DE10328669A1 - Plasmid-free clone of E. coli strain DSM 6601 - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft einen plasmidfreien Klon des E. coli-Stammes DSM 6601, ein Verfahren zu dessen Herstellung sowie die Verwendung der so erhaltenen Bakterien als Klonierungsvehikel.The The invention relates to a plasmid-free clone of the E. coli strain DSM 6601, a process for its preparation and its use the bacteria thus obtained as Klonierungsvehikel.
E. coli, ein in der Natur, insbesondere im menschlichen und tierischen Darm vorkommendes Bakterium, ist bereits seit langem Gegenstand eingehender mikrobiologischer und gentechnologischer Untersuchungen und wird in der Gentechnik insbesondere zur Klonierung und/oder Expression bestimmter Gene bzw. Proteine eingesetzt.E. coli, one in nature, especially in human and animal Intestinal bacterium has long been an object detailed microbiological and genetic engineering studies and is used in genetic engineering in particular for cloning and / or Expression of certain genes or proteins used.
Die meisten Stämme der Gattung Escherichia sind außerhalb des Darmlumens pathogen und führen im allgemeinen zu Infektionen an den befallenen Stellen. Ein apathogener Stamm der Gattung Escherichia coli ist der bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen hinterlegte Stamm DSM 6601, der in einigen genetischen Merkmalen von allen übrigen E. coli Stämmen abweicht. Es hat sich jedoch gezeigt, dass dieser Stamm nur unter erschwerten Umständen und teilweise überhaupt nicht genetisch manipulierbar ist und sich somit nicht als einfaches Klonierungsmittel einsetzen lässt.The most tribes of the genus Escherichia are outside of the intestinal lumen pathogenic and lead generally infections at the affected sites. An apathogenic one Strain of the genus Escherichia coli is that at the German Collection of Microorganisms deposited strain DSM 6601, which in some genetic characteristics from all the rest E. coli strains differs. However, it has been shown that this strain only under difficult circumstances and partly at all is not genetically manipulatable and therefore not as simple Use cloning agent.
E.
coli DSM 6601 enthält
natürlicherweise zwei
Plasmide, die als pMut1 oder pMut2 bezeichnet werden und eine Größe von 3177
bzw. 5552 kb aufweisen. Diese Plasmide und ihre DNA-Sequenzen sind
beispielsweise in der
Ausgehend von der Überlegung, dass die Pathogenität bzw. Apathogenität der E. coli-Bakterien offensichtlich teilweise von deren Plasmiden gesteuert wird und der weiteren Überlegung, dass die teilweise auftretende „genetische Resistenz" der E. coli Stämme auch mit dessen kryptischen Plasmiden zusammenhängen könnte, liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, einen plasmidfreien E. coli Stamm zu entwickeln, der ansonsten hinsichtlich seiner genomischen DNA genetisch völlig identisch mit dem Originalstamm ist.outgoing from the consideration, that pathogenicity or apathogenicity the E. coli bacteria apparently partially controlled by their plasmids and the further consideration, that the partially occurring "genetic resistance" of the E. coli strains also could be related to the cryptic plasmids, the invention has the object to develop a plasmid-free E. coli strain that otherwise genetically identical to the original strain in terms of genomic DNA is.
Die vorstehende Aufgabe wird gelöst durch Bereitstellen eines plasmidfreien Klons des E. coli-Stammes DSM 6601, sowie durch ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Klons.The The above problem is solved by providing a plasmid-free clone of the E. coli strain DSM 6601, as well as a method for producing such Clone.
