DE19817921A1 - New mycobacterial mutants used to screen for antibiotic vectors - Google Patents

New mycobacterial mutants used to screen for antibiotic vectors

Info

Publication number
DE19817921A1
DE19817921A1 DE19817921A DE19817921A DE19817921A1 DE 19817921 A1 DE19817921 A1 DE 19817921A1 DE 19817921 A DE19817921 A DE 19817921A DE 19817921 A DE19817921 A DE 19817921A DE 19817921 A1 DE19817921 A1 DE 19817921A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
mutant
gene
mycobacterium smegmatis
mutants
exochelin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19817921A
Other languages
German (de)
Inventor
Giesbert Schumann
Ute Moellmann
Irmgard Heinemann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gruenenthal GmbH
Original Assignee
Gruenenthal GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gruenenthal GmbH filed Critical Gruenenthal GmbH
Priority to DE19817921A priority Critical patent/DE19817921A1/en
Priority to CA002325604A priority patent/CA2325604A1/en
Priority to JP2000544786A priority patent/JP2003527066A/en
Priority to CN99807501A priority patent/CN1309703A/en
Priority to KR1020007011550A priority patent/KR20010078706A/en
Priority to AU34214/99A priority patent/AU765518B2/en
Priority to NZ507541A priority patent/NZ507541A/en
Priority to PL99346020A priority patent/PL346020A1/en
Priority to PCT/EP1999/002438 priority patent/WO1999054454A1/en
Priority to HU0101563A priority patent/HUP0101563A2/en
Priority to IL13899799A priority patent/IL138997A0/en
Priority to SK1534-2000A priority patent/SK15342000A3/en
Priority to BR9909780-0A priority patent/BR9909780A/en
Priority to EP99915755A priority patent/EP1071761A1/en
Priority to ARP990101725A priority patent/AR019070A1/en
Priority to UY25475A priority patent/UY25475A1/en
Priority to PE1999000305A priority patent/PE20000462A1/en
Priority to CO99022537A priority patent/CO4990995A1/en
Publication of DE19817921A1 publication Critical patent/DE19817921A1/en
Priority to NO20005129A priority patent/NO20005129L/en
Priority to ZA200005674A priority patent/ZA200005674B/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/32—Mycobacterium
    • C12R2001/34—Mycobacterium smegmatis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Mycobacterial mutants (A) in which (i) the genes involved in biosynthesis of mycobactin are inactivated and/or (ii) the genes that encode components of the exochelin-mediated iron uptake system have been switched off by gene replacement or by insertional or deletional inactivation, are new. Independent claims are also included for the following; 1) a method of screening for potential antibiotic vectors using (A) to identify siderophores that are transported into mycobacteria independently of the exochelin/mycobactin transport system; and 2) the mutant Mycobacterium smegmatis strains M24 and B1 (DSM 12085)

Description

Mykobakterielle Infektionen stellen ein zunehmendes Problem dar. Verschärft wird die Situation durch das Auftreten von Mykobakterienstämmen mit breiter Resistenz gegen die zur Verfügung stehenden Chemotherapeutika. Die Suche nach neuen Wirkstoffen und Wirkmechanismen ist somit ein vordringliches Problem.Mycobacterial infections are an increasing problem Situation due to the appearance of mycobacterial strains with broad resistance to the available chemotherapy drugs. The search for new active ingredients and Mechanisms of action is therefore a pressing problem.

Ein wesentlicher, begrenzender Faktor für die antimykobakterielle Wirkung von Chemotherapeutika besteht in der geringen Permeabilität der mykobakteriellen Zellwand (Suzuki, A. E., Inamine, J. M.: Res.Microbiol. 145, 1994, 210-213; Jarlier, V., Nikaido, H.: FEMS Microbiol.Lett. 123, 1994, 11-18).An essential, limiting factor for the antimycobacterial effect of Chemotherapy drugs consist in the low permeability of the mycobacterial cell wall (Suzuki, A.E., Inamine, J.M .: Res.Microbiol. 145, 1994, 210-213; Jarlier, V., Nikaido, H .: FEMS Microbiol.Lett. 123, 1994, 11-18).

Ein methodisches Konzept für die Überwindung dieser Barriere ist die Kopplung von Antibiotika an Vektoren, die vom pathogenen Mikroorganismus aktiv aufgenommen werden.A methodical concept for overcoming this barrier is the coupling of Antibiotics on vectors that are actively absorbed by the pathogenic microorganism become.

Als solche Vektoren können Eisenchelatoren (Siderophore) eingesetzt werden. Unter den Eisenmangel-Bedingungen am Infektionsort bilden viele pathogene Mikroorganismen Siderophore, die in das Medium ausgeschieden werden. Ferri-Siderophore werden von spezifischen Rezeptoren an der Zelloberfläche gebunden und von ATP-abhängigen Permeasen in das Zellinnere transportiert. Bei gram-negativen Mikroorganismen ist bekannt, daß sie außer den von ihnen selbst produzierten Siderophoren auch solche aufnehmen können, die von anderen Arten gebildet werden (Xenosiderophore). Über die Eisenaufnahmesysteme von Mykobakterien ist relativ wenig bekannt (Übersicht: Wheeler, P. R., Ratledge, C.: in Bloom, B. R. ed.: Tuberculosis, ASM Press, Washington, DC, 1994). Man kennt bisher zwei Typen von Siderophoren, die membrangebundenen lipophilen Mycobactine (Snow, G. A.: Bacteriological Reviews 34, 1970, 99-125) und die extrazellulären hydrophilen Exocheline (Macham, L. P. et al.: J.Gen.Microbiol. 101, 1977, 41-49; Hall, R., Ratledge, C.: J.Gen.Microbiol. 133, 1987, 193-199). Die Strukturen der Exocheline, die von Mycobacterium smegmatis (Sharman et al.: Biochem.J. 305, 1995, 187-196), M. neoaurum (Sharman et al.: Chemistry & Biology 2, 1995, 553-561) und M. tuberculosis (Gobin et al.: Proc.Natl.Acad.Sci. USA 92, 1995, 5189-5193 ) gebildet werden, konnten ermittelt werden. Ebenso wurden die Strukturen verschiedener Mycobactine bestimmt (Snow, G. A.: Bacteriol.Rev. 34, 1970, 99-125).Iron chelators (siderophores) can be used as such vectors. Among the Iron deficiency conditions at the site of infection form many pathogenic microorganisms Siderophores that are excreted in the medium. Ferri siderophores are made by specific receptors bound to the cell surface and dependent on ATP Permeases transported into the cell interior. With gram-negative microorganisms known that in addition to the siderophores they produced themselves, they also have can take up, which are formed by other kinds (Xenosiderophore). Relatively little is known about the iron uptake systems of mycobacteria (overview: Wheeler, P.R., Ratledge, C .: in Bloom, B.R. ed .: Tuberculosis, ASM Press, Washington, DC, 1994). Two types of siderophores are known to date, the membrane-bound ones lipophilic mycobactins (Snow, G.A .: Bacteriological Reviews 34, 1970, 99-125) and the extracellular hydrophilic exocheline (Macham, L.P. et al .: J.Gen.Microbiol. 101, 1977, 41-49; Hall, R., Ratledge, C .: J.Gen.Microbiol. 133, 1987, 193-199). The structures of the Exocheline produced by Mycobacterium smegmatis (Sharman et al .: Biochem. J. 305, 1995, 187-196), M. neoaurum (Sharman et al .: Chemistry & Biology 2, 1995, 553-561) and M. tuberculosis (Gobin et al .: Proc.Natl.Acad.Sci. USA 92, 1995, 5189-5193) could be determined. The structures were also different Mycobactine determined (Snow, G.A .: Bacteriol.Rev. 34, 1970, 99-125).

