DE19821843A1 - Preparation of autologous human blood cytokine(s) - Google Patents
Preparation of autologous human blood cytokine(s)Info
- Publication number
- DE19821843A1 DE19821843A1 DE19821843A DE19821843A DE19821843A1 DE 19821843 A1 DE19821843 A1 DE 19821843A1 DE 19821843 A DE19821843 A DE 19821843A DE 19821843 A DE19821843 A DE 19821843A DE 19821843 A1 DE19821843 A1 DE 19821843A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- cells
- aliquot
- blood
- tumor
- cytokines
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
- A61K38/217—IFN-gamma
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Humaneigenblutzytokinen, ein durch dieses Verfahren erhältliches Produkt sowie dessen Verwendung zur Behand lung und Diagnose von Krankheiten.The invention relates to a method for producing Human autologous blood cytokines, one by this procedure available product and its use for treatment development and diagnosis of diseases.
Es ist bekannt, daß eine Vielzahl von Menschen im Laufe ihres Lebens an Tumoren erkranken und daran sterben. Bei einem Tumor handelt es sich um ursprünglich körpereigene Zellen, die durch die verschiedensten Einflüsse zu Tumor zellen entarten können. Solche Zellen weisen ein abnormales Zellwachstum auf, das letztendlich auf gesunde Zellen destruktiv wirkt.It is known that a lot of people are in the course get tumors of their lives and die from them. At a tumor is originally the body's own Cells caused by various influences on tumor cells can degenerate. Such cells have a abnormal cell growth that ultimately leads to healthy Cells has a destructive effect.
Bei der Behandlung von Tumorerkrankungen steht es im Vordergrund, die Tumorzellen operativ zu entfernen. Eine solche Operation ist jedoch für den bereits durch den Tumor geschwächten - Patienten sehr belastend. Ferner ist nicht immer sichergestellt, daß bei der Operation tatsächlich alle Tumorzellen entfernt werden. Nicht entfernte Tumorzellen können jedoch weiter wachsen und somit zu einem erneuten Ausbruch der Tumorerkrankung führen. Weiterhin werden durch die operative Entfernung des Primärtumors die Metastasen (Tochtergeschwülste) nicht erfaßt, die ebenfalls zu einer Tumorerkrankung führen können.In the treatment of tumor diseases, it is in the Foreground to surgically remove the tumor cells. A such operation is, however, for the one already through the Tumor weakened - patients very stressful. Further is not always ensured that during surgery actually all tumor cells are removed. Not however, removed tumor cells can continue to grow and thus a new outbreak of the tumor disease to lead. Furthermore, the surgical removal of the primary tumor metastases (daughter tumors) not covered, which also leads to a tumor disease being able to lead.
Nach der operativen Entfernung von Tumorzellen wird der Patient häufig einer Chemotherapie und/oder einer Strahlentherapie unterzogen, um eventuell noch im Körper vorhandene Tumorzellen abzutöten. Beide Therapien werden jedoch von massiven Nebenwirkungen begleitet, wie starkes Erbrechen, Gewichtsverlust und Haarausfall. Des weiteren werden durch Chemotherapeutika und Strahlen, die beide selbst Krebserzeugend sind, neue Tumorzellen erzeugt, die zur Entstehung eines neuen Tumors beitragen können.After the surgical removal of tumor cells, the Patient often undergoing chemotherapy and / or Radiation therapy may be applied to the body kill existing tumor cells. Both therapies will however accompanied by massive side effects such as strong ones Vomiting, weight loss and hair loss. Furthermore are caused by chemotherapy drugs and radiation, both are cancer-producing themselves, new tumor cells are generated that can contribute to the development of a new tumor.
Da die vorstehenden Therapien zur Tumorbehandlung nicht befriedigend sind, wird verschiedentlich versucht, das körpereigene Immunsystem des Patienten zur Behandlung von Tumoren auszunutzen. Dabei soll das Immunsystem des Patienten dazu gebracht werden, Tumorzellen als körperfremd zu erkennen und zu vernichten. Dies hat sich jedoch als äußerst schwierig herausgestellt, da sich die Tumorzellen maskieren und somit für das körpereigene Immunsystem nicht erkennbar sind.Because the above therapies for tumor treatment are not are satisfactory, various attempts are made to the patient 's own immune system for the treatment of Take advantage of tumors. The immune system of the Patients are made to look at tumor cells to recognize and destroy foreign to the body. This has been However, it turned out to be extremely difficult since the Mask tumor cells and thus for the body's own Immune system are not recognizable.