In den Figuren,In the figures,
Bei den langwierigen Untersuchungen, die zur vorliegenden Erfindung führten, hat sich gezeigt, dass plasmidfreie Klone des Stammes DSM 6601 mit normalen gentechnischen Methoden überhaupt nicht oder nur unter großen Schwierigkeiten herstellbar sind, so dass zur Generierung derartiger Klone besondere Wege eingeschlagen werden müssen. Da der Wildtyp des Stammes neben seiner genomischen DNA zwei Plasmide unterschiedlicher Größe aufweist, muß die Eliminierung dieser Plasmide in mehreren, zum Teil parallel laufenden Schritten erfolgen.at the lengthy investigations leading to the present invention led, has shown that plasmid-free clones of the strain DSM 6601 with normal genetic engineering methods at all not or only under big ones Difficulties are produced, so that to generate such Clones have to be taken special ways. As the wild type of the strain in addition to its genomic DNA has two plasmids of different sizes, must the Elimination of these plasmids in several, partly parallel running Steps take place.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Klone werden gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren die in dem E. coli Stamm DSM 6601 natürlich vorkommenden Plasmide pMut1 und pMut2 in einem ersten Schritt jeweils mit einer Antibiotikaresistenz markiert. Dazu werden die Plasmide gemäß herkömmlicher Verfahren isoliert und das Resistenzgen an einer gewünschten Stelle eingebracht. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das Resistenzgen zusammen mit einer Expressionskasette in das jeweilige Plasmid eingebracht, welche eine Promotor enthält, der konstitutitv oder auch induzierbar sein kann.to Preparation of the clones of the invention be according to the inventive method the naturally occurring in the E. coli strain DSM 6601 plasmids In each case, pMut1 and pMut2 are marked with antibiotic resistance in a first step. For this purpose, the plasmids according to conventional Method isolated and the resistance gene to a desired Job introduced. According to one preferred embodiment is the resistance gene together with an expression cassette in the respective plasmid containing a promoter, the konstitutitv or may be inducible.
Die so erhaltenen Plasmide werden dann gemäß herkömmlicher Verfahren, beispielsweise dem CaCl2-Verfahren oder Elektroporation, in einen geeigneten Wirt eingebracht, und dort kloniert, wobei das in das jeweilige Plasmid eingebrachte Resistenzgen die Selektion der das Plasmid tragenden Wirtszellen erleichtert. Ein zur Klonierung des ein Resistenzgen tragenden Plasmids geeigneter Wirt sind beispielsweise die E.coli Stämme DH5α oder E.coli HB101.The plasmids thus obtained are then introduced into a suitable host according to conventional methods, for example the CaCl 2 method or electroporation, and cloned there, the resistance gene introduced into the respective plasmid facilitating the selection of the host cell carrying the plasmid. A host suitable for cloning the resistance gene carrying plasmid are, for example, the E. coli strains DH5α or E. coli HB101.
Die das Resistenzgen tragenden Plasmide werden isoliert und anschließend wird das sacB-Gen in die Plasmide eingebracht, um einen weiteren Marker bereitzustellen.The The resistance gene carrying plasmids are isolated and then the sacB gene in the plasmids are introduced to provide another marker.
Die so erhaltenen bzw. markierten Plasmide werden dann in den E.coli Stamm DSM 6601 eingebracht.The plasmids so obtained or labeled are then introduced into the E. coli Strain DSM 6601 introduced.
Nach Transformation werden die E.coli DSM 6601 auf einem Medium gezüchtet, das das Antibiotikum/die Antibiotika enthält, für das/die die Resistenzgene, die in den vorangegangenen Schritten in die Plasmide eingebracht wurde, Resistenz verleihen.After transformation, the E. coli DSM 6601 are grown on medium containing the antibiotic / antibiotics for which the resistance genes introduced into the plasmids in the previous steps confer resistance hen.
Durch Züchten auf einem derartigen Medium werden nur Klone wachsen, die gegen die im Nährmedium enthaltenen Antibiotika resistent sind. Weiterhin werden die Bakterien, da sie die ursprünglichen Plasmide pMut1 und pMut2 für ihr Wachstum nicht mehr benötigen, überflüssiges genetisches Material verlieren, so dass schlußendlich die Bakterien nur noch die modifizierten Plasmide pMut1 und pMut2 (die das/die Resistenzgene und das sacB Gen enthalten) enthalten.By Breed on such a medium only clones will grow against in the nutrient medium contained antibiotics are resistant. Furthermore, the bacteria, since they are the original ones Plasmids pMut1 and pMut2 for no longer need their growth, superfluous genetic Lose material, so that ultimately the bacteria only nor the modified plasmids pMut1 and pMut2 (which the / the resistance genes and the sacB gene).