Bei M. smegmatis wurden erste Gene identifiziert, die in die Biosynthese des Exochelins und wahrscheinlich in der Aufnahme von Ferri-Exochelin involviert sind (Fiss, E. H. et al.: Molecular Microbiology 14, 1994, 557-569). Die von drei der vier gefundenen ORFs (fxuA, fxuB, fxuC) abgeleiteten Proteine zeigen Homologie zu Membranproteinen von E. coli, die an der Aufnahme von Enterobactin beteiligt sind. Man nimmt daher an, daß es sich hierbei um Untereinheiten der Ferri-Exochelin-Permease handelt. Ein funktioneller Beweis dafür wurde bisher nicht erbracht. Der vierte ORF (fxbA) kodiert für ein Protein, das an der Biosynthese des Exochelins beteiligt ist. Dies konnte durch Komplementation einer Biosynthesemutante nachgewiesen werden.In M. smegmatis, the first genes were identified that are involved in the biosynthesis of exochelin and are probably involved in the uptake of Ferri-Exochelin (Fiss, E.H. et al .: Molecular Microbiology 14, 1994, 557-569). That of three of the four ORFs found (fxuA, fxuB, fxuC) derived proteins show homology to membrane proteins of E. coli that are involved in the uptake of enterobactin. It is therefore believed that these are subunits of the ferri-exochelin permease. A functional one No proof of this has so far been provided. The fourth ORF (fxbA) encodes a protein which is involved in the biosynthesis of exochelin. This could be done through complementation of a mutant biosynthesis.

Der Eisentransportprozeß via Exochelin/Mycobactin ist im Detail nicht charakterisiert. Ebenso ist bisher wenig über die Aufnahme von Xenosiderophoren durch Mykobakterien bekannt. Es konnte bisher nur gezeigt werden, daß M. smegmatis verschiedene Xenosiderophore nutzen kann (Matzanke, B. F. et al.: BioMetals 10, 1997, 193-203). Die Frage, ob diese Xenosiderophore über spezifische Aufnahmesysteme in die Zelle transportiert werden und damit potentielle Antibiotika-Vektoren darstellen, kann bisher nur mit sehr aufwendigen Methoden der Mössbauer-Spektroskopie beantwortet werden (Matzanke, B. F.: Hyperfine Interactions 112, 1998, 123-128). Diese Methode ist für ein Screening ungeeignet, da sie eine sehr aufwendige Ausrüstung erfordert und sehr zeitaufwendig ist. Damit ist diese Methode auf wenige, hochspezialisierte Labors beschränkt und erlaubt nur einen sehr begrenzten Probendurchsatz.The iron transport process via exochelin / mycobactin is not characterized in detail. So far, little has been said about the uptake of xenosiderophores by mycobacteria known. So far it could only be shown that M. smegmatis different Xenosiderophore can use (Matzanke, B.F. et al .: BioMetals 10, 1997, 193-203). The Question whether these xenosiderophores enter the cell via specific uptake systems can be transported and thus represent potential antibiotic vectors, so far can only be answered with very complex methods of Mössbauer spectroscopy (Matzanke, B.F .: Hyperfine Interactions 112, 1998, 123-128). This method is for one Screening unsuitable because it requires very expensive equipment and very much  is time consuming. So this method is on a few, highly specialized laboratories limited and allows only a very limited sample throughput.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine ökonomische und effektive Screeningmethode nach potentiellen Antibiotika-Vektoren zu entwickeln. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß in geeigneten Testverfahren Mutanten von Mykobakterien eingesetzt werden, bei denen unterschiedliche Komponenten des Exochelin/Mycobactin-Transportsystems ausgeschaltet wurden.The invention has for its object an economical and effective To develop a screening method for potential antibiotic vectors. According to the invention the object is achieved in that in suitable test procedures Mutants of mycobacteria are used in which different Components of the exochelin / mycobactin transport system have been switched off.

Die Erfindung betrifft demgemäß ein Verfahren zum Screening nach potentiellen Antibiotika-Vektoren für Mykobakterien, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß Mykobakterien-Mutanten, in denen Gene inaktiviert wurden, welche für Komponenten des siderophorvermittelten Eisenaufnahmesystems kodieren, in geeigneten Testverfahren eingesetzt werden, welche es gestatten, solche Siderophore zu erkennen, die unabhängig vom Exochelin/Mycobactin-Transportsystem in die Mykobakterienzelle transportiert werden.The invention accordingly relates to a method for screening for potential Antibiotic vectors for mycobacteria, which is characterized in that Mycobacteria mutants in which genes have been inactivated, which are responsible for components encode the siderophore-mediated iron intake system in suitable test procedures are used, which make it possible to recognize such siderophores that are independent transported from the exochelin / mycobactin transport system into the mycobacterial cell become.

Ein erfindungsgemäß geeignetes Testverfahren ist ein Wachstumsförderungstest auf festen Medien. Dazu werden die Mutanten auf einem Eisenmangel-Medium kultiviert und die zu testenden Siderophore zu begrenzten Arealen der Testplatte zugegeben. Eine Förderung des Wachstums der Mutanten in solchen Arealen zeigt, ob das von den Testsubstanzen bereitgestellte Eisen von den Mutanten genutzt werden kann.A test method suitable according to the invention is a growth promotion test on solid Media. For this purpose, the mutants are cultivated on an iron deficiency medium and the too added testing siderophores to limited areas of the test plate. A promotion the growth of the mutants in such areas shows whether this is due to the test substances provided iron can be used by the mutants.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß mit dieser einfachen Screeningmethode, die einen hohen Durchsatz erlaubt, Siderophore gefunden werden können, die unabhängig vom Exochelin/Mycobactin-Transportsystem in die Zelle transportiert werden. Mit dieser Methode kann unter Einsatz der unterschiedlichen Mutanten nach solchen Siderophoren gescreent werden, die keinen Ligandenaustausch mit Exochelin oder Mycobactin eingehen. Nur solche Siderophore stellen potentielle Antibiotika-Vektoren dar, da diese Substanzen anderenfalls nicht in die Zelle transportiert werden. Weiterhin ist die erfindungsgemäße Screening-Methode nicht auf Wachstumsförderungstests auf festen Medien beschränkt. Sie umfaßt ebenfalls Wachstumsförderungstests in flüssigen Medien sowie Testverfahren, bei denen die Aufnahme von 55Fe durch die Mutanten in an sich bekannter Weise gemessen wird.Surprisingly, it was found that with this simple screening method, which allows high throughput, siderophores can be found which are transported into the cell independently of the exochelin / mycobactin transport system. Using this method, different mutants can be used to screen for siderophores that do not undergo ligand exchange with exochelin or mycobactin. Only such siderophores represent potential antibiotic vectors, since otherwise these substances are not transported into the cell. Furthermore, the screening method according to the invention is not restricted to growth promotion tests on solid media. It also includes growth promotion tests in liquid media and test methods in which the uptake of 55 Fe by the mutants is measured in a manner known per se.

