DE19754774C2

DE19754774C2 - Transgenes nicht-menschliches Säugetier mit einer onkogenen Mutante des Raf-1-Gens

Info

Publication number: DE19754774C2
Application number: DE19754774A
Authority: DE
Inventors: Ulf R Rapp
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-11-28
Filing date: 1997-11-28
Publication date: 1999-11-25
Anticipated expiration: 2017-11-29
Also published as: US20070150974A1; WO1999028453A3; AU2408499A; DE19754774A1; CA2311599C; US20030154505A1; JP2001525170A; CA2311599A1; US20100125917A1; WO1999028453A2; US6566581B1; US20060212957A1; EP1034271A2

Description

Die Erfindung betrifft ein transgenes nicht- menschliches Säugetier, ein Verfahren zu dessen Her stellung, dessen Verwendung, Zellgewebe daraus, ein Verfahren zur Herstellung solchen Zellgewebes, dessen Verwendung, einen rekombinanten DNS-Expressionsvektor und die Verwendung dieses Vektors. - Der Ausdruck nicht-menschliche Säugetiere bezieht sich auf taxono misch höhere Einheiten als Tierarten. Transgene Tiere sind Organismen, die ein zusätzliches, nicht von ihrer Art stammendes, also fremdes Gen in ihrem Genom tragen. Im Rahmen der Erfindung sind dabei insbeson dere solche transgenen Tiere gemeint, die das fremde Gen auch in den Keimzellen aufweisen, die also das fremde Gen vertikal, i. e. von Generation zu Generation weitervererben. Ist also ein spezielles transgenes Tier geschaffen, so können weitere entsprechende transgene Tiere durch Züchtung erhalten werden. Trans gene Tiere sind in verschiedenen Ausbildungen bekannt und auch verschiedene Verfahren zur Herstellung von transgenen Tieren sind bekannt. Hierzu wird lediglich beispielhaft auf die Literaturstelle R. Jaenisch, Sci ence, Vol. 240, 10, 1988, S. 1468 ff., sowie die darin genannten Literaturstellen verwiesen. Der Ausdruck Zellgewebe umfaßt komplette Organe oder Teile von Or ganen eines Tiers, jedoch auch ganz spezifische Zell linien, die daraus isoliert und kultiviert, i. e. vermehrt werden können. Ein rekombinanter DNS- Expressionsvektor ist ein Instrument zur Herstellung eines transgenen Tiers, welches u. a. die fremde DNS, die in Zellen des Tiers eingeschleust werden sollen, trägt.

Der allgemeine technologische Hintergrund des mit der Erfindung geschaffenen speziellen transgenen Tiers ist folgender. Krebs, insbesondere Lungenkrebs, ist eine der häufigsten Erkrankungen des Menschen und weist bislang meist nur wenig erfolgversprechende Thera pieprognosen auf. Im Rahmen der Entwicklung von neuen und besseren Therapien für Krebserkrankungen des Men schen ist es u. a. erforderlich und aus ethischen Gründen auch gesetzlich vorgeschrieben, vorklinische Untersuchungen mit in der Grundlagenforschung oder im Rahmen von Screening-Untersuchungen erhaltenen mögli chen Wirkstoffen in Tiermodellen durchzuführen. Im Falle der Untersuchungen an prospektiven Wirkstoffen für Krebstherapien ist es daher erforderlich, Tiere oder (tierische) Zellgewebe zur Verfügung zu stellen, die die jeweils zu untersuchenden Krebserkrankungen aufweisen, damit die physiologische Wirkung, ggf. auch Nebenwirkungen, der Wirkstoffe qualitativ und quanti tativ getestet werden kann.

Krebserkrankungen lassen sich u. a. oft auf die Wirkung von sogenannten Oncoproteinen zurückführen. Dabei han delt es sich um Proteine, die gegenüber entsprechenden Proteinen des gesunden Organismus strukturell verändert sind. Diese Oncoproteine vermögen über noch nicht völlig aufgeklärte Prozesse normale Zellen in unkontrolliert proliferierende Zellen, i. e. Krebszel len, umzuwandeln. Die Bildung von Oncoproteinen in einem Organismus ist ihrerseits zurückzuführen auf sogenannte Oncogene, d. h. Gene die für das Oncoprotein codieren. Oncogene können über Viren in eine Zelle eingeführt werden, können aber auch im Wege der Muta tion von (bestimmten) "gesunden" Genen, den Proto- Onkogenen gebildet werden. Solche Mutationen können beispielsweise durch Translokation (Verschiebung) eines für die Produktion eines Proteins zuständigen Gens innerhalb des Genoms, durch Punktmutationen (Aus tausch einer Base und/oder einzelner Basen in der DNS eines für die Produktion eines Proteins zuständigen Gens gegen eine verschiedene Base mit der Folge der Bildung eines Proteins mit veränderter Aminosäurense quenz, des Oncogens), durch Deletion (Entfernung einer oder mehrerer Basen) oder auch durch Mutationen in dem Bereich eines für das betreffende Gen zuständigen sogenannten Promoters erfolgen. Als Promoter wird ein DNS-Bereich eines Gens bezeichnet, durch den die Tran skription (Umschreibung des DNS-Codes in eine ent sprechende RNS) und damit auch letzendlich die Expression (Bildung) des mit dem Gen korrelierten Pro teins kontrolliert werden kann. Natürlicherweise ist in der Regel jedem Gen ein spezifischer Promoter zugeordnet, der diesem in dem Genom vorgeschaltet ist. Vorgeschaltet meint dabei, daß der Promoter in der DNS-Sequenz in bestimmtem Abstand von dem Startpunkt einer Transkription angeordnet ist. Zur Einleitung einer Transkription ist es dann aber auch erforder lich, daß sich sogenannte - oft zelltypspezifische - Transskriptionsfaktoren an den Promoter anlagern.

Insbesondere im Zusammenhang mit Lungenkrebs spielen die sogenannten Raf-Proto-Oncogene eine besondere Rolle. Diese Gene sind evolutionsmäßig hoch kon servativ und codieren Serin/Threonin spezifische Kinasen des Cytoplasmas, welche ihrerseits in der mi togenen Signaltransduktion eine Rolle spielen. Bekannt sind die Gene A, B und c-Raf-1. Für eine Übersicht wird auf die Literaturstellen U. R. Rapp et al., The Oncogene Handbook, Elsevier Science Publishers, Nied erlande, S. 213-253, 1988, und U. R. Rapp, Oncogene, 6, 495, 1991, verwiesen. Zu der Familie der Raf-Gene gehört u. a. das c-Raf-1 Gen, welches ubiquitär in einem Organismus die c-Raf-1-Kinase exprimiert. Das c-Raf-1 Gen weist 3 konservierte Regionen auf, d. h. diese Regionen stimmen mit korrespondierenden Regionen anderer Raf-Gene der Familie überein. Die Region CR1 ist eine regulatorische Domäne um eine Cys Finger Kon sensussequenz, die Region CR2 ist eine Region mit ho hem Anteil an Serin bzw. Threonin und CR3 ist die Kinase-Domäne. Bezüglich weiterer Informationen und insbesondere auch weiterführender Literatur zum The menkomplex wird auf die Literaturstelle US-5,618,670 verwiesen. Aus dieser Literaturstelle sind auch (Teil-) Sequenzen der natürlichen Form der CR3 Region des c-Raf-1 Gens von Mäusen sowie (Teil-) Se quenzen verschiedener Punktmutationen davon bekannt. Aus der Literaturstelle US-5,156,841 sind Plasmide und eukariotische Expressionsvektoren, die A-Raf- und v- Raf-Onkogene enthalten, bekannt, allerdings in anderen Zusammenhängen, nämlich der gentechnischen Produktion von Raf-Oncoproteinen bzw. der in vivo Produktion von Raf-Oncoproteinen im Rahmen von immunologischen Untersuchungen.

Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, nicht-menschliche Säugetiere in ausreichend hoher Zahl und mit hinsichtlich der Tumorbildung gleichartiger und reproduzierbarer Pathologie zum Zwecke der Durchführung vorklinischer Untersuchungen zu prospek tiven Anti-Krebs-Wirkstoffen bzw. Therapien zu Ver fügung zu stellen.

Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Er findung ein transgenes nicht-menschliches Säugetier, dessen Zellen ein durch eine konstitutiv aktive onk ogene Mutante der Kinase-Domäne des c-Raf-1-Gens oder ein durch ein entsprechendes normales Allel bzw. Deri vat des A, B, oder c-Raf-1-Gens codiertes Protein ex primieren. - Der Ausdruck konstitutiv aktiv heißt im Kontext der Erfindung, daß das Protein als solches stets aktiv ist, daß also die physiologische Wirkung des Proteins auch ohne die Voraussetzung weiterer Reaktionskaskaden in einer Zelle bzw. dem Organismus stets eintritt. Demgegenüber erfordert die Aktivierung des nicht konstitutiv aktiven Raf-1-Proteins bei spielsweise die Bindung des Ras-Proteins an das Raf-1-Protein. Der Ausdruck konstitutiv aktiv bezieht sich im Rahmen der Erfindung folglich nur auf das Pro tein bzw. den korrespondierenden Gen-Code und nicht auf das Gen selbst bzw. die Genaktivierung. Dadurch, daß das Säugetier ein transgenes Tier mit den genannten Eigenschaften ist, können hinsichtlich der Pathologie der durch die Expression der Mutante induz ierten Tumore gleichartige Tiere in praktisch beliebi ger Anzahl im Wege der natürlichen Reproduktion aus einem transgenen Stammtier erhalten werden. Dadurch lassen sich vorklinische Untersuchungen von Wirkstoffen bzw. Therapien mit der erforderlichen Re produzierbarkeit sowie mit der erforderlichen statis tischen Signifikanz durchführen, und zwar auch mit definierten Kontrollgruppen.

Für die Durchführung von vorklinischen Untersuchungen zu Wirkstoffen und Therapien gegen Lungenkrebs emp fiehlt es sich, daß die Expression des durch die kon stitutiv aktive onkogene Mutante der Kinase-Domäne des Raf-1-Gens oder ein durch ein entsprechendes Allel bzw. Derivat des A, B oder c-Raf-1-Gens codierten Pro teins in Lungenzellen erfolgt, da dann die Tiere re produzierbar Lungentumore entwickeln.

In struktureller Hinsicht ist ein vorstehend angege benes Säugetier dadurch gekennzeichnet, daß es fremde DNS mit einer konstitutiv aktiven onkogenen Mutante der Kinase-Domäne des Raf-1-Gens oder mit einem ent sprechenden normalen Allel bzw. Derivat des A, B oder c-Raf-1-Gens enthält. Allele bzw. Derivate sind Vari anten in einer DNS-Sequenz, die die grundsätzliche Funktion des betreffenden Gens praktisch nicht beein flussen.

Vorteilhafterweise enthält die fremde DNS zusätzlich einen Promoter für das Surfactant Protein C, vorzug sweise für das humane Surfactant Protein C, und ist dieser Promotor in der fremden DNS mit der Maßgabe angeordnet, daß durch den Promotor die Transkription der Mutante der Kinase-Domäne des Raf-1-Gens oder eines entsprechenden normalen Allels bzw. Derivats des A, B oder c-Raf-1-Gens kontrolliert wird. Mit anderen Worten ausgedrückt, ist der Promoter, welcher natürlicherweise dem das Surfactant Protein C codier enden Gen vorgeschaltet ist, erfindungsgemäß stattdes sen an geeigneter Stelle der Mutante bzw. Gen vorgeschaltet. Dabei liegt die exakte Anordnung von Promoter und Mutante bzw. Gen zueinander im Können des Durchschnittsfachmanns. Sofern die exakte Posi tionierung des speziellen Promoters vor das er findungsgemäß eingesetzte Gen nicht bereits aus grundsätzlichen Erwägungen herleitbar ist, so können jedoch einfache Versuche durchgeführt werden mit ver schiedenen Varianten der Positionierung, um eine geeignete Positionierung zu ermitteln. Die Anzahl der unter Berücksichtigung des allgemeinen Fachwissens in Frage kommenden Varianten der Positionierung ist zahlenmäßig sehr beschränkt. Das Surfactant Protein C spielt im Rahmen des Surfactant Faktors eine Rolle, welcher die Alveolaroberflächenspannung zwischen dem Lungenepithel und der Luft herabsetzt und somit letz tendlich verhindert, daß die Alveolen beim Ausatmen kollabieren und die Epithelien verkleben. Mit dem Ein satz des Promoters für das Surfactant Protein C wird erreicht, daß nur die spezifisch bzw. verstärkt in der Lunge vorkommenden, mit diesem Promoter interagier enden Transskriptionsfaktoren die Mutante gleichsam einzuschalten vermögen mit dem Ergebnis, daß sich mit hoher Selektivität und Reproduzierbarkeit Lungentumore bilden.

In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung enthält die fremde DNS zusätzlich DNS des SV40 Virus. SV steht für Simian Virus. Diese umfaßt im einzelnen die Polyadenylierungssequenz sowie Intron/Exon- Bereiche des SV40 Virus, welche bekannt sind (siehe Beschreibung zur folgenden Fig. 2). Der Einbau dieser SV40 DNS bewirkt eine Steigerung der Translations effizienz der polyadenylierten mRNA. Im einzelnen ist es bevorzugt, wenn das Säugetier eines aus der Gruppe der Rodenten (Mager) ist.

Ein vorstehend näher erläutertes transgenes nicht- menschliches Säugetier, ist erhältlich durch folgende Verfahrensschritte: a) Einbau der cDNA-Sequenz einer konstitutiv aktiven onkogenen Mutante der Kinase- Domäne des Raf-1-Gens oder eines entsprechenden nor malen Allels bzw. Derivats des A, B oder c-Raf-1-Gens in einen Expressionsvektor, b) Einbringung des in Stufe a) erhaltenen Transgen-Vektors, vorzugsweise nach Linearisierung, in Pronuclei von befruchteten Oozyten aus einem nicht-menschlichen Säugetier, c) Implantation der in Stufe b) erhaltenen Oozyten in Ammentiere gleicher Spezies wie die Spenderspezies der Oozyten und Austragung von Nachkommentieren aus den Oozyten, d) Genotypisierung und Selektion der in Stufe c) erhaltenen Nachkommentiere mit der Maßgabe, daß Zellen der selektierten Säugetiere ein durch die kon stitutiv aktive onkogene Mutante der Kinase-Domäne des Raf-1-Gens oder ein durch ein entsprechendes normales Allel bzw. Derivat des A, B oder c-Raf-1-Gens cod iertes Protein exprimieren. Die Genotypisierung kann mittels dem Fachmann gut bekannten Methoden erfolgen, beispielsweise nach Schwanzspitzenbiopsie mittels PCR (Polymerase Chain Reaction, eine Methode zur in-vitro Amplifikation eines definierten DNS-Fragments) und Southern-Blot (eine Methode zur Analyse von DNS- Fragmenten in DNS Präparationen), wobei dann jene Säugetiere selektiert werden, deren Zellen ausweislich der Untersuchungen zur Genotypisierung die erfindungs gemäße fremde DNS enthalten. Vorteilhafterweise ent hält der in Stufe a) verwendete Expressionsvektor einen Promoter für das Surfactant Protein C, vorzug sweise einen Promoter für das humane Surfactant Pro tein C. Dieser Promotor ist in der fremden DNS mit der Maßgabe angeordnet, daß durch den Promotor die Tran skription der Mutante der Kinase-Domäne des Raf-1-Gens oder eines entsprechenden normalen Allels oder Deri vats des A, B oder c-Raf-1-Gens kontrolliert wird. Im einzelnen kann die fremde DNS beispielsweise entweder die gesunde (Fig. 1) oder eine konstitutiv aktive onkogene Mutante des Raf-1-Gens mit einer Sequenz gemäß einer der Fig. 1, jedoch mit Deletion als ΔRaf(26-302) aufweisen. Anstelle einer Deletion kann aber auch mit Punktmutationen der in der Fig. 1 gezeigten Sequenz gearbeitet werden. Solche Punktmuta tionen können beispielsweise gezielt durch Gabe von 1-Ethyl-1-nitrosoharnstoff (ENU) an Tiere mit der ge sunden Sequenz verursacht werden, wodurch solche Mu tanten auf einfache Weise zugänglich werden.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstel lung eines vorstehend beschriebenen transgenen, nicht- menschlichen Säugetiers gemäß der Patentansprüche 10 und 11. Erfindungsgemäße nicht-menschliche Säugetiere finden Verwendung zur vorklinischen Untersuchung der Wirksamkeit von gegen Lungenkarzinome gerichteten Sub stanzen und/oder von gegen Lungenkarzinome gerichteten Therapieverfahren, insbesondere zur vorklinischen Un tersuchung der Wirksamkeit von Raf-Kinase hemmenden Substanzen. Solche Substanzen hemmen vollständig oder reduzieren die Aktivität von Raf-Kinasen, womit möglicherweise ein Mittel zur Deaktivierung speziell von Raf-Onkoproteinen und folglich zur Proliferation shemmung von Tumorzellen gefunden werden kann. Eine andere vorteilhafte Verwendung eines erfindungsgemäßen nicht-menschlichen Säugetiers liegt in der Unter suchung der Pathogenese von Lungentumoren, wodurch auch ein besseres Verständnis der Krankheit als sol cher möglich wird.

