DE19811326C1 - Verfahren zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Tumorerkrankungen und zur Immunsuppression - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Tumorerkrankungen und zur Immunsuppression. Dabei werden solche Mittel ausgewählt, die eine besonders effektive Bindung an den Ah-Rezeptor aufweisen.

Der Ah-Rezeptor ist ein Mitglied der Proteinfamilie bHLH-PAS. Die Mitglieder dieser Proteinfamilie wirken als bedingt regulierte Transcriptionfaktoren, welche durch verschiedene chemische Verbindungen, beispielsweise durch Dioxine, aromatische Kohlenwasserstoffe, (heterozyklische) Nahrungsmittelmutagene und dergleichen aktiviert werden. Solche den Ah-Rezeptor aktivierende chemische Verbindungen werden folgend auch als Ah-Liganden bezeichnet.

Ah-Liganden transformieren den Ah-Rezeptor in einen aktiven Zustand, in welchem der Ah-Rezeptor z. B. mit dem Kernfaktor ARNT dimerisiert und infolge die Expression von Zielgenen induziert. Bislang bekannt ist, daß Zielgene, welche mit dem Metabolismus von Fremdsubstanzen korreliert sind, exprimiert werden. Hires gehören die Cytochrom P450I Subfamilie und Enzyme des Phase II Metabolismus (Schmidt, J. V. et al. Ann Rev Cell Dev Biol 12,55 (1996); Hankinson, Annu Rev Pharmacol Toxicol 35,307 (1995). Weiterhin ist bekannt, daß Dioxine die Proliferation und Differenzierung von Zellen beeinflussen, wofür als phänomenologische Wirkungen beispielhaft verstärkte Differenzierung der Haut, vermindertes Körperwachstum, Thymusatrophie, Hemmung der Spermienentstehung und Kanzerogenität (z. B. der Leber in Nagetieren) zu nennen sind. Der Ah-Rezeptor spielt in diesen Prozessen eine Rolle, wie die Korrelation zwischen Ah- Rezeptoraktivierung und der Toxizität von Dioxin-verwandten Liganden sowie genetischen Untersuchungen an Mäusen, welche verschiedene Allele des Ah- Rezeptorgens oder gezielte Null-Mutationen tragen, zeigen. (Schmidt, a.a.O.; Hankinson, a.a.O.; Fernandez-Salguero, et al. Science 268,722 (1995); Sewall. et al. Mutat Res 333,111 (1995). Es ist unwahrscheinlich, daß eine Dioxin-induzierte Metabolisierung von Fremdstoffen für die Wirkungen von Dioxinen auf Zellproliferation und Differenzierung verantwortlich ist. Insofern sind die Mechanismen und Gene, durch welche der Ah-Rezeptor die vorstehenden ausgeprägten Wirkungen zeigt, bislang unbekannt. Zwar sind als Zielgene für den Ah-Rezeptor IL-1β und der Tissue Plasminogen Activator Inhibitor 2 identifiziert worden (Sutter, et al. Science 254,415 (1991), diese scheinen jedoch, wie andere Zytokine, nicht direkt vom Ah-Rezeptor reguliert zu werden.

Es ist bekannt, daß das Zellzyklusinhibitorgen p27-Kip1 ein Faktor zur Regulierung der Proliferation von Zellen ist (Polyak et al. Cell 78,59 (1994; Loda et al. Nat med 3,231 (1997); Porter et al. Nat med 3,222 (1997); Catzavelos et al. Nat Med 3,227 (1997); Fredersdorf et al. Proc Natl Acad Sci USA 94,6380 (1997) Dies ergibt sich aus Untersuchungen, wonach in verschiedenen Tumorformen die Expression von Kip1 erniedrigt ist. Kip1 ist folglich ein Tumorsuppressorgen. Es wäre daher wünschenswert Substanzen zu finden, die den Pegel des durch das Kip1-Gen exprimierte Proteins in Zellen zu erhöhen vermögen. Bislang ist bekannt, den Transforming Growth Faktor β (TGFβ) einzusetzen; durch diesen Faktor erfolgt jedoch lediglich eine Stabilisierung des durch das Kip1-Gen exprimierten Proteins, nicht aber eine Induktion der Kip1-Boten-RNA.

