DE19820078A1 - Production of material labeled with carbon-13 useful for diagnostic or research purposes - Google Patents

Abstract

Production of material labeled with carbon-13 (<13>C) by cultivating plants in an atmosphere containing carbon dioxide (CO2). Production of material labeled with carbon-13 (<13>C) by cultivating plants in an atmosphere containing carbon dioxide (CO2) is carried out by a process in which: (a) photosynthesis, starting with a limited supply of CO2 or a substance capable of undergoing rapid carbon isotope exchange with CO2, takes place in a system to which no carbon is added and from which carbon is exclusively or predominantly removed in the form of organic compounds produced in the course of assimilation; (b) the plants, at least in the first phases of consumption of the carbon supply, are C3 plants; and (c) the biomass produced in the latter phases of CO2 consumption by assimilation is either used directly as <13>C-labeled biomass or separated into individual <13>C-labeled fractions. (a)

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von mit dem stabilen Isotop Kohlenstoff-13 (¹³C) markierten chemischen Verbindungen, insbesondere für die Durchführung von ¹³C-Atemtests für die medizinische Forschung und Diagnostik (vgl. z. B. Krumbiegel, Peter: Stable isotope pharmaceuticals for clinical research and diagnosis, Jena, Fischer-Verlag 1991).The invention relates to a method for producing chemical compounds labeled with the stable isotope carbon-13 ( ¹³ C), in particular for carrying out ¹³ C breath tests for medical research and diagnostics (cf., for example, Krumbiegel, Peter: Stable isotope pharmaceuticals for clinical research and diagnosis, Jena, Fischer Verlag 1991).

In der klinischen Diagnostik bereits etabliert hat sich der ¹³C-Harnstoff-Atemtest zum Nachweis von Helicobacter pylori-Infektionen, die vielfach Ursache von Erkrankungen des Magen-Darm-Trakts sind. Bei diesem Atemtest wird dem Patienten ¹³C-Harnstoff verabreicht. Helicobacter pylori produziert das Enzym Urease, das Harnstoff in CO₂ und H₂O zerlegt. Infektionen mit diesem Bakterium werden an der Geschwindigkeit erkannt, mit der das gebildete ¹³CO₂ mit der Atemluft ausgeschieden wird. In diesem Falle kommt ein ohne Schwierigkeiten und mit geringem Aufwand herstellbares ¹³C-markiertes Substrat zur Anwendung. Bei den meisten anderen ¹³C- Atemtests müssen kompliziertere ¹³C-markierte organische Verbindungen appliziert werden. Als Beispiele seien genannt Carbonsäuren, insbesondere Fettsäuren, Lipide, Monosaccharide und Disaccharide (Glucose, Fructose, Saccharose, Maltose, Galactose u. a.), Stärke, Aminosäuren wie Phenylalanin, Leucin und Glycin, Eiweiße wie Casein, usw., deren Herstellung in ¹³C-markierter Form schwierig und aufwendig ist.The ¹³ C-urea breath test for the detection of Helicobacter pylori infections, which are often the cause of diseases of the gastrointestinal tract, has already established itself in clinical diagnostics. In this breath test, the patient is given ¹³ C-urea. Helicobacter pylori produces the enzyme urease, which breaks down urea into CO ₂ and H ₂ O. Infections with this bacterium are recognized by the speed at which the ¹³ CO ₂ formed is excreted in the air we breathe. In this case, a ¹³ C-labeled substrate that can be produced without difficulty and with little effort is used. Most other ¹³ C breath tests require more complicated ¹³ C-labeled organic compounds. Examples include carboxylic acids, especially fatty acids, lipids, monosaccharides and disaccharides (glucose, fructose, sucrose, maltose, galactose etc.), starch, amino acids such as phenylalanine, leucine and glycine, proteins such as casein, etc., their production in ¹³ C- marked form is difficult and expensive.

Es ist das vorrangige, wenn auch nicht ausschließliche Ziel der Erfindung, diese Vielfalt ¹³C-markierter organischer Verbindungen auf einfache und wenig aufwendige Weise bereitzustellen.It is the primary, if not exclusive, aim of the invention to provide this variety of ¹³ C-labeled organic compounds in a simple and inexpensive manner.

Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions

¹³C wird heutzutage überwiegend (unter Ausnutzung des - wenn auch geringen - Dampfdruckunterschieds zwischen ¹³CO und ¹²CO) durch Tieftemperaturdestillation von Kohlenmonoxid hergestellt. ¹³C-markierte organische Verbindungen lassen sich daraus auf Wegen synthetisieren, die sich nicht grundsätzlich von den für die Herstellung organischer Verbindungen natürlicher Isotopenzusammensetzung des Kohlenstoffs geeigneten Synthesewegen unterscheiden. Dies schließt die Biosynthese von ¹³C-markierten organischen Verbindungen durch Algen oder andere lebenden Organismen durchaus ein.Nowadays, ¹³ C is mainly produced (using the - albeit slight - vapor pressure difference between ¹³ CO and ¹² CO) by low-temperature distillation of carbon monoxide. ¹³ C-labeled organic compounds can be synthesized therefrom in ways that do not fundamentally differ from the synthetic routes suitable for the production of organic compounds of natural isotope composition of carbon. This includes the biosynthesis of ¹³ C-labeled organic compounds by algae or other living organisms.

