experiment, a sequence comparison of pig liver, which was made available by a butcher's shop, is carried out with the DNA of a pig that is already present. Beef salami served as control DNA. DNA was obtained from 50 to 60 mg of pig liver and 50 to 60 mg of beef salami using QIAgen Kits (QIAGen) and purified. For the comparative analysis, the procedure carried out under example 1 was selected using oligonucleotides 1 and 2 for the polymerase chain reaction. A band of approximately 300 bp in length was cut out of the agarose gel for the sequence analysis. The length of this band corresponds to the PTEN / MMAC1 pseudogen. After purification of the cut-out amplificate, oligonucleotides labeled with Cy-5 were sequenced with the sequence 5 ^' - Cy-5-cag gaa aca gct atg ac -3 ^' . The comparative analysis of pig liver from the butcher's shop with DNA of a pig already sequenced in this area showed complete agreement. The control DNA (bovine salami) has a clearly different sequence from the pig DNA (see FIG. 3).

Beispiel 3Example 3

Die PCR und die Sequenzierung der Exons 1 bis 9 wird mit den in den Ansprüchen 19-26 beschriebenen Primern bei sonst analoger Reaktionsführung durchgeführt. Die entsprechenden Sequenzen der untersuchten Spezies sind im Anhang unter "Zusammenstellung der Spezies-Sequenzen " aufgeführt.The PCR and the sequencing of exons 1 to 9 is carried out with the primers described in claims 19-26 with an otherwise analogous reaction procedure. The corresponding sequences of the examined species are listed in the appendix under "Compilation of the species sequences".

Beispiel 4Example 4

In diesem Versuch soll die Speziesunterscheidung zwischen Schweine-DNA und menschlicher DNA mit verschiedenen Kombinationen vonIn this experiment the species distinction between pig DNA and human DNA with different combinations of

Hybridisationssondenpaaren gezeigt werden. Die vergleichende Analyse wurde durchgeführt, indem die Schmelzpunkte der Hybridisationssondenpaare C1 +B2, A1 +B2, A1+A2 und C1+A2 in Schweine-DNA und menschlicher DNA bestimmt wurden. Die Sonden wurden dementsprechend ausgewählt und synthetisiert (Tib MolHybridization probe pairs are shown. The comparative analysis was carried out by determining the melting points of the hybridization probe pairs C1 + B2, A1 + B2, A1 + A2 and C1 + A2 in pig DNA and human DNA were. The probes were selected and synthesized accordingly (Tib Mol

Biol Berlin).Biol Berlin).

Sonden:Probes:

A1 : 5^' - tgc ata ttt gtt tca tcc ggg caa att - Fluorescein - 3^' A1: 5 ^' - tgc ata ttt gtt tca tcc ggg caa att - fluorescein - 3 ^'

A2: 5^'- LC Red 705 - tta aag gca caa gat ttc tat ggg ga - ph - 3^" A2: 5 ^' - LC Red 705 - tta aag gca caa gat ttc tat ggg ga - ph - 3 ^"

B1 : 5^'- tgc ata ttt att aca tcg ggg caa att - Fluorescein - 3^" B1: 5 ^' - tgc ata ttt att aca tcg ggg caa att - fluorescein - 3 ^"

B2: 5^'- LC Red 640 - aag gca caa gag gcc cta gat ttc ta -ph - 3^' B2: 5 ^' - LC Red 640 - aag gca caa gag gcc cta gat ttc ta -ph - 3 ^'

C1 : 5^Λ- tgc ata ttt gtt aca tcg ggg taa att - Fluorescein - 3C1: 5 ^Λ - tgc ata ttt gtt aca tcg ggg taa att - Fluorescein - 3

C2: 5^'- LC Red 640 - aag gca caa gag gcc cta gat ttc ta -ph - 3^Λ C2: 5 ^' - LC Red 640 - aag gca caa gag gcc cta gat ttc ta -ph - 3 ^Λ

Voraussetzung für eine Sonden-Hybridisation ist die Amplifizierung des Zielbereiches mit einem geeigneten Primerpaar. Dazu wurde folgendes Primerpaar ausgewählt und synthetisiert:The prerequisite for probe hybridization is amplification of the target area with a suitable pair of primers. The following pair of primers was selected and synthesized:

Sense-Primer: PTEN se 5^'- atc ttg acc aat ggc taa gtg - 3^' (Tib Mol Biol)Sense primer: PTEN se 5 ^' - atc ttg acc aat ggc taa gtg - 3 ^' (Tib Mol Biol)

Antisense-Primer: Zoo44aRV 5^*- ttgt ctc tgg tcc tta ctt c-3^' (AmershamPharmacia)Antisense primer: Zoo44aRV 5 ^* - ttgt ctc tgg tcc tta ctt c-3 ^' (AmershamPharmacia)

Beide Primer binden an Bereiche des Exon 5 des PTEN/MMAC1 Gens, des Pseudogens und ihrer Homologe, welcher den Zielbereich von ca. 172 Basenpaaren einschließt.Both primers bind to regions of exon 5 of the PTEN / MMAC1 gene, the pseudogen and their homologues, which includes the target region of approximately 172 base pairs.

Die DNA wurde mittels des Quiagen Kits (QIAGen) aus Blut vom Schwein und vom Menschen entsprechend den Protokollen des Herstellers isoliert und bis zum Gebrauch bei -20° gelagert.The DNA was isolated from pork and human blood using the Quiagen Kit (QIAGen) according to the manufacturer's protocols and stored at -20 ° until use.

Die Real-time-PCR mit Hybridisationssonden und anschließender Schmelzpunktanalyse wurde wie folgt durchgeführt: Es wurden 3 Reihen mit jeweils 4 Probenansätzen (Glaskapillarküvetten (Röche) in einem gekühlten Pipettierblock (Röche) bereitgestellt. In Reihe 1 werden in jeden Ansatz 2μl (50ng) Schweine-DNA vorgelegt, in jeden Ansatz der 2. Reihe 2μl (50ng) menschliche DNA und in der 3. Reihe 2μl Aqua dest. für die Negativkontrollen. Die Hybridisationssonden wurden für die entsprechenden Ansätze in folgenden Kombinationen verwendet: 1. Ansatz jeder Reihe: A1 , 1 μl (0, 1 μM) und A2, 2μl (0,2μM); 2. Ansatz jeder Reihe: C1 , 1 μl (0, 1 μM) und B2, 2μl (0,2μM), 3 Ansatz jeder Reihe A1 , 1 μl (0,1 μM) und B2, 2μl (0,2μM),The real-time PCR with hybridization probes and subsequent melting point analysis was carried out as follows: 3 rows, each with 4 sample batches (glass capillary cuvettes (Röche), were provided in a cooled pipetting block (Röche). In row 1, 2 μl (50ng) pigs were added to each batch -DNA submitted, 2μl (50ng) human DNA in each batch of the 2nd row and 2μl distilled water for the negative controls in the 3rd row The hybridization probes were used for the corresponding batches in the following combinations: 1st batch of each row: A1 , 1 μl (0, 1 μM) and A2, 2μl (0.2μM); 2nd batch of each row: C1, 1 μl (0, 1 μM) and B2, 2μl (0.2μM), 3 batches of each row A1, 1 μl (0.1 μM) and B2, 2μl (0.2μM),

4 Ansatz jeder Reihe C1 , 1 μl (0,1 μM) und A2, 2μl (0,2μM)4 approach of each row C1, 1 μl (0.1 μM) and A2, 2μl (0.2μM)

Folgende Volumina und Endkonzentrationen bzw Mengen an Substraten undThe following volumes and final concentrations or amounts of substrates and

Einheiten an Polymerase wurden in allen Probenansatzen verwendetUnits of polymerase were used in all sample runs

Oligonukleotide PTEN se und Zoo44aRV je 2μl (10 μM), MgCL₂ (Röche MolecularOligonucleotides PTEN se and Zoo44aRV each 2μl (10 μM), MgCL ₂ (Röche Molecular

Diagnostics) 2,4μl (4mM), LightCycler-DNA Master Hybridisation Probes (RöcheDiagnostics) 2.4μl (4mM), LightCycler-DNA Master Hybridization Probes (Röche