Die in das erfindungsgemäße Screeningverfahren eingesetzten Mutanten von Mykobakterien werden hergestellt, indem Gene inaktiviert wurden, welche für Komponenten des siderophorvermittelten Eisenaufnahmesystems kodieren, wobei die Inaktivierung der Gene in an sich bekannter Weise entweder a) durch Mutagenese mittels chemischer bzw. physikalischer Mutagene, oder b) durch "gene replacement", d. h. Austausch des kompletten Genes bzw. von Teilen des Genes gegen ein Markergen, z. B. das Kanamycinresistenz-Markergen, oder c) durch Insertionsinaktivierung (Inaktivierung durch Insertion eines Markergens, z. B. des Kanamycinresistenz-Gens) oder Deletionsinaktivierung (Inaktivierung durch Deletion eines Teiles des Gens oder des ganzen Gens), oder d) durch eine Kombination der vorgenannten Methoden erfolgt. Der Einsatz verschiedener Mutanten, die in definierten, einzelnen Komponenten des Exochelin/Mycobactin-Transportsystems geblockt sind, in diesem relativ einfachen Verfahren erlaubt es auch, zusätzliche Informationen darüber zu gewinnen, inwieweit einzelne Komponenten dieses Transportsystems an der Aufnahme von Xenosiderophoren beteiligt sind.The mutants of Mycobacteria are made by inactivating genes that are responsible for Coding components of the siderophore-mediated iron absorption system, the Inactivation of the genes in a manner known per se either a) by means of mutagenesis chemical or physical mutagens, or b) by "gene replacement", d. H. Exchange of the complete gene or parts of the gene for a marker gene, e.g. B. the kanamycin resistance marker gene, or c) by insertion inactivation (inactivation by inserting a marker gene, e.g. B. the kanamycin resistance gene) or Deletion inactivation (inactivation by deletion of a part of the gene or the whole gene), or d) by a combination of the aforementioned methods. The use of different mutants that are defined in individual components of the Exochelin / Mycobactin transport system are blocked in this relatively simple The procedure also allows additional information to be obtained on the extent to which individual components of this transport system on the uptake of xenosiderophores involved.

Für die Erzeugung eines Mutantenspektrums, welches möglichst alle wesentlichen Komponenten des Exochelin/Mycobactin-Transportsystems umfaßt, war es notwendig, das gesamte Kluster der Ferri-Exochelin-Aufnahmegene zu kennen. Deshalb wurde der an fxuC angrenzenden Chromosomenabschnitt eines Mycobacterium smegmatis-Stammes, derjenige von M. smegmatis mc2155 (Snapper et al.: Mol Microbiol 4, 1990, 1911-1919), kloniert und darauf im Rahmen der Erfindung zwei weitere, neue ORFs (fxuD, fxuE) identifiziert, die mit großer Wahrscheinlichkeit zum Kluster der Ferri-Exochelin-Auf­ nahmegene gehören. In Abb. 1 ist die Restriktionskarte des gesamten Exochelin-Gen­ klusters, einschließlich der neu gefundenen ORFs, dargestellt.For the generation of a mutant spectrum, which includes all essential components of the exochelin / mycobactin transport system, it was necessary to know the entire cluster of the ferri-exochelin uptake genes. For this reason, the chromosome section of a Mycobacterium smegmatis strain adjacent to fxuC, that of M. smegmatis mc 2 155 (Snapper et al .: Mol Microbiol 4, 1990, 1911-1919), was cloned and then two further new ORFs within the scope of the invention (fxuD, fxuE) identified, which are very likely to belong to the cluster of the ferri-exochelin uptake genes. Fig. 1 shows the restriction map of the entire exochelin gene cluster, including the newly found ORFs.

Die erfindungsgemaße Screening-Methode wird unter Verwendung von Mutanten von Mycobacterium smegmatis exemplifiziert. Anstelle dieser Spezies können in analoger Weise auch entsprechende Mutanten anderer schnellwachsender Mykobakterien-Spezies, wie z. B. Mycobacterium phlei, M. vaccae, M. aurum, M. fortuitum oder M. chelonae eingesetzt werden. Weiterhin ist auch die Verwendung von Mutanten langsamwachsender Mykobakterien-Arten wie M. bovis, M. avium oder M. tuberculosis möglich.The screening method according to the invention is carried out using mutants of Mycobacterium smegmatis exemplified. Instead of this species can in analog Corresponding mutants of other fast-growing mycobacterial species, such as B. Mycobacterium phlei, M. vaccae, M. aurum, M. fortuitum or M. chelonae be used. Furthermore, the use of mutants is slow growing Mycobacterial species such as M. bovis, M. avium or M. tuberculosis possible.

Die folgenden smegmatis-Stämme wurden am 2. 4. 1998 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig (DSMZ), hinterlegt: Mycobacterium smegmatis M24 (DSM 12084), M. smegmatis B1 (DSM 12085) und Escherichia coli TOP10F' pGS4 (DSM 12083).The following smegmatis strains were on April 2, 1998 at the German Collection of Microorganisms and cell cultures GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig (DSMZ), deposited: Mycobacterium smegmatis M24 (DSM 12084), M. smegmatis B1 (DSM 12085) and Escherichia coli TOP10F 'pGS4 (DSM 12083).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Mutanten von Mykobakterien-Spezies, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in die Biosynthese des Mycobactins involvierte Gene inaktiviert wurden und/oder daß Gene, welche für Komponenten des Exochelin-ver­ mittelten Eisenaufnahmesystems kodieren, mittels gene replacement, Deletions- oder Insertionsinaktivierung ausgeschaltet wurden.The invention further relates to mutants of mycobacterial species which characterized in that genes involved in the biosynthesis of mycobactin have been inactivated and / or that genes which are responsible for components of the Exochelin-ver code the mean iron absorption system, by means of gene replacement, deletion or Insertion deactivation were switched off.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Mykobakterien-Mutanten, in denen in die Biosynthese des Mycobactins involvierte Gene inaktiviert wurden.In a preferred embodiment, the invention relates to mycobacterial mutants, in which have been inactivated genes involved in the biosynthesis of mycobactin.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Mykobakte­ rien-Mutanten, in denen mittels gene replacement, Deletions- oder Insertionsinaktivierung eines oder mehrere Gene, welche für Komponenten des Exochelin-vermittelten Eisenaufnahmesystems kodieren, ausgewählt aus fxbA, fxuA, fxuC, fxuD und fxuE, ausgeschaltet wurden und gegebenenfalls zusätzlich in die Biosynthese des Mycobactins involvierte Gene inaktiviert wurden.In a further preferred embodiment, the invention relates to mycobacts rien mutants, in which by means of gene replacement, deletion or insertion inactivation of a or multiple genes mediated for components of the exochelin Encode iron receiving system, selected from fxbA, fxuA, fxuC, fxuD and fxuE, were switched off and, if necessary, additionally in the biosynthesis of mycobactin involved genes were inactivated.

Insbesondere betrifft die Erfindung die in den Beispielen genannten Mutanten von Mykobakterien, vor allem von Mycobacterium smegmatis.In particular, the invention relates to the mutants of Mycobacteria, especially Mycobacterium smegmatis.

In den folgenden Beispielen wird die Erfindung exemplifiziert; die Beispiele sind aber in keiner Weise als Einschränkung der Erfindung zu verstehen.The invention is exemplified in the following examples; the examples are in in no way to be understood as a limitation of the invention.