Im letzteren Falle tut sich allerdings die Schwierigkeit auf, daß sich die angesichts der Kostbarkeit des Ausgangsmaterials (¹³CO bzw. eine einfache, daraus hergestellte chemische Verbindung wie ¹³CO₂) anzustrebende hohe Ausbeute bei dessen Umwandlung in die gewünschten organischen Verbindungen nicht oder nicht ohne weiteres realisieren läßt. Um dieser Schwierigkeit zu entgehen, werden für ¹³C- Atemtests zuweilen aus auf normalem Wege entstandener Biomasse hergestellte Substrate eingesetzt, deren ¹³C-Gehalt von dem ¹³C-Gehalt im Körper des Probanden abweicht. Dabei wird ausgenutzt, daß der ¹³C-Gehalt pflanzlicher Biomasse davon abhängt, welcher Mechanismus der Photosynthese der jeweiligen Pflanzenart zugrundeliegt: Sogenannte C₃-Pflanzen, wie Weizen, Kartoffel, Rübe, Kohl, Reis, aber auch Algen, bedienen sich bei ihrer Assimilation des sogenannten Calvin-Zyklus und haben ¹³C-Gehalte von etwa 1,08 Atom-%; bei C₄-Pflanzen wie Mais und Zuckerrohr mit ihrem Hatch-Slack-Zyklus der Photosynthese liegt der ¹³C-Gehalt bei ungefähr 1,10 Atom-%. Dies hat zur Folge, daß der ¹³C-Gehalt des menschlichen Körpers von der Ernahrungsweise abhängt. Bei Europäern mit ihrer Vorliebe für Weizen, Kartoffeln und Rübenzucker sind somit aus Mais oder Rohrzucker gewonnene organische Stoffe geeignete Substrate für ¹³C-Atemtests, bei Nordamerikanern, die statt Weizen und Kartoffeln überwiegend Mais essen und mit Rohrzucker süßen, sind aus C₃-Pflanzen hergestellte organische Stoffe für solche Tests geeignet. Angesichts der Kleinheit der Unterschiede in den ¹³C-Gehalten von Substrat und körpereigener Biomasse des Probanden sind allerdings Spezifität und Sensitivität in solcher Weise ausgeführter ¹³C- Atemtests gering.In the latter case, however, the difficulty arises that the high yield to be aimed at in view of the preciousness of the starting material ( ¹³ CO or a simple chemical compound such as ¹³ CO ₂ produced therefrom) does not, or not without, when converting it into the desired organic compounds can be realized further. In order to avoid this difficulty, substrates made of biomass produced in the normal way are sometimes used for ¹³ C breath tests, the ¹³ C content of which differs from the ¹³ C content in the subject's body. This takes advantage of the fact that the ¹³ C content of plant biomass depends on the mechanism underlying the photosynthesis of the respective plant species: So-called C ₃ plants, such as wheat, potatoes, beets, cabbage, rice, but also algae, make use of their assimilation of the so-called Calvin cycle and have ¹³ C contents of approximately 1.08 atom%; in C ₄ plants such as corn and sugar cane with their hatch-slack cycle of photosynthesis, the ¹³ C content is approximately 1.10 atom%. As a result, the ¹³ C content of the human body depends on the diet. For Europeans with a preference for wheat, potatoes and beet sugar, organic substances obtained from corn or cane sugar are therefore suitable substrates for ¹³ C breath tests; for North Americans who mainly eat corn and sweeten with cane sugar instead of wheat and potatoes, are made from C ₃ plants manufactured organic substances suitable for such tests. Given the smallness of the differences in the ¹³ C content of the substrate and the body's own biomass, the specificity and sensitivity of ¹³ C breath tests carried out in this way are low.

Der Stand der Technik läßt sich somit in folgender Weise charakterisieren: ¹³C- Atemtests mit auf künstlichem Wege hergestellten Substraten sind genau, aber - von Ausnahmen wie dem ¹³C-Harnstoff-Atemtest abgesehen - aufwendig, solche mit natürlichen Substraten zwar wenig aufwendig, aber ungenau. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, dieses Dilemma zu beseitigen und damit der Anwendung von ¹³C- Atemtests in der klinischen Forschung und Diagnostik eine breitere Basis zu geben. The state of the art can thus be characterized in the following way: ¹³ C breath tests with substrates produced by artificial means are accurate, but - apart from exceptions such as the ¹³ C urea breath test - complex, those with natural substrates are not very complex, but inaccurate. The invention is based on the object of eliminating this dilemma and thus giving the use of ¹³ C breath tests in clinical research and diagnostics a broader basis.