Molecular Diagnostics) 2μl einer 10-fach-konzentπerten Stocklosung aus Taq-DNA-Molecular Diagnostics) 2μl of a 10-fold concentrated stock solution made of Taq DNA

Polymerase, Reaktionspuffer, dNTP-Mischung und 10mM MgCI₂ Die MgCI₂-Polymerase, reaction buffer, dNTP mixture and 10mM MgCI ₂ The MgCI ₂ -

Endkonzentration im Gesamtreaktionsansatz von 20μl betragt 5mM Nach vollständigem Laden aller Reagenzien werden die Glaskapillarkuvetten verschlossen, bei 2000g für 1 Minute zentπfugiert und in das für die Kapillaren vorgeseheneFinal concentration in the total reaction mixture of 20 μl is 5 mM. After all the reagents have been completely loaded, the glass capillary cuvettes are sealed, centrifuged at 2000 g for 1 minute and placed in the space provided for the capillaries

Reaktionskarussel des LightCyclers eingesetztReaction carousel of the LightCycler used

Insgesamt werden 45 Zyklen im LightCycler-Analysesystem wie folgt durchgeführtA total of 45 cycles in the LightCycler analysis system are carried out as follows

Denaturierung für 1 Sekunde bei 95°C, Anlagerung der Oligonukleotide und Sonden für 10 Sekunden bei 54°C und die Veriangerung der DNA-Strange für 5 Sekunden bei 72°C Vor Beginn des ersten Zyklus wurde 30 Sekunden bei 95°C denaturiertDenaturation for 1 second at 95 ° C., attachment of the oligonucleotides and probes for 10 seconds at 54 ° C. and the extension of the DNA strand for 5 seconds at 72 ° C. Before the start of the first cycle, 30 seconds were denatured at 95 ° C.

Die Temperierungsrate wird von der Denaturierung zur Anlagerung auf 20°C/The tempering rate is from denaturation to storage at 20 ° C /

Sekunde programmiert, von der Anlagerung zur Veriangerung der DNA-Strange aufSecond programmed, from attachment to extension of the DNA strand

20°C/ Sekunde und auf 20°C/ Sekunde für den Schritt von der Veriangerung bis zur20 ° C / second and to 20 ° C / second for the step from extension to

Denaturierung Die Fluoreszenz, die aus dem FRET der komplementär nebeneinander anlagernden Sonden resultiert, wird zur Beobachtung der PCR amDenaturation The fluorescence resulting from the FRET of the complementary probes is used to observe the PCR on

Ende der Anlagerunsphase in jedem Zyklus gemessen Sonden, die sich auf Grund von Sequenzunterschieden der Target-DNA nicht vollständig anlagern können, da deren Anlagerungstemperatur unter der der Oligonukleotide liegt, können zu diesemAt the end of the attachment phase in each cycle, probes that cannot attach completely due to sequence differences in the target DNA, since their attachment temperature is lower than that of the oligonucleotides, can add to this

Zeitpunkt der Fluoreszenzmessung noch nicht erfasst werdenThe time of the fluorescence measurement has not yet been recorded

Nach vollständiger Amplifikation wird eine abschließende Schmelzkurve wie folgt aufgezeichnet Denaturierung der Amplifikationsprodukte für 5 Sekunden bei 95°CAfter complete amplification, a final melting curve is recorded as follows. Denaturation of the amplification products for 5 seconds at 95 ° C

Kuhlen auf 30°C mit einer Tempeπeruπgsrate von 20°C/Sekunde, Halten dieserCool to 30 ° C with a temperature rate of 20 ° C / second, hold this

Temperatur für 15 Sekunden und anschließendes langsames Heizen von 0,2°C/Temperature for 15 seconds and then slowly heating at 0.2 ° C /

Sekunde bis 95°C Wahrend des langsamen Temperaturanstieges wird dieSecond to 95 ° C During the slow temperature rise the

Fluoreszenz der angelagerten Hybridisationssonden bis zum jeweiligenFluorescence of the attached hybridization probes up to the respective

Abschmelzen/ Dissoziieren kontinuierlich registriert Für jede Probe wird durch dasMelting / dissociation continuously registered For each sample, the

Aufzeichnen des Fluoreszenzsignals in Abhängigkeit von der Temperatur eineRecord the fluorescence signal as a function of the temperature

Schmelzkurve aufgezeichnet Durch Bilden der ersten negativen Ableitung der Fluoreszenz gegen die Temperatur werden die Schmelzkurven in Schmelzpeaks umgewandeltMelting curve recorded by taking the first negative derivative of the Fluorescence versus temperature converts the melting curves into melting peaks

Nach Abgleichen der Fluoreszenzsignale bei 640nm und 705nm gegen die mit einem Colorcompensation Kit (Röche Molecular Diagnostics) erstellten Standardkunten für die jeweilige Wellenlange, konnten die Schmelzpunkte der Schweine-DNA mit denen der menschlichen DNA für die verschiedenen Sondenkombinationen verglichen werden Dabei konnten für die Schweine-DNA jeweils 2 Schmelzpunkte für jedes Sondenpaar aufgezeichnet werden, je einer für das Pseudogen und einer für das Gen Alle Schmelzpunkte der Schweine-DNA waren von denen der menschlichen DNA verschieden (Figur 5)After comparing the fluorescence signals at 640nm and 705nm against the standard values created for each wavelength using a color compensation kit (Röche Molecular Diagnostics), the melting points of the pig DNA could be compared with those of the human DNA for the different probe combinations. DNA, 2 melting points were recorded for each pair of probes, one for the pseudogen and one for the gene. All melting points of the pig DNA were different from those of the human DNA (FIG. 5)

Beispiel 5Example 5

In diesem Versuch wird die Speziesunterscheidung der Schweine-DNA von verschiedenen anderen Tierspezies mit einem einzigen Hybridisationssondenpaar gezeigt Dazu wurden DNAs von Rind Schaf, Zwergziege, Huhn und Pute zur Analyse herangezogen (Gensequenzen in Anlage "Zusammenstellung der Spezies- Sequenzen" unter "Sequenzen-lntron4-Exon5")In this experiment, the species differentiation of pig DNA from various other animal species is shown with a single pair of hybridization probes. For this, DNA from bovine sheep, pygmy goat, chicken and turkey was used for analysis (gene sequences in Appendix "Compilation of the species sequences" under "Sequences-Intron4 -Exon5 ")

Die vergleichende Analyse wurde durchgeführt, indem die Schmelzpunkte eines Hybridisationssondenpaares, dessen Sequenzen für das Pseudogen des Schweines im Bereich der 9 Basenpaardeletion spezifisch sind (A1/A2) und welches bereits in Beispiel 4 Verwendung fand, bestimmt wurden Für die Amplifizierung wurden die unter Beispiel 4 verwendeten Pπmer verwendet Die DNA wurde aus den Bluten der genannten Spezies mittels QIAGen Kιt(QIAGen) gewonnen und aufgereinigt Für die Real-time-PCR werden für jede Spezies ein Probenansatz mit jeweils 2μl (50 ng) der entsprechenden DNA und für eine Negativkontrolle ein Probenansatz mit 2μl Aqua dest vorgelegt In jeden Probenansatz wurde weiterhin jeweilsl μl (1 μM) der Sonde A1 und 2μl (0,2μM) der Sonde A2 pipettiert Für das Pipettieren weiterer Reagenzien in ihren Volumina und Konzentrationen und für die weiteren Reaktionsschπtte am LightCycler wurde das Vorgehen unter Beispiel 1 gewähltThe comparative analysis was carried out by determining the melting points of a hybridization probe pair, the sequences of which are specific for the pseudogen of the pig in the region of the 9 base pair deletion (A1 / A2) and which were already used in Example 4 The DNA used was obtained from the bleeds of the species mentioned using QIAGen Kιt (QIAGen) and purified. For real-time PCR, a sample batch with 2μl (50 ng) of the corresponding DNA is used for each species and a sample batch for a negative control presented with 2μl distilled water 1 μl (1 μM) of probe A1 and 2μl (0.2μM) of probe A2 were pipetted into each sample batch. The procedure was followed for pipetting further reagents in their volumes and concentrations and for further reaction steps on the LightCycler chosen under example 1