In einem weiteren Schritt werden die so gezüchteten Bakterien in ein Nährmedium überführt, das das Wachstum von Bakterien hemmt, die das sacB enthalten, wobei ein Selektionsdruck ausgeübt wird, der im wesentlichen nur das Wachstum von Bakterien erlaubt, die das sacB-Gen verloren haben. Dies kann durch Züchten des Stamms bei 30°C in Gegenwart von 10% Saccharose erfolgen, da sich bei derartigen Bedingungen nur solche Klone replizieren können, die das sacB-Gen tragende Plasmid verloren haben.In In a further step, the bacteria thus grown are transferred to a nutrient medium which inhibits the growth of bacteria containing the sacB, wherein a selection pressure is exerted, which essentially allows only the growth of bacteria that lost the sacB gene to have. This can be done by breeding of the strain at 30 ° C in the presence of 10% sucrose, since in such Conditions only those clones can replicate, which carries the sacB gene Lost plasmid.
Als Folge wird ein plasmidfreies Derivat des Stammes DSM 6601 erhalten.When As a result, a plasmid-free derivative of strain DSM 6601 is obtained.
Es wurde nun gefunden, dass die erfindungsgemäßen Klone mit Maßgabe des Verlusts der Plasmide keinerlei Veränderung der genomischen DNA erfahren haben und sich überraschenderweise gut als Klonierungsvehikel einsetzen lassen.It has now been found that the clones of the invention with the proviso of Loss of plasmids no change in genomic DNA have experienced and surprisingly good can be used as a cloning vehicle.
Damit können sie im Labor gefahrlos als Wirtszelle für die Klonierung bzw. Expression einer Vielzahl von Genen bzw. Proteinen eingesetzt werden. Versuche mit dem erfindungsgemäßen Stamm DSM 6601 ΔpMut1/2 haben gezeigt, dass er ein besonders guter Akzeptor für Fremd-DNA ist, wenn diese in seine eigenen, in isolierter Form vorliegenden Plasmide integriert wird, d.h. also, die eigenen Plasmide als Klonierungsvektoren für die Fremd-DNA fungieren. Weiterhin können sie, da sie von einem apathogenen Stamm abgeleitet sind zur Behandlung von Störungen des Gastrointestinaltraktes in Tieren und Menschen eingesetzt werden. Dazu können sie, wenn gewünscht, mit Fremdgenen transformiert werden, die die Adhäsion der Bakterien an die Mucosa fördern, wie beispielsweise Adhäsinen, die ggf. Wirtstier-spezifisch die Adhäsion der Bakterien an die Mucosa von beispielsweise Rindern und/oder Schweinen fördern und somit den das Wachstum anderer pathogener Mikroorganismen behindern bzw. verhindern.In order to can they are safe in the laboratory as a host cell for cloning or expression a variety of genes or proteins are used. tries with the strain DSM according to the invention 6601 ΔpMut1 / 2 have shown that he is a particularly good acceptor of foreign DNA when these are in their own isolated plasmids is integrated, i. so, the own plasmids as cloning vectors for the Foreign DNA act. Furthermore you can they are derived from an apathogenic strain for the treatment of disorders of the gastrointestinal tract in animals and humans. Can do this you, if desired, be transformed with foreign genes that promote the adhesion of the bacteria to the mucosa, such as for example, adhesins, the host-specific the adhesion of the bacteria to the mucosa For example, encourage cattle and / or pigs and thus the growth hamper or prevent other pathogenic microorganisms.
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezug auf die Beispiele weiter erläutert.The The present invention will now be further described with reference to the examples explained.
Beispiel 1example 1
Veränderung von pMut 1Change of pMut 1
Die beiden natürlich vorkommenden Plasmide pMut1 und pMut2 des Wildtyps DSM 6601 nach dem Plasmid-Midiprep-Protokoll von QIAGEN (QIAGEN Plasmid Purification Handbook 12/2002, Seiten 16–20) isoliert.The both, of course occurring plasmids pMut1 and pMut2 of the wild-type DSM 6601 after the Plasmid Midiprep Protocol from QIAGEN (QIAGEN Plasmid Purification Handbook 12/2002, pages 16-20) isolated.