Darlegung des Wesens der ErfindungState the nature of the invention

Erfindungsgemäß wird - ausgehend von einem begrenzten Vorrat an Kohlendioxid bzw. einer mit Kohlendioxid in raschem Kohlenstoff-Isotopenaustausch stehenden Substanz - die pflanzliche Photosynthese vollzogen in einem System, dem kein Kohlenstoff zugeführt und dem Kohlenstoff ausschließlich oder überwiegend in Form von im Zuge der Photosynthese gebildeten organischen Stoffen entzogen wird. Da das leichte stabile Isotop des Kohlenstoffs, das ¹²C, bei der Photosynthese bevorzugt assimiliert wird, führt diese Prozedur zu einer zunehmenden ¹³C-Anreicherung in dem im System verbliebenen Rest, und zwar in einem Ausmaß, das die Verschiebung des ¹³C-Gehalts in einem einzigen Schritt, wie sie unter natürlichen Bedingungen, von einem unendlich großen Vorrat von (atmosphärischem) Kohlendioxid ausgehend, also in einem offenen System geschieht, um ein Mehrfaches übertrifft.According to the invention - starting from a limited supply of carbon dioxide or a substance which is in rapid carbon-isotope exchange with carbon dioxide - plant photosynthesis is carried out in a system to which no carbon is added and the carbon is exclusively or predominantly in the form of organic formed in the course of photosynthesis Substances is withdrawn. Since the light stable isotope of carbon, ¹² C, is preferentially assimilated in photosynthesis, this procedure leads to an increasing ¹³ C accumulation in the rest remaining in the system, to an extent that the shift of the ¹³ C content in a single step, as happens under natural conditions, starting from an infinite supply of (atmospheric) carbon dioxide, i.e. in an open system, by a multiple.

Für die ¹³C-Anreicherung in einem geschlossenen System, wie es erfindungsgemaß realisiert wird, gilt die Rayleigh-Gleichung:
The Rayleigh equation applies to the ¹³ C enrichment in a closed system, as is realized according to the invention:

C_n = C₀(m₀/m)^α-1= (m₀/m)^1,02-1 mit n = m₀/m,
C _n = C ₀ (m ₀ / m) ^α-1 = (m ₀ / m) ^1.02-1 with n = m ₀ / m,

worin C₀ der anfängliche ¹³C-Gehalt, α der elementare Trennfaktor, also das Verhältnis der ¹³C-Gehalte in einer Ausgangsmenge und in einer unendlich kleinen Menge daraus entstandener Biomasse, m₀ die anfängliche Kohlenstoff-Menge (in mol), m die im geschlossenen System verbliebene Kohlenstoff-Menge (in mol) und Cn der¹³C-Gehalt in dieser Restmenge m ist. Für C₃-Pflanzen ist α = 1,02.where C _{0 is} the initial ¹³ C content, α is the elementary separation factor, i.e. the ratio of the ¹³ C contents in an initial amount and in an infinitely small amount of biomass resulting from it, m _{0 is} the initial amount of carbon (in mol), m the amount of carbon remaining in the closed system (in mol) and Cn is the ¹³ C content in this remaining amount m. For C ₃ plants, α = 1.02.

Die Tabelle zeigt die ¹³C-Gehalte C_n (in Atom-%), wie sie sich in Abhängigkeit von dem Verhältnis Ausgangsmenge/Restmenge m₀/m ergeben, wenn die Photosynthese von einer C₃-Pflanze vollzogen wird und von einer an ¹³C besonders reichen natürlichen Kohlenstoff-Quelle, dem Süßwasserkalk Travertin, ausgegangen wird. Zum Vergleich sind auch die (mittleren) ¹³C-Gehalte von C₃- und C₄-Pflanzen, von atmosphärischem CO₂ sowie des als internationaler Standard gebräuchlichen Belemnitenkalks der PD- Formation in South Carolina (PDB-Standard) in die Tabelle aufgenommen. The table shows the ¹³ C contents C _n (in atomic%) as a function of the ratio of the starting quantity / residual quantity m ₀ / m when photosynthesis is carried out by a C ₃ plant and by one on ¹³ C particularly rich natural carbon source, the freshwater lime travertine, is assumed. For comparison, the (mean) ¹³ C contents of C ₃ and C ₄ plants, of atmospheric CO ₂ and of the Belemnite lime of the PD formation in South Carolina (PDB standard), which is the international standard, are included in the table.

Die Zahlenangaben der Tabelle sind obere Grenzen der erzielbaren ¹³C-Anreicherung. Sie gelten streng nur unter der Voraussetzung, daß dem System kein Kohlendioxid und keine mit Kohlendioxid in Isotopenaustausch tretenden Stoffe zugeführt werden, daß dem System Kohlenstoff ausschließlich in Form von durch Photosynthese entstandenen Stoffen und nicht auch in Form von gasförmigem bzw. gelöstem Kohlendioxid oder in Form von gelösten anorganischen Stoffen entzogen wird und daß die Biomasse dem System in unendlich kleinen Portionen entnommen wird.The figures in the table are the upper limits of the ¹³ C enrichment that can be achieved. They apply strictly only on the condition that no carbon dioxide and no substances that are in an isotope exchange with carbon dioxide are added to the system, that the system carbon is only in the form of substances produced by photosynthesis and not in the form of gaseous or dissolved carbon dioxide or in the form is extracted from dissolved inorganic substances and that the biomass is removed from the system in infinitely small portions.

Wie die Tabelle zeigt, steigt der ¹³C-Gehalt in dem nicht assimilierten Kohlendioxid- Anteil mit zunehmender Entnahme durch Assimilation entstehender Biomasse weit über das in einem offenen System mögliche Maß an. Schon bei m₀/m = 50 liegt der¹³C- Gehalt bei 1,21, wenn Algen oder andere C₃-Pflanzen eingesetzt werden.As the table shows, the ¹³ C content in the non-assimilated portion of carbon dioxide increases with increasing removal of biomass produced by assimilation far above the level possible in an open system. Even at m ₀ / m = 50, the ¹³ C content is 1.21 if algae or other C ₃ plants are used.