Ein Ansatz zur Überwindung dieses Problems ist in der DE-A-39 23 848 aufgezeigt. Diese Patentanmeldung betrifft ein Verfahren zur Immunpotenzierung von weißen Blut zellen, bei dem Tumorzellen durch einen chirurgischen Eingriff gewonnen und dann mit autologen weißen Blut zellen überschichtet werden. Dabei werden immunpoten zierte weiße Blutzellen erhalten, die dem Patienten reinjeziert werden. Dies führt letztendlich zur Zerstö rung des Tumors durch die immunpotenzierten weißen Blut zellen. Allerdings weist dieses Verfahren den Nachteil auf, daß ein chirurgischer Eingriff notwendig ist, der den Patienten stark belastet.One approach to overcoming this problem is in the DE-A-39 23 848 shown. This patent application relates a procedure for immunopotentiating white blood cells, in which tumor cells by a surgical Intervention won and then with autologous white blood cells are overlaid. Thereby immunopotent graced white blood cells received by the patient be reinjected. This ultimately leads to destruction tion of the tumor by the immunopotiated white blood cells. However, this method has the disadvantage on the fact that a surgical intervention is necessary, the heavily burdened the patient.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines Mittels zu schaffen, das nicht die Nachteile des Standes der Technik aufweist.The present invention is therefore the object based on a method for producing an agent create that does not have the disadvantages of the prior art having.
Erfindungsgemäß wird dies durch ein Verfahren zur Her
stellung von Humaneigenblutzytokinen erreicht, das die
folgenden Schritte umfaßt:
According to the invention, this is achieved by a method for the production of human autologous blood cytokines, which comprises the following steps:
- a) Gewinnen einer Zusammensetzung von weißen Blutzellen, Plasma und einem Antigen aus dem Vollblut eines Spenders, wobei diese von den Erythrozyten abgetrennt werden,a) obtaining a composition of white blood cells, Plasma and an antigen from a donor's whole blood, which are separated from the erythrocytes,
- b) Aufteilen der Zusammensetzung in ein erstes und ein zweites Aliquot,b) dividing the composition into a first and a second aliquot,
- c) Demaskieren der im ersten Aliquot vorliegenden Zellen undc) unmasking the cells present in the first aliquot and
- d) Zusammengeben des in Schritt c) erhaltenen ersten Aliquots zum zweiten Aliquot und nachfolgende Inkubation.d) combining the first obtained in step c) Aliquots for the second aliquot and subsequent incubation.
Die Erfindung beruht auf folgender Erkenntnis des Erfinders: Im Blut eines Tumorpatienten liegen - neben den üblichen weißen Blutzellen - Tumorzellen und Tumor zellmaterial-enthaltende weiße Blutzellen vor. Die beiden letzteren sind aber so "maskiert", daß sie von den weißen Blutzellen nicht als fremd erkannt werden und daher auch keine Immunantwort gegen den Tumor induziert wird. Diese Maskierung der Tumorzellen ist darauf zurückzuführen, daß sie Oberflächenmarker, wie CD44V aufweisen, die von den weißen Blutzellen nicht als fremd erkannt werden. Führt man jedoch das erfindungsgemäße Verfahren durch, dann werden die weißen Blutzellen dazu gebracht, vermehrt Zytokine zu produzieren. Nach Schritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird somit ein Produkt erhalten, das autologe Zytokine in einem effizient erhöh te Gehalt aufweist. Reinjeziert man daher dieses Produkt dem Spender, aus dem es gewonnen wurde, dann kommt es zu einer spezifischen, gegen den Tumor gerichteten Immun antwort über die Zytokinproduktion und somit zu einer Heilung der Tumorerkrankung.The invention is based on the following knowledge of Inventor: In the blood of a tumor patient lie - next to the usual white blood cells - tumor cells and tumor white blood cells containing cell material. The two the latter are so "masked" that they are white Blood cells are not recognized as foreign and therefore also no immune response against the tumor is induced. This Masking of the tumor cells is due to the fact that they have surface markers, such as CD44V, that are available from the white blood cells are not recognized as foreign. Leads however, the method according to the invention is followed by the white blood cells are made to multiply To produce cytokines. After step d) of The method according to the invention thus becomes a product obtained that efficiently raise autologous cytokines in a te content. So you reinject this product the donor from whom it was obtained, then it comes to a specific immune against the tumor answer about the cytokine production and thus to a Cure the tumor.
Diese Erkenntnis trifft nicht nur für Tumoren und Tumor zellen zu, sondern auch für Viren, Bakterien, Prionen und andere Antigene, die zum Ausbruch einer damit asso ziierten Krankheit führen können und im Blut von Menschen vorkommen. This finding not only applies to tumors and tumors cells, but also for viruses, bacteria, prions and other antigens that break out with it asso cited disease and can result in human blood occurrence.
