DE19815659A1

DE19815659A1 - Reaktive Quadratsäure- und Croconsäure-Farbstoffe als Marker für Biomoleküle und Arzneistoffe

Info

Publication number: DE19815659A1
Application number: DE19815659A
Authority: DE
Inventors: Ewald Terpetschnig
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-04-08
Filing date: 1998-04-08
Publication date: 1999-10-14
Also published as: ATE494347T1; DE69943106D1; ES2357989T3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft reaktive, wasserlösliche Farbstoffe auf der Grundlage der Quadratsäure bzw. Croconsäure und ihrer Derivate, die eine kovalente Bindung mit Biomolekülen, wie z. B. Proteine, Lipide, Polynucleotide oder DNA oder Drogen oder Pharmaka, eingehen können. Die Farbstoffe dienen insbesondere der Fluoreszenzmarkierung dieser Materialien. Die markierten Moleküle können dann in optischen, insbesondere fluoreszenz-optischen, Bestimmungsverfahren eingesetzt werden. Typische Assays beruhen auf der Reaktion von farbstoffmarkierten Antigenen, Antikörpern oder DNA-Segmenten mit der jeweils komplementären Spezies.

Description

Darstellung von Sq635-b-dibutylester (A2)

1 g 1-(ε-Carboxypentanyl)-2,3,3-trimethylindolenin-5-kaliumsulfonat (A1) (Mujumdar, B., et. al., Bioconjugate Chemistry, (1993), 105-111) und 120 mg Quadratsäure (Aldirch) werden in 30 ml eines Butanol/Toluol-Gemisches suspendiert und 22 Stunden unter Verwendung eines Wasserabscheiders refluxiert. Nach dem Abkühlen wird das Lösungsmittel abgezogen und das Produkt mittels präparativer Dünnschichtchromatographie. Als stationäre Phase dienen RP-C18 Glasplatten. Als Laufmittel wird ein Methanol/Wasser-Gemisch (2/1, v/v) verwendet. Die blaue Bande mit einem R_f-Wert von 0,63 beinhaltet die gewünschte Substanz.

Darstellung von Sq635-b-dicarbonsäure (A3)

50 mg Sq635-b-dibutylester (A2) werden in 5 ml Wasser gelöst. Dann gibt man 20 ml einer 1 molaren Salzsäure zu und erhitzt die Lösung 1,5 Stunden auf 80°C. Nach dem Abkühlen wird das Lösungsmittel abrotiert und das Produkt am Ölpumpenvakuum getrocknet.

Darstellung von Sq635-b-di-NHS-ester mit TSTU (A4)

35 mg Sq635-b-dicarbonsäure (A3) werden in einem Gemisch aus 1 ml DMF, 1 ml 1,4-Dioxan und 0,5 ml Wasser gelöst. Dazu gibt man 25 mg TSTU und 11 µl Diisopropylethylamin. Die Reaktionsmischung wird dann 50 Min. bei Raumtemperatur gerührt und anschließend filtriert. Dann wird das Lösungsmittel abgezogen und das Produkt im Exsikkator über P₂O₅ getrocknet.

Darstellung von Sq635-b-di-NHS-ester mit NHS/DCC (A4)

15 mg Sq635-b-dicarbonsäure (A3), 14 mg DCC und 4 mg NHS werden in 1 ml trockenem DMF gelöst. Dann gibt man 10 µl Triethylamin zu. Das Reaktionsgemisch wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend filtriert. Dann wird das Lösungsmittel abgezogen, der Rückstand mit Ether gewaschen und am Ölpumpenvakuum getrocknet. Dieser Schritt verläuft quantitativ.