Das Vergleichen der Schmelzpunkte von der Schweine-DNA mit denen der anderen Tierspezies zeigt deutliche Unterscheidung der Schweine-DNA von den anderen Tierspezies (Figur 6) Beispiel 6Comparing the melting points of the pig DNA with those of the other animal species shows a clear distinction between the pig DNA and the other animal species (FIG. 6) Example 6

In diesem Versuch soll die Speziesunterscheidung zwischen verschiedenen Tierspezies am Beispiel folgender Spezies mit Hybridisationssonden von Beispiel 4 gezeigt werden:In this experiment, the species differentiation between different animal species is shown using the example of the following species with hybridization probes from Example 4:

Schwein, Hirsch, Hund, indischer Elefant, Forelle, Wachtel, Ente, Kropfgazelle, Maus, Meerschwein (Gensequenzen in Anlage "Zusammenstellung der Spezies- Sequenzen" unter "Sequenzen-lntron4-Exon5")Pig, deer, dog, Indian elephant, trout, quail, duck, goiter, mouse, guinea pig (gene sequences in Appendix "Compilation of the species sequences" under "Sequences-Intron4-Exon5")

Die vergleichende Analyse wurde durchgeführt, indem die Schmelzpunkte aus verschiedenen Kombinationen der Hybridisationssonden aus Beispiel 4 in den Kombinationen C1+B2, A1+B2, A1+A2, C1+A2, B1+B2 und B1+A2 bestimmt und für jede Tierspezies zu einem Panel zusammengestellt wurden.The comparative analysis was carried out by determining the melting points from various combinations of the hybridization probes from Example 4 in the combinations C1 + B2, A1 + B2, A1 + A2, C1 + A2, B1 + B2 and B1 + A2 and one for each animal species Panel were put together.

Die DNA wurde aus den Bluten der genannten Spezies mittels QIAGen Kit(QIAGen) gewonnen und aufgereinigt. Für die Amplifizierung wurden die unter Beispiel 4 aufgeführten Primer verwendet. Für den weiteren Versuchsverlauf und die anschließende Schmelzpunktanalyse wurde das Vorgehen, erweitert durch die zusätzlichen Sondenkombinationen und größere Anzahl an Spezies, unter Beispiel 4 gewählt.The DNA was obtained from the bleeds of the species mentioned using the QIAGen Kit (QIAGen) and purified. The primers listed in Example 4 were used for the amplification. For the further course of the experiment and the subsequent melting point analysis, the procedure, expanded by the additional probe combinations and larger number of species, was chosen under Example 4.

Für jede Spezies wurde ein Panel ihrer Schmelzpunkte für die entsprechenden Sondenkombinatioπen zusammengestellt (Figur 7). Durch Vergleich der Panel der verschiedenen Spezies resultiert eine Unterscheidung jeder Spezies von den anderen in mindestens einem Schmelzpunkt.For each species, a panel of their melting points was put together for the corresponding probe combinations (FIG. 7). By comparing the panels of the different species, a distinction of each species from the others results in at least one melting point.

In Figur 8 sind die Mittelwertkun/en, die für ausgewählte Sondenkombinationen (C1+C2/ A1+A2/ B1+A2 und A1+C2 aus je 15 Schweine-DNAs und C1+C2/ A1+A2/ B1+A2 und C1+A2 aus je 15 Menschen-DNAs) ermittelt wurden, mit den entsprechenden Standardabweichungen dargestellt. Die Versuchsdurchführung entspricht dem Beispiel 4.In Figure 8 are the mean values for selected probe combinations (C1 + C2 / A1 + A2 / B1 + A2 and A1 + C2 from 15 pig DNAs each and C1 + C2 / A1 + A2 / B1 + A2 and C1 + A2 from 15 human DNAs) were determined with the corresponding standard deviations. The experimental procedure corresponds to example 4.

Desweiteren sind im Anhang unter der "Zusammenstellung der Spezies-Sequenzen" die Sequenzen der untersuchten Spezies für die Exon 1-9 und der 5^'-untranslatierten Region des PTEN/MMAC1 Gens, des Pseudogens und ihrer Homologe aufgeführt. Diese Beispiele für verschiedene Sondenkombinations-Panel können durch eine beliebige Anzahl von Sonden und Primer für das beschriebene Gen PTEN/MMAC1 , des Pseudogens und ihrer Homologe, aber auch für alle anderen Gene, erweitert und angewendet werden. Eine lineare Zunahme der Pπmer und Sondenkombinationen im gesamten Genom ergibt einen exponentiellen Zuwachs an Unterscheidungsmoglichkeiten verschiedenster Spezies untereinander Durch den Einsatz von sequenzspezifischen Sonden und mehreren und/oder beliebig vielen Sondenkombinationen kann eine Spezies durch ihr ganz spezifisches Schmelzpunktpanel von allen anderen Spezies unterschieden werdenFurthermore, the sequences of the examined species for exon 1-9 and the 5 ^' untranslated region of the PTEN / MMAC1 gene, the pseudogen and their homologs are listed in the appendix under "Compilation of the species sequences". These examples of different probe combination panels can be expanded and used by any number of probes and primers for the described gene PTEN / MMAC1, the pseudogen and its homologues, but also for all other genes. A linear increase in the number and combination of probes in the entire genome results in an exponential increase in the possibility of differentiation of different species from one another. By using sequence-specific probes and several and / or any number of combinations of probes, a species can be distinguished from all other species by its very specific melting point panel

Literaturliterature

Steck, P A , Pershouse, M A , Jasser, S A , Yung, W K.A , Lin, H , Ligon, A H , Langford, L A , Baumgard, M L , Hattier, Th , Davis, T , Frye, Ch Hu, R , Swedlund, B , Teng, D H F , and Tavtigian, S V (1997) Identification of a candidate tumor suppressor gene, MMAC1, at chromosome 10q23 3 that is mutated in multiple advanced cancers Nat Genet 15 356-362Steck, PA, Pershouse, MA, Jasser, SA, Yung, W KA, Lin, H, Ligon, AH, Langford, LA, Baumgard, ML, Hattier, Th, Davis, T, Frye, Ch Hu, R, Swedlund, B, Teng, DHF, and Tavtigian, SV (1997) Identification of a candidate tumor suppressor gene, MMAC1, at chromosome 10q23 3 that is mutated in multiple advanced cancers Nat Genet 15 356-362

Wittwer C T , Herrmann, M G , Moss A A , and Rasmussen, R P (1997) Continuous fluorescence monitoπng of rapid cycle DNA amplification BioTechniques 22 130-138Wittwer C T, Herrmann, M G, Moss A A, and Rasmussen, R P (1997) Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification BioTechniques 22 130-138

Wittwer, C T , Rme, K M , Andrew, R V David D A , Gundry R A and Balis, U J (1997) The LightCycler™ A mikrovolume multisample fluoπmeter with rapid temperatur control BioTechniques 176-181Wittwer, C T, Rme, K M, Andrew, R V David D A, Gundry R A and Balis, U J (1997) The LightCycler ™ A mikrovolume multisample fluoπmeter with rapid temperature control BioTechniques 176-181

Lay M J and Wittwer, C T (1997) Real-time fluorescence genotypmg of factor V Leiden duπng rapid-cycle PCR Clinical Chemestry 43 12, 2262-2267Lay M J and Wittwer, C T (1997) Real-time fluorescence genotypmg of factor V Leiden duπng rapid-cycle PCR Clinical Chemestry 43 12, 2262-2267

Bernard, P S , Lay M J and Wittwer C T (1998) Integreated amplification and detection of the C677T pomt mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase gene by fluorescence resonance energy transfer and probe meltmg curves Analytical biochemestry 255 101-107Bernard, PS, Lay MJ and Wittwer CT (1998) Integrated amplification and detection of the C677T pomt mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase gene by fluorescence resonance energy transfer and probe meltmg curves Analytical biochemestry 255 101-107