Der Ausdruck "Humaneigenblutzytokine" umfaßt Zytokine jeglicher Art, die in menschlichem Blut vorkommen, wobei der Begriff ". . .eigen. . ." darauf hinweist, daß die Zytokine autologe Zytokine sind, d. h. vom gleichen Menschen stammen. Zytokine sind Botenstoffe des Immun systems, die die Proliferation und Differenzierung von Blutzellen regulieren. Sie werden in folgende Unter klassen eingeteilt: Interleukine, Interferone, Kolonie stimulierende Faktoren, Lymphokine und Wachstumsfaktoren. Für das erfindungsgemäße Verfahren sind die Zytokine vorzugsweise ausgewählt aus Tumornekrosefaktor-a, Inter feron-g und löslichem Interleukin-2-Rezeptor und Gemische von zwei bis allen der Interleukine.The term "human autologous blood cytokines" includes cytokines of any kind found in human blood, whereby the term ".. .igen..." indicates that the Cytokines are autologous cytokines, i.e. H. of the same People come from. Cytokines are messengers of the immune system systems that proliferate and differentiate Regulate blood cells. You will find in the following sub Classified: interleukins, interferons, colony stimulating factors, lymphokines and growth factors. The cytokines are for the method according to the invention preferably selected from tumor necrosis factor-a, inter feron-g and soluble interleukin-2 receptor and mixtures from two to all of the interleukins.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden Humaneigeblut zytokine hergestellt. Diese Herstellung umfaßt auch die Konzentrationserhöhung der Zytokine, wobei die Zytokin konzentration vor und nach Durchführung des erfindungs gemäßen Verfahrens bestimmt werden kann. Dabei ist es ausreichend, daß die Konzentration von mindestens zwei der Zytokine im Vergleich zu unbehandeltem Blut durch das erfindungsgemäße Verfahren erhöht ist.In the process according to the invention, human egg blood is obtained manufactured cytokines. This manufacture also includes Increase in the concentration of the cytokines, the cytokine concentration before and after implementation of the invention can be determined according to the method. It is sufficient that the concentration of at least two of cytokines compared to untreated blood by the method according to the invention is increased.
In Schritt a) wird eine Zusammensetzung von weißen Blut zellen, Plasma und einem Antigen aus dem Vollblut eines Spenders gewonnen, wobei diese von den Erythrozyten abgetrennt werden. Der Ausdruck "weiße Blutzellen" umfaßt im Blut vorkommende kernhaltigen Zellen jeglicher Art, insbesondere Leukozyten, z. B. Lymphozyten, Monozyten und neutrophile, eosinophile und basophile Granulozyten. Die vorstehende Zusammensetzung kann auf jede beliebige Art gewonnen werden, mit der weiße Blutzellen, Plasma und Antigene, wie Tumorzellen, von den Erythrozyten getrennt werden. Als günstig hat es sich für die Gewinnung der Zusammensetzung gezeigt, wie folgt vorzugehen. Zuerst wird dem Patienten in üblicher Weise Vollblut entnommen, z. B. aus der Ellenbeugenvene, das dann mit Heparin versetzt wird. Das Vollblut weist dabei die Antigen wirkenden Zellen auf. Es wird so viel Vollblut dem Patienten entnommen, um zum einen die unproblematische Durchführung des Verfahrens zu gewährleisten und zum anderen den Patienten nicht übermäßig zu belasten. Als geeignetes Volumen haben sich dabei ca. 50 ml Vollblut erwiesen. Eine Weiterverarbeitung des heparinisierten Vollblutes erfolgt günstigerweise innerhalb 96 Stunden nach der Blutentnahme, wobei eine besondere Kühlung des heparinisierten Blutes in dieser Zeitspanne nicht notwendig ist, d. h. es kann bei Raumtemperatur bis zur Weiterverarbeitung gelagert werden. Dies stellt im Hinblick auf die Wirtschaftlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens einen großen Vorteil dar. Das heparinisierte Vollblut wird dann in ein Röhrchen, z. B. der Entnahme spritze, senkrecht stehen gelassen, wobei die Schwerkraft auf das Blut einwirkt. Durch das Einwirken der Schwer kraft kommt es zur Ausbildung von drei Schichten. Die unterste Schicht sind die Erythrozyten, darüber befinden sich die weißen Blutzellen (Interphase), gefolgt vom Plasma, wobei entweder in der Interphase oder im Plasma oder in beiden sich das Antigen befindet. Die Abtrennung der Interphase und des Plasmas von den Erythrozyten kann auf jede beliebige Art erfolgen. Beispielsweise wird an der Spritze, mit der das Blut entnommen wurde, ein Schlauch angebracht. Ferner werden vier Röhrchen, z. B. ein 50 ml Röhrchen, ein 15 ml Röhrchen und zwei Röhrchen mit je 10 ml Inhalt, bereitgestellt. In das erste 10 ml Röhrchen wird ein Teil des Plasmas, z. B. 2 ml, überführt, in dem der Zytokingehalt (=Zytokin-Ausgangswert) bestimmt werden kann. Auch in das zweite 10 ml Röhrchen wird ein Teil des Plasmas, z. B. 2 ml, eingeführt, in dem die infektionsserologische Parameter, wie anti-HCV, anti-HIV-1-2 und HbsAg, bestimmt werden können. Anschließend wird der Schlauch in das Röhrchen mit 50 ml Inhalt eingelegt, und es erfolgte die Überführung des restlichen Plasmas bis die Erythrozytenschicht (sichtbare rötliche Ver färbung des Schlauches) erreicht wird. Unter Beibehaltung des Drucks auf den Spritzenstempel und weitere Über führung des Blutes in das Röhrchen nimmt die Fließfähig keit des Blutes ab. Der Druck auf den Spritzenstempel wird solange fortgesetzt, bis die Fließfähigkeit wieder den Vorzustand (Einzeltropfenbildung) erreicht hat. Danach war die Überführung des Spritzeninhalts in das Röhrchen beendet. Diese Schritte können bei Raumtempe ratur durchgeführt werden.In step a) a composition of white blood cells, plasma and an antigen from whole blood Donors won, these being from the erythrocytes be separated. The term "white blood cells" includes any kind of nucleated cells in the blood, especially leukocytes, e.g. B. lymphocytes, monocytes and neutrophils, eosinophils and basophils. The above composition can be in any way with the white blood cells, plasma and Antigens, such as tumor cells, are separated from the erythrocytes become. It has proven to be favorable for the extraction of Composition shown to do the following. First