Aus der gegen Ende der Prozedur entstehenden Biomasse mit gegenüber natürlicher Biomasse in ausreichendem Maße erhöhtem ¹³C-Gehalt läßt sich mit bekannten Methoden in einem Zuge ein großer Teil der Palette der für ¹³C-Atemtests und andere Zwecke geeigneten ¹³C-markierten organischen Verbindungen herstellen: Speisen aus pflanzlicher (und mittelbar auch aus tierischer) Nahrung, Eiweiße, Fette, Kohlenhydrate, deren Hydrolysate, pflanzliche Wirkstoffe usw.A large part of the range of ¹³ C-labeled organic compounds suitable for ¹³ C breath tests and other purposes can be produced in one go from known biomass from the biomass which arises at the end of the procedure and has a sufficiently high ¹³ C content compared to natural biomass : Dishes from vegetable (and indirectly also from animal) food, proteins, fats, carbohydrates, their hydrolysates, plant-based substances, etc.

Je kleiner das Verhältnis Assimilation/Atmung ist, desto geringer ist unter sonst gleichen Bedingungen die nach dem erfindungsgemaßen Vorgehen erreichbare ¹³C- Anreicherung. Maßnahmen wie hohe Lichtintensität, intermittierende Beleuchtung, hoher Kohlendioxid-Eintrag in die Nährlösung, optimaler Kohlendioxid- und Sauerstoffgehalt in der Gasphase und optimale Zusammensetzung und Temperatur der Nährlösung, sind geeignet, den Anteil der Assimilation im Vergleich mit der Atmung zu erhöhen.The smaller the assimilation / breathing ratio, the lower the ¹³ C enrichment which can be achieved by the procedure according to the invention, the lower the conditions being otherwise the same. Measures such as high light intensity, intermittent lighting, high carbon dioxide input into the nutrient solution, optimal carbon dioxide and oxygen content in the gas phase and optimal composition and temperature of the nutrient solution are suitable for increasing the proportion of assimilation compared to breathing.

Gemäß Anspruch 2 ist die erreichbare ¹³C-Anreicherung umso größer, je kleiner die Biomasse-Portionen sind, die dem System jeweils entnommen werden.According to claim 2, the achievable ¹³ C enrichment is greater, the smaller the biomass portions that are removed from the system.

Bei der Umwandlung des an ¹³C angereicherten Rests an Kohlendioxid bzw. an einer mit Kohlendioxid in Isotopenaustausch tretenden chemischen Verbindung in Biomasse als Ausgangsmaterial für die Gewinnung ¹³C-markierter organischer Stoffe kann es - wie im Anspruch 3 formuliert ist - vorteilhaft sein, C₄-Pflanzen einzusetzen, insbesondere für den Fall, daß diese Umwandlung nicht ganz vollständig verläuft. (Bei vollständiger Umwandlung spielt dieser Aspekt keine Rolle.)When the ¹³ C-enriched residue of carbon dioxide or a chemical compound which is in an isotope exchange with carbon dioxide is converted into biomass as the starting material for the production of ¹³ C-labeled organic substances, it can be advantageous - as stated in claim 3 - C ₄ -Use plants, especially in the event that this conversion is not entirely complete. (This aspect does not matter when the conversion is complete.)

Die Ansprüche 4 und 5 bringen zum Ausdruck, daß das als Ausgangsmaterial verwendete Kohlendioxid bzw. die mit Kohlendioxid in raschem Kohlenstoff- Isotopenaustausch stehenden Substanz vorteilhaft aus einem natürlichen Karbonat, insbesondere aus Travertin, hergestellt werden sollte, das einen besonders hohen ¹³C- Gehalt aufweist.Claims 4 and 5 express that the carbon dioxide used as the starting material or the substance which is in rapid carbon-isotope exchange with carbon dioxide should advantageously be produced from a natural carbonate, in particular from travertine, which has a particularly high ¹³ C content .

Die Ansprüche 6, 7 und 8 betreffen im Prinzip bekannte Techniken zur Anzüchtung von Biomasse in relativ abgeschlossenen Systemen, durch deren Abwandlung erfindungsgemäße Bedingungen geschaffen werden können. Solche Anpassungen können sein das Ausbringen der Biomasse über Schleusen, die ein Austreten von Kohlendioxid-haltiger Luft aus dem System bzw. einen Eintritt von Kohlendioxid­ haltiger Luft in das System verhindern, das Bevorraten der anfänglichen Kohlendioxid- Menge innerhalb des Systems durch Kondensation, Adsorption, Absorption bzw. Chemisorption, die vorübergehende Entfernung des Kohlendioxids aus der Gasphase durch ebensolche Methoden zum Zwecke der Erneuerung der Gasphase u. a. Claims 6, 7 and 8 relate in principle to known techniques for growing Biomass in relatively closed systems, through their modification conditions according to the invention can be created. Such adjustments can be the spreading of the biomass over locks, which prevent leakage Air containing carbon dioxide from the system or an entry of carbon dioxide containing air into the system will prevent the initial carbon dioxide Quantity within the system through condensation, adsorption, absorption or Chemisorption, the temporary removal of carbon dioxide from the gas phase by such methods for the purpose of renewing the gas phase u. a.  