Riπe, K M , Rasmussen, R P and Wittwer, C T (1997) Product differentation by analysis of DNA meltmg curves duπng the Polymerase Chain reaction Analytical Biochemestry 245 154-160Riπe, K M, Rasmussen, R P and Wittwer, C T (1997) Product differentation by analysis of DNA meltmg curves duπng the Polymerase Chain reaction Analytical Biochemestry 245 154-160

Bernard, P S , Pntham, G H , and Wittwer, C T (1999) Color multiplexing hybπdization probes using the Apolipoprotein E locus as a model System for genotyping Analytical Biochemestry 273 221-228Bernard, P S, Pntham, G H, and Wittwer, C T (1999) Color multiplexing hybπdization probes using the Apolipoprotein E locus as a model System for genotyping Analytical Biochemestry 273 221-228

Nauck, M , Wieland, H and März, W (1999) Rapid, homogeneous genotyping of the 4G/5G polymorphism in the promotor region of the PAI I gene by fluorescence resonance energy transfer and probe meltmg curves Clinical Chemestry 45 8, 1141-1147Nauck, M, Wieland, H and März, W (1999) Rapid, homogeneous genotyping of the 4G / 5G polymorphism in the promotor region of the PAI I gene by fluorescence resonance energy transfer and probe meltmg curves Clinical Chemestry 45 8, 1141-1147

Nauck, M S , Gierens, H , Nauck, M A , März, W and Wieland, H (1999) Rapid genotyping of human platelet antigenl (HPA-1) with fluorophore- labelled hybπdization probes on the LightCycler™ Bπtish Journal of Haematology 105 803-810Nauck, MS, Gierens, H, Nauck, MA, March, W and Wieland, H (1999) Rapid genotyping of human platelet antigenl (HPA-1) with fluorophore-labeled hybridization probes on the LightCycler ™ Bπtish Journal of Haematology 105 803- 810

Kreuzer K -A , Lass U , Bohn A Landt O and Schmidt C A (1999) LightCycler technology for the quantitation of brc/abl fusion transcπpts Cancer Research 59 3171-3174Kreuzer K -A, Lass U, Bohn A Landt O and Schmidt C A (1999) LightCycler technology for the quantitation of brc / abl fusion transcπpts Cancer Research 59 3171-3174

Kyger, E M , Krevolin, M D and Powell M J (1998) Detection of the hereditary hemochromatosis gene mutation by real-time fluorescence polymerase chain reaction and peptide nucleic acid clamping Analytical Biochemistry 260 142- 148Kyger, E M, Krevolin, M D and Powell M J (1998) Detection of the hereditary hemochromatosis gene mutation by real-time fluorescence polymerase chain reaction and peptide nucleic acid clamping Analytical Biochemistry 260 142-148

Mangasser-Stephan, K Tag, C , Reiser, A and Gressner A M (1999) Rapid genotyping of hemochromatosis gene mutations on the LightCycler with fluorescent hybπdisation probes Clinical Chemistry 45 10 1875-1881 Asiandis, O, Nauck, M., Schmitz and G. (1999) High-speed prothrombin G to 20210 and methylenetetrahydrofolate reductase C to 677 mutation detection using real-time fluorescence PCR and melting curves. BioTechniques 27: 234- 238 Mangasser-Stephan, K Tag, C, Reiser, A and Gressner AM (1999) Rapid genotyping of hemochromatosis gene mutations on the LightCycler with fluorescent hybridization probes Clinical Chemistry 45 10 1875-1881 Asiandis, O, Nauck, M., Schmitz and G. (1999) High-speed prothrombin G to 20210 and methylenetetrahydrofolate reductase C to 677 mutation detection using real-time fluorescence PCR and melting curves. BioTechniques 27: 234-238

Anhangattachment

Zusammenstellung - Figuren 1-8:Compilation - Figures 1-8:

Figur 1 : Schematische Darstellung des Verfahrens zurFigure 1: Schematic representation of the method for

Identifizierung von Organismen gemäß Beispiel 1Identification of organisms according to example 1

Figur 2: Vergleich der ermittelten Sequenzen vom Mensch und afrikanischen Elefant gemäß Beispiel 1Figure 2: Comparison of the determined sequences of humans and African elephants according to Example 1

Figur 3: DNA-Sequenzvergleich eines Schweines mit käuflich erworbener Schweineleber und Rindersalami gemäß Beispiel 2. Die Unterschiede der Nukleotidsequenzen sind dargestellt. Auffallig ist die 9-Basenpaar große Deletion (nukleotide 216-224) beim Schwein / Schweineleber.Figure 3: DNA sequence comparison of a pig with commercially available pig liver and bovine salami according to Example 2. The differences in the nucleotide sequences are shown. The 9-base pair large deletion (nucleotides 216-224) in the pig / pig liver is striking.

Figur 4: Positionen der Hvbridisationssonden im Exon 5 des PTEVFigure 4: Positions of the hybridization probes in exon 5 of the PTEV

Gens, Pseudogens und ihrer HomologeGens, pseudogens and their homologues

Figur 5: Beispiel 4 - Schmelzpunkt-Panel von Schwein und MenschFigure 5: Example 4 - melting point panel of pig and human

Figur 6: Beispiel s - Schmelzpunkte der Sondenkombination AI +Figure 6: Example s - melting points of the probe combination AI +

A2 beim Schwein im Vergleich zu verschiedenen SpeziesA2 in pigs compared to different species

Figur 7: Beispiel 6 - Schmelzpunkt-Panel verschiedener SpeziesFigure 7: Example 6 - Melting point panel of different species

Figur 8: Standardabweichungen ausgewählter Sonden für SchweinFigure 8: Standard deviations of selected probes for pigs

(HS) und Mensch (WT) (HS) and people (WT)

Claims

Patentansprüche claims

1. Verfahren zur Identifizierung von Organismen durch vergleichende genetische Analyse, dadurch gekennzeichnet, daß man kodierende und/oder nichtkodierenden Bereiche und/oder funktioneil bedeutende Bereiche hochkonseπtierter Gene und/oder deren homologe Gene, und/oder deren cDNA-Abschriften und/oder deren Pseudogene mit Hilfe der PCR amplifiziert und nachfolgend genotypisiert und analysiert.1. A method for identifying organisms by comparative genetic analysis, characterized in that coding and / or non-coding areas and / or functionally significant areas of highly-construed genes and / or their homologous genes, and / or their cDNA transcripts and / or their pseudogenes amplified with the help of PCR and subsequently genotyped and analyzed.

2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß jeweils für einen bestimmten Abschnitt des hochkonservierten Gens jeweils ein Primerpaar benutzt wird, das in der hochkonservierten Exonregion und/oder nichtkodierenden Bereichen und/oder funktioneil bedeutenden Bereichen und/oder im 5'- oder 3'- untranslatierten Bereich des Gens liegt und bei möglichst vielen, bevorzugt allen untersuchten Spezies-DNAs bindet und die Amplifikation des entsprechenden Genbereiches ermöglicht.2. The method according to claim 1, characterized in that in each case a primer pair is used for a certain section of the highly conserved gene, which in the highly conserved exon region and / or non-coding areas and / or functionally significant areas and / or in the 5 'or 3rd '- is the untranslated region of the gene and binds to as many, preferably all, of the examined species DNAs and enables the amplification of the corresponding gene region.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Primern liegende kodierende und/oder nichtkodierende Bereiche, die entweder hochvariante Intronbereiche und/oder Variante Exonbereiche oder 5'- oder 3'- untranslatierte Bereiche des Gens sind, bezüglich ihrer Sequenz analysiert und durch Vergleich mit den speziesspezifischen Sequenzvarianten identifiziert werden.3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that lying between the primers coding and / or non-coding regions, which are either highly variant intron regions and / or variant exon regions or 5'- or 3'- untranslated regions of the gene, with regard to their sequence analyzed and identified by comparison with the species-specific sequence variants.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß entweder der Sense- oder der Antisensestrang jeglicher Spezies-DNA oder auch deren PCR-Abschriften für die Identifizierung verwendet werden.4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that either the sense or the antisense strand of any species DNA or their PCR transcripts are used for identification.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß vorzugsweise Animalia identifiziert werden. 5. The method according to claim 1 to 4, characterized in that preferably Animalia are identified.