whole blood is taken from the patient in the usual way, e.g. B. from the elbow vein, then with heparin is transferred. The whole blood shows the antigen acting cells. It gets so much whole blood to it Patients removed, on the one hand the unproblematic To ensure implementation of the process and to not overburdening the patient. As suitable volumes are approximately 50 ml whole blood proven. A further processing of the heparinized Whole blood is conveniently done within 96 hours after blood collection, with special cooling of the heparinized blood during this period is necessary, d. H. it can reach up to room temperature Further processing can be stored. This represents in With regard to the economy of the invention Process is a great advantage. The heparinized Whole blood is then placed in a tube, e.g. B. the removal syringe, left standing vertically, gravity acts on the blood. By the action of the heavy This creates three layers. The the bottom layer are the erythrocytes, located above the white blood cells (interphase), followed by Plasma, being either in the interphase or in the plasma or the antigen is in both. The separation the interphase and the plasma from the erythrocytes done in any way. For example, on the syringe with which the blood was drawn Hose attached. Furthermore, four tubes, e.g. B. one 50 ml tube, one 15 ml tube and two tubes each with 10 ml content. In the first 10 ml Tube becomes part of the plasma, e.g. B. 2 ml transferred in which the cytokine content (= initial cytokine value) is determined can be. The second 10 ml tube is also used Part of the plasma, e.g. B. 2 ml, introduced in which the infection serological parameters, such as anti-HCV, anti-HIV-1-2 and HbsAg, can be determined. Then will the tube is inserted into the 50 ml tube, and the rest of the plasma was transferred until the erythrocyte layer (visible reddish ver coloring of the hose) is achieved. While maintaining the pressure on the syringe stamp and other over Leading the blood into the tube takes away the flowability of blood. The pressure on the syringe plunger is continued until the fluidity again has reached the previous state (single drop formation). After that the transfer of the syringe contents into the Tube ended. These steps can be taken at room temperature be carried out.
Die vorstehend erwähnten Bestimmungsverfahren für Zyto kine und infektionsserologische Parameter sowie hierzu notwendige Materialien und Geräte sind dem Fachmann bekannt.The above-mentioned determination methods for cyto kine and infection-serological parameters as well as this necessary materials and devices are the specialist known.
In Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die in Schritt a) gewonnene Zusammensetzung in zwei Aliquote, nämlich in ein erstes und ein zweites Aliquot, aufgeteilt. Vorzugsweise erfolgt das Aufteilen in Schritt b) so, daß das erste Aliquot 10 bis 40 Vol.-%, vorzugs weise 20 bis 30 Vol.-%, insbesondere ca. 25 Vol.-%, des gesamten Volumens der Zusammensetzung beträgt. Dieses Aufteilen kann z. B. dadurch erfolgen, daß das erste Aliquot, z. B. mit einer Spritze, entnommen und in ein anderes Gefäß transferiert wird.In step b) of the method according to the invention composition obtained in step a) in two aliquots, namely a first and a second aliquot, divided up. The division is preferably carried out in step b) so that the first aliquot 10 to 40 vol .-%, preferably as 20 to 30 vol .-%, in particular about 25 vol .-%, of total volume of the composition. This Can split z. B. done by the fact that the first Aliquot, e.g. B. with a syringe, removed and in a another vessel is transferred.
In Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die im ersten Aliquot enthaltenen Zellen demaskiert. Diese Zellen weisen die weißen Blutzellen, die weißen Blut zellen, die bereits die Antigene oder Teile davon enthalten, und die Antigene selbst auf. Der Ausdruck "Demaskieren" bedeutet, daß die Zellen diejenigen Eigen schaften verlieren, die sie für das körpereigene Immun system unkenntlich machen. Das Demaskieren umfaßt die Entfernung der Tarnung der Zellen, insbesondere der Tumorzellen, und/oder die Membranreduktion der Zellen. Das Demaskieren kann spontan erfolgen oder induziert werden. Günstig ist es dabei, wenn die Induktion der Demaskierung physikalisch erfolgt. Dies bedeutet, daß die Zellen physikalisch, z. B. mechanisch, so beeinflußt werden, daß sie demaskiert werden. Als besonders brauch bare Maßnahme für das physikalische Induzieren hat sich das Zentrifugieren, z. B. bei 1800 Umdrehungen pro Minute während 10 Minuten erwiesen. Nach der Zentrifugation kann der Überstand abgenommen werden, z. B. durch Dekantation, und zum zweiten Aliquot zugegeben werden. Der Rückstand (demaskierte Zellen) wird in einem geeigneten wäßrigen Medium, z. B. Ringerphosphatlösung, aufgenommen und für das weitere Verarbeiten, d. h. Schritt d) des erfindungs gemäßen Verfahrens, verwendet.In step c) of the method according to the invention, the cells in the first aliquot unmasked. This Cells have white blood cells, white blood cells that already have the antigens or parts of them included, and the antigens themselves. The expression "Unmasking" means that the cells own those they lose for the body's immune system make the system unrecognizable. The unmasking includes that Removing the camouflage of the cells, especially the Tumor cells, and / or the membrane reduction of the cells. The unmasking can be spontaneous or induced become. It is favorable if the induction of the Unmasking is done physically. This means that the Cells physically, e.g. B. mechanically, so influenced be unmasked. As a special need There has been a measure for physical induction centrifugation, e.g. B. at 1800 revolutions per minute proven during 10 minutes. After centrifugation the supernatant can be removed, e.g. B. by decantation, and added to the second aliquot. The residue (unmasked cells) in a suitable aqueous Medium, e.g. B. Ringer phosphate solution, added and for further processing, d. H. Step d) of the invention according to the method used.
