DE19815659A1 - Reaktive Quadratsäure- und Croconsäure-Farbstoffe als Marker für Biomoleküle und Arzneistoffe - Google Patents
Reaktive Quadratsäure- und Croconsäure-Farbstoffe als Marker für Biomoleküle und ArzneistoffeInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft reaktive, wasserlösliche Farbstoffe auf der Grundlage der Quadratsäure bzw. Croconsäure und ihrer Derivate, die eine kovalente Bindung mit Biomolekülen, wie z. B. Proteine, Lipide, Polynucleotide oder DNA oder Drogen oder Pharmaka, eingehen können. Die Farbstoffe dienen insbesondere der Fluoreszenzmarkierung dieser Materialien. Die markierten Moleküle können dann in optischen, insbesondere fluoreszenz-optischen, Bestimmungsverfahren eingesetzt werden. Typische Assays beruhen auf der Reaktion von farbstoffmarkierten Antigenen, Antikörpern oder DNA-Segmenten mit der jeweils komplementären Spezies.
Description
1 g 1-(ε-Carboxypentanyl)-2,3,3-trimethylindolenin-5-kaliumsulfonat (A1)
(Mujumdar, B., et. al., Bioconjugate Chemistry, (1993), 105-111) und 120 mg
Quadratsäure (Aldirch) werden in 30 ml eines Butanol/Toluol-Gemisches
suspendiert und 22 Stunden unter Verwendung eines Wasserabscheiders
refluxiert. Nach dem Abkühlen wird das Lösungsmittel abgezogen und das
Produkt mittels präparativer Dünnschichtchromatographie. Als stationäre Phase
dienen RP-C18 Glasplatten. Als Laufmittel wird ein Methanol/Wasser-Gemisch
(2/1, v/v) verwendet. Die blaue Bande mit einem Rf-Wert von 0,63 beinhaltet die
gewünschte Substanz.
50 mg Sq635-b-dibutylester (A2) werden in 5 ml Wasser gelöst. Dann gibt man 20
ml einer 1 molaren Salzsäure zu und erhitzt die Lösung 1,5 Stunden auf 80°C.
Nach dem Abkühlen wird das Lösungsmittel abrotiert und das Produkt am
Ölpumpenvakuum getrocknet.
35 mg Sq635-b-dicarbonsäure (A3) werden in einem Gemisch aus 1 ml DMF, 1 ml
1,4-Dioxan und 0,5 ml Wasser gelöst. Dazu gibt man 25 mg TSTU und 11 µl
Diisopropylethylamin. Die Reaktionsmischung wird dann 50 Min. bei
Raumtemperatur gerührt und anschließend filtriert. Dann wird das Lösungsmittel
abgezogen und das Produkt im Exsikkator über P2O5 getrocknet.
15 mg Sq635-b-dicarbonsäure (A3), 14 mg DCC und 4 mg NHS werden in 1 ml
trockenem DMF gelöst. Dann gibt man 10 µl Triethylamin zu. Das
Reaktionsgemisch wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und
anschließend filtriert. Dann wird das Lösungsmittel abgezogen, der Rückstand mit
Ether gewaschen und am Ölpumpenvakuum getrocknet. Dieser Schritt verläuft
quantitativ.
47 mg 1-(ε-Carboxypentanyl)-2,3,3-trimethylindolenin-5-kaliumsulfonat (A1)
(Mujumdar, B., et. al., Bioconjugate Chemistry, (1993), 105-111) und 22 µl
Quadratsäuredibutylester (Aldrich) werden in 8 ml Ethanol gelöst. Dann gibt man
140 µl Triethylamin zu und refluxiert das Reaktionsgemisch 30 Minuten. Dann fügt
man zu der siedenden Lösung 220 µl einer 1 mol/l NaOH zu und refluxiert weitere
30 Minuten. Nach dem Abkühlen gibt man 2,3 ml einer 1 mol/l Salzsäure zu und
zieht das Lösungsmittel ab. Der Rückstand wird mit 24 mg 2,3,3-Trimethylindol-5-
kaliumsulfonat (B1) (Mujumdar, B., et. al., Bioconjugate Chemistry, (1993), 105-
111) in 30 ml eines Butanol/Toluol-Gemisches (1/1, v/v) unter Verwendung eines
Wasserabscheiders eine Stunde lang refluxiert. Nach dem Abkühlen wird das
Lösungsmittel abgezogen, der Rückstand mit Methanol aufgenommen und mittels
präparativer Dünnschichtchromatographie gereinigt. Als stationäre Phase dienen
RP-C18 Glasplatten. Als Laufmittel wird ein Methanol/Wasser-Gemisch (2/1, v/v)
verwendet. Die blaue Bande mit einem Rf-Wert von 0,50 wird gesammelt.
Ausbeute: 5 mg.
Die Proteinmarkierungsreaktionen wurden in einem 50 mmol/l Bicarbonatpuffer
(pH 9,0) ausgeführt. Es wurde eine Stammlösung mit 1 mg Farbstoff in 100 µl
DMF hergestellt. 10 mg Protein wurden in 1 ml Bicarbonatpuffer gelöst, worauf
verschiedene Mengen an Farbstoff aus der Stammlösung hinzugegeben wurden.
Dann wurde das Reaktionsgemisch 20-24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Der freie Farbstoff wurde vom markierten Protein entweder durch
Gelchromatographie oder duch Dialyse abgetrennt. Der Markierungsgrad des
Farbstoff-Konjugates wurde mit einem BCA Protein Assay Kits von Pierce,
Rockford bestimmt.