6 Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß vorzugsweise Vertebraten identifiziert werden6 The method according to claim 1 to 4, characterized in that vertebrates are preferably identified

7 Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß vorzugsweise Saugetiere identifiziert werden7 The method according to claim 1 to 4, characterized in that preferably mammals are identified

8 Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß vorzugsweise Pflanzen identifiziert werden8. The method according to claim 1 to 4, characterized in that preferably plants are identified

9 Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Genotypisierung durch DNA-Sequenzierung, jegliche Hybndisierungsverfahren, Restriktionsfragmentlangenanalysen, chromatographische Verfahren, spektroskopische und insbesondere massenspektroskopische Verfahren, allelspezifische PCR oder durch andere Methoden, die für den Nachweis von DNA- Sequenz-Vananten geeignet sind, erfolgt9. The method according to claim 1 to 4, characterized in that the genotyping by DNA sequencing, any hybridization method, restriction fragment length analyzes, chromatographic methods, spectroscopic and in particular mass spectroscopic methods, allele-specific PCR or by other methods for the detection of DNA sequence vanants are suitable

10 Verfahren nach Anspruch 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, daß Exon- und/oder Intronbereiche sowie funktioneil bedeutsame Bereiche des hochkonservierten Tumorsuppressorgens PTEN/MMAC1 und dessen Homologe zur Amplifikation und anschließender genetischer Analyse verwendet werden10 The method according to claim 1 to 4, characterized in that exon and / or intron areas and functionally important areas of the highly conserved tumor suppressor PTEN / MMAC1 and its homologs are used for amplification and subsequent genetic analysis

11 Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, bei dem cDNA-Abschnften des PTEN/MMAC1 Gens und dessen Homologe zur genetischen Analyse verwendet werden11. The method according to claim 1 to 4, in which cDNA sections of the PTEN / MMAC1 gene and its homologs are used for genetic analysis

12 Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, bei dem Pseudogene oder Abschnitte von Pseudogenen des PTEN/MMAC1 Gens und dessen Homologe zur genetischen Analyse verwendet werden12. The method according to claims 1 to 4, in which pseudogenes or sections of pseudogenes of the PTEN / MMAC1 gene and its homologs are used for genetic analysis

13 Verfahren nach Anspruch 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet daß vorzugsweise nebeneinander angeordnete Exons des PTEN/MMAC1 Gens und dessen Homologe und/oder die an die Exons anschließenden Teile des Introns genetisch analysiert werden 13. The method according to claim 1 to 4, characterized in that preferably arranged side by side exons of the PTEN / MMAC1 gene and its homologs and / or the parts of the intron adjoining the exons are genetically analyzed

14 Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Exonbereiche 1 und 2 und/oder 3 und 4 und/oder 4 und 5 und/oder 5 und 6 und/oder14 The method according to claim 1 to 4, characterized in that the exon regions 1 and 2 and / or 3 and 4 and / or 4 and 5 and / or 5 and 6 and / or

6 und 7 und/oder 7 und 8 und/oder 8 und 9 mit den eingeschlossenen Intronbereichen 1 und/oder 2 und/oder 3 und/oder 4 und/oder 5 und/oder 6 und/oder6 and 7 and / or 7 and 8 and / or 8 and 9 with the enclosed intron regions 1 and / or 2 and / or 3 and / or 4 and / or 5 and / or 6 and / or

7 und/oder 8 sowie die 5'- und 3'-untranslatιerten Regionen des PTEN/MMAC1 Gens und deren Homologe zur genetischen Analyse verwendet werden7 and / or 8 and the 5'- and 3'-untranslated regions of the PTEN / MMAC1 gene and their homologs are used for genetic analysis

15 Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Bereiche hochkonservierter Gene und/oder Pseudogene und deren Homologe auswählt, als Primer geeignete Oligonukleotide konstruiert, die an die entsprechenden komplementären kodierenden und/oder nichtkodierenden Bereiche und/oder funktioneil bedeutenden Bereiche anlagern, mittels einer geeigneten Technik amplifiziert und durch genetische Analyse die Sequenz des jeweiligen kodierenden und/oder nichtkodierenden Bereiches bei verschiedenen Spezies vergleichend analysiert15. The method according to claim 1 to 4, characterized in that one selects areas of highly conserved genes and / or pseudogens and their homologues, constructs suitable oligonucleotides as primers which attach to the corresponding complementary coding and / or non-coding areas and / or functionally important areas, amplified using a suitable technique and comparative analysis of the sequence of the respective coding and / or non-coding region in different species by genetic analysis

16 Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man Bereiche des PTEN/MMAC1 -Gens und/oder des Pseudogens und ihrer Homologe auswählt16 The method according to claim 15, characterized in that one selects regions of the PTEN / MMAC1 gene and / or the pseudogen and their homologs

17 Verfahren nach Anspruch 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß man unterschiedliche Sequenzabschnitte jedes einzelnen Exons, Introns oder untranslatierter Region des PTEN/MMAC1 -Gens und deren Homologen bzw die entsprechende cDNA auswählt17 The method according to claim 15 and 16, characterized in that one selects different sequence segments of each individual exon, intron or untranslated region of the PTEN / MMAC1 gene and their homologues or the corresponding cDNA

18 Verfahren nach Anspruch 1 bis 17 dadurch gekennzeichnet, daß eine Genctyp!S!e.^rung von DNA des Schweines, die bevorzugt aus Nahrungsmitteln gewonnen wird, auf der Grundlage der Gensequenzvariante von PTEN/MMAC1 , die eine 9 Basenpaar große Deletion enthalt, durchgeführt wird18 The method according to claim 1 to 17, characterized in that a genctype! S! E. ^r ung of DNA of the pig, which preferably is derived from foods is based on the Gensequenzvariante of PTEN / MMAC1, which contains a 9 base pair deletion is performed

19 Oligonukleotid-Pπmer für die PCR und die Sequenzierung von Exon 1 und/oder 5'-untranslatιerter Region des PTEN/MMAC1 Gens und seinen Homologen, gekennzeichnet durch die Sequenzen19 oligonucleotide polymer for the PCR and the sequencing of exon 1 and / or 5'-untranslated region of the PTEN / MMAC1 gene and its homologues, characterized by the sequences

PTENexl -401 sense 5^'- cccttctactgcctcca -3^' PTENexl -401 sense 5 ^' - cccttctactgcctcca -3 ^'

PTENexl -465 sense 5^'- gggagggggtctgagt - 3^' PTENexl -465 sense 5 ^' - gggagggggtctgagt - 3 ^'

PTENexl ATG sensePTENexl ATG sense

5^'- atgacagccatcatcaaaga - 3^" 5 ^' - atgacagccatcatcaaaga - 3 ^"

PTENexl R antisensePTENexl R antisense

5^'- aggtcaagtctaagtcgaatc - 3^' 5 ^' - aggtcaagtctaagtcgaatc - 3 ^'

20 Ohgonukleotid-Pπmer für die PCR und die Sequenzierung von Exon 2 des PTEN/MMAC1 Gens und seinen Homologen, gekennzeichnet durch die Sequenzen20 ohgonucleotide polymer for the PCR and the sequencing of exon 2 of the PTEN / MMAC1 gene and its homologues, characterized by the sequences

PTENex2F sensePTENex2F sense

5^'- atatttatccaaacattattgctat - 3^' 5 ^' - atatttatccaaacattattgctat - 3 ^'

PTENex2R antisensePTENex2R antisense

5^' - cttactacatcatcaatattgttcc - 3^' 5 ^' - cttactacatcatcaatattgttcc - 3 ^'

21 Oligonukleotid-Pπmer für die PCR und die Sequenzierung von Exon 4, Intron 4 und Exon 5 des PTEN/MMAC1 Gens und seinen Homologen, gekennzeichnet durch die Sequenzen21 oligonucleotide polymer for the PCR and the sequencing of exon 4, intron 4 and exon 5 of the PTEN / MMAC1 gene and its homologues, characterized by the sequences