In Schritt d) werden das erste Aliquot, das die demaskierten Zellen enthält, oder das diesem ersten Aliquot entsprechende oben genannte Medium, das ebenfalls die demaskierten Zellen enthält, mit dem zweiten Aliquot zusammengegeben, vorzugsweise in einer Zellkulturflasche. Anschließend wird eine Inkubation durchgeführt, vorzugs weise bei 37 ± 2°C während 48 ± 5 bis 72 ± 5 Stunden. Das nach Schritt d) erhaltene Produkt kann in Ampullen in üblicher Weise konfektioniert werden und/oder bei ca. -16°C oder weniger während 12 Stunden bis 14 Tagen gelagert werden.In step d) the first aliquot that the contains unmasked cells, or this first Aliquot corresponding medium mentioned above, also containing unmasked cells with the second aliquot put together, preferably in a cell culture bottle. An incubation is then carried out, preferably wise at 37 ± 2 ° C for 48 ± 5 to 72 ± 5 hours. The product obtained after step d) can be in ampoules in are usually assembled and / or at approx. -16 ° C or less stored for 12 hours to 14 days become.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Beispielsweise werden die verwendeten Geräte und Verbrauchsmaterialien in üblicher Weise, z. B. mit einem Sterilisationsmittel, wie einen Alkohol oder eine alkoholische Lösung, behandelt und/oder unter Reinluftbedingungen gearbeitet.The inventive method is preferably under sterile conditions performed. For example the equipment and consumables used in usual way, e.g. B. with a sterilizing agent, such as an alcohol or an alcoholic solution and / or worked under clean air conditions.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist eine Reihe von Vorteilen auf: Es kann ein wirksames Mittel gegen die durch die weiter oben genannten Antigene verursachten Erkrankungen, insbesondere Tumorerkrankungen, in schneller, preisgünstiger Weise ohne großen Apparate aufwand schaffen. Dieses kann als natürliches, biologisches Medikament angesehen werden, da es nur natürlich vorkommende Substanzen enthält und ohne Einsatz von Fremdstoffen hergestellt wurde. Im Vergleich zu vielen anderen Mitteln, wie Antitumormittel, ist seine Verwendung und Herstellung gefahrlos möglich. Das durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt Mittel ist nebenwirkungsfrei und es zeigt eine optimale, direkte therapeutische Wirkung. Ferner hält es mit der Tumor evolution schritt, da es dem Patienten in verschiedenen Zeitabständen verabreicht werden kann und es sich dabei jeweils dem aktuellen Evolutionsstadium des Tumors anpaßt.The method according to the invention has a number of Advantages on: It can be an effective remedy against that caused by the antigens mentioned above Diseases, especially tumor diseases, in faster, less expensive without large apparatus create effort. This can be a natural biological drug can be viewed as it only contains naturally occurring substances and without use of foreign substances. Compared to many other agents, such as anti-tumor agents, are his Use and manufacture possible without risk. That through the method according to the invention is an agent free of side effects and it shows an optimal, direct therapeutic effect. It also keeps up with the tumor evolution step since it affects the patient in different Time intervals can be administered and there it the current stage of evolution of the tumor adjusts.
Das durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Zytokin-haltige Produkt ist daher zur Behandlung von durch die Antigene verursachten Erkrankungen, insbeson dere Tumorerkrankungen, bestens geeignet.The manufactured by the inventive method Cytokine-containing product is therefore used to treat diseases caused by the antigens, in particular other tumor diseases, ideally suited.