Darstellung von Sq635-m-carbonsäure (B2)

47 mg 1-(ε-Carboxypentanyl)-2,3,3-trimethylindolenin-5-kaliumsulfonat (A1) (Mujumdar, B., et. al., Bioconjugate Chemistry, (1993), 105-111) und 22 µl Quadratsäuredibutylester (Aldrich) werden in 8 ml Ethanol gelöst. Dann gibt man 140 µl Triethylamin zu und refluxiert das Reaktionsgemisch 30 Minuten. Dann fügt man zu der siedenden Lösung 220 µl einer 1 mol/l NaOH zu und refluxiert weitere 30 Minuten. Nach dem Abkühlen gibt man 2,3 ml einer 1 mol/l Salzsäure zu und zieht das Lösungsmittel ab. Der Rückstand wird mit 24 mg 2,3,3-Trimethylindol-5- kaliumsulfonat (B1) (Mujumdar, B., et. al., Bioconjugate Chemistry, (1993), 105- 111) in 30 ml eines Butanol/Toluol-Gemisches (1/1, v/v) unter Verwendung eines Wasserabscheiders eine Stunde lang refluxiert. Nach dem Abkühlen wird das Lösungsmittel abgezogen, der Rückstand mit Methanol aufgenommen und mittels präparativer Dünnschichtchromatographie gereinigt. Als stationäre Phase dienen RP-C18 Glasplatten. Als Laufmittel wird ein Methanol/Wasser-Gemisch (2/1, v/v) verwendet. Die blaue Bande mit einem R_f-Wert von 0,50 wird gesammelt. Ausbeute: 5 mg.

Allgemeine Vorschrift zur Markierung von Proteinen

Die Proteinmarkierungsreaktionen wurden in einem 50 mmol/l Bicarbonatpuffer (pH 9,0) ausgeführt. Es wurde eine Stammlösung mit 1 mg Farbstoff in 100 µl DMF hergestellt. 10 mg Protein wurden in 1 ml Bicarbonatpuffer gelöst, worauf verschiedene Mengen an Farbstoff aus der Stammlösung hinzugegeben wurden. Dann wurde das Reaktionsgemisch 20-24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der freie Farbstoff wurde vom markierten Protein entweder durch Gelchromatographie oder duch Dialyse abgetrennt. Der Markierungsgrad des Farbstoff-Konjugates wurde mit einem BCA Protein Assay Kits von Pierce, Rockford bestimmt.

Markierung von polyclonalem anti-HSA mit Sq635-b-NHS-ester

385 µl anti-HSA (c = 5,2 mg/ml) werden in 750 µl Bicarbonatpuffer (0,1 mol/l, pH = 9,0) gelöst. 1 mg Sq535-b-NHS-ester wird in 50 µl DMF gelöst und die Farbstofflösung wird langsam unter Rühren in die Proteinlösung gegeben wonach noch weitere 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wird. Der markierte Antikörper wird vom freien Farbstoff durch Gelchromatographie getrennt. Als stationäre Phase diente Sephadex G50, als Laufmittel wurde Phosphatpuffer (22 mmol/l, pH = 7,2) verwendet. Als erstes wird die blaue Bande des markierte Antikörper eluiert.

Markierung von HSA mit Sq-635b

Sq-635b-NHS-ester (ca. 0,5 mg) werden in 50 µl DMF gelöst. 5 mg HSA werden in 750 µl Bicarbonatpuffer (0,1 mol/l, pH = 9,0) gelöst. Die Farbstofflösung wird langsam zu der Proteinlösung gegeben und 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde gegen einen Phosphatpuffer (22 mmol/l, pH = 7,2) unter Verwendung einer Dialysemembran (1500 FT, Union Carbid) mit cut-off von 10.000 dialysiert.

Synthese und Aktivierung eines Croconium-Farbstoffes Darstellung des Krokonsäurefarbstoffes (C2)

1,65 g 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2-methylbenzthiazolium jodid (C1) (Mujumdar, B., et. al., Bioconjugate Chemistry, (1993), 105-111) und 0,3 g Krokonsäure (Aldrich) werden in einer Mischung aus 20 ml Pyridin und 0,6 ml Triethylamin gelöst. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird das Lösungsmittel abgezogen, der Rückstand mit Methanol gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 1,3 g (50%).