Für die Markierung des Plasmids pMut1 wurde die vom Vektor pBR322 abgeleitete Tetracyclinresistenzkassette ausgewählt. Der zugehörige Promotor wurde aus dem Plasmid pASK75 entnommen. Das aus dieser Klonierung resultierende Plasmid wurde mit pKS-tetAtetp/o bezeichnet. Das Insert tetAtetp/o (Insertgröße 1,5 kb) wurde mit den Restriktionsenzymen XbaI und HindIII ausgeschnitten. Das XbaI/HindIII-Fragment wurde über eine NdeI-Restriktionsschnittstelle in das Plasmid pMut1 eingeführt.For the labeling of the plasmid pMut1, the tetracycline resistance cassette derived from the vector pBR322 was selected. The associated promoter was taken from the plasmid pASK75. The plasmid resulting from this cloning was designated pKS-tetA tetp / o . The insert tetA tetp / o (insert size 1.5 kb) was excised with the restriction enzymes XbaI and HindIII. The XbaI / HindIII fragment was introduced into the plasmid pMut1 via an NdeI restriction site.
Dazu wurde nach Restriktionsverdau der Plasmide mit den entsprechenden Enzymen der Restriktionsansatz über eine Säule (Quiagen, PCR Purification Kit) gereinigt und einer Klenow-Behandlung unterzogen, um „blunt ends" zu bilden. Um eine Religation des Plasmids pMut1 zu verhindern, wurde eine Dephosphorylierung des mit dem Restriktionsenzym NdeI linearisierten und mit Klenow-Enzym behandelten Plasmids durchgeführt. Anschließend wurde der Vektor pMut1 und das Insert tetAtetp/o ligiert und damit der E. coli K-12 Stamm DH5α transformiert.After restriction digestion of the plasmids with the corresponding enzymes, the restriction mixture was purified via a column (Quiagen, PCR Purification Kit) and subjected to Klenow treatment to form "blunt ends." In order to prevent religation of the plasmid pMut1, a dephosphorylation was carried out of the restriction enzyme NdeI linearized and treated with Klenow enzyme plasmid was then ligated the vector pMut1 and the insert tetA tetp / o and thus transformed the E. coli K-12 strain DH5α.
Zur Herstellung kompetenter Zellen wurden 150 ml LB-Medium (Lurea-Bertani-Medium) mit 1,5 ml einer ÜN-Kultur beimpft und bei 37°C geschüttelt bis zu einer OD600 = 0,5. Danach wurde die Bakterienkultur 20 Minuten auf Eis inkubiert und 10 Minuten mit 4000 Upm bei 4°C zentrifugiert. Das Bakterienpellet wurde 3 × in sterilem, eiskaltem, 10%-igem Glycerin gewaschen, zuerst mit 100%, dann mit 50% und zuletzt mit 10% des Ausgangsvolumens. Zum Schluß wurde das gewaschene Pellet in 300 μl 10% Glycerin resuspendiert, aliquotiert (40 μl) und bei –80°C gelagert. Zur Transformation von Bakterienzellen wurden 1–2 μl Plasmid-DNA (1–100 ng) mit 40 μl auf Eis aufgetauten kompetenten Zellen gemischt und 5 Minuten auf Eis inkubiert. Danach wird dieser Ansatz luftblasenfrei zwischen die beiden Elektroden einer sterilen und vorgekühlten 2 mm Elektroporationsküvette pipettiert. Die Küvette wird gut abgetrocknet und in den Elektrodenhalter eingesetzt. Nach Durchführung des Elektroimpulses bei 2,5 kV, 200 Ω und 25 μF wurde die Bakteriensuspension mit 1 ml LB-Medium aus der Küvette gespült und bei 37°C für 1–2 Std. im Schüttler inkubiert. Anschließend wurden die Bakterien abzentrifugiert und der Überstand bis auf 100 μl abgezogen. Das Sediment wurde in den verbliebenen 100 μl resuspendiert, auf einer Tc-haltigen Selektionsplatte ausplattiert und ÜN bei 37°C inkubiert.For the preparation of competent cells, 150 ml of LB medium (Lurea Bertani medium) were inoculated with 1.5 ml of an overnight culture and shaken at 37 ° C. to an OD 600 = 0.5. Thereafter, the bacterial culture was incubated on ice for 20 minutes and centrifuged at 4000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. The bacterial pellet was washed 3x in sterile, ice-cold, 10% glycerol, first at 100%, then at 50%, and finally at 10% of the starting volume. Finally, the washed pellet was resuspended in 300 μl 10% glycerol, aliquoted (40 μl) and stored at -80 ° C. To transform bacterial cells, 1-2 μl of plasmid DNA (1-100 ng) were mixed with 40 μl of competent cells thawed on ice and incubated on ice for 5 minutes. Thereafter, this batch is pipetted free of air bubbles between the two electrodes of a sterile and precooled 2 mm electroporation cuvette. The cuvette is well dried and inserted into the electrode holder. After carrying out the electric pulse at 2.5 kV, 200 Ω and 25 μF, the bacterial suspension was rinsed out of the cuvette with 1 ml of LB medium and incubated at 37 ° C. for 1-2 hours in a shaker. Subsequently, the bacteria were removed by centrifugation and the supernatant was removed to 100 μl. The sediment was in the 100 .mu.l resuspended, plated on a Tc-containing selection plate and incubated at 37.degree.