Für die Anzüchtung von Mikroalgen, die ebenfalls zu den C₃-Pflanzen gehören, lassen sich die erfindungsgemäßen Bedingungen ohne großen Aufwand erfüllen, was im Anspruch 9 zum Ausdruck gebracht wird.For the cultivation of microalgae, which also belong to the C ₃ plants, the conditions according to the invention can be met without great effort, which is stated in claim 9.

Wenn es um die Herstellung spezieller biologischer Wirkstoffe geht, die im Zuge des pflanzlichen Sekundärstoffwechsels synthetisiert werden, ist es, wie im Anspruch 10 zum Ausdruck gebracht wird, zweckmäßig, für die Anzucht in der letzten Phase entsprechende Drogenpflanzen zu benutzen. Gemäß Anspruch 3 ist dies besonders vorteilhaft, wenn diese Drogenpflanzen C₄-Pflanzen sind.When it comes to the production of special biological active substances which are synthesized in the course of the plant secondary metabolism, it is expedient, as stated in claim 10, to use appropriate drug plants for the cultivation in the last phase. According to claim 3, this is particularly advantageous if these drug plants are C ₄ plants.

Der Anspruch 11 drückt aus, daß das Anlegen eines großen Vorrats an Kohlenstoffverbindungen dadurch erleichtert werden kann, daß das zu assimilierende Kohlendioxid in Isotopenaustausch mit der wäßrigen Lösung eines Hydrogencarbonats oder einer anderen mit Kohlendioxid in raschem Kohlenstoff-Isotopenaustausch stehenden Substanz gebracht wird.The claim 11 expresses that the creation of a large supply Carbon compounds can be facilitated by the fact that the to be assimilated Carbon dioxide in isotope exchange with the aqueous solution of a bicarbonate or another with carbon dioxide in rapid carbon isotope exchange standing substance is brought.

Die erfindungsgemäßen Systeme lassen sich auch in mehreren Stufen hintereinanderschalten. Dies ist, wie Anspruch 12 zum Ausdruck bringt, insbesonders dann von Vorteil, wenn derjenige Anteil der in den letzten Etappen der jeweiligen Stufe erzeugten Biomasse und deren Folgeprodukte, der nicht für die Herstellung ¹³C- markierter Verbindungen verwertet wird, als an ¹³C angereichertes Ausgangsmaterial für folgende Schritte zur Herstellung ¹³C-markierter Stoffe herangezogen wird.The systems according to the invention can also be connected in series in several stages. As claim 12 expresses, this is particularly advantageous if the portion of the biomass produced in the last stages of the respective stage and its secondary products, which is not used for the production of ¹³ C-labeled compounds, as enriched in ¹³ C Starting material for the following steps for the production of ¹³ C-labeled substances is used.

AusführungsbeispielEmbodiment

Anhand eines Ausführungsbeispiels soll die Erfindung näher beschrieben werden (Fig. 1). In einer gasdicht abgeschlossenen, verglasten Kammer 1 befindet sich ein Behälter 2 mit einer für die Züchtung von Mikroalgen geeigneten Nährlösung. Ein Rührer 3 sorgt für einen raschen CO₂-Eintrag aus der Gasphase in die mit einer kleinen Menge der Alge Chlorella vulgaris beimpfte Nährlösung. Die Lampe 4 emittiert Licht (mit einem Intensitätsmaximum im grünen Spektralbereich), welches tagsüber das einfallende Tageslicht ergänzt und nachts an dessen Stelle tritt. Die Kammer 1, die über Rohrleitungen - Rohrleitungen für Gase sind in Fig. 1 durch Doppelstriche gekennzeichnet - wahlweise mit einer der beiden Füllkörperkolonnen 5 oder 6 verbunden werden kann, darf nur über die Schleuse 7 betreten und verlassen werden.The invention will be described in more detail using an exemplary embodiment ( FIG. 1). A container 2 with a nutrient solution suitable for growing microalgae is located in a gas-tight, glazed chamber 1 . A stirrer 3 ensures rapid CO ₂ entry from the gas phase into the nutrient solution inoculated with a small amount of the alga Chlorella vulgaris. The lamp 4 emits light (with an intensity maximum in the green spectral range), which supplements the incident daylight during the day and takes its place at night. Chamber 1 , which can be connected via pipes - pipes for gases are indicated by double dashes in FIG. 1 - optionally with one of the two packed columns 5 or 6 , may only be entered and exited via lock 7 .

Im normalen Betrieb der Apparatur sind die Dreiwege-Hähne 8, 9, 10 und 11 wie in Fig. 1 gezeigt eingestellt, so daß der Kompressor 12 die Luft aus der Kammer 1 ansaugt und über die Füllkörperkolonne 5 in die Kammer 1 zurückdruckt. In der Kolonne 5 rieselt der emporströmenden Luft eine wäßrige Kaliumhydrogencarbonat-Lösung entgegen, die von der Pumpe 13 aus dem Behälter 14 gefördert wird und nach Passieren der Kolonne 5 in diesen zurückläuft. (Rohrleitungen für Flüssigkeiten sind durch dicke Linien gekennzeichnet.) In dem Maße, wie die im Behälter 2 ablaufende Photosynthese der im System Kammer 1/Kolonne 5 zirkulierenden Gasphase CO₂ entzieht, dosiert die Pumpe 15 dem im System Behälter 14/Kolonne 5 zirkulierenden Flüssigkeitskreislauf verdünnte Schwefelsäure zu, die auf dem Wege der chemischen Reaktion
In normal operation of the apparatus, the three-way cocks 8 , 9 , 10 and 11 are set as shown in FIG. 1, so that the compressor 12 sucks in the air from the chamber 1 and presses it back into the chamber 1 via the packed column 5 . In the column 5, the upward flowing air flows against an aqueous potassium hydrogen carbonate solution, which is pumped out of the container 14 by the pump 13 and, after passing through the column 5 , runs back into the latter. (Pipelines for fluids are characterized by thick lines.) Withdraws In proportion as the elapsing in the container 2 photosynthesis of the circulating in the system chamber 1 / column 5 gas phase CO _2, the pump 15 metered the circulating in the system tray 14 / column 5 fluid circuit diluted sulfuric acid too, by way of chemical reaction