Aktivierung zum Säurechlorid (C3)

0.1 g Krokonsäurefarbstoff (C2) und 0.3 g PCl₅ werden vorsichtig im Mörser zerrieben. Das Gemisch wird in einem Rundkolben 30 Minuten auf 100°C erhitzt.

Dann gibt man 10 ml Toluol zu und rührt weitere 45 Minuten bei Raumtemperatur. Das Reaktionsgemisch wird filtriert und das Filtrat zur Trockene eingeengt. Ausbeute: 0.05 g Croconsäurfarbstoff-Säurechlorid.

Synthese des reaktiven Thioquadratsäure-Farbstoffes (D1)

40 mg Sq635-b-dibutylester und 70 mg P₄S₁₀ werden in 2 ml Pyridin 5 Stunden refluxiert. Das Lösungsmittel wird abgezogen und der Rückstand mit Chloroform behandelt. Das Rohprodukt wird mittels präparativer Dünnschichtchromatographie gereinigt. Als stationäre Phase dienen RP-C18 Glasplatten. Als Laufmittel wird ein Methanol/Wasser-Gemisch (2/1, v/v) verwendet. Die Bande mit einem R_f-Wert von 0,40 wird gesammelt. Ausbeute: 10 mg.

Claims

1. Farbstoffe der Struktur 1 und 2, welche zur Fluoreszenzmarkierung von Proteinen, Nucleinsäuren, DNA, biologischen Zellen, Lipiden oder Pharmaka geeignet sind:
wobei

1. A, B bzw. C für O, S bzw N-R stehen, wobei R im N-R für einen aliphatischen oder aromatischen bzw einem reaktiven aliphatischen oder aromatische Rest wie (CH₂)_nCOOH oder (CH₂)_nNH₂ steht.
2. mindestens ein Substituent der Substituenten A, B bzw C durch CR_xR_y ersetzt wird, wobei R_x und R_y für COOH, CN, CONH₂, COCl, CONHS usw. stehen.
3. X und Y für ein Element aus der Gruppe O, S, Se, bzw. der Strukturelemente NR und C(CH₃)₂ ausgewählt werden.
4. zumindest einer der Substituenten R₁ bis R₁₀ für eine reaktive Gruppe steht, welche eine kovalente Verknüpfung des Farbstoffes mit den oben genannten Trägermolekülen ermöglicht. Die reaktiven Gruppe kann aus folgenden Funktionalitäten ausgewählt werden: Isothiocyanate, Isocyanate, Monochlortriazine, Dichlortriazine, Aziridine, Sulfonylhalogenide, N- Hydroxysuccinimidester, Imido-Ester, Glyoxal und Aldehyd für Amin- und Hydroxyl-Funktionen sowie Maleimide und lodacetamide für Thiol-Funktionen. Diese reaktiven Gruppen können auch über Spacer-Gruppen der allgemeinen Struktur -(CH₂)_n- am eigentlichen Chromophor gebunden sein, wobei n Werte von 1 bis 18 einnehmen kann.
5. zumindest eine der Substituenten R₁ bis R₁₀ einen ionisierbaren Substituenten wie SO₃ ^-, COO^- oder NR₃ ⁺ darstellt, der die hydrophilen Eigenschaften dieses Farbstoffes bestimmt.
6. und die Substituenten R₃ bis R₁₀ auch für höher kondensierte aromatische oder heterocyclische Ringe stehen können.

2. Verwendung der Moleküle nach Anspruch (1) zur kovalenten Kopplung zwischen den oben angeführten funktionellen Gruppen und einer OH-, NH₂- bzw SH-Funktion von Trägermolekülen in wässriger Lösung und zu einer kovalenten markierten Verbindung, die fluoreszente Eigenschaften aufweist.

3. Verwendung der in Anspruch (2) genannten markierten Verbindungen in fluoreszenzanalytischen qualitativen und quantitativen Bestimmungsverfahren.