Wie vorstehend dargelegt wurde, kann vor und nach der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens jeweils die Konzentration der Zytokine bestimmt werden. Ist die Konzentration von mindestens zwei Zytokinen nach der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahrens erhöht, dann ist dies ein Hinweis darauf, daß zum einen die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgreich war und zum anderen, daß die entsprechenden Antigene im Blut vorliegen. Somit ist das erfindungsgemäße Verfahren auch bestens zur Diagnose der durch die Antigene verur sachten Erkrankungen einsetzbar.As stated above, before and after the Implementation of the method according to the invention Concentration of the cytokines can be determined. Is the Concentration of at least two cytokines after the Implementation of the method according to the invention increased, then this is an indication that on the one hand the Implementation of the method according to the invention successfully and secondly, that the corresponding antigens in the There is blood. The method according to the invention is thus also ideal for diagnosing the antigens gentle diseases can be used.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung: The following example explains the invention:
Heparinisiertes Vollblut wurde einem Tumorpatienten wie folgt entnommen: Die zur Blutentnahme vorgesehene Stelle an der Ellenbeugenvene wurde mit einer alkoholischen Lösung desinfiziert. Anschließend wurde eine Ampulle, die Heparin enthielt, aufgebrochen und das Heparin über eine sterile Kanüle in eine Entnahnamespritze aspiriert. Nachdem durch Anlegen eines Stauschlauches am Oberarm die Ellenbeugenvene gestaut wurde, wurde sie punktiert und in üblicher Weise der Erfolg der Punktion kontrolliert. Der Blutstau wurde durch Lösen der Stauschlauches beseitigt und 50 ml Vollblut wurde in die bereits Heparin enthal tende Spritze aspiriert. Die Spritze wurde aus der Vene heraus gezogen. Das so gewonnene heparinisierte Vollblut wurde innerhalb von 96 Stunden weiterverarbeitet, wobei während der Lagerung bis zur Weiterverarbeitung die Spritze bei Raumtemperatur aufbewahrt wurde.Heparinized whole blood was given to a tumor patient like taken as follows: The place intended for blood sampling on the elbow vein was with an alcoholic Disinfected solution. Then there was an ampoule that Contained heparin, broken up and the heparin over a aspirated sterile cannula into a withdrawal syringe. After placing the tourniquet on the upper arm Elbow vein was jammed, she was punctured and in usually controls the success of the puncture. Of the Blood congestion was removed by loosening the tourniquet and 50 ml of whole blood was already contained in the heparin aspirated syringe. The syringe was out of the vein pulled out. The heparinized whole blood obtained in this way was processed within 96 hours, whereby during storage until further processing Syringe was stored at room temperature.
Die Spritze wurde dann vertikal mit der Spritze nach oben in einen Edelstahlbehälter gestellt. Hier verblieb die Spritze bei Raumtemperatur, bis durch die Schwerkraft sedimentation der Zellen die Interphase eintrat. Diese ist dadurch erkennbar, daß sich eine scharfe, eindeutig erkennbare Trennung der Erythrozyten, der weißen Blut zellen und des Plasmas abzeichnet, die mit einer be kannten Blutsenkung vergleichbar ist. Nach Eintritt der Interphase wurde die Spritze und der Edelstahlständer mit einem alkoholischen Desinfektionsmittel ohne Rück standrest desinfiziert. Nach der Desinfektion wurde die Spritze aus dem Spritzenständer entnommen und unter eine Laminatflow gestellt, unter der sich bereits die weiteren benötigten Geräte, Verbrauchsmaterialien und Reagenzien befanden.The syringe was then vertical with the syringe up placed in a stainless steel container. Here remained the Syringe at room temperature until by gravity sedimentation of the cells the interphase occurred. This is recognizable by the fact that there is a sharp, clear recognizable separation of the erythrocytes, the white blood cells and of the plasma, which are marked with a be known blood sedimentation is comparable. After the entry The syringe and the stainless steel stand became interphase an alcoholic disinfectant without a back stand disinfected. After disinfection, the Syringe removed from the syringe stand and under one Laminate flow, under which the others are already required equipment, consumables and reagents found.
Dort erfolgte dann die weitere Präparation des sedimen tierten Blutes in folgender Weise: An die Spritze wurde ein Butterfly-Schlauchsystem angebracht. Ferner wurden ein 50 ml Blue Max Röhrchen, ein 15 ml Röhrchen und zwei Röhrchen mit je 10 ml Inhalt bereitgestellt. In das erste 10 ml Röhrchen wurden 2 ml des Plasmas überführt, in dem der Zytokingehalt (=Zytokin-Ausgangswert) bestimmt wurde. Auch in das zweite 10 ml Röhrchen wurden 10 ml Plasma eingeführt, in dem die infektionsserologischen Parameter anti-HCV, anti-HIV-1-2 und HBsAg bestimmt wurden. Anschließend wurde der Schlauch in das Blue Max Röhrchen eingelegt, und es erfolgte die Überführung des Plasmas bis die Erythrozytenschicht (sichtbare rötliche Verfärbung des Schlauches) erreicht wurde. Unter Bei behaltung des Drucks auf den Spritzenstempel und weitere Überführung des Blutes in das Röhrchen nahm die Fließ fähigkeit des Blutes ab. Der Druck auf den Spritzen stempel wurde solange fortgesetzt, bis die Fließfähigkeit wieder den Vorzustand (Einzeltropfenbildung) erreicht hat. Danach war die Überführung des Spritzeninhalts in das Röhrchen beendet.The further preparation of the sedimen then took place there blood in the following way: On the syringe a butterfly hose system attached. Furthermore one 50 ml Blue Max tube, one 15 ml tube and two Tubes with 10 ml content provided. In the first 10 ml tubes were transferred to 2 ml of the plasma in which the cytokine content (= initial cytokine value) was determined. 10 ml of plasma were also placed in the second 10 ml tube introduced in which the infection-serological parameters anti-HCV, anti-HIV-1-2 and HBsAg were determined. The tube was then inserted into the Blue Max tube inserted, and the plasma was transferred until the erythrocyte layer (visible reddish Discoloration of the hose) was reached. Under bei maintaining pressure on the syringe plunger and others Transfer of the blood into the tube took the flow ability of the blood. The pressure on the syringes Stamping was continued until the fluidity again reached the previous state (single drop formation) Has. After that the transfer of the syringe content was in the tube ends.