385 µl anti-HSA (c = 5,2 mg/ml) werden in 750 µl Bicarbonatpuffer (0,1 mol/l,
pH = 9,0) gelöst. 1 mg Sq535-b-NHS-ester wird in 50 µl DMF gelöst und die
Farbstofflösung wird langsam unter Rühren in die Proteinlösung gegeben wonach
noch weitere 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wird. Der markierte
Antikörper wird vom freien Farbstoff durch Gelchromatographie getrennt. Als
stationäre Phase diente Sephadex G50, als Laufmittel wurde Phosphatpuffer (22
mmol/l, pH = 7,2) verwendet. Als erstes wird die blaue Bande des markierte
Antikörper eluiert.
Sq-635b-NHS-ester (ca. 0,5 mg) werden in 50 µl DMF gelöst. 5 mg HSA werden
in 750 µl Bicarbonatpuffer (0,1 mol/l, pH = 9,0) gelöst. Die Farbstofflösung wird
langsam zu der Proteinlösung gegeben und 20 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt. Die Reaktionsmischung wurde gegen einen Phosphatpuffer (22 mmol/l,
pH = 7,2) unter Verwendung einer Dialysemembran (1500 FT, Union Carbid) mit
cut-off von 10.000 dialysiert.
1,65 g 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2-methylbenzthiazolium jodid (C1) (Mujumdar, B., et.
al., Bioconjugate Chemistry, (1993), 105-111) und 0,3 g Krokonsäure (Aldrich)
werden in einer Mischung aus 20 ml Pyridin und 0,6 ml Triethylamin gelöst. Das
Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird das
Lösungsmittel abgezogen, der Rückstand mit Methanol gewaschen und
getrocknet. Ausbeute: 1,3 g (50%).
0.1 g Krokonsäurefarbstoff (C2) und 0.3 g PCl5 werden vorsichtig im Mörser
zerrieben. Das Gemisch wird in einem Rundkolben 30 Minuten auf 100°C erhitzt.
Dann gibt man 10 ml Toluol zu und rührt weitere 45 Minuten bei Raumtemperatur.
Das Reaktionsgemisch wird filtriert und das Filtrat zur Trockene eingeengt.
Ausbeute: 0.05 g Croconsäurfarbstoff-Säurechlorid.
40 mg Sq635-b-dibutylester und 70 mg P4S10 werden in 2 ml Pyridin 5 Stunden
refluxiert. Das Lösungsmittel wird abgezogen und der Rückstand mit Chloroform
behandelt. Das Rohprodukt wird mittels präparativer Dünnschichtchromatographie
gereinigt. Als stationäre Phase dienen RP-C18 Glasplatten. Als Laufmittel wird ein
Methanol/Wasser-Gemisch (2/1, v/v) verwendet. Die Bande mit einem Rf-Wert
von 0,40 wird gesammelt. Ausbeute: 10 mg.
Claims (3)
1. Farbstoffe der Struktur 1 und 2, welche zur Fluoreszenzmarkierung von
Proteinen, Nucleinsäuren, DNA, biologischen Zellen, Lipiden oder Pharmaka
geeignet sind:
wobei
wobei
- 1. A, B bzw. C für O, S bzw N-R stehen, wobei R im N-R für einen aliphatischen oder aromatischen bzw einem reaktiven aliphatischen oder aromatische Rest wie (CH2)nCOOH oder (CH2)nNH2 steht.
- 2. mindestens ein Substituent der Substituenten A, B bzw C durch CRxRy ersetzt wird, wobei Rx und Ry für COOH, CN, CONH2, COCl, CONHS usw. stehen.
- 3. X und Y für ein Element aus der Gruppe O, S, Se, bzw. der Strukturelemente NR und C(CH3)2 ausgewählt werden.
- 4. zumindest einer der Substituenten R1 bis R10 für eine reaktive Gruppe steht, welche eine kovalente Verknüpfung des Farbstoffes mit den oben genannten Trägermolekülen ermöglicht. Die reaktiven Gruppe kann aus folgenden Funktionalitäten ausgewählt werden: Isothiocyanate, Isocyanate, Monochlortriazine, Dichlortriazine, Aziridine, Sulfonylhalogenide, N- Hydroxysuccinimidester, Imido-Ester, Glyoxal und Aldehyd für Amin- und Hydroxyl-Funktionen sowie Maleimide und lodacetamide für Thiol-Funktionen. Diese reaktiven Gruppen können auch über Spacer-Gruppen der allgemeinen Struktur -(CH2)n- am eigentlichen Chromophor gebunden sein, wobei n Werte von 1 bis 18 einnehmen kann.
- 5. zumindest eine der Substituenten R1 bis R10 einen ionisierbaren Substituenten wie SO3 -, COO- oder NR3 + darstellt, der die hydrophilen Eigenschaften dieses Farbstoffes bestimmt.
- 6. und die Substituenten R3 bis R10 auch für höher kondensierte aromatische oder heterocyclische Ringe stehen können.
2. Verwendung der Moleküle nach Anspruch (1) zur kovalenten Kopplung
zwischen den oben angeführten funktionellen Gruppen und einer OH-, NH2- bzw
SH-Funktion von Trägermolekülen in wässriger Lösung und zu einer kovalenten
markierten Verbindung, die fluoreszente Eigenschaften aufweist.
3. Verwendung der in Anspruch (2) genannten markierten Verbindungen in
fluoreszenzanalytischen qualitativen und quantitativen Bestimmungsverfahren.
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---|---|---|---|---|
EP3744810A4 (de) * | 2017-12-21 | 2021-05-19 | Shenzhen University | Fluoreszenter farbstoff, herstellungsverfahren dafür und verwendung davon |
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Also Published As
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