Zoo43sUV senseZoo43sUV sense

5^'- tgtgctgagagacattatgac-3^* 5 ^' - tgtgctgagagacattatgac-3 ^*

SPL5 sense 5^"-aaatttaattgcagaggt-3^' SPL5 sense 5 ^" -aaatttaattgcagaggt-3 ^'

Zoo44aRV antisense 5^'- ttgtctctggtccttacttc-3 Zoo44aRV antisense 5 ^' - ttgtctctggtccttacttc-3

22 Oligonukleotid-Pnmer für die PCR und die Sequenzierung von Exon 5 des22 oligonucleotide pnmer for the PCR and sequencing of exon 5 des

PTEN/MMAC1 Gens und seinen Homologen, gekennzeichnet durch die SequenzenPTEN / MMAC1 gene and its homologues, characterized by the sequences

PTEN se sense 5^'-atcttgaccaatggctaagtg-3^" PTEN se sense 5 ^' -atcttgaccaatggctaagtg-3 ^"

Zoo44aRV antisense 5^'- ttgtctctggtccttacttc-3^' Zoo44aRV antisense 5 ^' - ttgtctctggtccttacttc-3 ^'

23 Oligonukleotid-Pnmer für die PCR und die Sequenzierung von Exon 6 des PTEN/MMAC1 Gens und seinen Homologen, gekennzeichnet durch die Sequenzen23 oligonucleotide pnmer for the PCR and the sequencing of exon 6 of the PTEN / MMAC1 gene and its homologues, characterized by the sequences

PTENex6F sensePTENex6F sense

5^"-gga gta act att ccc agt cag ag -3^" 5 ^" -gga gta act att ccc agt cag ag -3 ^"

PTENex6R antisense 5^'-gca agt tcc gcc act gaa-3^' PTENex6R antisense 5 ^' -gca agt tcc gcc act gaa-3 ^'

24 Oligonukleotid-Pnmer für die PCR und die Sequenzierung von Exon 7 des PTEN/MMAC1 Gens und seinen Homologen, gekennzeichnet durch die Sequenzen24 oligonucleotide pnmer for the PCR and the sequencing of exon 7 of the PTEN / MMAC1 gene and its homologues, characterized by the sequences

PTENex7F sensePTENex7F sense

5^'-cct cag ttt gtg gtc tgc ca-35 ^' -cct cag ttt gtg gtc tgc ca-3

PTENex7R antisensePTENex7R antisense

5^'-c ctt ttt tag cat ctt gtt ctg ttt-3^' 5 ^' -c ctt ttt tag cat ctt gtt ctg ttt-3 ^'

25 Oligonukleotid-Pnmer für die PCR und die Sequenzierung von Exon 8 des PTEN/MMAC1 Gens und seinen Homologen, gekennzeichnet durch die Sequenzen25 oligonucleotide pnmer for the PCR and the sequencing of exon 8 of the PTEN / MMAC1 gene and its homologues, characterized by the sequences

PTENexδF sensePTENexδF sense

5^{^}-caa aat gtt tca ctt ttg ggt aaa-3^' PTENexδR antisense5 ^{^} -caa aat gtt tca ctt ttg ggt aaa-3 ^' PTENexδR antisense

5^' -taa aat ttg gag aaa agt atc ggt t-3^' 5 ^' -taa aat ttg gag aaa agt atc ggt t-3 ^'

26. Oligonukleotid-Primer für die PCR und die Sequenzierung von Exon 9 des PTEN/MMAC1 Gens und seinen Homologen, gekennzeichnet durch die Sequenzen:26. Oligonucleotide primer for the PCR and the sequencing of exon 9 of the PTEN / MMAC1 gene and its homologues, characterized by the sequences:

PTENexθF sensePTENexθF sense

5^*-gtg aag ctg tac ttc aca aaa ac-3^' 5 ^* -gtg aag ctg tac ttc aca aaa ac-3 ^'

PTENexθtga antisensePTENexθtga antisense

5^'-aaa aaa att cag act ttt gta att tg -3^' 5 ^' -aaa aaa att cag act ttt gta att tg -3 ^'

27. Verfahren nach Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man für die DNA-Amplifikation eine Mischung von Oligonukleotiden verwendet, die sich am 3^'- Bereich des Oligonukleotids in ihrer Länge um ein oder mehrere Nukleotide unterscheiden oder die hinsichtlich ihrer Nukleotidsequenz am 3^'- Ende des Oligonukleotids an einer oder mehreren Positionen unterschiedlich sind.27. The method according to claim 1 to 17, characterized in that for the DNA amplification a mixture of oligonucleotides is used which differ in length at the 3 ^' region of the oligonucleotide by one or more nucleotides or which differ in terms of their nucleotide sequence on the 3rd ^' - End of the oligonucleotide at one or more positions are different.

28. Verfahren nach Anspruch 1 bis 17 und 26, bei der die Oligonukleotide sense:28. The method according to claim 1 to 17 and 26, wherein the oligonucleotides sense:

5^'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gac - 3^',5 ^' - cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gac - 3 ^' ,

5^'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat - 3^',5 ^' - cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat - 3 ^' ,

5^'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat t - 3^', antisense:5 ^' - cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat t - 3 ^' , antisense:

5^'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt c - 3^',5 ^' - cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt c - 3 ^' ,

5^'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta c - 3^',5 ^' - cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta c - 3 ^' ,

5^'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc t - 3^', zur Amplifikation verwendet werden5 ^' - cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc t - 3 ^' , can be used for amplification

29. Verfahren nach Anspruch 1 bis 17 und 26, bei der die Oligonukleotide sense:29. The method according to claim 1 to 17 and 26, wherein the oligonucleotides sense:

5^'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gaa - 3^', 5^'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gac - 3^', 5 - cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gag - 3^',5 ^' - cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gaa - 3 ^' , 5 ^' - cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gac - 3 ^' , 5 - cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gag - 3 ^' ,

5^'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gat - 3^', antisense5 ^' - cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gat - 3 ^' , antisense

5^'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt a- 3 ,5 ^' - cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt a- 3,

5^'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt c- 3^',5 ^' - cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt c- 3 ^' ,

5^'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt g - 3^',5 ^' - cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt g - 3 ^' ,

5^'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt t - 3^' zur Amplifikation benutzt werden5 ^' - cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt t - 3 ^' can be used for amplification

30 Verfahren nach Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß bei der genetischen Analyse DNA-Sequenzierungstechniken eingesetzt werden30 The method according to claim 1 to 17, characterized in that DNA sequencing techniques are used in the genetic analysis

31 Verfahren nach Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß bei der genetischen Analyse für das PTEN/MMAC1 und/oder seiner Pseudogene und ihrer Homologe DNA-Sequenzierungstechniken eingesetzt werden31 The method according to claim 1 to 17, characterized in that in the genetic analysis for the PTEN / MMAC1 and / or its pseudogenes and their homologous DNA sequencing techniques are used

32 Verfahren zur Unterscheidung der DNA verschiedener Spezies, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Hybridisationssondenpaar eingesetzt wird, die Schmelzpunkte von verschiedenen Kombinationen bestimmt und für jede Spezies zu einem Panel zusammengestellt werden32 A method for differentiating the DNA of different species, characterized in that at least one pair of hybridization probes is used, the melting points of different combinations are determined and a panel is put together for each species

33 Verfahren zur Unterscheidung der DNA verschiedener Spezies, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Hybridisationssondenpaar eingesetzt wird und mindestens ein Genabschnitt amplifiziert wird unterschiedliche Hybridisationssondenpaare an unterschiedliche Genabschnitte hybridisieren, und die Schmelzpunkte von den verschiedenen Kombinationen bestimmt und für jede Spezies zu einem Panel zusammengestellt bzw zur Identifizierung mit diesem Panel verglichen werden33 A method for differentiating the DNA of different species, characterized in that at least one pair of hybridization probes is used and at least one gene section is amplified, different pairs of hybridization probe are hybridized to different gene sections, and the melting points are determined by the different combinations and compiled for each species into a panel or for identification be compared with this panel

34 Verfahren zur Unterscheidung der DNA verschiedener Spezies nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet dass mindestens ein Hybridisationssondenpaar eingesetzt wird und mindestens ein Genabschnitt von mindestens einer Spezies amplifiziert wird unterschiedliche Hybridisationssondenpaare an unterschiedliche Genabschnitte unterschiedlicher Spezies hybridisieren, und die Schmelzpunkte von den verschiedenen Kombinationen bestimmt und für jede Spezies zu einem Panel zusammengestellt bzw. zur Identifizierung mit diesem Panel verglichen werden.34 A method for differentiating the DNA of different species according to claim 33, characterized in that at least one pair of hybridization probes is used and at least one gene section of at least one species is amplified. Different pairs of hybridization probe hybridize to different gene sections of different species, and the melting points of the different combinations are determined and compiled for each species into a panel or compared with this panel for identification.