Ausführungsbeispiel 1Embodiment 1 Erzeugung der Mutante Mycobacterium smegmatis M24Generation of the mutant Mycobacterium smegmatis M24

Zur Erzeugung einer Mutante, bei der wesentliche Funktionen in der Biosynthese des Mycobactins geblockt sind, wird der Stamm Mycobacterium smegmatis mc2155 (Snapper et al.: Mol Microbiol 4, 1990, 1911-1919 ) einer chemischen Mutagenese mittels N-Nitrosomethyl-N-nitro-guanidin unterzogen. Unter den überlebenden Zellen wird die Mutante M. smegmatis M24 (DSM 12084) aufgrund der fehlenden UV-Fluoreszenz isoliert. Der Nachweis der fehlenden Mycobactin-Akkumulation erfolgt über HPLC und Electrospray-Massenspektrometrie. Die Exochelin-Biosynthese wurde durch die Mutagenese nicht beeinflußt. To generate a mutant in which essential functions in the biosynthesis of mycobactin are blocked, the strain Mycobacterium smegmatis mc 2 155 (Snapper et al .: Mol Microbiol 4, 1990, 1911-1919) is subjected to chemical mutagenesis using N-nitrosomethyl-N -nitro-guanidine. The mutant M. smegmatis M24 (DSM 12084) is isolated from the surviving cells due to the lack of UV fluorescence. The lack of mycobactin accumulation is demonstrated by HPLC and electrospray mass spectrometry. Exochelin biosynthesis was not affected by the mutagenesis.

Ausführungsbeispiel 2Embodiment 2 Erzeugung der Mutanten Mycobacterium smegmatis B1 und B3Generation of the mutants Mycobacterium smegmatis B1 and B3

Die Deletion des Genes fxbA erfolgt durch "gene replacement", bei dem das komplette Gen gegen die Kanamycin-Resistenzkassette aus pUC4K (Pharmacia Biotech Europe GmbH) ausgetauscht wird. Das dafür notwendige Plasmid pGS31 (Abb. 2) wird wie folgt konstruiert:
Die an das zu deletierende Gen angrenzenden Chromosomenabschnitte in der Mutante M24 werden als das 507 bp große Fragment B7/8 bzw. das 758 bp große Fragment B5/6 mittels PCR gewonnen. Folgende Oligonucleotide werden als "primer" für die PCR eingesetzt:
Fragment B7/8: CAGGATCCATTGGTAAGCCTTACC
GATCTAGAGCTGGTTCAGGGCATG
Fragment B5/6: ACGAATTCACACGCCAGAGAACGC
CAGGATCCTGATCTGGCAATTCCAG.The deletion of the fxbA gene is carried out by "gene replacement", in which the complete gene is exchanged for the kanamycin resistance cassette made of pUC4K (Pharmacia Biotech Europe GmbH). The plasmid pGS31 ( Fig. 2) required for this is constructed as follows:
The chromosome sections in mutant M24 adjacent to the gene to be deleted are obtained as the 507 bp fragment B7 / 8 or the 758 bp fragment B5 / 6 by means of PCR. The following oligonucleotides are used as "primers" for PCR:
Fragment B7 / 8: CAGGATCCATTGGTAAGCCTTACC
GATCTAGAGCTGGTTCAGGGCATG
Fragment B5 / 6: ACGAATTCACACGCCAGAGAACGC
CAGGATCCTGATCTGGCAATTCCAG.

Dabei werden die künstlichen Restriktionsorte eingeführt, die es gestatten, beide Fragmente in der gleichen Orientierung, die sie auf dem Chromosom haben, benachbart zur Kanamycin-Resistenzkassette in den Vektor pUC118 (Boehringer Ingelheim Bioproducts) zu klonieren. Dabei entsteht das Plasmid pGS31 (Abb. 2).The artificial restriction sites are introduced, which make it possible to clone both fragments in the same orientation that they have on the chromosome, adjacent to the kanamycin resistance cassette, into the vector pUC118 (Boehringer Ingelheim Bioproducts). This creates the plasmid pGS31 ( Fig. 2).

Der Stämme M. smegmatis mc2155 und M24 werden mit dem Plasmid pGS31 transformiert und Kanamycin-resistente Transformanten selektiert. Diese Klone werden auf ihr Biosynthesevermögen für Exochelin überprüft. Von den Transformanten des Stammes mc2155 wird der Klon M. smegmatis B1 (DSM 12085) und von den Transformanten des Stammes M24 der Klon M. smegmatis B3 isoliert, von denen kein Exochelin ausgeschieden wird. Mittels PCR wird nachgewiesen, daß der gefundene Exochelin-negative Phänotyp auf dem Austausch von fxbA gegen die Kanamycin-Resistenz­ kassette beruht. Dieser Austausch wird durch homologe Rekombination zwischen den in pGS31 klonierten, chromosomalen Fragmenten und den homologen Bereichen des Chromosoms bewirkt.The strains M. smegmatis mc 2 155 and M24 are transformed with the plasmid pGS31 and kanamycin-resistant transformants are selected. These clones are checked for their biosynthetic capacity for exochelin. Clone M. smegmatis B1 (DSM 12085) is isolated from the transformants of the mc 2 155 strain and clone M. smegmatis B3 from the M24 strain, from which no exochelin is excreted. By means of PCR it is demonstrated that the exochelin-negative phenotype found is based on the exchange of fxbA for the kanamycin resistance cassette. This exchange is brought about by homologous recombination between the chromosomal fragments cloned in pGS31 and the homologous regions of the chromosome.

Ausführungsbeispiel 3Embodiment 3 Erzeugung der Mutante Mycobacterium smegmatis U1Generation of the mutant Mycobacterium smegmatis U1

Die Deletion des Genes fxuA erfolgt durch "gene replacement" analog dem Ausführungsbeispiel 2. Das dafür notwendige Plasmid pGS22 wird wie folgt konstruiert:
Die an fxuA angrenzenden Chromosomenabschnitte in der Mutante M24 werden als das 768 bp große Fragment U1/5 bzw. das 755 bp große Fragment U6/7 mittels PCR gewonnen. Folgende Oligonucleotide werden als "primer" für die PCR eingesetzt:
Fragment U1/5: ACGAATTCGAGATCCTCGGCATCAAC
CAGGATCCTGGCGCTTCCCGAAATC
Fragment U6/7: GAGGATCCTGAAAGAACATATGACTC
TATCTAGACAAGATCGGCCGACATC.The deletion of the gene fxuA is carried out by "gene replacement" analogous to embodiment 2. The plasmid pGS22 required for this is constructed as follows:
The chromosome sections adjacent to fxuA in mutant M24 are obtained as the 768 bp fragment U1 / 5 or the 755 bp fragment U6 / 7 by means of PCR. The following oligonucleotides are used as "primers" for PCR:
Fragment U1 / 5: ACGAATTCGAGATCCTCGGCATCAAC
CAGGATCCTGGCGCTTCCCGAAATC
Fragment U6 / 7: GAGGATCCTGAAAGAACATATGACTC
TATCTAGACAAGATCGGCCGACATC.

Dabei werden die künstlichen Restriktionsorte eingeführt, die es gestatten, beide Fragmente, in der gleichen Orientierung die sie auf dem Chromosom haben, benachbart zur Kanamycin-Resistenzkassette in den Vektor pUC118 zu klonieren. Dabei entsteht pGS22 (Abb. 3). Der Stamm M24 wird mit dem Plasmid pGS22 transformiert und Kanamy­ cin-resistente Transformanten werden selektiert. Aus diesen Klonen wird die Deletionsmutante M. smegmatis U1 auf Grund ihres Phänotypes selektiert. Die Deletion von fxuA führt dazu, daß die Mutante U1 kein Ferri-Exochelin mehr aufnehmen kann. Der dem gefundenen Phänotyp zu Grunde liegende Austausch von fxuA gegen die Kanamycin-Resistenz­ kassette durch homologe Rekombination wird mittels PCR nachgewiesen.The artificial restriction sites are introduced which allow both fragments, in the same orientation as they have on the chromosome, to be cloned into the vector pUC118 adjacent to the kanamycin resistance cassette. This creates pGS22 ( Fig. 3). The strain M24 is transformed with the plasmid pGS22 and Kanamy cin-resistant transformants are selected. The deletion mutant M. smegmatis U1 is selected from these clones on the basis of their phenotype. The deletion of fxuA means that the mutant U1 can no longer take up ferri exochelin. The exchange of fxuA for the kanamycin resistance cassette on which the found phenotype is based by homologous recombination is detected by means of PCR.