Der
Erfolg der Klonierung wurde durch Minipräparation des jeweiligen Plasmids
einzelner Bakterienklone überprüft. Das
mit der Tetracyclinkassette markierte Plasmid pMut1 wurde als pMut1-Tc
bezeichnet. In
Beispiel 2Example 2
Veränderung von pMut2Change of pMut2
Für die Markierung des Plasmides pMut2 wurde eine Kanamycinresistenzkassette ausgewählt, die von dem Vektor pACYC177 abgeleitet wurde. Dazu wurde aus diesem die Resistenzkassette (Größe 1,34 kb) mit dem Restriktionsenzym StuI ausgeschnitten und über eine BglII-Restriktionsschnittstelle in das Plasmid pMut2 eingeführt. Nach Restriktionsverdau der Plasmide mit den entsprechenden Enzymen wurde der Restriktionsansatz über eine Säule (Quiagen, PCR Fraktion Kit) gereinigt und das Plasmid pMut2 einer Klenow-Behandlung unterzogen, um „blunt ends" für die Klonierung zu bilden. Um eine Religation des Plasmides pMut2 zu verhindern, wurde eine Dephosphorylierung des mit dem Restriktionsenzym BglII linearisierten und mit Klenow-Enzym behandelten Plasmides durchgeführt. Anschließend wurde der Vektor pMut2 und die Kanamycinkassette ligiert und damit der E. coli K-12 Stamm DH5α, wie in Beispiel 1 beschrieben, transformiert. Die Transformation wurde auf Kn-haltigen LB-Agarplatten ausplattiert. Der Erfolg der Klonierung wurde durch Minipräparation von Plasmid-DNA einzelner Bakterienklone überprüft. Das mit der Kanamycinkassette markierte Plasmid pMut2 wurde als pMut2-Kn bezeichnet.For the marking of the plasmid pMut2, a kanamycin resistance cassette was selected was derived from the vector pACYC177. This was made from this the resistance cassette (size 1,34 kb) with the restriction enzyme StuI cut out and a BglII restriction site introduced into the plasmid pMut2. To Restriction digestion of the plasmids with the corresponding enzymes was the restriction approach over a column (Quiagen, PCR Fraction Kit) and subjected the plasmid pMut2 to Klenow treatment to "blunt ends "for the cloning to build. To prevent religation of the plasmid pMut2, was dephosphorylated with the restriction enzyme BglII linearized and treated with Klenow enzyme plasmid. Subsequently was the vector pMut2 and the Kanamycinkassette ligated and thus the E. coli K-12 strain DH5α, as described in Example 1, transformed. The transformation was plated on Kn-containing LB agar plates. The success of Cloning was by minipreparation checked by plasmid DNA of individual bacterial clones. That labeled with the kanamycin cassette Plasmid pMut2 was named pMut2-Kn.