Dann wurden 25 Vol.-% der Menge des im 50 ml Blue Max
Röhrchens befindlichen Plasma/Zellgemisches (weiße Blut
zellen) unter Benutzung einer sterilen serologischen
Pipette (2 ml) mit Peleus-Ball aus diesem Röhrchen
entnommen und in das 15 ml Röhrchen überführt. Dieses
Röhrchen wurde in einer Tischzentrifuge 10 Minuten bei 1
800 U/min zentrifugiert. Das Röhrchen wird aus der
Zentrifuge entnommen und der Überstand in das 50 ml Blue
Max Röhrchen dekantiert. Dann wurden folgende Aliquote in
eine 250 ml Zellkulturflasche eingebracht:
Then 25% by volume of the amount of the plasma / cell mixture (white blood cells) in the 50 ml Blue Max tube was removed from this tube using a sterile serological pipette (2 ml) with Peleus ball and transferred into the 15 ml tube . This tube was centrifuged in a table top centrifuge at 1800 rpm for 10 minutes. The tube is removed from the centrifuge and the supernatant decanted into the 50 ml Blue Max tube. The following aliquots were then placed in a 250 ml cell culture bottle:
- - in 10 ml Ringerlösung befindliches Zellgemisch nach Zentrifugation (nackte Zellen = demaskierte Zellen) aus dem 15 ml Röhrchen,- cell mixture in 10 ml Ringer's solution Centrifugation (bare cells = unmasked cells) from the 15 ml tube,
- - unbehandelte Zellen (75 Vol.-% des Ausgangsgemisches) und Überstand nach Zentrifugation aus dem 50 ml Blue Max Röhrchen unduntreated cells (75% by volume of the starting mixture) and supernatant after centrifugation from the 50 ml blue Max tubes and
- - Ringerphosphatlösung zum Auffüllen der Suspension auf 45 ml.- Ringer's phosphate solution to fill up the suspension 45 ml.
Die Zellkulturflasche wurden dann liegend in einen Brutschrank gelegt und bei 37 ± 2°C. inkubiert. Die Inkubationsdauer beträgt zwischen 43 und 77 Stunden. Nach Beendigung der Inkubationszeit wurde die Zellkultur flasche aus dem Brutschrank entnommen und senkrecht in einen Tiefkühlschrank gestellt und bei mindestens -16°C während 12 Stunden bis 2 Wochen gelagert.The cell culture bottle was then placed in a lying position Incubator placed and at 37 ± 2 ° C. incubated. The The incubation period is between 43 and 77 hours. After The cell culture ended the incubation period bottle removed from the incubator and placed vertically in placed a freezer and at least -16 ° C stored for 12 hours to 2 weeks.
Das so erhaltene Produkt kann dann in üblicher Weise in Ampullen konfektioniert werden.The product thus obtained can then in the usual way Ampoules are assembled.
Auf diese Weise werden Produkte erhalten, die einen im Vergleich zum Ausgangswert erhöhten Zytokingehalt aufweisen. Wurde das Zytokin-haltige Produkt dem Tumor patienten ggf. mehrmals reinjeziert, dann konnte der Patient von seinem Tumorleiden befreit werden.In this way, products are obtained which Increased cytokine content compared to baseline exhibit. The cytokine-containing product became the tumor if necessary, the patient was reinjected several times, then the Patient is freed from his tumor.
Claims (19)
- a) Gewinnen einer Zusammensetzung von weißen Blutzellen, Plasma und einem Antigen aus dem Vollblut eines Spenders, wobei diese von den Erythrozyten abgetrennt werden,
- b) Aufteilen der Zusammensetzung in ein erstes und ein zweites Aliquot,
- c) Demaskieren der im ersten Aliquot vorliegenden Zellen und
- d) Zusammengeben des in Schritt c) erhaltenen ersten Aliquots zum zweiten Aliquot und nachfolgende Inkubation.
- a) obtaining a composition of white blood cells, plasma and an antigen from the whole blood of a donor, these being separated from the erythrocytes,
- b) dividing the composition into a first and a second aliquot,
- c) unmasking the cells present in the first aliquot and
- d) combining the first aliquot obtained in step c) into the second aliquot and subsequent incubation.