Ausführungsbeispiel 4Embodiment 4 Erzeugung der Mutante Mycobacterium smegmatis U5Generation of the mutant Mycobacterium smegmatis U5

Die Inaktivierung des Genes fxuC erfolgt durch Integration der Kanamycin-Resistenz­ kassette innerhalb des Genes. Die Transkriptionsrichtung des Kanamycin-Resistenz­ genes wird dabei entgegengesetzt zu der von fxuC gewählt, um polare Effekte auf fxuA und fxuB möglichst zu vermeiden. Dafür wird das 725 bp große KpnI-PstI-Frag­ ment (Fragment 1, Abb. 1) in pUC118 subkloniert. Fragment 1 wird aus pGS4, erhältlich aus E. coli TOP10F' pGS4 (DSM 12083), gewonnen. pGS4 ist ein pUC118-Deri­ vat, dessen Insert den in Abb. 1 dargestellten Bereich von Fragment 1 und Fragment 3 enthält. In den internen BamHI-Restriktionsort wird die Kanamycin-Resistenzkassette in der entsprechenden Orientierung kloniert. Dabei entsteht das Plasmid pGS52 (Abb. 4). Der Stamm M24 wird mit pGS52 transformiert und Kanamycin-resistente Transformanten selektiert. Aus diesen Klonen wird die Insertionsmutante M. smegmatis U5 auf Grund ihres Phänotypes selektiert. Bei dieser Mutante ist durch homologe Rekombination das Gen fxuC im Chromosom gegen die in pGS52 klonierte und durch Insertion von KanR inaktivierte Kopie von fxuC ausgetauscht. Die Insertion von KanR in fxuC führt dazu, daß die Mutante U5 kein Ferri-Exochelin mehr aufnehmen kann. Die nach dem gefundenen Phänotyp postulierte Integration wird mittels PCR nachgewiesen.The fxuC gene is inactivated by integrating the kanamycin resistance cassette within the gene. The direction of transcription of the kanamycin resistance gene is chosen opposite to that of fxuC in order to avoid polar effects on fxuA and fxuB as far as possible. For this, the 725 bp KpnI-PstI fragment (fragment 1, Fig. 1) is subcloned into pUC118. Fragment 1 is obtained from pGS4, available from E. coli TOP10F 'pGS4 (DSM 12083). pGS4 is a pUC118 derivative whose insert contains the region of fragment 1 and fragment 3 shown in FIG. 1. The kanamycin resistance cassette is cloned in the appropriate orientation in the internal BamHI restriction site. This creates the plasmid pGS52 ( Fig. 4). The strain M24 is transformed with pGS52 and kanamycin-resistant transformants are selected. The insertion mutant M. smegmatis U5 is selected from these clones on the basis of their phenotype. In this mutant, the gene fxuC in the chromosome is replaced by the homologous recombination with the copy of fxuC cloned in pGS52 and inactivated by insertion of KanR. The insertion of KanR in fxuC means that the mutant U5 can no longer take up ferri exochelin. The integration postulated according to the phenotype found is verified by means of PCR.

Ausführungsbeispiel 5Embodiment 5 Erzeugung der Mutante Mycobacterium smegmatis U7Generation of the mutant Mycobacterium smegmatis U7

Um polare Effekte auf fxuA, fxuB und fxuC möglichst zu vermeiden und um die Regulation der Expression des Klusters fxuD-fxuA nicht zu beeinflussen, erfolgt die Inaktivierung von fxuD durch Deletion eines 325 bp großen Fragmentes beginnend 69 bp vom 5' Ende des Genes.To avoid polar effects on fxuA, fxuB and fxuC as much as possible and to avoid The regulation of the expression of the cluster fxuD-fxuA is not influenced Inactivation of fxuD by deletion of a 325 bp fragment starting from 69 bp from the 5 'end of the gene.

Dafür wird das 1737 bp große BamHI-Fragment (Fragment 2, Abb. 1) aus pGS4 in pUC118 subkloniert, wobei pGS41 entsteht (Abb. 5). pGS41 wird mit BspMII geschnitten und religiert, wobei pGS56 entsteht (Abb. 5). Durch Klonierung der Kanamycin-Resistenzkassette in den Bgl II-Ort von pGS56 wird pGS57 gebildet (Abb. 6). Der Stamm M24 wird mit pGS57 transformiert und Kanamycin-resistente Transformanten selektiert. Aus diesen Klonen wird die Insertionsmutante M. smegmatis U7, bei der das Gen fxuD durch homologe Rekombination gegen die deletierte Kopie ausgetauscht wurde, mittels PCR selektiert. Bei dieser Mutante ist die Kanamycin-Resistenzkassette zwischen fxuE und der Promotorregion für das Kluster fxuD-fxuB in das Chromosom integriert. Damit sollen polare Effekte auf die Expression des fxu-Klusters ausgeschlossen werden.For this purpose, the 1737 bp BamHI fragment (fragment 2, Fig. 1) from pGS4 is subcloned into pUC118, pGS41 being formed ( Fig. 5). pGS41 is cut with BspMII and religated, producing pGS56 ( Fig. 5). By cloning the kanamycin resistance cassette into the Bgl II site of pGS56, pGS57 is formed ( Fig. 6). The strain M24 is transformed with pGS57 and kanamycin-resistant transformants are selected. The insertion mutant M. smegmatis U7, in which the gene fxuD was exchanged for the deleted copy by homologous recombination, is selected from these clones by means of PCR. In this mutant, the kanamycin resistance cassette between fxuE and the promoter region for the cluster fxuD-fxuB is integrated into the chromosome. This is intended to rule out polar effects on the expression of the fxu cluster.

Ausführungsbeispiel 6Embodiment 6 Erzeugung der Mutante Mycobacterium smegmatis U9Generation of the mutant Mycobacterium smegmatis U9

Die Inaktivierung von fxuE erfolgt durch Austausch des chromosomalen Genes mittels homologer Rekombination gegen eine durch Insertion von KanR inaktivierte Kopie dieses Genes. Dazu wird das 1752 bp große SalI-KpnI-Fragment (Fragment 3, Abb. 1) aus pGS4 in pUC118 subkloniert. In den internen BamHI-Restriktionsort innerhalb von fxuE wird die Kanamycin-Resistenzkassette aus pUC4K kloniert. Dabei entsteht pGS50 (Abb. 7). Der Stamm M24 wird mit pGS50 transformiert und Kanamycin-resistente Transformanten selektiert. Aus diesen Klonen wird die Insertionsmutante M. smegmatis U9 mittels PCR selektiert. Bei dieser Mutante ist durch homologe Rekombination das Gen fxuE im Chromosom gegen die in pGS50 klonierte und durch Insertion von KanR inaktivierte Kopie von fxuE ausgetauscht. Die Orientierung von KanR ist dabei so gewählt, daß ein Durchlesen vom KanR-Promotor in das fxu-Kluster ausgeschlossen ist.FxuE is inactivated by exchanging the chromosomal gene by means of homologous recombination for a copy of this gene which has been inactivated by insertion of KanR. For this purpose, the 1752 bp SalI-KpnI fragment (fragment 3 , Fig. 1) from pGS4 is subcloned into pUC118. The kanamycin resistance cassette from pUC4K is cloned into the internal BamHI restriction site within fxuE. This creates pGS50 ( Fig. 7). The strain M24 is transformed with pGS50 and kanamycin-resistant transformants are selected. The insertion mutant M. smegmatis U9 is selected from these clones by means of PCR. In this mutant, the gene fxuE in the chromosome is replaced by the homologous recombination with the copy of fxuE cloned in pGS50 and inactivated by insertion of KanR. The orientation of KanR is chosen so that reading through the KanR promoter into the fxu cluster is excluded.