In
Beispiel 3Example 3
Einbringen des sacB-GensIntroduction of the sacB gene
sUm das sacB-Gen (kodiert für eine Levansaccharase) in die mit Resistenzkassetten markierten Plasmide pMut1-Tc und pMut2-Kn einzubringen, wurde in beiden Plasmiden die jeweils singuläre EcoRI-Restriktionsschnittstelle ausgewählt. Das sacB-Gen (Größe 2,6 kb) wurde aus dem Plasmid pCVD442 mit dem Restriktionsenzym PstI isoliert. Zur Vorbereitung der Vektoren pMut1-Tc und pMut2-Kn wurden diese Plasmide mit EcoRI linearisiert und anschließend zur Bildung von „blunt ends" einer Klenow-Behandlung unterzogen sowie dephosphoryliert. Das Insert sacB wurde nach dem Restriktionsverdau mit PstI gereinigt und mit Klenow-Enzym behandelt. Die linearisierten Vektoren und das Insert wurden ligiert und damit der E. coli K-12 Stamm DH5α, der wie in Beispiel 1 beschrieben kompetent gemacht wurde, transformiert. Der Erfolg der Klonierung wurde durch Minipräparation von Plasmid-DNA einzelner Bakterienklone und anschließende Restriktionsanalyse überprüft. Die mit dem sacB-Gen markierten Plasmide pMut1-Tc und pMut2-Kn wurden als pMut1-TcSac und pMut2-KnSac bezeichnet.Sum the sacB gene (coded for a levan sucrase) into the resistance cassettes labeled plasmids pMut1-Tc and pMut2-Kn was introduced in both plasmids each singular EcoRI restriction site selected. The sacB gene (size 2.6 kb) was isolated from the plasmid pCVD442 with the restriction enzyme PstI. to Preparation of the vectors pMut1-Tc and pMut2-Kn were these plasmids linearized with EcoRI and then to form blunt ends "of a Klenow treatment subjected and dephosphorylated. The insert sacB was after the Restriction digested with PstI and treated with Klenow enzyme. The linearized vectors and the insert were ligated and with it the E. coli K-12 strain DH5α, which was made competent as described in Example 1, transformed. The success of the cloning was achieved by minipreparation of single plasmid DNA Bacterial clones and subsequent Restriction analysis checked. The plasmids pMut1-Tc and pMut2-Kn labeled with the sacB gene referred to as pMut1-TcSac and pMut2-KnSac.
Beispiel 4Example 4
Herstellung eines plasmidfreien Klones des E. coli-Stammes DSM 6601Preparation of a plasmid-free Clones of E. coli strain DSM 6601
Zunächst wurde das Plasmid pMut1-TcSac durch Elektroporation in diesen Stamm, wie in Beispiel 1 beschrieben, transformiert. Nach der Elektroporation zur Überführung des Plasmides pMut1-TcSac in den Stamm DSM 6601 wurde der Ansatz auf Tc-haltigen (50 μg/ml) LB-Platten ausplattiert. Die erhaltenen Tetracyclin-resistenten Bakterienklone wurden auf den Besitz des Plasmids pMut1-TcSac und den damit verbundenen Verlust des natürlich vorkommenden Plasmides pMut1 überprüft. Der Verlust des Plasmids pMut1 wurde nach Präparation der Plasmid DNA und Restriktionsverdau derselben mit dem Enzym EcoRI nach elektrophoretischer Auftrennung der linearisierten Plasmide durch das Fehlen der pMut1 repräsentierenden DNA-Bande nachgewiesen.At first was the plasmid pMut1-TcSac by electroporation into this strain, such as in Example 1, transformed. After electroporation for the transfer of the Plasmid pMut1-TcSac in strain DSM 6601 was Tc-containing on the approach (50 μg / ml) LB plates are plated. The obtained tetracycline-resistant Bacterial clones were based on the possession of the plasmid pMut1-TcSac and the associated loss of the naturally occurring plasmid pMut1 checked. Of the Loss of the plasmid pMut1 was after preparation of the plasmid DNA and Restriction digestion of the same with the enzyme EcoRI after electrophoretic Separation of the linearized plasmids by the absence of pMut1 representing DNA band detected.