Gegenüber dem Stand der Technik liegt der Erfindung das technische Problem zugrunde, ein Verfahren Herstellung von Mitteln, die zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder zur Immunsuppression geeignet sind, zur Verfügung zu stellen.

Die Lösung dieses technischen Problems lehrt das Verfahren gemäß Anspruch.

Vorzugsweise steht das Detektor-Gen unter der Kontrolle der regulatorischen Elemente des Kip1-Gens. Als Detektor-Gen ist z. B. ein Gen bezeichnet, welches das natürlicherweise von dem Kip1-Promoter kontrollierte Kip1-Gen-Produkt ist. In diesem Falle kann ein Nachweis der Kip1-Expression beispielsweise durch Northern- Blot oder Western-Immunoblotverfahren erfolgen. Der Ausdruck Detektor-Gen bezieht sich dabei darauf, daß ein dadurch exprimierbares Protein mit fachüblichen Mitteln zumindest halb-quantitativ unschwer nachweisbar ist.

Alternativ kommen auch synthetische Gene in Betracht, die die wesentlichen regulatorischen Elemente des Kip1-Gens enthalten. In diesem Falle ist es z. B. vorteilhaft, das Luziferase-Gen unter die Kontrolle des Kip1-Promoters zu verwenden, da dieses besonders leicht meßbar ist. Luziferase ist ein in Leuchtorganen vorkommendes Enzym, das in Gegenwart von Sauerstoff Luziferin in einen optisch angeregten Zustand überführt. Luziferase läßt sich daher leicht mit optischen Nachweissystemen messen, wodurch hohe Probendurchsätze möglich sind und ein effektives Screening von niedermolekularen Stoffen im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt werden kann. Denkbar sind für das erfindungsgemäße Verfahren aber auch andere Detektorsysteme, wie alkalische Phosphatase, Chloramphinikolacetyltransferase, β-Galactosidase.

Die Erfindung beruht demgemäß auf der neuen Erkenntnis, daß der Ah-Rezeptor direkt die Expression des Kip1-Gens induziert, und zwar dessen Transskription und ein unter der Kontrolle des Kip1-Gens stehendes Detektorgen einsetzbar ist.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich einerseits Mittel zur Behandlung von Tumorerkrankungen bestimmen. Andererseits läßt sich untersuchen, welche chemischen Verbindungen durch Induktion der Expression des Kip1-Gens als Tumorsuppresorsubstanzen geeignet sind (und nicht nur lediglich proteinstabilisierend wie TGFβ). Die so aufgefundenen chemischen Verbindungen sind gegenüber TGFβ vorteilhaft, da sie vergleichsweise einfacher als pharmazeutische Wirkstoffe herzustellen (nämlich durch organische Synthese anstelle gentechnischer Verfahren) und einzusetzen sind. Letzteres beruht darauf, daß solche chemischen Verbindungen potentiell nach oraler Applikation wirksam sind. Weiterhin vorteilhaft ist, daß die so findbaren chemischen Verbindungen Induktoren für die Kip1-Boten-RNA sind und nicht lediglich für die Proteinstabilität. Die ausreichende Expression der Boten-RNA ist nämlich primär erforderlich, so daß durch Proteinstabilisierung die Akkumulation des Kip1-Proteins in Zellen weiter gesteigert werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist nach dem Gesagten somit zum Screening sowohl von chemischen Verbindungen zur Behandlung von Tumorerkrankungen als auch von chemischen Verbindungen zur Immunsuppression geeignet. Dabei werden aus den getesteten Mitteln jene ausgewählt, welche eine besonders effektive Induktion des Kip1-Genes zeigen.

Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen chemischen Verbindungen sind auch besser verträglich als TGFβ, da letzteres beispielsweise auch Entzündungsreaktionen fördert. Zwar sind bei Einsatz gefundener Substanzen auch Nebenwirkungen, wie Immunsuppression und Induktion fremdstoffabbauender Enzyme zu erwarten, diese sind jedoch vergleichsweise akzeptabel. Mit einem erfindungsgemäßen Verfahren gefundene Substanzen können aber auch für die Behandlung von Immunerkrankungen eingesetzt werden, wie beispielsweise lymphoproliferativer Syndrome, Autoimmunerkrankungen oder bei Transplantationen, da insbesondere das zelluläre (T-Zell) Immunsystem durch Ah- Liganden supprimiert werden kann.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit auch chemische Verbindungen, die zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder zur Immunsuppression geeignet sind. Diese Mittel sind dadurch gekennzeichnet, daß sie selektierbar sind, indem Zielzellen mit chemischen Verbindungen, die an den Ah- Rezeptor der Zielzellen binden, behandelt werden und die Bindung der chemischen Verbindungen an den Ah-Rezeptor der Zielzellen durch Messung der hierdurch induzierten Expression eines für die Wirkungen der chemischen Verbindungen relevanten Detektor-Gens bestimmt wird. Bezüglich der hierbei verwendbaren Detektor-Gene und Promoter gilt das zuvor Gesagte.

Die Erfindung betrifft ferner transgene Zielzellen zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren. Hierbei gelten alle vorstehenden Erläuterungen bezüglich Promoter und Detektorgen-DNS entsprechend. Solche Zielzellen sind unschwer mit den Mitteln der Gentechnologie herstellbar. So kann beispielsweise die c-DNA-Sequenz der Detektorgen-DNS in einen Expressionsvektor, beispielsweise ein Plasmid, kloniert werden, welcher den Promotorbereich des Kip1-Gens enthält.

Die DNA-Sequenz beispielsweise für die Luziferase ist bekannt (de Wet, J. R. et al. Mol Cell Biol 2,725-737). Die DNA-Sequenz für den Kip1-Promoter ist ebenfalls bekannt, wozu auf Kwon, T. K. et al. Gene 180, 113 (1996); Minami, S. et al. FEBS Letters 411,1 (1997) verwiesen wird. Die relative Anordnung von Kip1-Promoter und 5 Detektorgen zueinander erfolgt nach üblichen Verfahren.

Zur Kontrolle der Genübertragung können zusätzlich Selektionsgene in die Zielzelle eingebracht werden. Dies sind Gene, die eine leichte Selektion der generierten transgenen Zielzellen erlauben.

Die Auswahl geeigneter Zielzellen liegt im üblichen Können des Fachmanns. Als Zielzellen kommen Mikroorganismen, tierische und menschliche Zellen in Frage. Beispiele für geeignete Mikroorganismen sind Hefezellen. Als tierische Zellen kommen z. B. CHO-Zellen, Hepatomzellen oder menschliche Tumorzellinien in Betracht.

Sofern die transgenen Zielzellen nichtmenschliche Zellen sind, kann es vorteilhaft sein, wenn deren Genom für die Expression des human-Ah-Rezeptors codierende DNS enthält. Diese DNS ist bekannt, wozu auf die Literaturstelle Dolwick, K. M. et al. Mol Pharmacol 44,911-917 verwiesen wird. Hierzu werden die Zielzellen zusätzlich dahingehend gentechnisch modifiziert, daß sie eine für den human-Ah- Rezeptor kodierende C-DNS exprimieren. Beispielsweise werden als Zielzellen Zellen von Tieren aus der Gruppe der Rodenten, beispielsweise 5L Rattenhepatomzellen, verwendet.

Gegenstand der Erfindung sind schließlich auch Mittel, die zur Behandlung von Tumorerkrankungen und zur Immunsuppression geeignet sind. Diese Mittel zeichnen sich dadurch aus, daß sie die oben beschriebenen chemischen Verbindungen enthalten. Vorzugsweise erfolgt deren Herstellung unter Einsatz von Zielzellen in der oben wiedergegebenen Weise.