Ausführungsbeispiel 7Embodiment 7 Screeningverfahren nach potentiellen Antibiotika-VektorenScreening procedure for potential antibiotic vectors

Die erfindungsgemäßen Mutanten werden bei 37°C für 48 h auf NB-Agar (12 g Oxoid Nr. 1 Medium pro Liter) kultiviert und anschließend in Verarmungsmedium (50 ml Glycerin, 8,5 g NaCl pro Liter; pH 7,2) suspendiert. Die Zelldichte der Suspension beträgt 3 × 108/ml. 1,5 ml dieser Suspension werden gemischt mit 99 ml Biotest-Agar (20 ml Glycerin, 5 g L-Asparagin, 5 g KH2PO4 pro Liter Aqua bidest.; pH 7,5; nach Zusatz von 2% Aluminiumoxid Sterilisierung bei 121°C für 15 min; filtrieren; pH 6,8 einstellen; nach Zusatz von 12 g Agar No1 (Oxoid) erneut sterilisieren bei 121°C; unmittelbar vor der Inokulation werden dem Medium 0,46 µg/ml Zn2+, 0,1 µg/ml Mn2+, 0,04 mg/ml Mg2+, 1 µg/ml CaCl2 × 2H2O, 0,2 µg/ml Na2MoO4 × 2H2O, 0,2 µg/ml CuSO4 × 5H2O und 0,4 µg/ml CoCl2 × 6H2O sowie 10 µM Ethylendiamin-di-(o-hydroxyphenylessigsäure) zugegeben). Diese Suspension wird in Petrischalen gegeben. 100 ml dieser Suspension werden in eine Petrischale gegeben. Nach dem Erhärten des Agars werden auf die Oberfläche Filterpapierscheiben (5 mm ∅) aufgelegt, die mit Lösungen der zu testenden Substanzen getränkt sind. Wachstumszonen um die Filterpapierscheiben werden nach 2 Tagen Inkubation bei 37°C gemessen.The mutants according to the invention are cultivated at 37 ° C. for 48 h on NB agar (12 g of Oxoid No. 1 medium per liter) and then suspended in depletion medium (50 ml of glycerol, 8.5 g of NaCl per liter; pH 7.2) . The cell density of the suspension is 3 × 10 8 / ml. 1.5 ml of this suspension are mixed with 99 ml of Biotest agar (20 ml of glycerin, 5 g of L-asparagine, 5 g of KH 2 PO 4 per liter of aqua bidest .; pH 7.5; after adding 2% aluminum oxide, sterilize 121 ° C for 15 min; filter; adjust pH 6.8; after adding 12 g Agar No1 (Oxoid), sterilize again at 121 ° C; immediately before inoculation, 0.46 µg / ml Zn 2+ , 0 are added to the medium , 1 µg / ml Mn 2+ , 0.04 mg / ml Mg 2+ , 1 µg / ml CaCl 2 × 2H 2 O, 0.2 µg / ml Na 2 MoO 4 × 2H 2 O, 0.2 µg / ml of CuSO 4 × 5H 2 O and 0.4 μg / ml CoCl 2 × 6H 2 O and 10 μM ethylenediamine-di- (o-hydroxyphenylacetic acid) were added). This suspension is placed in petri dishes. 100 ml of this suspension are placed in a petri dish. After the agar has hardened, filter paper discs (5 mm ∅) are placed on the surface, which are soaked with solutions of the substances to be tested. Growth zones around the filter paper discs are measured after 2 days of incubation at 37 ° C.

Wachstumszonen bei den Mutanten U1 bis U9 zeigen z. B. an, daß die Aufnahme des getesteten Xenosiderophors unabhängig von allen bisher bekannten Komponenten des Exochelin/Mycobactin-Transportsystems erfolgt. Eine Wachstumszone bei Mutante B1 zeigt einen Ligandenaustausch mit dem Mycobactin an, während eine Wachstumszone bei Mutante M24 bei fehlender Förderung der Mutante U1 Ligandenaustausch mit dem Exochelin zeigt.Growth zones in the mutants U1 to U9 show z. B. that the inclusion of tested Xenosiderophors independent of all previously known components of the Exochelin / Mycobactin transport system takes place. A growth zone in mutant B1 indicates a ligand exchange with the mycobactin during a growth zone at Mutant M24 in the absence of support for mutant U1 ligand exchange with the Exochelin shows.

In den folgenden Abbildungen wird die in den Beispielen exemplizierte Erfindung näher erläutert. Die Abbildungen stellen dar:The following examples illustrate the invention exemplified in the examples explained. The pictures show:

Abb. 1: Restriktionskarte des Exochelin-Genklusters Fig. 1: Restriction map of the exochelin gene cluster

Abb. 2: Konstrukte zur Deletion von fxbA Fig. 2: Constructs for deleting fxbA

Abb. 3: Konstrukte zur Deletion von fxuA Fig. 3: Constructs for deleting fxuA

Abb. 4: Restriktionskarte des Plasmides pGS52 Fig. 4: Restriction map of plasmid pGS52

Abb. 5: Inserts der Plasmide pGS41 und pGS56 Fig. 5: Inserts of the plasmids pGS41 and pGS56

Abb. 6: Restriktionskarte des Plasmides pGS57 Fig. 6: Restriction map of plasmid pGS57

Abb. 7: Restriktionskarte des Plasmides pGS50 Fig. 7: Restriction map of plasmid pGS50

Claims (15)

1. Mutanten von Mykobakterien-Spezies, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in die Biosynthese des Mycobactins involvierte Gene inaktiviert wurden und/oder daß Gene, welche für Komponenten des Exochelin-vermittelten Eisenaufnahmesystems kodieren, mittels gene replacement, Deletions- oder Insertionsinaktivierung ausgeschaltet wurden.1. Mutants of mycobacterial species, which are characterized in that genes involved in the biosynthesis of mycobactin have been inactivated and / or that genes which code for components of the exochelin-mediated iron uptake system have been switched off by means of gene replacement, deletion or insertion inactivation. 2. Mutanten von Mykobakterien-Spezies gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in die Biosynthese des Mycobactins involvierte Gene inaktiviert wurden.2. mutants of mycobacterial species according to claim 1, characterized characterized in that inactivates genes involved in the biosynthesis of mycobactin were. 3. Mutanten von Mykobakterien-Spezies gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Inaktivierung der Gene entweder a) durch Mutagenese mittels chemischer bzw. physikalischer Mutagene, b) durch gene replacement, c) durch Insertions- oder Deletionsinaktivierung oder d) durch eine Kombination vorgenannter Methoden erfolgt.3. mutants of mycobacterial species according to claim 2, characterized characterized in that the inactivation of the genes either a) by mutagenesis by means of chemical or physical mutagens, b) by gene replacement, c) by insertion or deletion inactivation or d) by a combination the aforementioned methods. 4. Mutanten von Mykobakterien-Spezies gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mittels gene replacement, Deletions- oder Insertionsinaktivierung eines oder mehrere Gene, welche für Komponenten des Exochelin-vermittelten Eisenaufnahmesystems kodieren, ausgeschaltet wurden und gegebenenfalls zusätzlich in die Biosynthese des Mycobactins involvierte Gene inaktiviert wurden.4. mutants of mycobacterial species according to claim 1, characterized characterized in that by means of gene replacement, deletion or Insertion inactivation of one or more genes which are responsible for components of the Exochelin-mediated iron intake system, have been turned off and possibly additionally genes involved in the biosynthesis of mycobactin have been inactivated. 5. Mutanten von Mykobakterien-Spezies gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Mykobakterien-Spezies um Mycobacterium smegmatis, M. phlei, M. vaccae, M. aurum, M. fortuitum, M. chelonae, M. bovis, M. avium oder M. tuberculosis handelt.5. mutants of mycobacterial species according to claim 1, characterized characterized in that the mycobacterial species is Mycobacterium smegmatis, M. phlei, M. vaccae, M. aurum, M. fortuitum, M. chelonae, M. bovis, M. avium or M. tuberculosis. 6. Mycobacterium smegmatis-Mutante M24 (DSM 12084) gemäß Anspruch 1.6. Mycobacterium smegmatis mutant M24 (DSM 12084) according to claim 1. 7. Mycobacterium smegmatis-Mutante B1 (DSM 12085) gemäß Anspruch 1.7. Mycobacterium smegmatis mutant B1 (DSM 12085) according to claim 1. 8. Mycobacterium smegmatis-Mutante B3 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß beim Stamm M24 das Gen fxbA durch homologe Rekombination mit dem Insert des Plasmides pGS31, wie in Abb. 2 dargestellt, gegen die Kanamycin-Resistenzkassette ausgetauscht wurde.8. Mycobacterium smegmatis mutant B3 according to claim 1, characterized in that the gene fxbA in strain M24 was replaced by homologous recombination with the insert of the plasmid pGS31, as shown in Fig. 2, against the kanamycin resistance cassette. 9. Mycobacterium smegmatis-Mutante U1 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß beim Stamm M24 das Gen fxuA durch homologe Rekombination mit dem Insert des Plasmides pGS22, wie in Abb. 3 dargestellt, gegen die Kanamycin-Resistenzkassette ausgetauscht wurde.9. Mycobacterium smegmatis mutant U1 according to claim 1, characterized in that the gene fxuA in strain M24 was replaced by homologous recombination with the insert of the plasmid pGS22, as shown in Fig. 3, against the kanamycin resistance cassette. 10. Mycobacterium smegmatis-Mutante U5 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß beim Stamm M24 die Expression des Genes fxuC durch Integration der Kanamycin-Resistenzkassette aus pUC4K mittels homologer Rekombination mit dem Insert des Plasmides pGS52, wie in Abb. 4 dargestellt, unterbrochen wurde. 10. Mycobacterium smegmatis mutant U5 according to claim 1, characterized in that the expression of the fxuC gene was interrupted in the M24 strain by integrating the kanamycin resistance cassette from pUC4K by means of homologous recombination with the insert of the plasmid pGS52, as shown in FIG. 4 . 11. Mycobacterium smegmatis-Mutante U7 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß beim Stamm M24 Teile des Genes fxuD durch homologe Rekombination mit dem Insert des Plasmides pGS56, wie in den Abb. 5 und 6 dargestellt, deletiert wurden.11. Mycobacterium smegmatis mutant U7 according to claim 1, characterized in that in the M24 strain, parts of the fxuD gene were deleted by homologous recombination with the insert of the plasmid pGS56, as shown in FIGS. 5 and 6. 12. Mycobacterium smegmatis-Mutante U9 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß beim Stamm M24 die Expression des Genes fxuE durch Integration der Kanamycin-Resistenzkassette mittels homologer Rekombination mit dem Insert des Plasmides pGS57, wie in Abb. 7 dargestellt, unterbrochen wurde.12. Mycobacterium smegmatis mutant U9 according to claim 1, characterized in that the expression of the gene fxuE was interrupted in the strain M24 by integrating the kanamycin resistance cassette by means of homologous recombination with the insert of the plasmid pGS57, as shown in Fig. 7. 13. Verfahren zum Screening nach potentiellen Antibiotika-Vektoren, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mutante gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 in einem Testverfahren eingesetzt wird, welches es gestattet, solche Siderophore zu erkennen, die unabhängig vom Exochelin/Mycobactin-Transportsystem in die Mykobakterienzelle transportiert werden.13. Method of screening for potential antibiotic vectors, thereby characterized in that a mutant according to one of claims 1 to 12 in one Test procedure is used, which allows such siderophores to recognize that regardless of the exochelin / mycobactin transport system in the Mycobacterial cells are transported. 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Testverfahren um einen Wachstumsförderungstest auf einem festen oder flüssigen Eisenmangel-Medium handelt.14. The method according to claim 13, characterized in that it is in the Test procedure for a growth promotion test on a solid or liquid Iron deficiency medium acts. 15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß bei dem Testverfahren die Aufnahme von 55Fe durch die Mutante gemessen wird.15. The method according to claim 13, characterized in that the uptake of 55 Fe by the mutant is measured in the test method.
DE19817921A 1998-04-17 1998-04-17 New mycobacterial mutants used to screen for antibiotic vectors Withdrawn DE19817921A1 (en)

Priority Applications (20)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19817921A DE19817921A1 (en) 1998-04-17 1998-04-17 New mycobacterial mutants used to screen for antibiotic vectors
HU0101563A HUP0101563A2 (en) 1998-04-17 1999-04-10 Mutants of the mycobacterium species and use of the same for screening for antibiotics vectors
BR9909780-0A BR9909780A (en) 1998-04-17 1999-04-10 Mutants of mycobacterial species and their use for screening by punctual antibiotic vectors
CN99807501A CN1309703A (en) 1998-04-17 1999-04-10 Mutants of mycobacterium species and use of same for screening for antibiotics vectors
KR1020007011550A KR20010078706A (en) 1998-04-17 1999-04-10 Mutants of the mycobacterium species and the use thereof for screening for antibiotic vectors
AU34214/99A AU765518B2 (en) 1998-04-17 1999-04-10 Mutants of the mycobacterium species and use of the same for screening for antibiotics vectors
NZ507541A NZ507541A (en) 1998-04-17 1999-04-10 Mutants of the mycobacterium species and use of the same for screening for antibiotics vectors
PL99346020A PL346020A1 (en) 1998-04-17 1999-04-10 Mutants of the mycobacterium species and use of the same for screening for antibiotics vectors
PCT/EP1999/002438 WO1999054454A1 (en) 1998-04-17 1999-04-10 Mutants of the mycobacterium species and use of the same for screening for antibiotics vectors
CA002325604A CA2325604A1 (en) 1998-04-17 1999-04-10 Mutants of the mycobacterium species and the use thereof for screening for antibiotic vectors
IL13899799A IL138997A0 (en) 1998-04-17 1999-04-10 Mutants of the mycobacterium species and use of the same for screening for antibiotics vectors
SK1534-2000A SK15342000A3 (en) 1998-04-17 1999-04-10 Mutants of the mycobacterium species and use of the same for screening for antibiotics vectors
JP2000544786A JP2003527066A (en) 1998-04-17 1999-04-10 Methods of using it for screening for mutants and antibiotic vectors of mycobacterial species
EP99915755A EP1071761A1 (en) 1998-04-17 1999-04-10 Mutants of the mycobacterium species and use of the same for screening for antibiotics vectors
ARP990101725A AR019070A1 (en) 1998-04-17 1999-04-14 MUTANTS OF MICOBACTERY SPECIES, AND PROCEDURE FOR EXPLORATION OF POTENTIAL ANTIBIOTIC VECTORS.
UY25475A UY25475A1 (en) 1998-04-17 1999-04-15 MUTANTS OF SPECIES OF MICOBACTERIA AND EXPLORATION PROCEDURE OF POTENTIAL ANTIBIOTIC VECTORS APPLYING THE SAME
PE1999000305A PE20000462A1 (en) 1998-04-17 1999-04-15 MUTANTS OF MYCOBACTERIA SPECIES AND VECTOR EXPLORATION PROCEDURE OF POTENTIAL ANTIBIOTICS APPLYING THE SAME
CO99022537A CO4990995A1 (en) 1998-04-17 1999-04-15 MUTANTS OF SPECIES OF MICOBACTERIA AND EXPLORATION PROCEDURE OF POTENTIAL ANTIBIOTIC VECTORS APPLYING THEM
NO20005129A NO20005129L (en) 1998-04-17 2000-10-12 Mutants of mycobacterial species and their use for screening by antibiotic vectors
ZA200005674A ZA200005674B (en) 1998-04-17 2000-10-13 Mutants of the mycobacterium species and use of the same for screening for antibiotics vectors.

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19817921A DE19817921A1 (en) 1998-04-17 1998-04-17 New mycobacterial mutants used to screen for antibiotic vectors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE19817921A1 true DE19817921A1 (en) 1999-10-21

Family

ID=7865403

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19817921A Withdrawn DE19817921A1 (en) 1998-04-17 1998-04-17 New mycobacterial mutants used to screen for antibiotic vectors

Country Status (20)

Country Link
EP (1) EP1071761A1 (en)
JP (1) JP2003527066A (en)
KR (1) KR20010078706A (en)
CN (1) CN1309703A (en)
AR (1) AR019070A1 (en)
AU (1) AU765518B2 (en)
BR (1) BR9909780A (en)
CA (1) CA2325604A1 (en)
CO (1) CO4990995A1 (en)
DE (1) DE19817921A1 (en)
HU (1) HUP0101563A2 (en)
IL (1) IL138997A0 (en)
NO (1) NO20005129L (en)
NZ (1) NZ507541A (en)
PE (1) PE20000462A1 (en)
PL (1) PL346020A1 (en)
SK (1) SK15342000A3 (en)
UY (1) UY25475A1 (en)
WO (1) WO1999054454A1 (en)
ZA (1) ZA200005674B (en)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0706532A8 (en) * 2006-01-12 2019-01-02 Albert Einstein College Medicine Yeshiva Univ dry mycobacterium mutants2

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DUSSURGET,Olivier, et.al.: An ideR mutant of Mycobacterium smegmatis has derepressed siderophore production and an altered oxidative- stress response. In: Molecular Microbiology 1996, 22, 3, S.535-544 *
FISS,Ellen H., et.al.: Identification of genes involved in the sequestration of iron in mycobacteria: the ferric exochelin biosynthetic and uptake pathways. In: Molecular Microbiology 1994, 14, 3, S.557-569 *
MATZANKE,Berthold F., et.al.: Iron uptake and intracellular metal transfer in mycobacteria mediated by xenosiderophores. In: BioMetals, 1997, 10, S.193-203 *
McADAM,Ruth A., et.al.: In Vivo Growth Characteristics of Leucine and Methionine Auxotrophic Mutants of Mycobacterium bovis BCG Generated by Transposon Mutagenesis. In: Infection And Immunity, May 1995, Vol.63, No.3, S.1004-1012 *

Also Published As

Publication number Publication date
IL138997A0 (en) 2001-11-25
CO4990995A1 (en) 2000-12-26
JP2003527066A (en) 2003-09-16
EP1071761A1 (en) 2001-01-31
ZA200005674B (en) 2002-01-14
CN1309703A (en) 2001-08-22
UY25475A1 (en) 2001-11-30
AU3421499A (en) 1999-11-08
BR9909780A (en) 2001-09-11
KR20010078706A (en) 2001-08-21
HUP0101563A2 (en) 2001-09-28
AR019070A1 (en) 2001-12-26
NO20005129L (en) 2000-12-18
PL346020A1 (en) 2002-01-14
CA2325604A1 (en) 1999-10-28
PE20000462A1 (en) 2000-05-20
NZ507541A (en) 2003-05-30
WO1999054454A1 (en) 1999-10-28
WO1999054454A9 (en) 2001-03-15
AU765518B2 (en) 2003-09-18
SK15342000A3 (en) 2001-04-09
NO20005129D0 (en) 2000-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE68929507T2 (en) RECOMBINANT MYCOBACTERIAL EXPRESSION CARRIERS AND THEIR USE
DE69434663T2 (en) NUCLEOTIDE SEQUENCES FOR EXPRESSION CONTROL OF DNA SEQUENCES IN A HOST CELL
DE3786661T2 (en) METHOD FOR RELEASING RNS AND DNA FROM CELLS.
DE69629576T2 (en) METHOD FOR PRODUCING RECOMBINANT PLASMIDES
DE2759053A1 (en) METHOD FOR MANUFACTURING GENE PRODUCTS FROM PLASMID DNA
DE19647847B4 (en) Process for decomposing organic compounds, device for decomposing organic compounds, process for isolating microorganisms of the species Komagatella brevis and new microorganism of the species Komagatella brevis
Fischeder et al. Occurrence of mycobacteria in drinking water samples
Allaway et al. Use of differential fluorescence induction and optical trapping to isolate environmentally induced genes
Richards et al. Electron microscope study of effect of benzalkonium chloride and edetate disodium on cell envelope of Pseudomonas aeruginosa
DE60111783T2 (en) PROCESS FOR PREPARING AND CLEANING SECTURED PROTEINS AND PRODUCING PROTEIN ARRAYS
DE3781541T2 (en) MODIFIED PERTUSSISTOXIN.
EP0342633A2 (en) Transformation du Bacillus thuringiensis
EP2205767A1 (en) Method for determining frameshift mutations in coding nucleic acids
DE69026260T2 (en) Inducible expression vectors
DE19817921A1 (en) New mycobacterial mutants used to screen for antibiotic vectors
DE69009744T3 (en) Probes, equipment and methods for detection and differentiation of mycobacteria
DE4231764A1 (en) Chromosomal integration of many copies of product gene - esp. into bacteria, by double crossing over, using thymidylate synthase gene as indicator, giving transformants of high prodn. capacity.
EP0263528A2 (en) Live salmonella vaccine with a host species-adapted attenuation and an anti-epidemic potential
DE69929745T2 (en) New bacteriophage, process for isolation and suitable universal growth medium
Tetz et al. Surface films of Escherichia coli colonies
DE102007012824A1 (en) Vaccine strains with graded colony size/attenuation comprise at least two attenuating metabolic drift mutations that are resistance mutations
Rastogi et al. Stazyme, a mycobacteriolytic preparation from a Staphylococcus strain, is able to break the permeability barrier in multiple drug resistant Mycobacterium avium
DE10328669A1 (en) Plasmid-free clone of E. coli strain DSM 6601
DE102008062941A1 (en) New vaccine strains having two or three different attenuation active metabolic drift mutations, which result in smaller colonies with corresponding longer generation time and correlated attenuation degree
WO2012022727A1 (en) Lov-domain protein for photosensitive defunctionalization

Legal Events

Date Code Title Description
OM8 Search report available as to paragraph 43 lit. 1 sentence 1 patent law
8139 Disposal/non-payment of the annual fee