2 KHCO₃ + H₂SO₄ → K₂SO₄ + 2 H₂O + 2 CO₂
2 KHCO ₃ + H ₂ SO ₄ → K ₂ SO ₄ + 2 H ₂ O + 2 CO ₂

CO₂ freisetzt, welches das in Biomasse umgewandelte CO₂ substituiert und so einen für das Algenwachstum optimalen CO₂-Gehalt in der Gasphase aufrechterhält.Releases CO ₂ , which substitutes the CO ₂ converted into biomass and thus maintains an optimal CO ₂ content in the gas phase for algae growth.

Die in der Kolonne 5 ablaufende Isotopenaustauschreaktion
The isotope exchange reaction taking place in column 5

¹³CO₂ + KH¹²CO₃ → ¹²CO₂ + KH¹³CO₃
¹³ CO ₂ + KH ¹² CO ₃ → ¹² CO ₂ + KH ¹³ CO ₃

bewirkt, daß sich die durch Bevorzugung des ¹²CO₂ bei der Photosynthese zustandekommende ¹³C-Anreicherung im zirkulierenden CO₂ dem gelösten Hydrogencarbonat (ohne nennenswerte Veränderung des ¹³C-Gehalts) mitteilt. Dabei wird die in Form von gelöstem Hydrogencarbonat vorliegende Kohlenstoff-Menge groß gewählt im Vergleich mit der in der Gasphase zirkulierenden. Es resultieren dann Bedingungen, unter denen in einer geschlossenen Apparatur geringer Größe eine große Kohlenstoff-Menge auf dem Wege der pflanzlichen Photosynthese in Biomasse umgewandelt werden kann.has the effect that the ¹³ C accumulation in the circulating CO ₂ that occurs due to preference for ¹² CO ₂ during photosynthesis is communicated to the dissolved hydrogen carbonate (without any noteworthy change in the ¹³ C content). The amount of carbon present in the form of dissolved hydrogen carbonate is chosen to be large in comparison with that circulating in the gas phase. The result is conditions under which a large amount of carbon can be converted into biomass by plant photosynthesis in a closed, small-sized apparatus.

In gewissen Zeitabständen muß das geschilderte Betriebsregime allerdings unterbrochen werden, um die produzierte Biomasse zu entnehmen, die Nährlösung (durch Zusatz der verbrauchten Nährstoffe) zu regenerieren und die zirkulierende Luft (zum Zwecke der Aufrechterhaltung eines für das Wachstum der Algen günstigen Sauerstoff-Gehalts) zu erneuern. (Die Zeitabstände, in denen dies zu geschehen hat, sind nach dem Nutzen/Aufwand - Verhältnis zu bemessen: Je öfter die genannten Prozeduren ausgeführt werden, desto höher wird - unter sonst gleichen Bedingungen - die ¹³C-Anreicherung.)At certain intervals, however, the operating regime described must be interrupted in order to remove the biomass produced, to regenerate the nutrient solution (by adding the used nutrients) and to circulate the air (for the purpose of maintaining an oxygen content that is favorable for the growth of algae) renew. (The time intervals in which this has to be done are to be measured according to the benefit / effort ratio: the more often the mentioned procedures are carried out, the higher - under otherwise identical conditions - the ¹³ C enrichment.)

Es kann zweckmäßig sein, die drei genannten Operationen in einem Zuge durchzuführen. In jedem Falle wird wie folgt verfahren: Der Dreiwege-Hahn 9 wird um 180°, der Dreiwege-Hahn 10 im Uhrzeigersinne um 900 gedreht, so daß der Kompressor 12 die aus der Kammer 1 gesaugte Luft durch die Füllkörperkolonne 6 drückt, wo ihr von der Pumpe 16 aus dem Behälter 17 gesaugte Kalilauge entgegenrieselt, die das im Gaskreislauf befindliche CO₂ absorbiert und im Behälter 17 reserviert.It may be appropriate to carry out the three operations mentioned in one go. In each case, the procedure is as follows: the three-way valve 9 is rotated by 180 °, the three-way valve 10 clockwise by 900, so that the compressor 12 presses the air sucked out of the chamber 1 through the packed column 6 , where you from the pump 16 from the container 17 sucked potash lye, which absorbs the CO ₂ in the gas circuit and reserves it in the container 17 .