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19821843A DE19821843A1 (en) | 1997-10-23 | 1998-05-15 | Preparation of autologous human blood cytokine(s) |
PCT/EP1998/006757 WO1999021887A2 (en) | 1997-10-23 | 1998-10-23 | Method for the production of human blood cytokines |
AT98955520T ATE452144T1 (en) | 1997-10-23 | 1998-10-23 | METHOD FOR PRODUCING HUMAN BLOOD CYTOKINES |
EP98955520A EP1025123B1 (en) | 1997-10-23 | 1998-10-23 | Method for the production of human blood cytokines |
DE59814423T DE59814423D1 (en) | 1997-10-23 | 1998-10-23 | METHOD FOR PRODUCING HUMANEOUS BLOOD CYTOKINES |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19746865 | 1997-10-23 | ||
DE19821843A DE19821843A1 (en) | 1997-10-23 | 1998-05-15 | Preparation of autologous human blood cytokine(s) |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19821843A1 true DE19821843A1 (en) | 1999-04-29 |
Family
ID=7846417
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19821843A Withdrawn DE19821843A1 (en) | 1997-10-23 | 1998-05-15 | Preparation of autologous human blood cytokine(s) |
DE59814423T Expired - Lifetime DE59814423D1 (en) | 1997-10-23 | 1998-10-23 | METHOD FOR PRODUCING HUMANEOUS BLOOD CYTOKINES |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE59814423T Expired - Lifetime DE59814423D1 (en) | 1997-10-23 | 1998-10-23 | METHOD FOR PRODUCING HUMANEOUS BLOOD CYTOKINES |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
AT (1) | ATE452144T1 (en) |
DE (2) | DE19821843A1 (en) |
-
1998
- 1998-05-15 DE DE19821843A patent/DE19821843A1/en not_active Withdrawn
- 1998-10-23 DE DE59814423T patent/DE59814423D1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-23 AT AT98955520T patent/ATE452144T1/en active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATE452144T1 (en) | 2010-01-15 |
DE59814423D1 (en) | 2010-01-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69432351T2 (en) | METHOD FOR STERILIZING PRODUCTS | |
DE3872588T2 (en) | SIMPLIFIED METHOD FOR PRODUCING HUMAN LYMPHOKINACTIVATED KILLER CELLS. | |
EP3335744B1 (en) | Leukocyte preparation and method for producing a leukocyte preparation | |
DE3027105A1 (en) | METHOD FOR PRODUCING A FACTOR STIMULATING THE PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION OF HUMAN GRANULOPOETIC STEM CELLS | |
DE69833333T2 (en) | PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING CERVUS NIPPON GERMANIC ACIDS WITH GROWTH STIMULATING ACTIVITY ON HEMATOPOIETIC STEM CELLS AND MEGAKARYOCYTES | |
EP0868194A1 (en) | Combination of g-csf with a chemotherapeutic agent for stem cell mobilisation | |
DE19813759C1 (en) | Inducing a natural killer cell immune response ex vivo | |
DE19916085A1 (en) | Antiviral agent, e.g. for treating HIV infections, comprising autovaccine obtained by heating blood containing viruses and antigens with protein crosslinking agent | |
DE2645993A1 (en) | AGENT AGAINST MYELOIC LEUKAEMIA AND ITS MANUFACTURING METHOD | |
DE2635065A1 (en) | METHOD FOR SEMI-CONTINUOUS TREATMENT OF WHOLE BLOOD | |
DE4242902A1 (en) | Process for the preparation of lectin concentrates from mistletoe extracts and standardized preparations prepared therefrom for increasing natural immune resistance and for use in tumor therapy | |
DE69020157T2 (en) | INCREASED ACTIVATION OF LAK CELLS BY TREATING HUMAN PERIPHERAL MONONUCLEAR BLOOD CELLS WITH AMINO ACIDS. | |
DE69433789T2 (en) | METHODS OF INHIBITION OF HIV-ASSAYED DISEASE BY MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST SELF-TESTED CYTOTOXIC T CELLS | |
EP1025123B1 (en) | Method for the production of human blood cytokines | |
EP1744776B1 (en) | Neurotransmitter mixture which promotes the healing of wounds | |
DE19821843A1 (en) | Preparation of autologous human blood cytokine(s) | |
DE69601154T2 (en) | Preparations for the treatment of hepatitis C. | |
EP1337625B1 (en) | Stem cells, method for expansion in vitro and use thereof | |
DE69526096T2 (en) | GROWTH REGULATOR | |
Crouch et al. | Modification of irradiation injury in the monkey by bone marrow transplantation | |
DE69724364T2 (en) | Red blood cell fractionation method, and antibacterial agents or bacterial reproductive inhibitors thus prepared | |
EP0183253B1 (en) | Medicament comprising an organ extract from the peyers patches for the treatment of diabetes mellitus and pancreatitis | |
DE69433472T2 (en) | Recognin VACCINES | |
DE3913438A1 (en) | METHOD FOR PRODUCING AN IMMUNITY MEMORY CELL SUSPENSION | |
EP0282844B1 (en) | Use of dopamine-agonists in the preparation of a medicament for the treatment of bone injuries |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8141 | Disposal/no request for examination | ||
8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
8170 | Reinstatement of the former position | ||
8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |