DE69935414T2

DE69935414T2 - Humanes h-TRCP Protein

Info

Publication number: DE69935414T2
Application number: DE69935414T
Authority: DE
Inventors: Richard Benarous; Florence Margottin; Herve Durand; Fernando Arenzana Seisdedos; Mathias Kroll; Jean-Paul Concordet
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1998-01-30
Filing date: 1999-01-29
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2019-01-30
Also published as: DE69935414D1; EP1049775B1; JP2002501746A; CA2370098C; WO1999038969A1; ATE356207T1; AU2169499A; FR2774378A1; EP1049775A1; CA2370098A1; US6730486B1

Description

Die vorliegende Erfindung hat ein neues menschliches Protein zum Gegenstand, das bei der Zielsteuerung der Proteine zu den Abbauwegen durch das Proteasom wirkt. Dieses Protein, genannt h-βTrCP, ist in der Lage, insbesondere mit dem Protein Vpu des HIV-1-Virus sowie mit den Zellproteinen IκB, β-Catenin und Skp1p zusammenzuwirken.
Der Abbau der Proteine durch das Proteasom, einem Multiproteinkomplex, der in allen Zellen vorliegt, ist involviert in zahlreichen essentiellen Zellphänomenen wie die Regelung der Zellvermehrung, die Erneuerung der Proteine und die Entfernung der unkorrekt replizierten Proteine, insbesondere auf der Ebene des endoplasmatischen Retikulums (CIECHANOVER, A.,Cell, 79, 13-21, 1994). Zahlreiche Viren wie der Virus HIV-1, der CD4 über eines seiner Vpu-Protein abbaut (TRONO D., Cell, 82, 189-1992, 1995) verwenden zu ihren Gunsten diese zellulären Abbauwege der Proteine, in denen die Proteine zielgesteuert werden zum Proteasom durch verschiedene Wechselwirkungen mit anderen Proteinen, bevor sie abgebaut werden. Um zum Proteasom zielgesteuert zu werden und abgebaut zu werden von jenem, müssen die Proteine im allgemeinen vorher ubiquitinyliert werden durch Ubiquitin-Ligase-Komplexe. Um ubiquitinyliert zu werden, müssen die Proteine weiterhin häufig Modifikationen unterliegen, wie Phosphorylierungen (CIECHANOVER, A. Embo. J., 17, 7151-7160, 1998).
Bis heute kannte man mehrere andere Proteine vom Typ βTrCP:

– das Protein βTrCP von Xenopus, beschrieben durch Spevak et al. (Mol. Cell. Biol., 13, 4953-4966, 1993);
– das Slimb-Protein von Drosophila, beschrieben durch Jiang et al. (Nature, vol. 391, 29. Januar 1998);
– das Protein KIAA0696, gezeigt durch Ishikawa et al. (DNA Research, 5, 169-176, 1998) beim Anlass einer systematischen Analyse der im Gehirn exprimierten Sequenzen.

Jiang et al. haben gezeigt, daß das Slimb-Protein bei Drosophila in der Stabilität des Armadillo-Proteins und der Signalisierung von zwei metabolischen Wegen involviert ist, die für die Entwicklung essentiell sind, nämlich den Hedgehog- und Wingless-Wegen. Sie haben auch gezeigt worden, daß das Slimb-Protein eine Homologie von etwa 80% mit dem Protein βTrCP von Xenopus hat, wovon keine Funktion durch Spivak et al. beschrieben worden ist. Da das β-Catenin bei Xenopus oder beim Menschen, das homolog mit dem Armadillo-Protein der Drosophila ist, zu den Abbauwegen des Proteasoms in Abwesenheit von Signalisierung der Hedgehog- und Wingless-Wege zielgesteuert zu werden scheint, schlagen sie vor, daß beim Menschen die Gene, die die Homologe von Slimb kodieren, involviert sein könnten bei dem proteolytischen Abbau des β-Catenins, welches Protein onkogene Eigenschaften annimmt, wenn es nicht abgebaut wird (POLAKIS, P., Biochim. Biophys. Acta 1332, F127-47, 1997).
Selbst wenn die Konservierung der Wingless- und Hedgehog-Wege bei den Wirbeltieren wichtig ist, ist es dennoch nicht ebenso sicher, daß die Konservierung der Funktionen der homologen Proteine vollständig sein wird. Es gab im Übrigen zahlreiche Beispiele, die zeigen, daß es immer signifikante Unterschiede zwischen den Spezies gibt.
Darüber hinaus haben Jiang et al. die Implikation von Slimb bei der Kontrolle der Wingless- und Hedgehog-Wege bei Drosophila nur auf Basis von genetischen Untersuchungen etabliert. Ein Beweis, daß diese Kontrolle abhängig ist von einer direkten Interaktion zum Beispiel zwischen Slimb und Armadillo ist weder erforscht noch angewandt.
Das Protein gemäß der Erfindung, genannt h-βTrCP, ist in der Lage, mit viralen Proteinen oder Zellproteinen wechselzuwirken, die in der Lage sind, als Mediatoren zu wirken oder durch das Proteasom abgebaut zu werden. Insbesondere das Protein h-βTrCP ist in der Lage, insbesondere mit dem Protein Vpu des HIV-1-Virus sowie mit den Zellproteinen IκB und β-Catenin zusammenzuwirken.
Es ist insbesondere nützlich für die Zielsteuerung von therapeutischen Mitteln wie insbesondere Antitumor-, Antiviren-, Antientzündungs- und Anti-Alzheimer-Mitteln.
Das Protein Vpu ist ein kleines Membranprotein mit 81 Aminosäuren, exprimiert durch den Großteil der Isolate des HIV-1-Virus, aber weder durch jene des menschlichen HIV-2-Virus, der deutlich weniger pathogen ist, noch durch jene des SIV-Affenvirus (COHEN et al., Nature, 334, 532-534, 1988; et STREBEL et al., Science, 2, 1221-1223, 1988).
Eine der Funktionen des Proteins Vpu ist sein Vermögen, den Abbau des CD4-Proteins, einem Zellrezeptor des HIV-1-Virus, zu induzieren, wobei es so an der Verminderung der Expression des CD4-Rezeptors an der Oberfläche der Zellen teilhat (Willey et al., J. Virol. 68, 1207-1212, 1994).
Man weiß auch, daß zwei Phosphorylierungsserine des Vpu-Proteins, angeordnet an Position 52 und 56, unabdingbar für den Abbau von CD4 sind, der durch Vpu induziert wird (MARGOTTIN et al., Virology, 223, 381-386, 1996). Bei dem Infektionsvorgang durch den HIV-1-Virus in Abwesenheit des Vpu-Proteins assoziieren sich der Hüllenvorläufer Gp160 und das neu synthetisierte Protein CD4 im übrigen im endoplasmatischen Retikulum unter Blockieren der Reifung des Proteins Gp160 (BOUR et al., J. Virol., 65, 6387-6396, 1991). Der Abbau des CD4-Rezeptors, vermittelt durch das Protein Vpu, ist essentiell, um das virale Hüllprotein freizusetzen, das im endoplasmatischen Retikulum durch seine Bindung an CD4 dank der Wechselwirkung mit der Gp120-Untereinheit zurückgehalten wird, und erlaubt die normale Reifung der Hülle zur Plasmamembran und später deren Integration in die viralen Partikel, was sie infektiös macht. Jüngere Untersuchungen haben die Tatsache gezeigt, daß der Abbau des CD4-Rezeptors, vermittelt durch das Protein Vpu, sensibel gegenüber spezifischen Inhibitoren ist, die für das Proteasom spezifisch sind, und abhängig von der Gegenwart einer "intakten Ubiquitinylierungsmaschinerie" sind (FUJITA et al., J. Gen. Virol., 78, 619-625, 1997).
Das Protein Vpu hat daher an den absolut kritischen Funktionen teil, um die Produktion von infektiösen viralen Partikeln in großer Anzahl sicherzustellen, da es nicht nur bei den Proteinen des Gens gag einwirkt, das heißt bei den Proteinen einer Struktur unter Erhöhung der Erschlaffung der viralen Partikel, sondern auch bei jenen des Gens env, indem es die Reifung des Hüllproteins nach Abbau des CD4-Rezeptors erlaubt. MARGOTTIN et al. 1996 (supra) haben gezeigt, daß die Wechselwirkung unter Vpu und CD4 mit deren cytoplasmatischer Domäne stattfand und daß diese Wechselwirkung nicht ausreichend war, um den Abbau des CD4-Rezeptors auszulösen.
Das Protein Skp1p ist ein Zellprotein, das involviert ist in der Zielsteuerung der Proteine zu den Abbauwegen durch das Proteasom, welche von der Ubiquitinylierung der Proteine abhängen (PICKART C.M., The Faseb Journal, 11, 1055-1066, 1997).
BAI et al. (Cell, 86, 263-274, 1996) haben gezeigt, daß das Protein Skp1p notwendig war für die durch Ubiquitin vermittelte Proteolyse und daß dieser Abbau dank der Wechselwirkung von Skp1p mit Proteinen geschah, die ein F-Box genanntes Motiv enthalten.
Das Protein Skp1p ist ein wesentlicher Faktor zur Zielsteuerung von Regulatorproteinen des Zellzyklus durch das Proteasom. Die Zielsteuerung des Abbaus dieser Regulatoren ist insbesondere notwendig am Anfang des Zellzyklus in der S-Synthesephase von DNA (PAGANO, M., The Faseb Journal, 11, 1068-1075, 1997). Jüngere Untersuchungen haben gezeigt, daß das Protein Skp1p mit den F-Box-Proteinen wesentliche Elemente von Komplexen mit hohen Molekulargewichten sind, die SCF genannt werden für "Skp1p-Cullin-F-box-protein complexes". Diese SCF-Komplexe spielen die E3-Enzymrolle, welche durch deren Ubiquitin-Ligase-Wirkung den letzten Ubiquitinylierungsschritt von Substratproteinen erlaubt, die so zum Abbau durch das Proteasom zielgesteuert werden (HOYT, A, Cell, 91, 149-151, 1997). Im übrigen wird man bemerken, daß es bis heute kein Homolog von Skp1p gibt, das bei Drosophila identifiziert ist.
Das Protein IκB, das in verschiedenen Formen vorliegt (α, β, ε) ist ein vorwiegender Inhibitor des NFκB-Transkriptionsfaktors, welcher jenen in Form eines inaktiven Komplexes im Cytoplasma hält (Beg A. et al. Genes and Dev., 7. 2064-2070, 1993). Nach Stimulierung der Zellen durch Faktoren wie Interleukin 1 (IL1) und dem Tumornecrosefaktor (TNF), wird das Protein IκB phosphoryliert auf den Serinresten S32 und S36. Diese Phosphorylierung führt sehr schnell zur Ubiquitinylierung des Proteins und zu seiner Zielsteuerung zum Abbau durch das Proteasom. Der aktive NFκB-Faktor zum Beispiel in Form von zwei P50- und P65-Untereinheiten wird dann freigesetzt, importiert in den Kern, wo er sehr zahlreiche Gene aktivieren können wird und insbesondere Entzündungsphänomene hervorrufen können wird.
Das Protein β-Catenin ist ein Zellprotein, das wesentliche Signaltransduktionswege wie die Wingless-Wege kontrolliert, die sehr konserviert bei den Wirbeltieren sind (MILLER et al., Genes and Dev. 10, 2527-2539, 1996 und POLAKIS, P., Biochim. Biophys. Acta 1332, F 127-47, 1997). Das β-Catenin sammelt sich in den Krebszellen an, entweder in Folge von Mutationen, die die Phosphorylierung auf den Serinresten 33 und 37 hindern (mutierte β-Catenin-Proteine) oder in Folge von Mutationen seines Co-Faktors, dem Protein APC, das für seinen Abbau notwendig ist.
Die Ansammlung des β-Catenins, verbunden mit seinem Nichtabbau, führt zu seinem Import in den Kern und zur Aktivierung der Gene, die kontrolliert sind durch die Promotoren TCF-LEF, was Zelltransformations- und Zellvermehrungsphänomene hervorruft.
Es ist kürzlich gezeigt worden, daß Mutationen des 1-Presinilins bei Patienten, die von der Alzheimer-Krankheit betroffen sind, zu einer Destabilisierung und einem wachsenden Abbau des β-Catenins führte (ZHANG et al., Nature, 395, 698-702, 1998). Diese Autoren haben gezeigt, daß nicht mutiertes 1-Presinilin sich an ein β-Catenin bindet und so zu seiner Stabilität beiträgt. Bei der Alzheimer-Krankheit ist das mutierte Presinilin nicht mehr in der Lage, sich an das β-Catenin zu binden und dieses letztere wird dann schnell abgebaut. Der Gehalt von β-Catenin ist deutlich vermindert in den neuronalen Zellen von Patienten, die von der Alzheimer-Krankheit betroffen sind. Der Verlust des β-Catenins zieht eine verstärkte Apoptose der neuronalen Zellen mit sich, die verantwortlich wäre für den bei dieser Pathologie festgestellten neuronalen Verlust.
Man versteht leicht, daß es sehr drängt, Mittel zu finden, um die Zielsteuerung der Proteine zum Proteasom zu modulieren, das heißt zu aktivieren oder zu inhibieren.
Man hat jetzt ein neues menschliches Protein gefunden, das ein Protein ist, welches bei der Zielsteuerung der Proteine zu den Abbauwegen durch das Proteasom eingreift, und welches es ermöglicht, Modulatorreagenzien der Zielsteuerung der Proteine zum Proteasom zu screenen.
Die vorliegende Erfindung hat daher ein neues humanes Protein zum Gegenstand, genannt βTrCP, das die SEQ ID Nr. 2 hat und das beim Targeting von Proteinen zu den Wegen des Abbaus durch das Proteasom eingreift.
Das Protein βTrCP hat 569 Aminosäuren und umfaßt eine F-Box und sieben WD-Motive, deren Position in der Sequenz SEQ ID Nr. 2 die folgende ist:

– F-BOX: Aminosäuren 147-191,
– erstes WD-Motiv: Aminosäuren 259 bis 292,
– zweites WD-Motiv: Aminosäuren 304 bis 332,
– drittes WD-Motiv: Aminosäuren 343 bis 372,
– viertes WD-Motiv: Aminosäuren 387 bis 415,
– fünftes WD-Motiv: Aminosäuren 427 bis 455,
– sechstes WD-Motiv: Aminosäuren 467 bis 492,
– siebtes WD-Motiv: Aminosäuren 516 bis 544.

Aufgrund der Homologie dieses neuen Proteins mit βTrCP von Xenopus, welches Protein β-Transducin-Motive enthält und im Englischen unter der Bezeichnung "beta transducin repeats containing protein" bekannt ist, wird das Protein der Erfindung h-βTrCP (human-βTrCP) genannt.
Das Protein h-βTrCP der Erfindung ist in der Lage, mittels seiner WD-Motive mit Proteinen wechselzuwirken, die in der Lage sind, durch das Proteasom abgebaut zu werden, insbesondere mit den viralen Proteinen und den Zellproteinen, die über das Phosphorylierungsmotiv verfügen, das die Aminosäuren Asp-Ser-Gly-Xaa-Xaa-Ser umfaßt, in welchen Xaa irgendeine natürliche Aminosäure ist und bei welchen die Serinreste phosphoryliert sind.
Die Phosphorylierung dieses Motivs Asp-Ser-Gly-Xaa-Xaa-Ser ist unabdingbar zur Ubiquitinylierung und zum späteren Abbau der Proteine, die diesen Motivtyp aufweisen. Das Protein h-βTrCP ist nicht in der Lage, mit Proteinen wechselzuwirken, die dieses Motiv enthalten, da die beiden Serinreste phosphoryliert sind und sie nicht mit Proteinen wechselwirken können, die ein Phosphorylierungsmotiv enthalten, in welchen die Serinreste zu nicht-phosphorylierbaren Aminosäuren mutiert sind. Unter Wechselwirken mit den phosphorylierten Proteinen auf diesem Motiv kontrolliert das Protein h-βTrCP deren Ubiquitinylierung und deren Zielsteuerung zum Proteasom Im Hinblick auf deren Abbau.
Unter diesen Proteinen kann man insbesondere das virale Protein Vpu und die Zellproteine IκB und β-Catenin nennen.
Man hat auch gefunden, daß das Protein h-βTrCP mittels seiner F-Box mit dem Protein Skp1p wechselwirkt. Es ist daher Teil eines neuen SCF-Komplexes, SCF-h-βTrCP, der bestimmte Zellproteine oder Virenproteine auswählt, welche durch das Proteasom abgebaut werden müssen.
Durch die Zielsteuerungsaktivität über die Abbauwege durch das Proteasom spielt das Protein h-βTrCP gemäß der Erfindung die Rolle eines Zellmediators des Proteins Vpu in den durch das HIV-1-Virus infizierten Zellen.
Ohne an irgendeine Theorie gebunden sein zu wollen, denkt man, daß in den durch den HIV-1-Virus infizierten Zellen der Virus mittels des Proteins Vpu den SCF-Komplex verwendet, von dem das βTrCP-Protein ein Teil ist, um den Abbau des CD4-Rezeptors zu induzieren, was die virale Replikation und die Freisetzung der infektiösen Viren begünstigen wird.
Die Erfindung hat auch Peptidfragmente des Proteins h-βTrCP zum Gegenstand, die aus der Addition, Unterdrückung und/oder dem Ersetzen von einer oder mehreren Aminosäuren resultiert, wobei die Peptidfragmente die Wechselwirkung mit den Proteinen konserviert haben, die in der Lage sind, durch das Proteasom abgebaut zu werden, insbesondere mit dem Protein Vpu des HIV-1-Virus, mit dem Zellprotein IκB oder dem Zellprotein β-Catenin und/oder mit dem Protein Skp1p.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Peptidfragmente, die wenigstens eine der nachfolgenden Aminosäuresequenzen von h-βTrCP umfassen:
251-569,
292-569,
292-396,
292-545 und
1-291.
Man bevorzugt insbesondere die Peptidfragmente, die teilweise oder vollständig von der F-Box befreit sind, oder jene, die teilweise oder vollständig von den WD-Motiven befreit sind.
Ein besonders bevorzugtes Peptidfragment ist die Mutante, die deletiert ist von den Resten 32-179, nachfolgend βTrCPΔF genannt.
Die vorliegende Erfindung hat auch Nukleinsäuresequenzen zum Gegenstand, nämlich die Genom-DNA-Sequenzen, die cDNA-Sequenzen oder mRNA-Sequenzen, die umfassen oder bestehen aus einer Kette von Nukleotiden, die das Protein h-βTrCP codiert oder eines seiner Peptidfragmente wie oben definiert.
Die Erfindung betrifft insbesondere Nukleinsäuresequenzen, die für das Protein h-βTrCP und seine Peptidfragmente codieren, die oben beschrieben sind, welche dargestellt sind durch:

a) die DNA-Sequenzen SEQ ID Nr. 1 und Nukleinsäurefragmente, die für die Peptidfragmente codieren;
b) DNA-Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit der Sequenz a) hybridisieren;
c) DNA-Sequenzen, die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes resultieren aus den obigen Sequenzen a) und b) und das Protein h-βTrCP oder seine Fragmente codieren; und
d) entsprechende mRNA- und DNA-Sequenzen.

Die Proteine und Peptidfragmente gemäß der Erfindung können erhalten werden durch die Gentechnik, welche die Schritte umfaßt des:

– Kultivierens eines transformierten Mikroorganismus oder von transformierten Eukaryotenzellen, transformiert mit Hilfe einer Sequenz von Nukleinsäuren gemäß der Erfindung, und
– Gewinnens des Proteins oder des Peptidfragments, das von dem Mikroorganismus oder den Eukaryotenzellen erzeugt ist.

Diese Technik ist dem Fachmann wohlbekannt. Für betreffende Details wird man sich auf das nachfolgende Werk beziehen können: Recombinant DNA Technology I. Editors Ales Prokop. Raskesh K Bajpai: Annals of the New-York Academy of Sciences, volume 646, 1991.
Sie können auch hergestellt werden durch klassische Peptidsynthesen, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
Die Nukleinsäuren gemäß der Erfindung können hergestellt werden durch chemische Synthese und Gentechnik unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann wohlbekannt sind und zum Beispiel beschrieben sind in SAMBROOCK et al. (supra).
Die Synthese der cDNA-Sequenzen gemäß der Erfindung kann durch Amplifikation von mRNA von menschlichen Zellen mit Hilfe des PCR-Verfahrens (Polymerase Chain Reaction) durchgeführt werden, wie zum Beispiel beschrieben durch GOBLET et al. (Nucleic Acid Research, 17, 2144, 1989) unter Verwendung der synthetischen Oligonukleotide als Primer, die definiert sind ausgehend von der DNA-Sequenz SEQ ID Nr. 1.
Das Fragment amplifizierter Aminosäuren kann anschließend kloniert werden gemäß Techniken, die beschrieben sind in AUSUBEL et al. (Current Protocols in Molecular Biology, chapter 3, supra).
Die Erfindung hat auch transgene Tiere zum Gegenstand, die ein Transgen des Proteins h-βTrCP der Erfindung exprimieren, oder transgene Tiere, in denen das Gen βTrCP annulliert worden ist.
Diese transgenen oder für das Gen des Proteins h-βTrPC invalidierten Tiere werden als in vivo-Untersuchungsmodelle für die Störung des Zellzyklus und der Vermehrung durch Abwesenheit oder Überexpression des Gens des Proteins h-βTrCP oder verzweigter oder mutierter Formen dieses Proteins, des Proteins Skp1p, des Proteins Vpu, des Proteins IκB oder des Proteins β-Catenin dienen können.
Diese transgenen Tiere werden erhalten durch Techniken, die dem Fachmann wohlbekannt sind, wie jene, die beschrieben sind in "Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual", HOGAN, B., BEDDINGTON, R., COSTANTINI, F. & LACY, E. Cold Spring Harbor laboratory press, second edition, 1994.
Als Tiere bevorzugt man die Säugetiere, wie Maus oder Ratte.
Die Erfindung hat auch Procaryotenmikroorganismen und Eukaryotenzellen zum Gegenstand, die mit Hilfe eines Expressionsvektors transformiert sind, der eine DNA-Sequenz gemäß der Erfindung enthält. Dieser Expressionsvektor, der zum Beispiel in Form eines Plasmids sein kann, muß außerdem die DNA-Sequenz der Erfindung, für ihre Expression notwendige Mittel wie insbesondere einen Promotor, einen Transkriptionsterminator, einen Replikationsursprung und vorzugsweise einen Selektrionsmarker umfassen. Die Transformation der Mikroorganismen und der Eukaryotenzellen ist eine dem Fachmann wohlbekannte Technik, die leicht, in Abhängigkeit des zu transformierenden Mikroorganismus, die zur Expression der DNA-Sequenzen gemäß der Erfindung notwendigen Mittel bestimmen können wird.
Der zum Zwecke der Erfindung bevorzugte Mikroorganismus ist E.coli, während man als Hefe bevorzugt Saccharomyces cerevisiae verwendet.
Als Beispiele von Eukaryotenzellen, die den Zwecken der Erfindung genügen, kann man insbesondere die Zellen COS, CHO, SF9, Jurkat, usw. nennen, wobei alle bei ATCC verfügbar sind.
Die Erfindung hat auch die Eukaryotenzellen zum Gegenstand, die mit Expressionsvektoren co-transformiert sind, die einerseits die DNA-Sequenz enthalten, die für das Protein Vpu, für das Protein Skp1p, für das Protein IκB oder für die β-Catenin-Proteine codieren, die mutiert sind, und andererseits eine Sequenz, die für das Protein h-βTrCP codiert, wobei die Expressionsvektoren weiterhin Mittel enthalten, die für deren Expression verwendbar sind, einschließlich in dem Doppelhybridsystem in Hefe.
Die vorliegende Erfindung hat daher Anti-HIV-1-Antiviralmittel zum Gegenstand, die aus Peptidfragmenten des Proteins h-βTrCP der Erfindung bestehen, die die Wechselwirkungseigenschaften h-βTrCP bewahrt haben, entweder mit dem Protein Vpu, oder mit dem Protein Skp1p. Diese Peptidfragmente sind von der F-Box oder den WD-Motiven derart befreit, daß sie nicht mit dem Skp1p-Protein oder dem Vpu-Protein jeweils wechselwirken können.
Man kann auch als Antivirenmittel, Antitumormittel oder Antientzündungsmittel spezifische Antikörper nennen, die gegen das Protein h-βTrCP der Erfindung und seine Peptidfragmente gerichtet sind, was einen anderen Gegenstand der Erfindung bildet.
Diese Antikörper können monoclonale Antikörper sein, die erhalten sind durch das wohlbekannte Verfahren von KOHLER und MILSTEIN (Nature, 256, 495-497, 1975) oder polyclonale Antikörper, die erhalten sind gemäß klassischen Tierimmunisierungsverfahren (Antibodies, a laboratory manual. E. Harlow & D. Lane. Cold Spring Narbor laboratory press, 1988).
Man kann schließlich als Antivirenmittel, Antitumormittel oder Antientzündungsmittel die Antisense-Oligonukleotide nennen, die die Transkription oder die Translation des Proteins h-βTrCP der Erfindung blockieren, welche sich mit einer Nukleinsäuresequenz hybridisieren, wie oben definiert, was auch einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung bildet.
Diese Antisense-Oligonukleotide werden hergestellt durch Techniken, die dem Fachmann wohlbekannt sind, wie jene, die beschrieben sind durch AUSUBEL et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Grenn Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York, 1989, aktualisiert bis 1997).
Die Peptidfragmente von h-βTrCP, die die F-Box aufweisen oder die gleichzeitig die WD-Motive und die F-Box konserviert haben, können verwendet werden als Antitumor- oder Antientzündungsmittel.
Die Peptidfragmente von h-βTrCP, die von der F-Box befreit sind, können verwendet werden zur Gentherapie zur Behandlung von Knochengelenkentzündungskrankheiten oder akuten Entzündungssyndromen, die begleitet sind von einer Aktivierung von NFκB, induziert durch massive Freisetzung von TNFα bei diesen Vorgängen.
Wie veranschaulicht durch 7 ist die Expression von h-βTrCPΔF in der Lage, massiv um einen Faktor von etwa 20 Mal die Transkriptionsaktivierung zu inhibieren, die durch TNFα induziert wird. In allen Pathologien, die gekennzeichnet sind durch eine intensive Entzündungsreaktion aufgrund einer Freisetzung von TNFα, wird h-βTrCPΔF als ein leistungsfähiges Antientzündungsmittel wirken können. Es gibt beispielsweise derzeit mehrere Ansätze, um eine Gentherapie der rheumatoiden Polyarthritis mit Injektion in die beschädigten Gelenke von rekombinanten Viren einzusetzen. Man kann bei diesen Gentherapieversuchen der Entzündungssyndrome Vektoren verwenden, die h-βTrCPΔF exprimieren. Diese Vektoren werden von verschiedenen Typen sein können (Retrovirus, Adenovirus; ANDERSON F., Nature, 392, 25-30, 1998). Die Expression von h-βTrCPΔF wird durch ihre Wirkungen auf die Inhibition der Aktivierung von NFκB durch TNF kontrolliert werden können.
Die vorliegende Erfindung hat auch die Verwendung des Proteins h-βTrCP oder der Nukleinsäuresequenzen zum Gegenstand, die für dieses Protein oder für seine Peptidfragmente codieren, zum Zielsteuern der therapeutischen Mittel, die geeignet sind, die Wechselwirkung des Proteins h-βTrCP mit den Proteinen zu modellieren, die geeignet sind, durch das Proteasom abgebaut zu werden, insbesondere für deren Zielsteuerung:

– Anti-HIV-1-Antivirenmittel, die in der Lage sind, die Wechselwirkung zwischen dem Protein h-βTrCP und dem Protein Vpu zu inhibieren und/oder die Wechselwirkung zwischen dem Protein h-βTrCP und dem Protein Skp1p zu inhibieren,
– Antitumormittel, die in der Lage sind, die Regulation des Zellzyklus oder der Abbauprozesse der Proteine in den menschlichen Tumorzellen durch Modulation (Inhibition oder Aktivierung) der Wechselwirkung unter dem Protein h-βTrCP und dem Protein Skp1p zu stören, sowie durch Reaktivierung der Wechselwirkung zwischen dem Protein h-βTrPC und den β-Catenin-Proteinen, die in Tumorzellen mutiert sind, oder unter dem Protein βTrCP und dem normalen β-Catenin-Protein in den Tumorzellen, die von dem Protein APC befreit sind,
– Antientzündungsmittel, die in der Lage sind, die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB durch Inhibition der Wechselwirkung unter dem Protein h-βTrCP und dem Protein IκB zu stören,
– Anti-Alzheimermittel, die in der Lage sind, den Abbaugrad des β-Catenins in den neuronalen Zellen durch Inhibition der Wechselwirkung zwischen dem Protein h-βTrCP und dem Protein β-Catenin zu vermindern.

Unter Störung der Wechselwirkungen Vpu/h-βTrCP und/oder Skp1p/h-βTrCP kann man daher:

– entweder die Replikation und die Reproduktion des HIV-1-Virus durch die infizierten Zellen inhibieren,
- oder den Eintritt in die S-Phase des Zellzyklus inhibieren und eine Anti-Vermehrungswirkung haben.

Unter Störung der Wechselwirkungen IκB/h-βTrCP und/oder Skp1p/h-βTrCP kann man den Abbau des Proteins IκB durch das Proteasom inhibieren und daher die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB inhibieren.
Unter Aktivieren der Wechselwirkung mutiertes β-Catenin/h-βTrCP kann man schließlich den Abbau des β-Catenins aktivieren, das in den Tumorzellen angesammelt ist. Unter Inhibieren der Wechselwirkung β-Catenin/h-βTrCP bei Patienten, die von der Alzheimer-Krankheit betroffen sind, kann man die Apoptose der neuronalen Zellen vermindern.
Screenen von Modulatoren der Wechselwirkung h-βTrCP/Proteine
Man kann die Antivirenmittel auswählen entweder aus Zufallspeptidbanken bei der Phagen-Oberfläche (SCOTT J. et al., Science, 249, 386-390, 1990), unter Verwendung von Zufallssyntheseoligonukleotiden gemäß der SELEX-Typ-Technik (TUERK und GOLD, Science, 249, 505-510, 1990). Diese Technik erlaubt es, aus einem sehr großen Pool von Oligonukleotiden jene zu isolieren, die eine große Affinität für das Protein von Interesse haben, im vorliegenden Fall das Protein h-βTrCP. Sie werden als Aptamere bezeichnet. Unter diesen Aptameren wird man jene selektionieren können, die die Wechselwirkungen Vpu/h-βTrCP und Skp1p/hβTrCP inhibieren durch Screenen hiernach.
Das oben definierte Screenen kann zum Beispiel ausgeführt werden unter Verwendung des Doppelhybridsystems in Hefe, bei dem Hefezellen, die das Protein h-βTrCP gemäß der Erfindung und eines der Proteine Vpu, IκB oder β-Catenin, das Protein Skp1p co-exprimieren, kultiviert werden auf geeigneten selektiven Medien in Gegenwart der zu testenden Substanz. Die selektiven Medien sind gewöhnlich auf diesem Gebiet verwendete Medien und daher dem Fachmann wohlbekannt.
Das Hefedoppelhybridsystem ist beschrieben durch FIELDS und SONG in Nature, 340-245-246, 1989 und in dem Patent US 5 667 973 . Dieses Doppelhybridsystem basiert auf der Detektion der Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Aktivierung des His- oder LacZ-Reportergens unter der Kontrolle von Gal4-Transkriptionsaktivatordomänen in der Hefe.
In diesem Doppelhybridsystem cotransformiert man eine Hefe durch einen Doppelhybridvektor, der cDNA enthält von einem der Proteine und einen Vektor, der cDNA von einem anderen Protein enthält, wobei jeder dieser Vektoren entweder eine Bindedomäne an DNA oder eine Transkriptionsaktivierungsdomäne enthält. Man läßt anschließend durch die Hefe zwei Proteine in einem geeigneten Kulturmedium exprimieren, zum Beispiel einem Kulturmedium ohne Histidin. Die Wechselwirkung unter den hybriden Proteinen erlaubt die Aktivierung des His3-Gens und das Wachstum der Hefen auf einem Medium ohne Histidin einerseits sowie die Aktivierung des LacZ-Gens, die gezeigt wird durch eine spezifische colorimetrische Reaktion der β-Galactosidase. Man kann daher die Wechselwirkung verifizieren, da die Hefen auf einem Medium ohne Histidin wachsen und da man eine colorimetrische Reaktion beobachtet.
Man kann auch den Halo-Test verwenden, wie beschrieben durch Valtz & Peter (Meth-Enzymol-283, 350-365, 1997), um zu detektieren, ob es eine Wechselwirkung gibt.
Man kann auch Varianten des Doppelhybridsystems wie des Tripelhybridsystems verwenden, beschrieben durch TIRODE et al. (J. Biol. Chem., 272, 22995-22999, 1997) oder durch COLAS et al. (Nature, 380, 548-550, 1996), in denen ein Inhibitorpeptid der Wechselwirkung als dritter Partner exprimiert werden kann, um die Wechselwirkung der beiden anderen zu inhibieren. Eine Zufallspeptidbank kann auch von der Art verwendet werden.
Man kann auch das reverse Hybridsystem verwenden, das beschrieben ist durch VIDAL et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., 93, 10315-10320), in welchem man nicht auf eine Wechselwirkung, sondern gegen eine Wechselwirkung selektioniert. Man kann in diesem System wie in dem klassischen Doppelhybridsystem chemische Peptidmolekülbanken screenen, einschließlich solcher aus der chemischen Synthese, um die Hefen mit den Doppelhybridvektoren oder reversen Hybridvektoren cotransformiert zu machen, welche Träger der Fusionen mit dem Protein Vpu, dem Protein IκB, β-Catenin, dem Protein h-βTrCP oder dem Protein Skp1p sind, in Gegenwart dieser kleinen Moleküle zur Untersuchung eines Inhibitors der Wechselwirkungen Vpu-h-βTrCP und Skp1p-h-βTrCP oder β-Catenin-h-βTrCP oder auch IκB-h-βTrCP.
Die Tests zum Screenen von Inhibitoren einer Wechselwirkung werden auch im Doppelhybrid durch Konjugation (FROMONT-RACINE et al., Nature Genetics, 16, 277-282, 1997), durch Membrandoppelhybrid (BRODER Y.C. et al., Curr. Biol., 8, 1121-1124, 1998) und gegebenenfalls, wenn die Phosphorylierungen in den Bakterien stattfinden können, durch Bakteriendoppelhybrid (KARIMOVA et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 95, 5752-5756, 1998) durchgeführt werden können.
Das Screenen kann auch in vitro durchgeführt werden unter Verwendung von einem der Proteine Vpu, IκB, β-Catenin oder dem Protein Skp1p und dem Protein h-βTrCP, wobei eines der Proteine auf einem geeigneten Träger immobilisiert ist und das andere durch irgendein Mittel markiert ist, das bei den Detektionsmitteln von biologischen Substanzen verwendet wird, wobei dieses Markiermittel zum Beispiel ein radioaktives Isotop, ein lumineszentes Reagenz, Biotin oder ein spezifischer Antikörper sein kann.
Eines der Proteine wird vorzugsweise in Form eines Fusionsproteins mit Gluthation-S-Transferase (GST) auf Agarose-Gluthation-Kugeln oder in Mikrotiterplatten immobilisiert, wobei das GST als Kopplungsmittel des Proteins auf den Kugeln oder auf den Löchern der Platten dient.
Zu diesem Zweck kann man insbesondere den SPA-Szintillationstest (SPA) verwenden, beschrieben durch BOSWORTH et al. (Nature, 341, 167-168, 1989) und vertrieben von Amersham. Dieser Test besteht darin, durch ein radioaktives Element, zum Beispiel Tritium, eines der Proteine zu markieren und das andere Protein auf Magnetkugeln oder auf Agarose-Gluthation-Kugeln zu immobilisieren. Die Inhibitorwirkung der zu testenden Substanzen und der Wechselwirkungen, die das Protein h-βTrCP implizieren, kann leicht ohne Trennung der radioaktiven Spezies detektiert werden, die gebunden oder frei sind gemäß den durch BOSWORTH et al (supra) beschriebenen Protokollen.
Man kann auch die Technik "Surface Plasmon Resonances" verwenden, beschrieben durch KARLSSON et al. (J. Immunol. Methods, 145, 229-233, 1991) unter Verwendung des Biacores, vertrieben durch Pharmacia, um die Inhibitoren der Wechselwirkungen zu isolieren, die das Protein h-βTrCP gemäß der Erfindung involvieren.
Die Inhibitoraktivität der Antivirenmittel, die so selektioniert sind, wird überprüft werden können durch Tests auf T CD₄+-Zellen oder bei Schimpansen, die durch die Viren HIV-1 oder SIV Cpz infiziert sind.
Man kann auch die Antitumormittel und die Antientzündungsmittel, Liganden des Proteins h-βTrCP der Erfindung durch Doppelhybridtechniken oder artverwandte oder durch in vitro Wechselwirkung mit kombinatorischen Peptidbanken oder anderen chemischen Produkten wie oben beschrieben isolieren.
Die Spezifität der Antiviren-, Antitumor- oder Antientzündungsmittel, die ausgewählt sind durch den Doppelhybridtest, können anschließend durch Säugetierzellkultur bestimmt werden, zum Beispiel von menschlichen Zellen, die mit dem Protein β-TrCP oder einem Fragment von jenem transfektiert sind, in Gegenwart eines spezifischen Reportergens des in der Pathologie, die man zu behandeln wünscht, ivolvierten Proteins.
Für das Protein IκB wird man menschliche Zellen, die von den Zellinien Hela, 293, 293T, usw. kommen, und das Reportergen, abhängig von den NFκB-Stellen (3Enh-κB-ConA Luc), das die Expression der Luciferase kontrolliert, verwenden können.
In den nicht stimulierten menschlichen Zellen ist das humane βTrCP-Protein übergangsmäßig ausgehend von einem Vektor eukaryotischer Expression exprimiert wie pCDNA3 (Invitrogen) oder jedem anderen Vektor eukaryotischer Expression, der DNA eingefügt hat, die für den βTrCP-Teil codiert unter Kontrolle eines starken Promotors des Cytomegalovirus CMV oder anderen. Eine Menge in der Größenordnung von 3 μg dieses Vektors, die die Expression des βTrCP-Proteins erlaubt, wird co-transfektiert werden durch eine der geläufigen Transfektionstechniken (Calciumphosphat, Lipofectamin (Life technologies), Elektroporation (Ausubel et Sambrook, nachfolgend) usw. mit 1 μg eines abhängigen (3Enh-κB-ConA luc) oder unabhängigen (RSV Luc oder ConA Luc) Reportervektors der NFκB-Stellen, die die Expression des Luciferasereportergens kontrollieren. Moleküle, die in der Lage sind, die h-βTrCP-IκB-Wechselwirkung zu inhibieren, werden die Verstärkung von Expression von Luciferase in diesem Test inhibieren. Diese Inhibitoren werden dem Kulturmedium 24, 36 oder 48 Stunden nach der Transfektion für wenigstens 6 Stunden zugegeben. Man wird die Spezifität dieser Inhibitoren kontrollieren können unter Überprüfen, daß sie keine Wirkung auf RSV Luc oder ConA Luc haben. Man wird auch das Dual-Luciferase-System vom Promega verwenden können, in welchem man gleichzeitig zwei unterschiedliche Reportervektoren testen kann.
Gemäß einem ähnlichen Experimentalprotokoll zu jenem obigen aber mit stimulierten Zellen wird man überprüfen können, daß die durch die Expression des Fragments h-βTrCPΔF induzierte Inhibition bei der TNF-abhängigen Transkriptionsaktivierung annulliert worden ist.
Gemäß diesem zweiten Test werden die Humanzellen so mit 1 μg Reportervektor co-transfektiert, entweder 3Enh-κB-ConA Luc oder ConA Luc oder RSV Luc, mit 3μg pCDNA3, das das h-βTrCPΔF-Peptidfragment exprimiert, eine Mutante des βTrCP, die bei deren F-Box deletiert ist. 24 bis 48 Stunden nach Transfektion werden die Zellen für 6 Stunden mit TNF oder Okadasäure (OKA) behandelt, die leistungsfähige Aktivatoren von NFκB sind (BAUERLE et al., Cell, 1996, 87, 13-20). Die Mutante h-βTrCPΔF hat eine massive Inhibitorwirkung auf die Expression des Luciferase-Reporters im Verhältnis zu einem unter denselben Bedingungen transfizierten Kontrollplasmid. Diese Wirkung ist der Inhibition des Abbaus von IκB zuzuschreiben, die induziert wird durch Bindung der Mutante h-βTrCPΔF anstelle des endogenen Wildtyp-h-βTrCP-Proteins. Aufgrund dessen wird ein Inhibitormittel der Wechselwirkung h-βTrCP-IκB auch die Wechselwirkung h-βTrCPΔF-IκB inhibieren und daher die Inhibitorwirkung des Fragments h-βTrCPΔF umkehren. Die potentiellen Inhibitoren werden dem Medium unter den Bedingungen zugegeben wie jene oben angezeigten. Man wählt in den mit TNF oder OKA stimulierten Zellen die Inhibitoren, welche eine Verstärkung der Expression des Reportergens induzieren.
Nachdem Inhibitoren bei den beiden oben genannten Tests ausgewählt worden sind, kann man in einem dritten Test verifizieren, daß sie in der Lage sind, die Aktivierung von NFκB zu inhibieren, die induziert wird durch Stimulation der Zellen mit TNF oder OKA.
Man behandelt mit den potentiellen Inhibitoren die Zellen, die lediglich mit 1 μg Reportervektor (3Enh-κB-ConA Luc) transfiziert sind und stimuliert sind für 6 Stunden mit TNF oder OKA. Um spezifisch zu sein dürfen diese Inhibitoren nur bei den IκB-abhängigen Reportervektoren Wirkung haben und nicht bei den anderen Reportervektoren (ConA oder RSV).
Für das β-Catenin wird man humane Zellen verwenden können, die oben aufgelistet sind und transformiert sind mit mutiertem β-Catenin oder dem Peptidfragment von βTrCP, das von der F-Box befreit ist, in Gegenwart des Vektors Top-TK-Luci, der ein Multimer der Stellen TCF-LEF enthält, entsprechend dem β-Catenin oder Fop-tk Luci, das ein inaktives mutiertes Multimer enthält und das nicht mehr dem β-Catenin entspricht.
Detektion von β-Catenin-Mutationen
Wie man leicht ein onkogenes mutiertes β-Catenin von Wildtyp-β-Catenin durch die Tatsache unterscheiden kann, daß das erste entgegen dem letzteren nicht in der Lage ist, sich an β-TrCP im Doppelhybrid zu binden, kann man weiterhin Mutationen des β-Catenins in menschlichen Tumoren detektieren, durch Messung der Wechselwirkung mit β-TrCP im Doppelhybrid.
Dieser Test ist interessant, da er Mutationen des β-Catenins in zahlreichen Krebsen feststellt wie Darmkrebs, Melanom, Hepatokarzinome usw. Die einzige Art, diese Mutation derzeit zu detektieren, war es, das β-Catenin aus RT-PCR auf der RNA der untersuchten Tumore zu sequenzieren. Für mehr Sicherheit müssen mehrere Doppelproben in diesem Test des Standes der Technik gemacht werden. Die Existenz einer Mutation zeigt darüber hinaus selbst nicht den onkogenen Charakter dieser Mutation. Es könnte sich um einen Polymorphismus ohne Bezug zu Tumorgenität handeln.
Der Vorteil des Doppelhybridtests mit dem β-TrCP-Protein erlaubt es, in äquivalenten Zeiträumen zu jenen, die notwendig sind zum Erhalt einer Sequenz, eine klare Antwort zu erhalten, was den Prozentanteil von mutierten onkogenen Sequenzen des β-Catenins anbetrifft, die aus der Tumor-RNA detektiert sind. Bei einer großen Anzahl von Kolonien kann der Prozentanteil von onkogenen Formen des β-Catenins, die nicht in der Lage sind, mit dem β-TrCP zu interagieren, im Verhältnis zu den Wildformen, die mit β-TrCP Wechselwirken, genau bestimmt werden. Der Test kann in äquivalenten Zeiten zu jener durchgeführt werden, die zum Erhalt von einigen Sequenzen und bei verminderten Kosten erforderlich ist.
Die Testschritte sind die folgenden:

1. Herstellung der Gesamt-RNA einer Biopsie eines Tumors und des gesunden umgebenden Gewebes als Kontrolle durch eine von verschiedenen Techniken oder RNA-Präparationskits (AUSUBEL et al., Current protocols in Molecular Biology).
2. Amplifikation durch RT-PCR aus RNA-Proben der β-Catenin-Sequenzen des Tumors und des gesunden umgebenden Gewebes unter Verwendung eines Oligonukleotidpaars, das die Amplifikation entweder nur des N-terminalen Teils (1-130), der die am häufigsten onkogenen Mutationen enthält (RUBINFELD, B. et al., Science, 275, 1790-1792, 1997; DE LA COSTE et al., Proc. Natl.Acad.Sci. USA, 95, 8847-8851, 1998) oder der Gesamtheit der Sequenz, die das β-Catenin codiert, erlaubt.
3. Insertion dieser durch Ligation in einem der Doppelhybridvetoren amplifizierten Fragmente zum Beispiel durch pGAD1318 derart, daß eine Fusion in Phase mit einer Aktivierungsdomäne der Transkription von Gal4 oder der äquivalenten Aktivierungsdomäne der Transkription oder Bindung an DNA erhalten wird, die durch den verwendeten Doppelhybridvektor codiert ist.
4. Transformation von Bakterien von verschiedenen geeignetem Stämmen und Eichen der Gesamtheit der Transformation auf LB-Ampicillin-Medium.
5. Ernten der Gesamtheit der Kolonien und Miniplasmidpräparation (AUSUBEL, supra).
6. L40-Hefen oder jeder andere geeignete Hefestamm werden durch das Plasmid co-transformiert, das die β-Catenin-Sequenzen der obigen Mikropräparation enthält, mit einem Fusionshybrid, das βTrCP enthält, zum Beispiel pLexA-βTrCP, in welchem βTrCP fusioniert ist an einen Bereich mit Bindung an DNA von LexA. Ein Doppelhybridversuch ist durchgeführt worden auf der Gesamtheit der erhaltenen Kolonien, zum Beispiel durch Ausstreichen der co-transfizierten Hefen auf DO-W-L-Medium und dann Überführung der Kolonien auf ein Medium, das selektiv für die Detektion der Wechselwirkungen ist, das heißt DO-W-L-H-Medium oder in Gegenwart von X-Gal für die Detektion der Wechselwirkungen durch Produktion von β-Galactosidase (BARTEL P. & FIELDS S., Meth. Enzymol., 254, 241-263, 1995).

Die für diesen Test notwendigen Reagenzien sind die folgenden:

1. Ein an den geeigneten Stellen vorverdauter pGAD1318-Vektor, um ein amplifiziertes Fragment einzufügen, das durch RT-PCR erhalten ist.
2. Geeignete Oligonukleotide, um die Sequenz des β-Catenins zu amplifizieren und anschließend die amplifizierten β-Catenin-Sequenzen einzufügen. Die Oligonukleotidprimer zur Amplifikation werden gewählt in Abhängigkeit der Insertionsart des amplifizierten Fragments und der festgehaltenen Stellen.
3. Das Plasmid pBTM116-βTrCP, welches βTrCP exprimiert in Fusion mit der Bindedomäne an DNA von LexA.
4. Als Kontrolleplasmide, die für Fusionshybride mit Kontrollproteinen codieren, zum Beispiel pLexRas und pGAD1318Raf.

Man wird auch für diesen Test die "Gap repair"-Technik anwenden (SCHWARTZ, H., et al. Mutation detection by a two-hybrid assay., Hum. Mol. Gen., 7, 1029-1032, 1998), um die Sequenz des amplifizierten Fragments von β-Catenin einzufügen in den Doppelhybridvektor und direkt Hefen zu transformieren, ohne zum vorherigen Transformationsschritt in den Bakterien überzugehen.
Die Erfindung wird nun detailliert mit Hilfe des nachfolgenden Experimentalberichts beschrieben werden.
Ein großer Teil der in diesen Beispielen beschriebenen Techniken, die dem Fachmann wohlbekannt sind, wird detailliert beschrieben in dem Werk von SAMBROOK et al. (supra) oder in dem Werk von AUSUBEL et al. (supra).
Die nachfolgende Beschreibung wird besser verstanden werden mit Hilfe der 1 bis 12, in denen:
die 1A eine Fotographie einer Petrischale ist, die das Wachstum von Hefezellen zeigt, die co-transformiert sind mit den Plasmiden, die Vpu_C + VBP1, Vpu_C + h-βTrCP; Vpu_C-2/6 + h-βTrCP; Vpu_C, h-βTrCP + Vpu_C und h-βTrCP + CD4_C enthalten auf einem Medium in Gegenwart von Histidin (His+), auf einem Medium in Abwesenheit von Histidin (His-) und auf einem Medium in Gegenwart eines Substrats der β-Galactosidase X-Gal (β-Gal);
die 1B die Fotographie eines Gels ist (Northern blot), das 3 mRNAs des Proteins h-βTrCP der Erfindung zeigt;
die 1C eine Fotographie eines Immunoblots ist, der die Expression des Proteins h-βTrCP der Erfindung zeigt;
die 2 Sequenzen von 4 Proteinen angibt, h-βTrCP der Erfindung und βTrCP1 von Xenopus, Met30p von Saccharomyces cerevisiae und Scon2p von Neurospora crassa;
die 3 eine Fotographie eines 15%-SDS-PAGE-Gels ist, das die Wechselwirkung zwischen Vpu_C und dem Protein h-βTrCP der Erfindung zeigt, das in vitro erzeugt ist;
die 4 die Fotographie einer Petrischale ist, die das Wachstum von Hefezellen zeigt, die co-transformiert sind durch Plasmide, die Skp1p + h-βTrCP; Skp1p + h-βTrCP-Δ7W; Skp1p + VBP1 und Skp1p + CD4_C enthalten, auf Medium in Gegenwart von Histidin (His+), auf Medium in Abwesenheit von Histidin (His-) und auf Medium in Gegenwart des Substrats der β-Galactosidase X-Gal (β-Gal);
die 5 eine schematische Darstellung des Abbaus des CD4-Rezeptors ist, induziert durch das Protein Vpu, die das oben beschriebene Interaktionsnetzwerk darstellt;
die 6 eine Fotographie einer Petrischale ist, die das Wachstum von Hefezellen zeigt, die co-transformiert sind durch die Plasmide, die βTrCP + IκBa; β-TrCP + IκBa S32-36AA; βTrCP + Raf; Ras + IκBα; βTrCP + Vpuc und Ras + Raf auf (His+)-Medium, auf (His-)-Medium und Expression von β-Gal enthalten;
die 7 eine graphische Darstellung ist, die die Expression von Luciferase zeigt (ausgedrückt in Lichteinheiten pro μg: RLU/μg Protein) in Zellen, die transfiziert sind mit h-βTrCP- und h-βTrCPΔF-Konstrukten und Kontrollplasmiden und folgenden Reportervektoren: 3Enh-KB-ConA luc; ConA luc; RSV luc;
die 8 die Fotographie eines Immunoblots ist, der die Detektion des phosphorylierten oder nicht phosphorylierten IκB-Proteins und h-βTrCP-Proteins oder des h-βTrCPΔF-Fragments in Gegenwart von Anti-IκBa,-, Anti-IκBα-S32^P- und Anti-Myc-Antikörper zeigt;
die 9 die Fotographie eines Immunoblots ist, der die Detektion des phosphorylierten oder nicht phosphorylierten IκB-Proteins mit dem Protein h-βTrCP oder dem h-βTrCPΔF-Fragment zeigt, in Gegenwart von Anti-IκBα-S32^P- und Anti-IκBa-Antikörpern;
die 10 die Fotographie einer Petrischale ist, die das Wachstum von Hefezellen zeigt, die co-transformiert sind durch die Plasmide, die βTrCP + βCat_1→130 βTrCP + βCat_1→130 S33-37AA; βTrCP-2 + βCat_1→130; βTrCP-2 + βCat_1→130 S33-37AA und βTrCP + βCat enthalten, auf (His+)-Medium, auf (His-)-Medium und die β-Gal-Expression;
die 11 eine graphische Darstellung ist, die die Expression der Luciferase (RLU/μg Protein) in Zellen darstellt, die transfiziert sind mit dem Plasmid pcDNA3, den Plasmiden, die β-Cat ΔN, βTrCP, βTrCPΔF, KIA 696 (β-TrCP-2) und KIA 696 ΔF (β-TrCP2ΔF) enthalten;
die 12 eine Fotographie eines Immunoblots ist, der die Untersuchung der Stabilität des β-Catenin-Proteins zeigt, detektiert mit Anti-βCat-Antikörpern unter Einfluß der Expression des Proteins h-βTrCP oder des Fragments h-βTrCPΔF, detektiert durch die Anti-Myc-Antikörper.
Beispiel 1 Doppelhybridscreen in Hefe/Nachweis der cDNA-Sequenz des Proteins h-βTrCP und des Proteins h-βTrCP
Man hat als Ziel die cytoplasmatische Domäne des Proteins Vpu verwendet. Man hat die Fusion der Aminosäurereste 28-81 des Proteins Vpu des LAI-Isolats von HIV-1 mit der DNA-Fixierungsdomäne von Gal4 (Gal4BD) vorgenommen. Die gescreente cDNA-Bank war jene der Jurkat-Zellen (menschliche T-Lymphocytenlinie, ATCC Nr. TIB 152) und sie ist mit der Aktivierungsdomäne von Gal4 (Gal4AD) fusioniert worden in den Vektor pGAD1318 (BENICHOU et al. J. Biol. Chem., 269, 30073-30076, 1994).
Der Klon von 1,3 kb, der anfangs durch das Doppelhybridsystem isoliert worden ist (genannt VBP1) codiert für eine teilweise komplementäre DNA. Diese teilweise cDNA codiert für ein Fragment von 319 Aminosäuren, die dem C-terminalen Bereich des Proteins h-βTrCP entsprechen. Sie enthält sich wiederholende Motive gefolgt von einem C-terminalen Schwanz von 24 Aminosäuren. Diese sich wiederholenden Motive, welche bekannt sind, werden als WD-Motive bezeichnet, wegen deren Ende, das gewöhnlich durch die Sequenz Trp-Asp (WD) endet. Man wird bemerken, daß die WD-Motive in den Protein-Protein-Wechselwirkungen involviert sind (NEER et al., Nature, 371, 297-300, 1994).
Der so isolierte Klon ist durch DNA-Sequenzieren auf einem automatisierten Sequenzierer, Applied Biosystem, charakterisiert worden, bekannt unter dem Namen ABI 373A. Die DNA-Sequenziertechnik ist dem Fachmann wohlbekannt und insbesondere beschrieben in dem Werk SAMBROOK et al., "Molecular Cloning: a Laboratory Manual" Ed. Gold Spring Harbor Press, NY, 1989.
Eine Untersuchung in den cDNA-Banken hat gezeigt, daß dieser Klon homolog zu einer Sequenz ist, die für das Protein βTrCP von Xenopus codiert, das vorher identifiziert worden ist durch SPEVAK et al. (Mol. Cell. Biol., 13, 4953-4966, 1993).
Die vollständige cDNA (2,1kb) des Proteins h-βTrCP, die die SEQ ID Nr. 1 hat, ist erhalten worden durch die Polymerasekettenreaktionstechnik (PCR) auf einer Plasmidpräparation, die der cDNA-Bank von Jurkat-Zellen entspricht, wie oben definiert, in dem Vektor pGAD1318.
Von den sieben WD-Motiven, die in dem C-terminalen Fragment identifiziert sind, verfügt das vollständige Protein h-βTrCP gemäß der Erfindung weiterhin über einen N-terminalen Bereich von etwa 250 Aminosäuren. Das N-terminale Fragment enthält ein Motiv, für das kürzlich eine Consensus-Sequenz definiert worden ist unter dem Ausdruck F-Box und dessen Rolle es war, Proteine zur Abbaumaschinerie der Proteine zu zielsteuern, die durch Ubiquitin vermittelt ist, dank der Wechselwirkung der Proteine, die die F-Box enthalten, mit dem Protein Skp1p (BAI et al., 1996, supra).
So ist das Protein h-βTrCP durch seine WD-Motive einerseits in der Lage, mit dem Protein Vpu zu wechselwirken und verfügt anderseits über ein F-Box-Motiv, das mit dem Protein Skp1p wechselwirkt und daher in der Lage ist, die Proteine zu den Abbauwegen durch das Proteasom zu zielsteuern.
Das Protein h-βTrCP verfügt über 569 Aminosäuren und umfaßt eine F-Box und sieben WD-Motive, deren Position in der Sequenz SEQ ID Nr. 2 die folgende ist:

– F-Box: Aminosäuren 147-191,
– erstes WD-Motiv: Aminosäuren 259-292,
– zweites WD-Motiv: Aminosäuren 304-332,
– drittes WD-Motiv: Aminosäuren 343-372,
– viertes WD-Motiv: Aminosäuren 387-415,
– fünftes WD-Motiv: Aminosäuren 427-455,
– sechstes WD-Motiv: Aminosäuren 467-492,
– siebtes WD-Motiv: Aminosäuren 516-544.

Man hat untersucht, ob das so isolierte Protein irgendeine Homologie mit bereits bekannten Proteinen hatte, unter Verwendung der dem Fachmann wohlbekannten Technik eines Sequenzalignments gemäß dem Programm MACAW (SCHULER et al., Proteins: structure, function and genetics, 9, 180-190, 1991).
Die erhaltenen Ergebnisse sind in 2 angegeben, die zeigt, daß das Protein h=βTrCP eine Homologie hat:

- 88% mit dem Protein x-βTrCP1 von Xenopus,
- 33% mit dem Protein Met30p von Saccharomyces cerevisiae, einem Inhibitor der Transkription, der in der Biosynthese involviert ist,
- 31% mit dem Protein Scon2p von Neurospora crassa.

Die 2 zeigt auch den Ort der F-Box und der WD-Motive.
Beispiel 2: Klonen der cDNA des Proteins h-βTrCP
Die cDNA des Proteins h-βTrCP mit SEQ ID Nr. 1 ist amplifiziert worden durch PCR aus 2 μg Plasmid-DNA der pGAD-cDNA-Bank unter Verwendung von zwei Amplifikationszyklen, wobei das äußere Primerpaar für den ersten bestand aus dem Sense-Primer A mit SEQ ID Nr. 3 (in pGAD1318) und dem Antisense-Primer B mit SEQ ID Nr. 4 (in VPB1) und wobei das innere Primerpaar für den zweiten Zyklus aus dem Sense-Primer C mit SEQ ID Nr. 5 (in pGAD1318) und dem Antisense-Primer D mit SEQ ID Nr. 6 (in VPB1) bestand.
Nach diesem Vorgang hat man ein Fragment von 1,4 kb isoliert, in das Plasmid pGAD-VBP1 subkloniert in Form eines 5'Spe1-3'BglII-Fragments, um den Klon pGAD-h-βTrCP zu rekonstituieren.
Die Sequenzen, die für VBP1 codieren (Aminosäurereste 251 bis 569 des Proteins h-βTrCP) oder für das vollständige Protein h-βTrCP codieren, sind subkloniert worden in die Vektoren pGBT9, pGEX4T2 (Pharmacia) oder pCDNA3 (lediglich für das Protein h-βTrCP) (Invitrogen) unter Verwendung von Standardverfahren.
Beispiel 3: Spezifische Wechselwirkung des Proteins Vpu mit dem Protein h-βTrCP
Die Experimentalergebnisse, die die spezifische Wechselwirkung des neuen menschlichen Proteins βTrCP mit dem Protein Vpu beschreiben, sind in der 1 veranschaulicht.
3a - Wechselwirkung zwischen dem Protein Vpu und dem Protein h-βTrCP durch den oben beschriebenen Doppelhybridscreen
Die 1A zeigt die Wechselwirkung durch Doppelhybridtechnik der G-terminalen Region des Proteins h-βTrCP (VBP1) aus der cDNA-Bank von Jurkat-Zellen (Zeile 1) oder des vollständigen Proteins h-βTrCP (Zeile 2), fusioniert an die Aktivierungsdomäne von Gal4 mit der cytoplasmatischen Domäne von Vpu, die fusioniert ist an die DNA-Bindedomäne von Gal4 oder umgekehrt (Zeile 5). Die Wechselwirkung manifestiert sich durch die Aktivierung der beiden Reportergene His3 und LacZ. Das Gen His3 erlaubt das Wachsen der Hefen in Abwesenheit von Histidin (-His-Feld), und das LacZ-Gen induziert die Produktion von β-Galactosidase, manifestiert durch Blaufärbung in Gegenwart des Substrats X-Gal (β-Gal-Feld). Diese Wechselwirkung ist spezifisch, da sie nicht zwischen dem Protein Vpu und dem Vektor allein vorgefunden wird (Zeile 4) oder zwischen dem Protein h-βTrCP und einem anderen Protein wie der cytoplasmatischen Region von CD4 (Zeile 6). Das Feld + His ist ein Kontrollfeld, das anzeigt, daß alle Kombinationen, einschließlich, wenn es keine Wechselwirkung gibt, in Gegenwart von Histidin wachsen.
Man muß bemerken, daß das Protein h-βTrCP nicht mit einer Mutante des inaktiven Vpu-Proteins interagiert, Vpuc-2/6 (Zeile 3), einem mutierten Klon bei den beiden Serinresten Ser 52 und Ser 56, die essentiell für die Aktivität von Vpu sind (MARGOTTIN et al., 1996, supra). Dieses Ergebnis zeigt, daß es eine Korrelation zwischen der Kapazität von Vpu, mit h-βTrCP zu interagieren und seiner Aktivität gibt.
3b - Nachweis der Expression des Proteins h-βTrCP durch "Northern Blot"-Analyse
Durch "Northern Blot"-Analyse von mRNA von verschiedenen menschlichen Zellinien unter Verwendung einer 5'-Sonde hat man gefunden, daß mehrere RNA-Matrizen (mRNA) mit einer entsprechenden Sonde an h-βTrCP (1B) hybridisieren. Diese mRNA mit jeweiligen Größen 2,4 kb, 3,5 kb und 7 kb werden in allen getesteten menschlichen Geweben wiedergefunden. Diese mRNA-Vielfalt ist remineszent für die durch HUDSON et al. (Dev. Genet., 19, 190-198, 1996) für die mRNA des βTrCP von Xenopus beschriebene Situation, für die drei unterschiedliche mRNA mit jeweiligen Größen nahe zu jenen hier gefundenen für die mRNA von h-βTrCP bereichtet worden sind.
3c - Nachweis der Expression des Proteins h-βTrCP durch "Immunoblot"-Analyse
Anti-h-βTrCP-Antipeptid-Antikörper (Abs) sind erzeugt worden bei Kaninchen durch Immunisierung mit dem Synthesepeptid 275-293, das dem ersten WD-Motiv des Proteins h-βTrCP entspricht. Diese Abs-Antikörper sind gereinigt worden durch Affinität durch Adsorption auf 30 μg GST-VBP1-Fusionsprotein, exprimiert bei E.Coli ausgehend von einem pGEX-VBP1-Vektor und immobilisierten nach Elektroporation auf eine Nitrocellulose-Membran. Die gereinigten Abs-Antikörper sind dann eluiert worden durch das Elutionsmittel Glycin.HCl, pH 3,0, neutralisiert worden mit 1M TRIS-Puffer, pH 8,0 und verwendet worden für eine Analyse durch eine Western-Blot-Technik der Expression des Proteins h-βTrCP in humanen Sup T1 (T1)-Zellen in den Kaninchenreticulocyten (RRL) und in den caninen mikrosomalen Membranlysaten (CMM).
Die 1C zeigt die Expression des Proteins h-βTrCP, detektiert in einem menschlichen T-Zell-Lysat der Linie Sup T1 (Zeile 1), von Kaninchenreticulocyten von Promega (Zeile 3), durch die "Western-Blot"-Technik unter Verwendung von Anti-h-βTrCP-Antikörpern, gerichtet gegen das Peptid 275-293, das oben erhalten ist. Im Gegenzug konnte kein Protein entsprechend dem h-βTrCP in Hundepancreas-Mikrosomenmembranen von Promega detektiert werden (Zeile 2). Die Größe des detektierten Proteins h-βTrCP (60 kD) zeigt an, daß der cDNA-Klon von h-βTrCP, der charakterisiert worden ist und dargestellt ist in 2, in der Lage ist, für ein vollständiges h-βTrCP-Protein zu codieren.
Beispiel 4: Kartographie der Wechselwirkungsorte zwischen Vpuc und dem Protein h-βTrCP
Die Wechselwirkungsorte unter der cytoplasmatischen Domäne des Proteins Vpu (Vpuc) und dem Protein h-βTrCP der Erfindung sind in folgender Weise bestimmt worden.
Auf der Ebene von Vpuc ist gezeigt worden, daß die Mutation der Serine an den Positionen 52 und 56 (Klon Vpuc-2/6) integral die Wechselwirkung unter Vpu und h-βTrCP abschaffte.
Auf der Ebene von h-βTrCP zeigen die Doppelhybridwechselwirkungsergebnisse mit der cytoplasmatischen Domäne von Vpu und die verschiedenen unten beschriebenen Mutanten, daß die Gesamtheit der WD-Motive und der C-terminale Schwanz erforderlich sind für eine optimale Wechselwirkung, wie in der nachfolgenden Tabelle angezeigt.
Die verwendeten Mutanten sind die folgenden:

– VPB1-ΔW₁ (Klon VPB1, dessen erste WD-Domäne deletiert worden ist; Reste 292 bis 569), die einem BglII-Xhol-Fragment von VBP1 entspricht,
- VPB1-ΔW_4-7 (VPB1-Klon, dessen WD-Domänen bis 4 bis 7 deletiert worden sind; Reste 292 bis 296) und
– VPB1-ΔC-ter (VPB1-Klon, dessen C-terminaler Schwanz nach der siebten WD-Domäne deletiert worden ist; Reste 292 bis 545)

Primer E: SEQ ID Nr. 7
Primer F: SEQ ID Nr. 8

Die Mutante h-βTrCP-Δ7W (Klon h-βTrCP, dessen sieben WD-Domänen deletiert worden sind; Reste 1 bis 291) ist konstruiert worden unter Einfügen eines Spel-BglII-Fragmentes aus dem Protein h-βTrCP in den Vektor pGAD1318 und der Mutante βTrCPΔF (deletierte Reste: 32 bis 179) ist erhalten worden durch Deletion des Fragments AvrII-Asp718 des Proteins h-βTrCP mit Konservierung des Leserasters.
Man hat verifiziert, daß die Interaktion unter den Proteinen und Vpu und h-βTrCP in vitro durch das folgende Verfahren stattfinden konnte: zwei Proteine sind in das Lysat von Kaninchenreticulocyten (RRL) eingeführt worden. Die Komplexe Vpu/βTrCP, in vitro gebildet, sind identifiziert worden durch Co-Immunopräzipitation unter Verwendung der Anti-h-βTrCP-Antikörper, gerichtet gegen das Peptid 553-569, hergestellt durch das gleiche Verfahren wie jenes, das verwendet ist, um die Anti-h-βTrCP-Antikörper zu erhalten, die gerichtet sind gegen das Peptid 275-293.
Die 3 veranschaulicht die in vitro-Wechselwirkung zwischen den Proteinen Vpu und h-βTrCP. Die Zeile 1 zeigt, daß das Protein Vpu nicht im Anti-h-βTrCP-Antiserum angetroffen wird, während die Zeile 5 anzeigt, daß es in Gegenwart eines Anti-Vpu-Antiserums ausfällt. Die Zeile 2 zeigt, daß die Anti-h-βTrCP-Antikörper in der Lage sind, das Protein Vpu zu co-präzipitieren, das in vitro co-translatiert wird mit dem Protein h-βTrCP. Die Zeile 4 zeigt, daß die Doppelmutante von Vpu, mutiert an den Positionen Ser52 und Ser56 nicht in der Lage ist, den Abbau von CD4 zu indizieren, nicht mit dem Protein h-βTrCP interagiert und daher nicht durch die Anti-h-βTrCP-Antikörper co-präzipitiert wird, während die Zeilen 6 und 7 zeigen, daß diese Mutante Vpu_c-2/6 mit derselben Effizienz translatiert wird wie das Protein Vpu.
Tabelle
Beispiel 5: Wechselwirkung zwischen dem Protein h-βTrCP und dem Protein Skp1p
Um zu zeigen, daß das F-Box-Motiv gut funktionell war und daher effizient zu Zielsteuerung zum Proteasom mittels des Proteins Skp1p dient, hat man einen Doppelhybridtest unter der N-terminalen Domäne des Proteins h-βTrCP und des Proteins Skp1p durchgeführt, was es erlaubt hat, eine Wechselwirkung zwischen dem Protein h-βTrCP und dem Protein Skp1p zu zeigen.
Das menschliche Protein Skp1p, beschrieben in BAI et al. (1996, supra) ist subkloniert worden in den pLex10-Vektor für eine Interaktionsanalyse mit dem Protein h-βTrCP in den Hefestamm L40 (VOJTEK et al. Cell, 74, 205-214, 1993).
Die 4 veranschaulicht die erhaltenen Ergebnisse. Die Zeile 1 der 4 zeigt zuerst, daß das Protein h-βTrCP mit dem Protein Skp1p interagiert. Die Zeile 2 zeigt, daß die N-terminale Domäne ausreicht, um Wechselwirkung zu erhalten, während die Zeile 3 zeigt, daß die Abwesenheit der N-terminalen Domäne des Proteins h-βTrCP in VBP1 jede Wechselwirkung mit dem Protein Skp1p verlieren läßt. Diese Ergebnisse sind zusätzliche wichtige Argumente zugunsten einer Rolle des Proteins h-βTrCP bei dem durch das Protein Vpu vermittelten Abbau des Rezeptors CD4 und bekräftigen die Experimente von FUJITA et al. (1997, supra) und SCHUBERT et al. (1997, supra), welche zeigen, daß der Abbau des CD4-Rezeptors, induziert durch das Protein Vpu im Proteasom stattgefunden haben muß. Es ist anzumerken, daß der cytoplasmatische Bereich von CD4 nicht in der Lage ist, direkt an das Protein Skp1 (Zeile 4) zu binden.
Beispiel 6: Modell eines Interaktionsnetzwerkes das involviert ist beim Abbau des CD4-Rezeptors
Der Abbau des CD4-Rezeptors, induziert durch das Protein Vpu, wird durchgeführt durch das Netzwerk von Wechselwirkungen a) zwischen dem Protein Vpu und dem CD4-Rezeptor, b) zwischen dem Protein Vpu und den WD-Motiven des Proteins h-βTrCP und c) zwischen der F-Box und dem Protein h-βTrCP und dem Protein Skp1p, wobei diese letztere Wechselwirkung d) die Zielsteuerung des Komplexes Vpu/CD4 zum Proteasom erlaubt.
Dieses Netzwerk von Wechselwirkungen ist schematisch in der 5 veranschaulicht.
Mittels eines solchen Wechselwirkungsnetzwerkes wird der Abbau des CD4-Rezeptors durch das Proteasom über das Protein Vpu hervorgerufen.
Der Abbau des CD4-Rezeptors erlaubt die Freisetzung des Hüllproteins Gp160 und daher die Freisetzung des infektiösen HIV-1-Virus.
Eines der Mittel, um die Entwicklung des HIV-1-Virus bei dem betroffenen Patienten zu verhindern, besteht darin, den Abbau des CD4-Rezeptors zu verhindern. Eines der Mittel, um diesen Abbau im Hinblick auf den obigen Abbauvorgang zu verhindern, besteht darin, Inhibitoren zu suchen oder antivirale Anti-HIV-Mittel, die die Wechselwirkung entweder zwischen dem Protein Vpu und dem Protein h-βTrCP oder zwischen dem Protein h-βTrCP und dem Protein Skp1p durch die oben beschriebenen Verfahren inhibieren.
Beispiel 7: Wechselwirkung zwischen dem Protein h-βTrCP und dem Protein IκB
Für diesen Doppelhybridtest in Hefe hat man die unten beschriebenen Proteine fusioniert, entweder an der Aktivierungsdomäne der Transkription von Gal4 (Gal4D) oder an der DNA-Bindedomäne von LexA:

– βTrCP = menschliches Protein βTrCP der vorliegenden Erfindung,
– IκBα,
– IκBα S32-36A = Mutante von IκBα bei den Serinen S32 und S36 derart, daß es keine Phosphorylierung gibt,
– Ras = Kontrollprotein,
– Raf = Kontrollprotein,
– Vpuc = cytoplasmatisches Vpu-Protein, wie oben beschrieben.

Die Experimentalergebnisse, die die spezifische Wechselwirkung des neuen humanen βTrCP-Proteins mit dem Protein IκB zeigen, sind in der 6 veranschaulicht.
Dank dieses Doppelhybridtests ist gezeigt worden, daß:

– die beiden Proteine h-βTrCP und IκB in der Lage sind, wechselzuwirken,
– die Wechselwirkung h-βTrCP/IκB spezifisch für die beiden Hybride ist, da, wenn eines der beiden Hybride ersetzt wird durch ein Hybrid mit einem anderen Protein wie Gal4AD-Raf oder LexABD-Ras, es keine Wechselwirkung mehr gibt, während diese beiden Kontrollhbyride in der Lage sind, wechselzuwirken, und
– diese Wechselwirkung verloren ist, wenn die Serinreste S32 und S36 des Proteins IκB an nicht phosphorylierten Resten wie Alanin mutiert sind.

In diesem Test hat man auch eine Wechselwirkung zwischen dem Protein VPu des HIV-1-Virus und dem Protein h-βTrCP beobachtet.
Beispiel 8: IκB/h-βTrCP-Wechselwirkung in menschlichen Zellen: Modulation der Transkriptionsaktivität von Reportergenen für die NFκB-Aktivität durch Expression des Proteins h-βTrCP oder seinem h-βTrCPΔF-Fragment
In den nicht stimulierten Zellen (NS) der Zellinie 293 werden das humane Protein βTrCP oder das Fragment h-βTrCPΔF übergangsweise exprimiert ausgehend von einem eukaryotischen Expressionsvektor wie pCDNA3 (Invitrogen), der cDNA eingefügt hat, die für das Protein h-βTrCP codiert, unter Kontrolle eines starken Promotors des Cytomegalovirus (CMV). Eine Menge von 3 μg dieses Plasmids, die die Expression des Proteins h-βTrCP oder des Fragments h-βTrCPΔF erlaubt, wird co-transfiziert durch Lipofectamine (Life technologies) mit 1 μg eines abhängigen (3Enh-κB-ConA Luc) oder unabhängigen (RSV Luc oder ConA Luc) Reportervektors mit NFκB-Stellen, die die Expression des Luciferase-Reportergens kontrollieren.
Die erhaltenen Ergebnisse (7) zeigen, daß das Fragment h-βTrCPΔF in der Lage ist, als eine negative Transdominante zu wirken. Das Fragment h-βTrCPΔF inhibiert durch Kompetition mit dem endogenen βTrCP die Aktivierung von NFκB, die induziert ist durch TNF oder Okadasäure (OKA). Diese Aktivierung von NFκB wird gemessen durch die Aktivität eines Reportergens unter der Kontrolle eines Promotors, der drei Fixierungsstellen an NFκB hat (3Enh-κB-ConA Luc) (Arenzana et al., 1993, J. Virol., 67, 6596-6609). Im Gegenzug hat das Protein h-βTrCP eine Aktivatorwirkung auf die Aktivierung von NFκB. Das Protein h-βTrCP oder das Fragment h-βTrCPΔF haben keine Wirkung auf die Transkription eines Reportergens, das gegen einen Promotor gerichtet ist, der keine NFκB-Stellen enthält (RSV Luc) (Invitrogen).
Beispiel 9: Verwendung von spezifischen Antikörpern für den Nachweis einer Wechselwirkung zwischen dem Protein h-βTrCP und dem endogenen IκB-Protein der Zellen 293 oder Hela und ihre Konsequenzen für die Stabilität des Proteins IκB
Die Stabilität der phosphorylierten Formen von IκB ist analysiert worden in den 293-Zellen, die transfiziert sind durch ein Kontrollplasmid, durch ein pcDNA-Plasmid (Invitrogen), daß das Protein h-βTrCP exprimiert oder durch ein pcDNA-Protein, das das Fragment h-βTrCPΔF, das Protein h-βTrCP und das Fragment h-βTrCPΔF exprimiert, die an das Epitop myc am C-Terminus des pcDNA-Vektors fusioniert worden sind. Nach 36 Stunden hat man die 293-Zellen mit TNF in Gegenwart von 100 μg/ml Cycloheximid (Inhibitor der Proteinsynthese) stimuliert. Man hat die Cytoplasmaproteine im denaturierenden SDS-Polyacrylamidgel getrennt und sie dann auf eine Nitrocellulosemembran überführt und inkubiert entweder mit monoclonalem Antikörper 10B, gerichtet gegen den aminoterminalen Teil von IκB und welcher alle Formen des Proteins erkennt (α-IκBα; JAFFRAY et al., Mol. Cell. Biol., 15, 2166-2172, 1995) oder mit polyclonalen Antikörpern, die spezifisch die phosphorylierten Formen IκB (α-IκBα-S32^P; 9241S, New England Biolabs) erkennen, oder mit einem monoclonalen Anti-myc-Antikörper, gerichtet gegen das myc-Epitop, das fusioniert ist mit h-βTrCP und h-βTrCPΔF und die Expression dieser letzteren in den transfizierten Zellen zeigt (α-Myc; Sc40AC, Santa Cruz), unter Ausführung eines Western-Blots (WB).
Die erhaltenen Ergebnisse (8) zeigen, daß die Expression der Mutante h-βTrCPΔF begleitet ist von der Inhibition des Abbaus von IκB, normalerweise induziert durch TNF. Unter Einfluß der Expression von h-βTrCPΔF reichern sich die phosphorylierten Formen an, wie gezeigt durch die Reaktivität der Antikörper α-IκBα-S32^P (rechtes Feld).
Das Protein h-βTrCP im Gegensatz aktiviert den Abbau von IκBα (mittleres Feld). Das untere Feld betrifft den Antikörper α-Myc und ist ein Kontrollfeld, das die Expression der Proteine h-βTrCP und h-βTrCPΔF zeigt.
Man hat auch die Wechselwirkung h-βTrCP-IκB durch ein Immunopräzipitationsexperiment gezeigt.
Um dies zu machen, hat man Hela-Zellen mit einem pcDNA-Kontrollplasmid transfiziert, das β-Galactosidase (β-Gal), das Protein h-βTrCP (βTrCP) oder die Mutante h-βTrCPΔF (βTrCPΔF) exprimiert, wobei h-βTrCP und h-βTrCPΔF fusioniert worden sind mit einem myc-Epitop am C-Terminus. Nach 36 Stunden hat man die Hela-Zellen für 15 Minuten durch TNF in Gegenwart von Inhibitoren des Proteasoms (z-LLL-H) stimuliert (PALOMBELLA, V. et al., Cell, 78, 773-789, 1994) (z-LLL-H + TNF; Reaktion +) oder ohne Stimulation belassen (Reaktion -). Man hat anschließend entweder einen direkten Immunoblot nach Trennung der Proteine des Zell-Lysats durch denaturierendes SDS-Gel und Überführung auf eine Nitrocellulose-Membran vorgenommen, die inkubiert ist mit α-IκBα-S32^P-Antikörpern (oberes Feld) oder mit einer Immunopräzipitation mit α-Myc-Antikörper, gefolgt von einem Immunoblot wie oben angezeigt mit dem Antikörper α-IκBα-S32^P oder dem Antikörper α-IκBα.
Die Ergebnisse sind in der 9 angezeigt, in welcher das obere Feld die Ergebnisse lediglich des Western-Blots zeigt und die beiden unteren Felder jene der Western-Blot-Immunopräzipitation und das rechte Feld die Migrationsbande der phosphorylierten Formen wiedergibt, welche induziert sind durch die Behandlung mit TNF auf den Hela-Kontrollzellen.
Die 9 zeigt durch Co-Immunopräzipitationsexperimente des Proteins h-βTrCP oder des Fragments h-βTrCPΔF fusioniert mit dem myc-Epitop, das allein die phosphorylierte Form von IκBα und nicht die nicht phosphorylierte Form mit dem Protein h-βTrCP verbunden sind (Spalte 4). Diese Verbindung zeigt sich vor allem dank der Inhibierung des Abbaus, der induziert wird durch die Mutante h-βTrCPΔF (Spalten 5 und 6) und die Verwendung von Inhibitoren des Proteasoms (z-LLL-H).
Beispiel 10: Wechselwirken zwischen dem Protein h-βTrCP und dem Protein β-Catenin
Für diesen Doppelhybridtest hat man die cDNAs fusioniert, die für die unten beschriebenen Proteine, codieren, entweder an der Aktivierungsdomäne der Transkription von Gal4 (Gal4AD) oder an der Bindedomäne an die DNA von LexA (LexABD):

– βTrCP = humanes βTrCP-Protein der vorliegenden Erfindung,
– KIAA0696 (βTrCP-2) = humanes βTrCP-Protein, isoliert von ISHIKAWA et al. (DNA Research, 5, 169-176, 1998),
– βCat_1→130 = normales β-Catenin-Protein (N-terminale Domäne; 1→130),
– βCat_1→130 S33-37AA = onkogenes β-Catenin-Protein, das mutiert ist bei den Serinresten S33 und S37, derart, daß es keine Phosphorylierung gibt,
– βCat = vollständiges normales β-Catenin-Protein.

Die Experimentalergebnisse, welche zeigen, daß es eine spezifische Wechselwirkung des neuen menschlichen Proteins βTrCP mit dem β-Catenin-Protein gibt, sind veranschaulicht in der 10.
Dank dieses Doppelhybridtests ist gezeigt worden, daß:

– die beiden Proteine h-βTrCP und βCat_1→130 in der Lage sind, wechselzuwirken,
– die Wechselwirkung h-βTrCP/βCat_1→130 wird verloren, wenn die Serinreste S33 und S37 mutiert sind zu nicht phosphorylierbaren Resten (onkogenes β-Catenin), und
– das βTrCP-2 weder in der Lage ist, mit nicht mutiertem β-Catenin zu reagieren noch mit mutiertem β-Catenin.

Es ist anzumerken, daß man auch eine Wechselwirkung zwischen dem vollständigen β-Catenin-Protein und dem Protein h-βTrCP beobachtet hat.
Beispiel 11: Aktivierung der Transkription des Reportergens TCF/LEF durch Expression des mutierten B-Catenins oder von h-βTrCPΔF in den menschlichen 293-Zellen
Man hat HEK 293-Zellen transfiziert mit dem Reportervektor Top-TK-Luci, der ein Multimer der TCF-LEF-Stellen enthält, oder dem Reportvektor Fop-TK-Luci, der ein inaktives Kontrollmultimer von TCF-LEF-Stellen enthält. Diese Konstrukte werden co-transfiziert mit dem Expressionsvektor pCDNA3 (Invitrogen), entweder leer als Kontrolle oder ein onkogenes Fragment des β-Catenins exprimieren, nämlich das β-Catenin, das befreit ist vom N-terminalen Teil β-catΔN, oder das Protein h-βTrCP exprimiert oder das Fragment βTrCPΔF. Die Luciferaseaktivität wird gemessen 24 Stunden nach Transfektion und normalisiert auf eine Renilla-Luciferase-Kontrollaktivität, erhalten durch Co-Transfektion von Zellen mit dem Vektor RSV- Renilla (Promega).
Die erhaltenen Ergebnisse, die in der 11 gezeigt sind, zeigen, daß das Fragment h-βTrCPΔF eine Aktivierung eines Reportergens induziert, kontrolliert durch einen Promotor TCF/LEF, der Modifikationen des Expressionsniveaus des β-Catenins entspricht (Morin P.J. et al. 1997, Science, 275, 1787-1790). Dies zeigt an, daß der Abbau des β-Catenins inhibiert wird durch Expression der Mutante h-βTrCPΔF. Was das Protein KIAA 0696 β-TrCP2 in demselben Reportergensystem anbetrifft, ist die positive Wirkung, induziert durch KIAA 0696 ΔF (βTrCP2ΔF) sehr viel geringer als jene, die erhalten wird mit dem äquivalenten Konstrukt βTrCPΔF.
Die Gesamtheit dieser Ergebnisse zeigt daher, daß es das h-βTrCP-Protein der Erfindung ist und nicht das Protein KIAA 0696, welches der Vermittler des Abbaus des β-Catenins ist.
Beispiel 12: Untersuchung der Expression des Proteins h-βTrCP oder des Fragments h-βTrCPΔF bei der Stabilität des endogenen β-Catenins der Hela-Zellen
Man hat Hela-Zellen mit den DNA-Mengen transfiziert, die in der 12 angezeigt sind, welche entweder das Protein h-βTrCP oder das Fragment h-βTrCPΔF exprimieren, fusioniert an das myc-Epitop am C-Terminus in einem pcDNA-Vektor (Invitrogen). Nach 24 Stunden hat man die Zellen lysiert und man hat die Zellproteine auf einem denaturierenden SDS-Polyacrylamidgel getrennt, man hat sie überführt auf Nitrocellulose-Membran und man hat sie inkubiert mit einem Anti-β-Catenin-Antikörper (α-βCat) oder mit einem Anti-myc-Antikörper zur Detektion der Expression des Proteins h-βTrCP oder des Fragments h-βTrCPΔF (α-Myc) unter Ausführung eines Western-Blots (WB).
Die Ergebnisse sind in der 12 angezeigt und zeigen, daß die Expression des h-βTrCP den Abbau des β-Catenins verstärkt (mittlere Spalte), während die Expression der Mutante h-βTrCPΔF den Abbau des β-Catenins inhibiert und zu seiner Ansammlung in den Zellen führt (rechte Spalte).
Es ist anzumerken, daß man in der Spalte C eine Kontrolle von nicht transfizierten Hela-Zellen zeigt; und der Stern zeigt durch nicht spezifische Markierung eines Zellproteins des Lysats von Hela-Zellen an, daß annähernd dieselbe Menge von Zellproteinen in allen Spuren aufgetragen ist.
Die Ergebnisse stützen jene, die in dem obigen Beispiel gezeigt sind.
Sequenzprotokoll

Claims

Humanes βTrCP-Protein (h-βTrCP) zum Targeting von Proteinen zu den Wegen der Degradation durch das Proteasom, dadurch gekennzeichnet, daß es die SEQID Nr. 2 hat, daß es in der Lage ist, mit den Proteinen zu interagieren, die geeignet sind, durch das Proteasom abgebaut zu werden und die das Phosphorylierungsmotiv besitzen, welches die Aminosäuren Asp-Ser-Glu-Xaa-Xaa-Ser umfaßt, worin Xaa eine beliebige natürliche Aminosäure ist und worin die Serin-Reste phosphoryliert sind, und daß es die nachfolgenden WD-Motive besitzt: – erstes WD-Motiv: Aminosäuren 259 bis 292, – zweites WD-Motiv: Aminosäuren 304 bis 332, – drittes WD-Motiv: Aminosäuren 343 bis 372, – viertes WD-Motiv: Aminosäuren 387 bis 415, – fünftes WD-Motiv: Aminosäuren 427 bis 455, – sechstes WD-Motiv: Aminosäuren 467 bis 492, – siebtes WD-Motiv: Aminosäuren 516 bis 544.
Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es in der Lage ist, mit dem Protein Vpu des Virus HIV-1 oder mit den Zellproteinen IκB oder β-Catenin zu interagieren.
Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine F-Box besitzt und daß es in der Lage ist, mit dem Protein Skplp zu interagieren.
Protein nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die F-Box von den Aminosäuren 147 bis 191 gebildet ist.
Peptidfragmente des Proteins nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, die aus der Zugabe, der Unterdrückung und/oder dem Ersetzen einer oder mehrerer Aminosäuren resultieren, wobei die genannten Peptidfragmente die Aktivität der Interaktion mit dem Protein Vpu des Virus HIV-1, dem Zellprotein IκB oder dem Zellprotein β-Catenin und/oder mit dem Protein Skplp bewahrt haben.
Nukleinsäuresequenzen, die für das humane Protein h-βTrCP und die Peptidfragmente nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 codieren, dadurch gekennzeichnet, daß sie gebildet sind von: a) der DNA-Sequenz SEQ ID Nr. 1 und den Nukleinsäurefragmenten, die für die genannten Peptidfragmente codieren; b) den DNA-Sequenzen, die unter strengen Bedingungen mit der Sequenz a) hybridisieren; c) den DNA-Sequenzen, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes aus den obigen Sequenzen a) und b) resultieren und für das humane Protein h-βTrCP oder dessen Fragmente codieren; und d) den entsprechenden mRNA- und DNA-Sequenzen.
Verwendung des Proteins h-βTrCP oder der Peptidfragmente nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 für das Screening von antiviralen Wirkstoffen gegen HIV-1, die geeignet sind, die Interaktion zwischen dem Protein h-βTrCP und dem Protein Vpu zu inhibieren.
Verwendung des Proteins h-βTrCP oder der Peptidfragmente nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 für das Screening von antiviralen Wirkstoffen gegen HIV-1, die geeignet sind, die Interaktion zwischen dem Protein h-βTrCP und dem Protein Skplp zu inhibieren.
Verwendung der Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 6 für das Screening von antiviralen Wirkstoffen gegen HIV, die geeignet sind, die Interaktion zwischen dem Protein h-βTrCP und dem Protein Vpu zu inhibieren.
Verwendung der Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 6 für das Screening von antiviralen Wirkstoffen gegen HIV, die geeignet sind, die Interaktion zwischen dem Protein h-βTrCP und dem Protein Skplp zu inhibieren.
Verwendung des Proteins h-βTrCP oder der Peptidfragmente nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 für das Screening antitumoraler Wirkstoffe, die in der Lage sind, die Regulierung des Zellzyklus oder der Prozesse zum Abbau der Proteine in humanen Tumorzellen durch Modulation der Interaktion zwischen dem Protein h-βTrCP und dem Protein Skplp zu stören.
Verwendung der Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 6 für das Screening von antitumoralen Wirkstoffen, die in der Lage sind, die Regulierung des Zellzyklus oder der Prozesse zum Abbau der Proteine in humanen Tumorzellen durch Modulation der Interaktion zwischen dem Protein h-βTrCP und dem Protein Skplp zu stören.
Verwendung des Proteins h-βTrCP oder der Peptidfragmente nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 für das Screening von antiinflammatorischen Wirkstoffen, die in der Lage sind, die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB durch Inhibition der Interaktion zwischen dem Protein h-βTrCP und dem Protein IκB zu stören.
Verwendung der Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 6 für das Screening von antiinflammatorischen Wirkstoffen, die in der Lage sind, die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB durch Inhibition der Interaktion zwischen dem Protein h-βTrCP und dem Protein IκB zu stören.
Verwendung des Proteins h-βTrCP oder der Peptidfragmente nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 für das Screening von antitumoralen Wirkstoffen, die geeignet sind, die Interaktion zwischen dem Protein h-βTrCP und einem mutierten β-Catenin-Protein von Tumorzellen oder zwischen dem h-βTrCP und dem normalen β-Catenin von Tumorzellen ohne das APC-Protein zu reaktivieren.
Verwendung der Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 6 für das Screening von antitumoralen Wirkstoffen, die geeignet sind, die Interaktion zwischen dem Protein h-βTrCP und dem mutierten β-Catenin-Protein von Tumorzellen oder zwischen dem h-βTrCP und dem normalen β-Catenin von Tumorzellen ohne das APC-Protein zu reaktivieren.
Verwendung des Proteins h-βTrCP oder der Peptidfragmente nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 für das Screening von Wirkstoffen gegen Alzheimer, die geeignet sind, die Abbaurate des β-Catenin durch Inhibition der Interaktion zwischen dem Protein h-βTrCP und dem β-Catenin-Protein zu reduzieren.
Verwendung der Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 6 für das Screening von Wirkstoffen gegen Alzheimer, die geeignet sind, die Abbaurate des β-Catenin durch Inhibition der Interaktion zwischen dem Protein h-βTrCP und dem β-Catenin-Protein zu reduzieren.
Verwendung des Proteins h-βTrCP oder der Peptidfragmente nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 für die Detektion der β-Catenin-Mutationen durch Hefe-Doppelhybrid-Screening.
Verwendung der Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 6 für die Detektion der β-Catenin-Mutationen durch Hefe-Doppelhybrid-Screening.
Antivirale Wirkstoffe gegen HIV, die von den Peptidfragmenten des Proteins h-βTrCP nach Anspruch 5 ohne die F-Box gebildet sind.
Antivirale Wirkstoffe gegen HIV, die von den Peptidfragmenten des Proteins h-βTrCP nach Anspruch 5 ohne die WD-Motive gebildet sind.
Spezifische Antikörper, die gegen das Protein h-βTrCP oder die Peptidfragmente gerichtet sind, wie sie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 definiert sind.
Antisense Oligonukleotide, welche die Transkription oder die Translation des Proteins h-βTrCP nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 blockieren und die mit einer Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 6 hybridisieren.
Antitumorale Wirkstoffe, die von den Peptidfragmenten des Proteins h-βTrCP nach Anspruch 5 gebildet sind, welche die F-Box aufweisen.
Antitumorale Wirkstoffe, die von den Peptidfragmenten des Proteins h-βTrCP nach Anspruch 5 gebildet sind, die sowohl die WD-Motive als auch die F-Box bewahrt haben.
Antiinflammatorische Wirkstoffe, die von den Peptidfragmenten des Proteins h-βTrCP nach Anspruch 5 ohne die F-Box gebildet sind.
Transgene Mäuse, die ein Transgen des Proteins h-βTrCP nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 exprimieren.
Transgene Mäuse, bei denen das Gen βTrCP ausgeschaltet wurde.
Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 6 sowie die für deren Expression erforderlichen Mittel umfaßt.
Mikroorganismen oder Wirtszellen, die durch einen Expressionsvektor nach Anspruch 30 transformiert sind.
Mikroorganismen oder Wirtszellen, die durch einen Expressionsvektor, welcher das für das Protein Vpu codierende Gen umfaßt, sowie durch einen Expressionsvektor nach Anspruch 30 cotransformiert sind.
Mikroorganismen oder Wirtszellen, die durch einen Expressionsvektor, welcher das für das Protein Skplp codierende Gen umfaßt, sowie durch einen Expressionsvektor nach Anspruch 30 cotransformiert sind.
Mikroorganismen oder Wirtszellen, die durch einen Expressionsvektor, welcher das für das Protein IκB codierende Gen umfaßt, sowie durch einen Expressionsvektor nach Anspruch 30 cotransformiert sind.
Mikroorganismen oder Wirtszellen, die durch einen Expressionsvektor, welcher das für das onkogene β-Catenin-Protein codierende Gen umfaßt, sowie durch einen Expressionsvektor nach Anspruch 30 cotransformiert sind.