Nun kann die Kammer 1 über die Schleuse 7 betreten werden, nachdem diese (im Beisein des Bedieners) mit CO₂-freier Luft gespült worden ist. Der Bediener, der mit einem Atemgerät ausgestattet ist, das von außen mit der einzuatmenden Luft versorgt wird und die ausgeatmete Luft nach außen ableitet, trennt die jeweils gebildete Biomasse durch Zentrifugieren bzw. Filtrieren von der Nährlösung, wäscht das Sediment bzw. Filtrat (zur Entfernung von anhaftendem gelösten CO₂ bzw. Carbonat) mit Wasser, das - je nach dem Füllstand in den Behältern 2, 14 bzw. 17 - mit der Nährlösung vereinigt wird oder über die Pumpen 15 bzw. 18 in den Kreislauf zurückgeführt wird, regeneriert die Nährlösung und bereitet den Behälter 2 auf den nächsten Arbeitsgang vor, bevor er die Kammer 1 mit der gewonnenen Biomasse über die Schleuse 7 wieder verläßt.The chamber 1 can now be entered via the lock 7 after it has been flushed (in the presence of the operator) with CO ₂ -free air. The operator, who is equipped with a breathing apparatus that is supplied with the air to be inhaled from the outside and discharges the exhaled air to the outside, separates the biomass formed in each case from the nutrient solution by centrifuging or filtering, washing the sediment or filtrate (for removal of adhering dissolved CO ₂ or carbonate) with water, which - depending on the level in containers 2 , 14 or 17 - is combined with the nutrient solution or returned to the circuit via pumps 15 or 18 regenerates the nutrient solution and prepares the container 2 for the next work step before it leaves the chamber 1 with the biomass obtained via the lock 7 again.

Nachdem der Dreiwege-Hahn 8 um 180° und der Dreiwege-Hahn 11 im Gegenzeigersinn um 90° gedreht worden ist, kann der Gaskreislauf bei laufendem Kompressor 12 mit frischer Luft gespült werden, die mittels eines mit Natronkalk beschickten Absorbers CO₂-frei gemacht und der Kammer 1 über den Dreiwege-Hahn 11 zugeführt wird. Danach werden die Hähne 8 und 11 in die Position vor dem Spülen mit CO₂-freier Luft zurückversetzt, so daß der Kompressor 12 wieder den Gaskreislauf im System Kammer 1/Kolonne 6 in Gang setzt und hält. Nun wird über die Pumpe 18 soviel verdünnte Schwefelsäure zudosiert, wie für die Wiederfreisetzung des vorher gebundenen und im Behälter 17 reservierten CO₂ erforderlich ist.After the three-way faucet 8 has been turned 180 ° and the three-way faucet 11 in the counterclockwise direction by 90 °, the gas circuit can be flushed with fresh air while the compressor 12 is running, which is made CO ₂ -free and free by means of an absorber charged with soda lime the chamber 1 via the three-way valve 11 is supplied. Then the taps 8 and 11 are returned to the position before flushing with CO ₂ -free air, so that the compressor 12 starts the gas cycle in the chamber 1 / column 6 system and keeps it going. Now, as much dilute sulfuric acid is metered in via the pump 18 as is necessary for the re-release of the CO ₂ previously bound and reserved in the container 17 .

Anschließend wird der anfangliche, normale Betriebszustand (mit dem Gaskreislauf im System Kammer 1/Kolonne 5 und dem Flüssigkeitskreislauf im System Kolonne 5/­ Behälter 14) wiederhergestellt.Then the initial, normal operating state (with the gas circuit in the system chamber 1 / column 5 and the liquid circuit in the system column 5 / container 14 ) is restored.

Die im Laufe der ersten Etappen des ¹³C-Anreicherungsprozesses ausgeschleuste Biomasse ist hinsichtlich ihres ¹³C-Gehalts beinahe wertlos und kann in üblicher Weise verwertet werden (Fett- und Eiweißquelle für die tierische und menschliche Ernährung; im Falle des Einsatzes von Braunalgen: Gewinnung von Alginaten bzw. Agar-Agar; bei Rotalgen: Gewinnung von Agar-Agar oder Carageen). Sobald aber die Menge des zirkulierenden CO₂ und Hydrogencarbonats bis auf einen Rest von weniger als 1 bis 2% der Ausgangsmenge für die Synthese der Biomasse verbraucht ist, liegt der ¹³C-Gehalt in einer für die Ausführung von Atemtests interessanten Größenordnung. Die in den nun folgenden Phasen entstehende Biomasse kann also in bekannter Weise auf Substrate für ¹³C-Atemtests aufgearbeitet werden.The biomass discharged in the course of the first stages of the ¹³ C enrichment process is almost worthless in terms of its ¹³ C content and can be used in the usual way (source of fat and protein for animal and human nutrition; in the case of the use of brown algae: extraction of Alginates or agar-agar; in the case of red algae: extraction of agar-agar or carageen). However, as soon as the amount of circulating CO ₂ and hydrogen carbonate has been used up for a residue of less than 1 to 2% of the starting amount for the synthesis of the biomass, the ¹³ C content is of an order of magnitude which is interesting for the execution of breath tests. The biomass produced in the subsequent phases can thus be processed in a known manner on substrates for ¹³ C breath tests.