Die Erfindung betrifft aber auch Zellgewebe, insbeson dere Lungengewebe, aus einem transgenen nicht- menschlichen Säugetier nach einem der Ansprüche 1 bis 9, welches Zellgewebe eine erhöhte Wahrscheinlichkeit der Bildung von Tumoren, vorzugsweise Lungentumoren, aufweist, ein Verfahren zu dessen Herstellung gemäß den Ansprüchen 16 und 17 sowie dessen Verwendung gemäß den Ansprüchen 18 bis 20. Bezüglich des Zellgewebes oder auch mit umfaßter, daraus isolierter und ggf. kultivierter spezifischer Zellinien gelten alle vor stehend gegebenen allgemeinen Erläuterungen entsprechend.

Schließlich umfaßt die Erfindung auch einen rekombinanten DNS Expressionsvektor enthaltend A) die DNS-Sequenz einer konstitutiv aktiven onkogenen Mu tante der Kinase-Domäne des c-Raf-1-Gens oder ein ent sprechendes normales Allel oder Derivat des A, B oder c-Raf-1-Gens, B) eine Promoter-Domäne für das Surfac tant Protein C, mittels welcher die Transskription der durch die in A) definierte DNS-Sequenz steuerbar ist, C) optional die DNS-Sequenz des SV40 Virus. Mittels eines solchen Vektors lassen sich erfindungsgemäße transgene Säugetiere und ggf. Zellgewebe daraus herstellen. Beispielhafterweise weist die in A) definierte DNS Sequenz eine Sequenz gemäß einer der Fig. 1 oder eine daraus abgeleitete Sequenz ΔRaf (26-302) auf und/oder ist die in B) definierte Promoter-Domäne eine Promoter-Domäne für das humane Surfactant Protein C.

Plasmide mit erfindungsgemäßen Transgenvektoren (ak tive onkogene Mutante der Kinase-Domäne des human c-Raf-1-Gens, i. e. Plasmid SPC-ΔRaf (26-302), sowie ein Transgenvektor mit normalem human c-Raf-1-Gen, i. e. Plasmid SPC-Raf-1) wurden bei der DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig hinterlegt. Die Hinterlegungsnummer für das Plasmid SPC-ΔRaf (26-302) lautet 11849. Die Hinterlegungsnummer für das Plasmid SPC-Raf-1 lautet 11848. Insofern betrifft die Erfindung auch Transgenvektoren wie hin terlegt, sowie damit herstellbare transgene Tiere bzw. Zellen oder Zellgewebe, sowie die vorstehend erläuter ten Verwendungen solcher Tiere bzw. Zellen oder Zellgewebe.

Im folgenden wird die Erfindung in lediglich Beispiele darstellenden Figuren und Ausführungsbeispielen er läutert. Es zeigt:

Fig. 1: Die DNS-Sequenz (linear) der Kinase-Domäne des human-c-Raf-1-Gens,

Fig. 2: Eine schematische Darstellung des Aufbaus von für die Erfindung geeigneten Vektoren, Fig. 3: Southern-Blot von selektierten erfindungs gemäßen transgenen Tieren,

Fig. 4a-b: Western- bzw. Northern-Blot von erhaltenen erfindungsgemäßen Tierlinien.

Die allgemeine Vorgehensweise bei der Herstellung er findungsgemäßer transgener Mäuse war folgende. Die c-DNA-Sequenzen der transformierenden c-Raf Subdomäne (Raf BxB) wurde in einen lungenspezifischen Expres sionsvektor kloniert, der den Promoterbereich des menschlichen Surfactant-assoziierten Proteins C (SPC) enthält. Nach Restriktionsverdau und Linearisierung dieser transgen-Vektoren, die schematisch in der Fig. 2 dargestellt sind, wurde die jeweilige Fremd-DNS in die Pronuclei von befruchteten Oozyten eingebracht, welche dann Ammenmäusen implantiert wurden. Die Nachkommen dieser Mäuse wurden nach Schwanzspitzenbi opsie mittels PCR und Southern-Blot genotypisiert. Mit den so identifizierten Founder-Tieren wurden Maus linien etabliert, in deren Lungen die Expression des Transgens im Western- bzw. Northern-Blot und mittels RT-PCR nachgewiesen wurde.

Die Fig. 2 zeigt lungengerichtete Expressionsvektoren für die Proteinkinase Raf-1. Die Transgenvektoren ent halten die 3,7 kb (kilobasen) umfassende Region des humanen SPC-Promotors, die 3,0 kb großen human c-Raf-1 bzw. 1,4 kb großen human ΔRaf (26-302) cDNA-Fragmente sowie ein 0,4 kb großes Fragment viraler DNA, das die Polyadenylierungssequenz sowie Intron/Exon-Bereiche des SV40 Virus beinhaltet, wodurch die Translationsef fizienz der polyadenylierten mRNA gesteigert wird.