Nachdem durch einleitende Experimente gefunden wurde, der Effekt von Dioxin auf den Zellzyklus anhaltende und induzierte Genexpression erfordert, wurden Experimente zur Untersuchung der Ah-Rezeptor-abhängigen, den Zellzyklus regulierenden Gene durchgeführt durch Charakterisierung biochemischer Veränderungen im Zellzyklusablauf (Lees, E., Curr Opin Cell Biol 7,773 (1995); Morgan, D. O., Nature 374,131 (1995). Die Pegel der Cycline D und E, welche in dem G1-S Übergang des Zellzyklus involviert sind, als auch deren assoziierte Cyclin­ abhängigen Kinasen (cdks 2 und 4) wurden durch Dioxin Behandlung nicht reduziert (siehe Fig. 2A). Die Pegel der Cycline D2 und D3 waren sogar erhöht, vermutlich weil die Zellen in einem Zustand eingefroren sind, welcher per se mit einem hohen Pegel dieser Cycline assoziiert ist. Dennoch, die Cyclin E assoziierte Histon H1 Kinase Aktivität war substanziell reduziert in Verfolg einer Behandlung mit TCDD (siehe Fig. 2B). p27Kip1 (Polyak, K. et al., Cell 78,59 (1994); Toyoshima, H., Hunter, T., Cell 78,67 (1994), welche unter anderen Bedingungen durch TGFß induziert wird, wurde nach 4 bis 72-stündiger Dioxin Exposition mit durchgehend erhöhtem Pegel gemessen mittels Western Blot (siehe Fig. 2C, Bahnen 1 und 2). Diese Induktion ist spezifisch, weil die p18-Ink und p21-Cip1 Pegel nicht nennenswert verändert waren und andere Inhibitoren (p57-Kip2, p15-Ink, p16-Ink, p19-Ink) nicht nachgewiesen werden konnten. Erhöhte Mengen an p27Kip1 waren assoziiert mit Cyclin E nach TCDD Behandlung, wie aus einer Immuncopräzipiationsanalyse (Fig. 2D) ersichtlich. In den gleichen Präzipitaten wurde die erwartete Akkumulation von einer langsamer wandernden Form von cdk2 gefunden (Fig. 2D), welche vermutlich bei Thr-160 nicht phosphoryliert ist (Polyak, a.a.O.). AhR (R = Rezeptor) beeinflußt die p27Kip1 Induktion, da eine Dioxin­ abhängige p27Kip1-Hochregulierung in einem an AhR armen Subclon von 5L Zellen nicht festgestellt werden konnte (BP8-AhR-, Figur C, Bahnen 3 und 4). Die Induktion wurde weiterhin durch ektopische Expression (Weiss, C. et al., Exp Cell Res 226,154 (1996) des AhR in diesem Subclon wiederhergestellt (BP8-AhR+, Figur C, Bahnen 5 und 6). Der Anstieg des p27Kip1 Proteinpegels ging einher mit einer vierfachen Induktion von Kip1 mRNA (Fig. 2E, Bahnen 1 und 2). Dies ist nicht durch RNA Stabilisierung hervorgerufen, da TCDD den Zerfall von Kip1 mRNA nach Unterbrechung der Transkription durch Actinomycin D nicht beeinflußt hat. Eine Kip1 mRNA Induktion erfordert nicht eine Dioxin-induzierte Expression von intermediären Proteinen, da der Translationsinhibitor Cycloheximid keinen Effekt zeigte (Fig. 2E, Bahnen 3 und 4). Diese Daten belegen die AhR-abhängige Aktivierung der Kip1 Transskription als einen neuen Mechanismus der Kip1 Induktion, welcher anders ist gegenüber der Kip1-Protein Akkumulation aufgrund von posttransskritionaler Regulation wie in anderen Fällen (Loda, M. et al., Nat med 3,231 (1997), Pagano, M. et al., Science 269,682 (1995); Tam, S. W., et al., Leukemia 3,363 (1997).

Genetische Hinweise für eine kausale Rolle der Kip1 Induktion in dioxin-induzierter Zellzyklus-Verzögerung wurden durch die transiente Expression einer Kip1 Antisensus RNA zur Inaktivierung von Kip1 erhalten. Coexpression des Green Flourescent Protein (GFP, Heim, A. B. et al., Nature 373,663 (1997) ermöglichte den Nachweis von effizient transfizierten Zellen mittels Flow Cytometrie (Fig. 3A). Wenn GFP zusammen mit einem leeren Expressionsvektor exprimiert wurde, reduzierte TCDD Behandlung die relative Anzahl von Zellen in S/G2 in beiden, der effizient transfizierten Subpopulation (Fig. 3B, oberes Panels) und der Mehrzahl von nicht transfizierten Zellen aus der gleichen Kulturschale (Fig. 3B, zweite Reihe). Wenn Kip1 Antisensus RNA zusammen mit GFP exprimiert wurde, wurde der TCDD Effekt auf die Zellzyklus-Verteilung in der effizient transfizierten Subpopulation an Zellen unterbrochen (Fig. 3B, dritte Reihe). In der nicht- transfizierten Subpopulation der gleichen Zellkultur verzögerte TCDD den Fortgang des Zellzyklus in der erwarteten Weise (Fig. 3B, letzte Reihe). Es ist dabei anzumerken, daß durch die Elektroporation die Dioxinempfindlichkeit reduziert wurde, so daß die beobachteten Effekte auf den Zellzyklus weniger ausgeprägt waren als in nicht-transfizierten Zellen, beispielsweise 1,5-2-fach gegenüber 3-4-fach in nicht elektroporierten Zellen (Weiss, a.a.O.). Diese Daten zeigen deutlich, daß Kip1 erforderlich ist für eine AhR-abhängige Dysregulation der Proliferation in 5L Zellen. Interessanterweise führt ein Verlust von Kip1 durch gezielte Mutagenese in Mäusen zu einem entgegengesetzten Phänotypus in Verfolg einer Dioxinvergiftung, nämlich Zunahme des Körpergewichts und multiple Organhyperplasie einschließlich eines hyperplastischen Thymus (Fero, M. L. et al., Cell 85,733 (1996); Nakayama, K., ibid. S. 707; Kiyokawa, ibid S. 721).

Ein wesentlicher Angriffspunkt der Dioxintoxizität ist der Thymus, welcher eine AhR-abhängige Atrophie erleidet (Poland, A. et al., Annu Rev Pharmacol Toxicol 22,517 (1982); Fernandez-Salguero, P. et al., Science 268,722 (1995)). Fetal Thymus Organ Culture (FTOC) bietet ein brauchbares Modell zum Studium von Dioxin Aktivitäten (Lai, Z. W. et al., Mol Pharmacol 52,30 (1997), sowie die darin genannten Literaturstellen). Nach nur 2 Tagen FTOC wurde eine 3-fache Induktion von Kip1- Protein in Thymocyten, welche von TCDD behandelten Kulturen präpariert wurden, gefunden, gegenüber Kulturen, die nur dem Lösungsmittel exponiert wurden (Fig. 4A). Dies ging einher mit einer Abnahme der Thymocyten-Proliferation, wie gezeigt durch einen reduzierten ³H-Thymidine Einbau in die Thymocyten DNA (75 ± 7%) und einen Abfall von 32 ± 3% auf 24 ± 1% der Anzahl Zellen in den S und G2 Phasen des Zellzyklus (ein repräsentatives Beispiel von 3 ähnlichen Experimenten ist in der Fig. 4B gezeigt). Die Proliferationsrate in allen frühen Thymocytensubpopulationen war unabhängig von Status der CD4 oder CD8 Expression (Tabelle 1) reduziert, aber der Effekt war stärker ausgeprägt in der prädominant unreifen, doppelt negativen und einer kleinen CD4low/+/CD8- Subpopulation.

Im Ergebnis zeigen die dargestellten Erkenntnisse, daß der Zellzyklus Inhibitor p27Kip1 unter der Kontrolle von AhR steht. Dadurch wird es erfindungsgemäß überraschenderweise möglich Daten zur Dioxintoxizität in Rodenten und Menschen (Sewall, C. H., Lucier G. W., Mutat Res 333,111 (1995) oder Toxizität bei niedrigen Dioxinkonzentrationen, wie sie ubiquitär in der Umwelt zu finden sind, zu vergleichen.

Die Erfindung und die der Erfindung zugrundeliegenden Erkenntnisse werden folgend näher erläutert.

Die Fig. 1 zeigt die transskriptionsabhängige Verzögerung des Zellzyklus-Fortschritts durch TCDD. 5L Zellen wurden wachstumsmäßig eingefroren durch Fasten in serumfreiem Medium über 24 h und synchron aus der Blockierung des Zellzyklus durch Zugabe von Serum befreit. Der Zellzyklusfortschritt wurde durch Western Blot Analyse überwacht, und zwar 8 h nach Serumstimulation durch die Akkumulation von phosphoryliertem Rb Protein (oberer Pfeil) im Verhältnis zu hypophosphoryliertem Rb Protein (unterer Pfeil). 2 h vor der Analyse wurden die Zellen mit 1nM TCDD, dem Transkriptionsinhibitor Actinomycin D (5 µg/ml) oder beidem behandelt. Die Kultivierungsbedingungen sind zuvor beschrieben worden (Weiss, C. et al. Exp Cell Res 226,154 (1996) und Extrakte wurden durch Zell-Lysis in denaturiertem SDS Probenpuffer präpariert.

Die Fig. 2 zeigt die Induktion des p27Kip1 Zellzyklusinhibitors während des Verzugs der TCDD-abhängigen Zellzyklus Progression. Biochemische Eigenschaften von G1- Phase Cyclin/cdk Komplexen wurden von 30-60% confluent asynchronen Zellkulturen, welche - außer jenen in Teil E - einer 24-stündigen Behandlung mit TCDD oder 0,1% des DMSO Lösungsmittels unterzogen worden waren, analysiert. Mengen an G1-Phase Cyclinen D1, D2, D3 und E sowie cdks 2 und 4(A) wurden mittels Western Blot aus Extrakten, welche durch Lysis mit einem milden Detergenz präpariert wurden (Matsushime, H. et al. Mol Cell Biol 14,2066 (1994), bestimmt. Die Cyclin E-abhängige Histon H1 Kinase Aktivität (B) wurde in einem Immunkomplex Kinase Assay (Matsuchime, a.a.O.) gemessen nach Präzipitation mit einem Anti- Cyclin E Antikörper (Bahnen 1 und 2) oder entsprechendem Anti-AP-2 Antikörper als Negativkontrolle (Bahnen 3 und 4). Die p27Kip1 Proteinpegel (C) wurden aus Ganzzellenextrakten aus TCDD behandelten Kulturen AhR exprimierender 5L Wild Type Zellen, ihren AhR-defizienten BP8AhR-Derivativen und BP8 Zellen, welche AhR ectopisch exprimieren (BP8AhR+), mittels Western Blot bestimmt (Weiss, a.a.O.). (D) Die Assoziation von erhöhten p27Kip1 Mengen mit Cyclin E wurde mittels Immuncopräzipitationsanalyse mit einem anti-Cyclin E Antikörper getestet, gefolgt von einer Western Blot Analyse von p27Kip1 oder cdk2 (Matsushime, a.a.O.) Die Induktion von Kip1 mRNA (E) nach 4-stündiger Exposition mit TCDD mit oder ohne 30-minütiger Vorbehandlung mit dem Translationsinhibitor Cycloheximid (20 µg/ml wurde mittels Northern Blot aus 10 µg total RNA getestet. Die partielle Ratten Kip1 cDNA Probe wurde mittels RT-PCR aus 5L Zellen RNA generiert unter Verwendung von Primern, welche mit nt 28-54 und nt 548-577 der murinen cDNA korrespondieren (Polyak, a.a.O.). Die gleichförmige Beladung der Bahnen in Protein Gelen mit Ganzzellenextrakten wurde mittels Coomassie Färbung eines Teils des Gels kontrolliert und die RNA Beladung wurde durch Rehybridisierung des Blots mit einer GAPDH Probe kontrolliert.

Die Fig. 3 zeigt, wie die Expression von Kip1 Antisensus RNA die TCDD induzierte Verzögerung des Zellzyklusfortschritts beeinflußt. 5L Zellen wurden transient cotransfiziert mit Expressionsvektoren für eine Kip1 Antisensus RNA und GFP (Teil B, unteres Panel) oder dem leeren Expressionsvektor und GFP (Teil B oberes Panel). Zellen wurden 32 h nach der Transfektion mit 1nM TCDD oder 0,1% DMSO Lösungsmittel als Kontrolle behandelt und geerntet für die 18 h spätere Analyse mit Flow Cytometrie unter Verwendung von Trypsin. (A) Die GFP exprimierende Subpopulation transfizierter Zellen (dicke Linie) wurden mittels hoher Grün- Fluoreszenz (GFP) identifiziert gegenüber nicht transfizierten Zellen (dünne Linie). (B) Zellzyklus-Profile wurden mittels H33258 Färbung bestimmt und individuell auf effizient transfizierte (ca. 5%), grün fluoreszierende Subpopulationen (Reihen 1 und 3) und nicht-transfizierte Subpopulationen (Reihen 2 und 4) analysiert in Gegenwart von 1nM TCDD (rechte Panels) oder 0,1% DMSO Lösungsmittel (linke Panels).

Die Fig. 4 zeigt TCDD induziertes p27Kip1 Protein und Zellzyklus-Verzögerung in fötaler Thymusorgankultur. Fötale Thymusdrüsen aus C57B16 Mäusen wurden nach 14,5 Tagen Schwangerschaft explantiert und für 2 Tage in der Gegenwart von 1nM TCDD oder 0,1%DMSO Lösungsmittel kultiviert vor der Präparation von Thymocyten p27Kip1 Protein (A) wurde mittels Western Blot aus 10⁵ Thymocyten bestimmt. Gleichmäßige Beladung des Gels wurde durch erneute Beprobung der Blots mit einem Erk1 Antikörper sichergestellt (Eines von drei repräsentativen Beispielen ist gezeigt). Die Zellzyklus Verteilung der gesamten Lymphocytenpopulation (B) wurde mittels Flow Cytometrie nach DNA Färbung mittels H33258 Bisbenzimid Farbstoff bestimmt.

Die folgende Tabelle zeigt die Unterdrückung der Proliferation in Thymocytensubpopulationen durch TCDD. Thymocyten von fötalen Thymusdrüsen wurden nach 2 Tagen der Kultivierung in der Gegenwart oder in Abwesenheit von TCDD gesammelt und auf die Zellzyklusverteilung analysiert. Die Werte sind Mittelwerte ± S.D. aus 3 unabhängigen Experimenten.

Claims (13)

1. Verfahren zur Herstellung von Mitteln, die zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder zur Immunsuppression geeignet sind, dadurch gekennzeichnet, daß chemische Verbindungen zur Herstellung der (des) Mittel(s) selektiert werden, indem Zielzellen mit chemischen Verbindungen, die an den Ah-Rezeptor der Zielzellen binden, behandelt werden, die Bindung der chemischen Verbindung(en) an den Ah-Rezeptor der Zielzellen durch Messung der hierdurch induzierten Expression eines für die Wirkungen der chemischen Verbindung(en) relevanten Detektor-Gens bestimmt wird und besonders effektive chemische Verbindungen zur Herstellung der (des) Mittel(s) eingesetzt werden (wird).

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Detektor-Gen das Kip1-Gen ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Detektor-Gen das Luziferase-Gen ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Zielzellen verwendet werden, welche den human-Ah-Rezeptor exprimieren.

5. Transgene Zielzellen zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß deren Genom unter Kontrolle des Kip1- Promotors stehende fremde Detektorgen-DNS enthält.

6. Transgene Zielzellen nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß deren Genom für die Expression des human-Ah- Rezeptors codierende DNS enthält.

7. Chemische Verbindung(en) zur Herstellung eines (von) Mittel(n) zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder zum Immunsuppression, dadurch gekennzeichnet, daß sie selektierbar sind, indem Zielzellen mit chemischen Verbindungen, die an den Ah-Rezeptor der Zielzellen binden, behandelt werden und die Bindung der chemischen Verbindungen an den Ah- Rezeptor der Zielzellen durch Messung der hierdurch induzierten Expression eines für die Wirkungen der chemischen Verbindungen relevanten Detektor- Gens bestimmt wird.

8. Chemische Verbindungen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Detektor-Gen das Kip1-Gen ist.

9. Chemische Verbindungen nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Detektor-Gen das Luziferase-Gen ist.

10. Chemische Verbindungen nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß Zielzellen verwendet werden, welche den human-Ah-Rezeptor exprimieren.

11. Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es chemische Verbindungen nach einem der Ansprüche 7 bis 10 enthält.

12. Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es erhältlich ist unter Einsatz der Zielzellen nach einem der Ansprüche 5 oder 6.

13. Verwendung des Mittels nach einem der Ansprüche 11 oder 12 zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder zur Immunsuppression.