Wenn in dieser letzten Etappe anstelle von Mikroalgen C₄-Pflanzen, wie Mais oder Zuckerrohr, eingesetzt werden, so hat dies den Vorteil, daß eine nicht ganz vollständige Umwandlung des im Kreislauf verbliebenen Kohlenstoffs in Biomasse die erzielbare ¹³C-Anreicherung nicht so stark beeinträchtigt wie beim Festhalten an den Mikroalgen mit ihrem Calvin-Zyklus der Photosynthese.If C ₄ plants such as corn or sugar cane are used in this last stage instead of microalgae, this has the advantage that an incomplete conversion of the carbon remaining in the cycle into biomass does not impair the achievable ¹³ C accumulation so much like sticking to the microalgae with their Calvin cycle of photosynthesis.

Claims (12)

1. Verfahren zur Herstellung C-markierter Verbindungen durch Züchtung pflanzlicher Organismen in einer Kohlendioxid enthaltenden Atmosphäre, dadurch gekennzeichnet,

• - daß die Photosynthese, von einem begrenzten Vorrat an Kohlendioxid bzw. einer mit Kohlendioxid in raschem Kohlenstoff-Isotopenaustausch stehenden Substanz ausgehend, in einem System durchgeführt wird, dem kein Kohlenstoff zugeführt und dem Kohlenstoff ausschließlich oder überwiegend in Form von im Zuge der Assimilation entstandenen organischen Verbindungen entzogen wird und
• - daß die pflanzlichen Organismen, zumindest in den ersten Phasen der Aufzehrung des Vorrats, C₃-Pflanzen sind und
• - daß die in den letzten Phasen der Aufzehrung des Kohlendioxids durch Assimilation entstehende Biomasse entweder direkt als ¹³C-markierte Biomasse eingesetzt oder in einzelne ¹³C-markierte Fraktionen zerlegt wird.

1. A process for the production of C-labeled compounds by cultivating plant organisms in an atmosphere containing carbon dioxide, characterized in that

• - That the photosynthesis, starting from a limited supply of carbon dioxide or a substance which is in rapid carbon-isotope exchange with carbon dioxide, is carried out in a system to which no carbon is added and the carbon is obtained exclusively or predominantly in the form of organic resulting from the assimilation Connections are withdrawn and
• - That the plant organisms, at least in the first phases of the depletion of the stock, are C ₃ plants and
• - That the biomass produced in the last phases of the consumption of carbon dioxide by assimilation is either used directly as ¹³ C-labeled biomass or is broken down into individual ¹³ C-labeled fractions.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein großer Teil des Vorrats dem System in kleinen Portionen entzogen wird.2. The method according to claim 1, characterized in that a large part of the stock is withdrawn from the system in small portions. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein großer Teil des Vorrats durch C₃-Pflanzen aufgezehrt wird, während der Rest mittels C₄-Pflanzen möglichst vollständig in Biomasse verwandelt wird.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that a large part of the stock is consumed by C ₃ plants, while the rest is converted as completely as possible into biomass by means of C ₄ plants. 4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das als Ausgangsmaterial eingesetzte Kohlendioxid aus einem natürlichen Karbonat hergestellt wird.4. The method according to claim 1, 2 or 3, characterized in that the as Starting material used carbon dioxide made from a natural carbonate becomes. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das natürlichen Karbonat Travertin ist.5. The method according to claim 4, characterized in that the natural carbonate Is travertine. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzüchtung der Biomasse in einem luftdicht abgeschlossenen Gewächshaus erfolgt.6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the biomass is grown in an airtight greenhouse. 7. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzüch­ tung der Biomasse in einem Behälter erfolgt, der sich in einer luftdicht abgeschlossenen System befindet.7. The method according to claim 1, 2, 3, 4 or 5, characterized in that the cultivation The biomass is processed in a container that is sealed in an airtight manner System is located. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Behälter Algen gezüchtet werden.8. The method according to claim 7, characterized in that in the container algae be bred. 9. Verfahren nach Anspruch 6, 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewächshaus bzw. das luftdicht abgeschlossene System mit einem Kühlaggregat, in dem Kohlendioxid bevorratet ist, in einem Kreislauf zusammengeschlossen ist. 9. The method according to claim 6, 7 or 8, characterized in that the greenhouse or the airtight system with a cooling unit in which Carbon dioxide is stored in a cycle.   10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Pflanzen gezüchtet werden, die spezielle, für die Ausführung von ¹³C-Atemtests benötigte biologische Wirkstoffe synthetisieren.10. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that plants are grown which synthesize special biological agents required for the execution of ¹³ C breath tests. 11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Kohlendioxid-Vorrat mit einem ebenfalls begrenzten, aber größeren Vorrat der wäßrigen Lösung einer mit Kohlendioxid in Isotopenaustausch tretenden chemischen Verbindung in Isotopenaustausch gebracht wird.11. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the carbon dioxide stock with an equally limited but larger stock of aqueous solution of a chemical entering into isotope exchange with carbon dioxide Connection is brought into isotope exchange. 12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß derjenige Anteil der in den letzten Etappen erzeugten Biomasse und deren Folgeprodukte, der nicht für die Herstellung ¹³C-markierter Verbindungen verwertet wird, als an ¹³C angereichertes Ausgangsmaterial für weitere Schritte zur Herstellung ¹³C-markierter Verbindungen herangezogen wird.12. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that that portion of the biomass produced in the last stages and its secondary products, which is not used for the production of ¹³ C-labeled compounds, as ¹³ C enriched starting material for further steps in the production ¹³ C-labeled compounds is used.