35. Verfahren zur Unterscheidung der DNA verschiedener Spezies nach Anspruch 33 und 34, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Hybridisationssonden der SEQ Nr. 3 bis 8 eingesetzt werden, die Schmelzpunkte von den verschiedenen Kombinationen bestimmt und für jede Spezies zu einem Panel zusammengestellt werden.35. A method for differentiating the DNA of different species according to claims 33 and 34, characterized in that at least two hybridization probes of SEQ Nos. 3 to 8 are used, the melting points are determined by the different combinations and put together to form a panel for each species.

36. Verfahren nach Anspruch 33 und 34, dadurch gekennzeichnet, dass die Speziesunterscheidung der Schweine-DNA von verschiedenen anderen Spezies mit dem Hybridisationssondenpaar A1/A2 als Hybridisationssondenpaar erfolgt.36. The method according to claim 33 and 34, characterized in that the species differentiation of the pig DNA from various other species is carried out with the hybridization probe pair A1 / A2 as a hybridization probe pair.

37. Verfahren nach Anspruch 33 und 34, dadurch gekennzeichnet, dass zur Speziesunterscheidung zwischen verschiedenen Spezies die Hybridisationssonden in den Kombinationen C1/C2; A1/B2/; A1/A2; C1/A2; B1/B2; B1/A2 eingesetzt werden.37. The method according to claim 33 and 34, characterized in that for the differentiation of species between different species, the hybridization probes in the combinations C1 / C2; A1 / B2 /; A1 / A2; C1 / A2; B1 / B2; B1 / A2 can be used.

38. LightCycler-Hybridisationssonden für Exon 5. gekennzeichnet durch die Sequenzen38. LightCycler hybridization probes for exon 5. characterized by the sequences

A1 : 5^' - tgc ata ttt gtt tca tcc ggg caa att - Fluorescein - 3^' A1: 5 ^' - tgc ata ttt gtt tca tcc ggg caa att - fluorescein - 3 ^'

A2: 5^'- LC Red 705 - tta aag gca caa gat ttc tat ggg ga - ph - 3^' A2: 5 ^' - LC Red 705 - tta aag gca caa gat ttc tat ggg ga - ph - 3 ^'

B1 : 5^'- tgc ata ttt att aca tcg ggg caa att - Fluorescein - 3^' B1: 5 ^' - tgc ata ttt att aca tcg ggg caa att - fluorescein - 3 ^'

B2: 5^'- LC Red 640 - aag gca caa gag gcc cta gat ttc ta -ph - 3^' B2: 5 ^' - LC Red 640 - aag gca caa gag gcc cta gat ttc ta -ph - 3 ^'

C1 : 5^' - tgc ata ttt gtt aca tcg ggg taa att - Fluorescein - 3^' C1: 5 ^' - tgc ata ttt gtt aca tcg ggg taa att - fluorescein - 3 ^'

C2: 5^'- LC Red 640 - aag gca caa gag gcc cta gat ttc ta -ph - 3^' C2: 5 ^' - LC Red 640 - aag gca caa gag gcc cta gat ttc ta -ph - 3 ^'

39. LightCycler-Hybridisationssonden für Exon 6, gekennzeichnet durch die Sequenzen39. LightCycler hybridization probes for exon 6, characterized by the sequences

PTENexδFLPTENexδFL

5^'- tca tct gga tta tag acc agt ggc act - Fluorescein - 3^' PTENex6LC 6405 ^' - tca tct gga tta tag acc agt ggc act - Fluorescein - 3 ^' PTENex6LC 640

5^"- LC Red 640- ttc aca aga tga tgt ttg aaa cta ttc caa- ph-3^' 5 ^" - LC Red 640- ttc aca aga tga tgt ttg aaa cta ttc caap-3 ^'

PTENex6F^* PTENex6F ^*

5 - gtg cca ctg gtc tat aat cca gat- Fluorescein - 3^' 5 - gtg cca ctg gtc tat aat cca gat- fluorescein - 3 ^'

PTENexβL^* 705PTENexβL ^* 705

5^N- LC Red 705- ttc ttt aac agg tag cta taa taa tac aca ta- ph - 3^' 5 ^N - LC Red 705- ttc ttt aac agg tag cta taa taa tac aca ta- ph - 3 ^'

40. LightCycler-Hybridisationssonden für Exon 7, gekennzeichnet durch die Sequenzen40. LightCycler hybridization probes for exon 7, characterized by the sequences

PTENex7F^* PTENex7F ^*

5^'- taa agg tga aga tat att cct cca att ca - Fluorescein - 3^' 5 ^' - taa agg tga aga tat att cct cca att ca - fluorescein - 3 ^'

PTENex7L*640PTENex7L * 640

5^'- LC Red 640- acc cac acg acg gga aga caa g - ph - 3^' 5 ^' - LC Red 640- acc cac acg acg gga aga caa g - ph - 3 ^'

PTENex7 FLPTENex7 FL

5^"- ggtaacggctgagggaactcaaagtac - Fluorescein - 3^' 5 ^" - ggtaacggctgagggaactcaaagtac - fluorescein - 3 ^'

PTENex7 LC (705-markiert)PTENex7 LC (705 marked)

5^'- LC Red 705- tgaacttgtcttcccgtcgtgtgg- ph - 3^' 5 ^' - LC Red 705- tgaacttgtcttcccgtcgtgtgg- ph - 3 ^'

41. LightCycler-Hybridisationssonden für Exon 8, gekennzeichnet durch die Sequenzen41. LightCycler hybridization probes for exon 8, characterized by the sequences

PTENexδF^* PTENexδF ^*

5^'- tga caa gga ata tct agt act tac ttt aac aaa - Fluorescein - 3^' 5 ^' - tga caa gga ata tct agt act tac ttt aac aaa - fluorescein - 3 ^'

PTENexδL^* 705PTENexδL ^* 705

5^'- LC Red 705- ctt gac aaa gca aat aaa gac aaa gc- ph - 3^' PTENexδ FLU5 ^' - LC Red 705- ctt gac aaa gca aat aaa gac aaa gc- ph - 3 ^' PTENexδ FLU

5^"- tgctatcgatttcttgatcacatagacttccatttt - Fluorescein - 3^' 5 ^" - tgctatcgatttcttgatcacatagacttccatttt - Fluorescein - 3 ^'

PTENexδ LCR (640-markιert)PTENexδ LCR (640 markers)

5^'- LC Red 640- actttttctgaggtttcctctggtcctggtat - ph - 3^' 5 ^' - LC Red 640- actttttctgaggtttcctctggtcctggtat - ph - 3 ^'

42 LightCycler-Hybridisationssonden für Exon 9, gekennzeichnet durch die Sequenzen42 LightCycler hybridization probes for exon 9, characterized by the sequences

PTENex9 FLPTENex9 FL

5^'- aac atc tgg tgt tac aga agt tga act gct - Fluorescein - 3^' 5 ^' - aac atc tgg tgt tac aga agt tga act gct - fluorescein - 3 ^'

PTENexθ LC 640PTENexθ LC 640

5^'- LC-640- cct ctg gat ttg acg gct cct cta et - ph - 3^' 5 ^' - LC-640- cct ctg gat ttg acg gct cct cta et - ph - 3 ^'