Anschließend wurde einer dieser Klone über Nacht in LB-Medium mit 10% Saccharose bei 30°C angezogen und dann auf LB-Platten mit 10% Saccharose ausplattiert (LB-Medium besteht aus 10g Pepton aus Casein, 5g Hefeextrakt und 5g Natriumchlorid auf 1 l destilliertem Wasser). Saccharose-haltiges LB-Medium wurde hergestellt, indem dem autoklavierten Medium nach dem Abkühlen auf 45°C von einer steril filtrierten 50 prozentigen (Gew./Vol.) Saccharosestammlösung ein Anteil bis zu einer Endkonzentration von 10% zugegeben wird.) Die Platten wurden bei 30°C inkubiert. Unter diesen Bedingungen können nur jene Klone replizieren, die sacB nicht mehr exprimieren, d.h. diese das sacB-Gen tragende Plasmid verloren haben. Der daraus resultierende Stamm DSM 6601ΔpMut1 wurde auf den Verlust des Plasmides pMut1-TcSac überprüft.Subsequently, one of these clones was grown overnight in LB medium with 10% sucrose at 30 ° C and then plated on LB plates with 10% sucrose (LB medium consists of 10g peptone from casein, 5g yeast extract and 5g sodium chloride to 1 l distilled water). Sucrose-containing LB medium was prepared by adding a portion to the autoclaved medium after cooling to 45 ° C from a sterile filtered 50% (w / v) sucrose stock solution to a final concentration of 10%.) The plates were incubated at 30 ° C. Under these conditions, only those clones that no longer express sacB, ie those that have lost the sacB gene, can replicate. The resulting strain DSM 6601ΔpMut1 was checked for the loss of the plasmid pMut1-TcSac.
Danach wurde durch Elektroporation das Plasmid pMut2-KnSac in den Stamm DSM 6601ΔpMut1 eingebracht.After that the plasmid pMut2-KnSac was electroporated into the strain DSM 6601ΔpMut1 brought in.
Nach der Elektroporation zur Überführung des Plasmides pMut2-KnSac in den Stamm DSM 6601ΔpMut1 wurde der Ansatz auf Kn-haltigen (50 μg/ml) LB-Platten ausplattiert. Die erhaltenen Kanamycin-resistenten Bakterienklone wurden auf den Besitz des Plasmids pMut2-KnSac und den damit verbundenen Verlust des natürlich vorkommenden Plasmides pMut2 überprüft. Anschließend wurde einer dieser Klone über Nacht in LB-Medium mit 10% Saccharose bei 30°C angezogen und dann auf LB-Platten mit 10% Saccharose ausplattiert. Die Platten wurden bei 30°C inkubiert. Der daraus resultierende Stamm DSM 6601 ΔpMut1/2 wurde auf den Verlust des Plasmides pMut2-KnSac überprüft.To the electroporation for the transfer of the Plasmid pMut2-KnSac in the strain DSM 6601ΔpMut1 was the approach to Kn-containing (50 μg / ml) LB plates are plated. The obtained kanamycin-resistant bacterial clones were based on ownership of the plasmid pMut2-KnSac and the associated Loss of course occurring plasmid pMut2 checked. Subsequently was one of these clones over Night grown in LB medium with 10% sucrose at 30 ° C and then on LB plates plated with 10% sucrose. The plates were incubated at 30 ° C. The resulting strain DSM 6601 ΔpMut1 / 2 was on the loss of the plasmid pMut2-KnSac.
Weiterhin wurde von dem plasmidfreien Stamm DSM 6601 ΔpMut1/2 eine Pulsfeldgelelektrophorese durchgeführt, um evtl. chromosomale Veränderungen des Stammes auszuschließen. Es wurde festgestellt, dass keine Änderungen nachweisbar waren und weitere Untersuchungen haben ergeben, dass der plasmidfreie Klon keinerlei morphologische, biochemische oder fermentative Änderungen zeigt.Farther was from the plasmid-free strain DSM 6601 ΔpMut1 / 2 a Pulsfeldgelgelelektrophorese carried out, possibly chromosomal changes to exclude the tribe. It was found that no changes were detectable and further investigations have shown that the plasmid-free Clone no morphological, biochemical or fermentative changes shows.
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