43 Hybndisationssondenpaar A1/A2 spezifisch für PTEN-Pseudogen Schwein gekennzeichnet durch die43 Hybridization probe pair A1 / A2 specific for PTEN pseudogenic pig characterized by the

SEQ Nr 3 A1 5^' - tgc ata ttt gtt tca tcc ggg caa att - Fluorescein - 3SEQ No. 3 A1 5 ^' - tgc ata ttt gtt tca tcc ggg caa att - Fluorescein - 3

SEQ Nr 4 A2 5^'- LC Red 705 - tta aag gca caa gat ttc tat ggg ga - ph - 3SEQ No. 4 A2 5 ^' - LC Red 705 - tta aag gca caa gat ttc tat ggg ga - ph - 3

44 Hybndisationssondenpaar B1/B2 spezifisch für Pseudogen Mensch gekennzeichnet durch die44 Hybridization probe pair B1 / B2 specific for pseudogene humans characterized by the

SEQ Nr 5 B1 5^'- tgc ata ttt att aca tcg ggg caa att - Fluorescein - 3SEQ No. 5 B1 5 ^' - tgc ata ttt att aca tcg ggg caa att - Fluorescein - 3

SEQ Nr 6 B2 5 - LC Red 640 - aag gca caa gag gcc cta gat ttc ta -ph - 3SEQ No. 6 B2 5 - LC Red 640 - aag gca caa gag gcc cta gat ttc ta -ph - 3

45 Hybndisationssondenpaar C1/C2 spezifisch für PTEN-Pseudogen Mensch (C2) und Homolog des Schweins (C1 ) gekennzeichnet durch die45 Hybridization probe pair C1 / C2 specific for PTEN pseudogene human (C2) and homologue of the pig (C1) characterized by the

SEQ Nr 7 - C1 5 - tgc ata ttt gtt aca tcg ggg taa att - Fluorescein - 3 SEQ Nr 8 - C2 entspricht Sonde B2SEQ No. 7 - C1 5 - tgc ata ttt gtt aca tcg ggg taa att - Fluorescein - 3 SEQ No. 8 - C2 corresponds to probe B2

46 DNA-Sequenzen und/oder Fragmente von Homologen des PTEN/MMAC1 Gens und/oder der Homologen des PTEN/MMAC1 Pseudogens, die Proteine codieren, die an der Zell-Zell-Adhasion und der Zellzyklusregulation beteiligt sind sowie eine unverzichtbare Funktion in der Embryogenese der jeweiligen Spezies haben und die im Anhang unter "Zusammenstellung der Speziessequenzen" zusammengestellt46 DNA sequences and / or fragments of homologues of the PTEN / MMAC1 gene and / or homologues of the PTEN / MMAC1 pseudogen, which encode proteins which are involved in cell-cell adhesion and cell cycle regulation and an indispensable function in embryogenesis of the respective species and compiled them in the appendix under "Compilation of the species sequences"

47 DNA-Sequenzen von Homologen des PTEN/MMAC1 Gens und/oder von Homologen des PTEN/MMAC1 Pseudogens, die im Anhang unter "Zusammenstellung der Speziessequenzen" zusammengestellt sind, welche im Vergleich zum PTEN/MMAC1 Gen und/oder dem PTEN/MMAC1 Pseudogen genetische Varianten wie Basenaustausche und/oder Insertionen und/oder Deletionen aufweisen und zur Identifizierung entsprechender Spezies geeignet sind47 DNA sequences of homologues of the PTEN / MMAC1 gene and / or of homologues of the PTEN / MMAC1 pseudogen, which are compiled in the appendix under "Compilation of the species sequences", which are compared to the PTEN / MMAC1 gene and / or the PTEN / MMAC1 pseudogen have genetic variants such as base exchanges and / or insertions and / or deletions and are suitable for identifying corresponding species

48 Besteck (Kit) zur Durchfuhrung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 18 sowie weiterer Ansprüche enthaltend a) ein oder mehrere Gefäße mit PCR- und/oder Sequenzierungsoligonukleotiden, die an hochkonservierten Genen binden, wobei die Oligonukleotide gegebenfalls radioaktiv oder mittels eines Farbstoffes oder andersartig markiert sind b) Gefäße mit weiteren gebrauchlichen Reagenzien für die DNA-Amplifizierung und/oder DNA-Analyse, insbesondere für die DNA-Sequenzierung und48 cutlery (kit) for performing the method according to claim 1 to 18 and further claims containing a) one or more tubes with PCR and / or sequencing oligonucleotides that bind to highly conserved genes, the oligonucleotides optionally radioactive or by means of a dye or otherwise labeled are b) tubes with other useful reagents for DNA amplification and / or DNA analysis, in particular for DNA sequencing and

c) ein Gefäß mit einer Kontroll-DNA, die zum Testen der Oligonukleotide und der Reaktionsbedingungen geeignet istc) a vessel with a control DNA which is suitable for testing the oligonucleotides and the reaction conditions

49 Besteck (Kit) nach Anspruch 48 zur Durchfuhrung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 18 sowie weiterer Ansprüche enthaltend a) ein oder mehrere Gefäße mit PCR- und/oder Sequenzierungs-Oligonukieotiden gemäß den Ansprüchen 19-26 49 cutlery (kit) according to claim 48 for performing the method according to claim 1 to 18 and further claims containing a) one or more tubes with PCR and / or sequencing oligonucleotides according to claims 19-26

50. Besteck (Kit) zur Identifikation von Spezies zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 18 sowie weiterer Ansprüche enthaltend:50. Cutlery (kit) for identifying species for carrying out the method according to claims 1 to 18 and further claims containing:

a) ein Gefäß mit einem Oligonukleotidpaar mit folgenden Sequenzen:a) a vessel with an oligonucleotide pair with the following sequences:

5^'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gac - 3^' und 5^'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt c - 3^',5 ^' - cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gac - 3 ^' and 5 ^' - cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt c - 3 ^' ,

b) zwei Gefäße mit jeweils einem der folgenden Sequenzierungsoligonukleotide, wobei diese Oligonukleotide gegebenfalls radioaktiv oder mittels eines Farbstoffes oder andersartig markiert sind:b) two vessels, each with one of the following sequencing oligonucleotides, these oligonucleotides optionally being radioactive or labeled with a dye or otherwise:

5^'- cag gaa aca gct atg ac - 3^' und 5^'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt - 3^'.5 ^' - cag gaa aca gct atg ac - 3 ^' and 5 ^' - cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt - 3 ^' .

c) ein Gefäß mit einer Kontroll-DNA, die zum Testen der Oligonukleotide und der Reaktionsbedingungen geeignet ist.c) a vessel with a control DNA which is suitable for testing the oligonucleotides and the reaction conditions.

51. Besteck (Light Cycler Kit) zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 32 bis 37 sowie weiterer Ansprüche, enthaltend a) ein oder mehrere Gefäße mit PCR-Primern und Hybridisationssonden, die an hochkonservierten Genen binden, wobei die Hybridisationssonden gegebenfalls mittels eines Farbstoffs markiert sind, b) Gefäße mit weiteren gebräuchlichen Reagenzien für die DNA-Amplifizierung und/oder DNA-Analyse, insbesondere für die Light Cycler Analyse und b) ein Gefäß mit einer Kontroll-DNA, die zum Testen der Oligonukleotide und der Reaktionsbediπgungen geeignet ist.51. Cutlery (light cycler kit) for performing the method according to claim 32 to 37 and further claims, containing a) one or more vessels with PCR primers and hybridization probes that bind to highly conserved genes, the hybridization probes being marked with a dye if necessary , b) tubes with other customary reagents for DNA amplification and / or DNA analysis, in particular for light cycler analysis, and b) a tube with a control DNA which is suitable for testing the oligonucleotides and the reaction conditions.

52. Besteck (Light Cycler Kit) zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 32 bis 37 sowie weiterer Ansprüche, enthaltend: a) ein oder mehrere Gefäße mit PCR-Primern und Hybridisationssonden gemäß den Ansprüchen 38 bis 42. 52. Cutlery (light cycler kit) for carrying out the method according to claims 32 to 37 and further claims, comprising: a) one or more vessels with PCR primers and hybridization probes according to claims 38 to 42.