Eingezeichnet sind ferner die Schnittstellen der ver wendeten und in den folgenden Beispielen verwendeten Restriktionsendonucleasen.

Die einzelnen Stufen der vorgehend skizzierten beispielhaften allgemeinen Vorgehensweise werden hin sichtlich des experimentellen Vorgehens in den fol genden Beispielen im einzelnen erläutert.

Beispiel 1

Die Klonierung der cDNS-Sequenzen der transformier enden c-Raf Subdomäne in einen lungenspezifischen Ex pressionsvektor wurde im einzelnen wie folgt durchgeführt. Der Vektor SPC-Raf-1 zur Generierung der Wildtyp-Raf-1-transgenen Mäuse wurde hergestellt, in dem ein 3,0 kb großes Fragment der menschlichen Raf-1 cDNA (Bonner, T. I.; Oppermann, H.; Seebrug, P.; Kerby, S. B.; Gunnell, M. A.; Young, A. C.; and Rapp, U. R.; 1986; "The complete coding sequence of the human raf oncogene and the corresponding structure of the c-raf-1 gene."; Nucleic Acids Res.; 14, 109) in die EcoRI-Schnittstelle des Plasmids SPC3.7/5V40 kloniert wurde, das die 3,7 kb umfassende Promotorregion des humanen Surfactant-assoziierten Proteins C (SPC) en thält (Korfhagen, T. R.; Glasser, S. W.; Wert, S. E.; Bruno, M. D.; Daugherty, C. C.; McNeish, J. D.; Stock, J. L.; Potter, S. S.; Whitsett, J. A.; 1990; "Cis-acting sequences from a human surfactant protein gene confer pulmonary-specific gene expression in transgenic mice."; Proc. Natl. Acad. Sci.; 87, 6122). Analog wurde der Transgenvektor SPC-ΔRaf (26-302) durch Insertion eines 1,4 kb großen Fragmentes der menschli chen Raf-1 cDNA kloniert, das durch Deletion der Ami nosäuren 26 bis 302 der regulatorischen Domäne entstanden ist (Bruder, J. T.; Heidecker, G.; and Rapp, U. R.; 1992; "Serum-, TPA-, and Ras-induced ex pression from Ap-1/Ets-driven promoters requires Raf-1 kinase."; Genes and Dev; 6, 545) und somit die Kinase- Domäne des Raf-1-Proteins enthält (aktivierte, onco gene Mutante der Raf-1-Kinase).

Beispiel 2

Die Linearisierung sowie die Pronucleusinjektion wurden im einzelnen wie folgt durchgeführt. Die Trans genvektoren wurden jeweils mit den Restriktionsendonu cleasen NotI und NdeI geschnitten, mit einem präpara tiven Agarosegel aufgereinigt (Sambrooks et al., 1989, s. u.) und auf eine Konzentration von 1 ng/ml verdünnt. 200 ng der linearisierten DNA-Fragmente wurde in die männlichen Vorkerne befruchteter Oozyten injiziert. Transgene Founder-Mäuse wurden durch Analyse der aus Schwanzspitzen isolierten genomischen DNA durch Southern-Blot (siehe auch Beispiel 3) identifiziert. Die Founder-Mäuse wurden mit nichttransgenen B6D2-Mäusen gekreuzt, um stabile Linien zu etablieren.

Die verwendeten Mäuse waren C57BL/6 × DBA F2 Mäuse (B6D2-Mäuse) und wurden von Harlan Winkelmann (Bor chen) und von Charles River (Sulzfeld) bezogen und im Tierstall des MSZ (Institut für Medizinische Strahlenkunde und Zellforschung der Universität Würzburg, 97078 Würzburg) unter pathogenfreien Bedin gungen gehalten und weitergezüchtet.

Beispiel 3

PCR und Southern-Blot zur Genotypisierung wurden nach folgenden Arbeitsvorschriften durchgeführt. Zum Nach weis der Transgen-Integration wurden 10 µg der geno mischen DNA aus Schwanzspitzen mit 40 units BamHI über Nacht geschnitten, auf einem 0,7%igen Agarosegel mit tels Elektrophorese separiert und mittels eines Kapil larblots auf Nitrocellulose übertragen (Sambrook, J.; Fritsch, E. F.; Maniatis, T.; 1989; "Molecular Cloning: a laboratory manual."; Cold Spring Harbor Laboratory Press) Nach Fixation der DNA durch UV-Licht erfolgte der Nachweis des Trangens durch Hybridisierung der Membran (Church, G. M. and Gilbert, W.; 1984; "Genomic sequencing."; Proc. Natl. Acad. Sci.; 81, 1991) mit einer Raf-1-Sonde (enthaltend die Rat1/SV40 Sequenz), die durch Verdau des Transgenvektors SPC-Raf-1 mit BamHI erhalten wurde. Die gebundene Sonde, die auch mit dem endogenen Maus-Raf-Locus kreuzhybridisierte, wurde durch Exposition der Membran auf Filmmaterial detektiert und markierte ein 3,4 kb großes Raf-1/SV40- Fragment bzw. ein 1,8 kB großes ΔRaf_26-302/SV40 Frag ment. Das Ergebnis von Southern-Blots aus selektierten erfindungsgemäßen Tieren ist in der Fig. 3 wieder gegeben. In dieser sind die Positionen von endogenem Raf-1 und der transgenen ΔRaf (26-302) bzw. Raf-1-Fragmente in transgenen (T) und nicht transgenen (NT) Mäusen für jeweils zwei unabhängige Mauslinien (ΔRaf_11 und ΔRaf_23 bzw. Raf_74 und Raf_87) erkennbar. Die Positionen der jeweiligen Fragmente sind durch Pfeile gekennzeichnet. Erkennbar ist ohne weiteres, daß die transgenen ΔRaf (26-302) bzw. Raf-1-Fragmenten zuordbaren Banden (untere Pfeile) nur bei den transgenen Tieren registriert wurden.

Beispiel 4

Es wurden insgesamt 2 c-Raf-B × B (bzw. ΔRaf (26-302))- Maus-Linien erhalten. Diese erfindungsgemäßen Mäuse beider Linien entwickelten im Alter von 6 bis 7 Monaten massive Lungen-Karzinome, deren zellulärer Ursprung, nach Verteilungsmuster und Phänotyp den Pneumozyten Typ II entsprechen. Untersuchung der Zeitabhängigkeit der Tumorentwicklung ergab, daß schon nach 2 Monaten deutliche multizentrische Tumorbildung vorliegt. Im Lungengewebe beider Linien konnte auch die Expression des Transgens im Western-Blot nachgewi esen werden, wie aus der Fig. 4 ersichtlich. Damit ist auch eine Korrelation zwischen gezielter fehlgesteuerter Raf-Kinaseaktivität und Lungentumorin duktion in vivo belegt.

Der Western-Blot nach Fig. 4 wurde wie folgt erhal ten. Die Proteinexpression des Transgens wurde nachge wiesen, indem Lungengewebe der Mäuse in detergens haltigem Puffer lysiert und etwa 100 µg der solubilis ierten Proteine mit einem 10%igen SDS-Polyacrylamid- Gel aufgetrennt wurden. Nach dem Transfer der Proteine auf Nitrocellulose, wurde die Membran über Nacht mit milchpulverhaltiger Abblock-Lösung und nacheinander je 1 Stunde mit einem polyklonalen anti-Raf-1 Kaninchen- Antiserum sowie mit Peroxidase-gekoppelten anti- Kaninchen-Immunglobulin inkubiert. Nach jedem Inkuba tionsschritt wurde mehrmals mit Waschlösung gewaschen. Die Detektion der gebundenen Antikörper erfolgte durch die Reaktion der Peroxidase mit einem Chemilumi neszenz-emittierenden Substrat und Exposition auf Filmmaterial. In der Fig. 4 ist im einzelnen dargestellt ein Immunoblot mit solubilisierten Prote inen aus Lungengewebe der angegebenen Mauslinien sowie aus nicht transgenen Kontrollmäusen (C) nach Färbung mit dem anti-Raf-Kaninchen Antiserum. Angegeben sind die Positionen der jeweiligen Raf-Proteine bei etwa 74 kDa (Raf-1) und 42 kDa (ΔRaf (26-302)). In Fig. 4a ist das endogene Raf-1 der Maus sowie das ΔRaf (26-302) in den transgenen Mauslinien gekennzeichnet. In Fig. 4b ist aufgrund des gleichen Molekulargewichts von en dogenem murinen Raf-1 und transgenem humanen Raf-1 die Transgenexpression anhand der Intensitätszunahmne der Raf-1-Bande zu erkennen.

Claims

1. Transgenes nicht menschliches Säugetier, dessen Zellen ein durch eine konstitutiv aktive onkogene Mu tante der Kinase-Domäne des c-Raf-1-Gens oder ein durch ein entsprechendes normales Allel oder ein Deri vat des A, B oder c-Raf-1-Gens codiertes Protein exprimieren.

2. Transgenes nicht-menschliches Säugetier nach An spruch 1, wobei die Expression in Lungenzellen erfolgt.

3. Transgenes nicht-menschliches Säugetier, wobei das Säugetier fremde DNS mit einer konstitutiv aktiven onkogenen Mutante der Kinase-Domäne des c-Raf-1-Gens oder mit einem entsprechenden normalen Allel oder Derivat des A, B oder c-Raf-1-Gens enthält.

4. Transgenes nicht-menschliches Säugetier nach An spruch 3, wobei die fremde DNS zusätzlich einen Promo tor für das Surfactant Protein C, vorzugsweise für das humane Surfactant Protein C, enthält und wobei dieser Promotor in der fremden DNS mit der Maßgabe angeordnet ist, daß durch den Promotor die Transkription der Mu tante der Kinase-Domäne des c-Raf-1-Gens oder eines entsprechenden normalen Allels oder Derivats des A, B, oder c-Raf-Gens kontrolliert wird.

5. Transgenes nicht-menschliches Säugetier nach einem der Ansprüche 3 oder 4, wobei die fremde DNS zusätzlich DNS des SV40 Virus enthält.

6. Transgenes nicht-menschliches Säugetier nach einem der Ansprüche 1 bis 5, welches ein Säugetier aus der Gruppe der Rodenten ist.

7. Transgenes nicht-menschliches Säugetier, welches erhältlich ist durch folgende Verfahrensschritte:

a) Einbau der cDNA-Sequenz einer konstitutiv aktiven onkogenen Mutante der Kinase-Domäne des c-Raf-1-Gens oder eines entsprechenden normalen Allels oder Deri vats des A, B oder c-Raf-1-Gens in einen Expressionsvektor,
b) Einbringung des in Stufe a) erhaltenen Transgen- Vektors, vorzugsweise nach Linearisierung, in Pronu clei von befruchteten Oozyten aus einem nicht- menschlichen Säugetier,
c) Implantation der in Stufe b) erhaltenen Oozyten in Ammentiere gleicher Spezies wie die Spenderspezies der Oozyten und Austragung von Nachkommentieren aus den Oozyten,
d) Genotypisierung und Selektion der in Stufe c) er haltenen Nachkommentiere mit der Maßgabe, daß Zellen der selektierten Säugetiere ein durch die konstitutiv aktive onkogene Mutante der Kinase-Domäne des c-Raf-1-Gens oder ein durch ein entsprechendes nor males Allel oder Derivat des A, B oder c-Raf-1-Gens codiertes Protein exprimieren.

8. Transgenes nicht menschliches Säugetier nach An spruch 7, wobei der in Stufe a) verwendete Expres sionsvektor einen Promoter für das Surfactant Protein C, vorzugsweise einen Promoter für das humane Surfac tant Protein C, enthält und wobei dieser Promotor in der fremden DNS mit der Maßgabe angeordnet ist, daß durch den Promotor die Transkription der Mutante der Kinase-Domäne des c-Raf-1-Gens oder eines ent sprechenden normalen Allels oder Derivats des A, B oder c-Raf-1-Gens kontrolliert wird.

9. Transgenes nicht menschliches Säugetier nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei die konstitutiv aktive onkogene Mutante des c-Raf-1-Gens eine Sequenz gemäß der Fig. 1 oder eine daraus abgeleitete Sequenz ΔRaf (26-302) aufweist.

10. Verfahren zur Herstellung eines transgenen, nicht- menschlichen Säugetiers, welches eine erhöhte Wahr scheinlichkeit der Bildung von Tumoren aufweist, mit folgenden Verfahrensschritten:

a) Einbau der cDNA-Sequenz einer konstitutiv aktiven onkogenen Mutante der Kinase-Domäne des c-Raf-1-Gens oder eines entsprechenden normalen Allels oder Derivats des A, B oder c-Raf-1-Gens in einen Expressionsvektor,
b) Einbringung des in Stufe a) erhaltenen Transgen- Vektors in Pronuclei von befruchteten Oozyten aus einem nicht-menschlichen Säugetier,
c) Implantation der in Stufe b) erhaltenen Oozyten in Ammentiere gleicher Spezies wie die Spenderspezies der Oozyten und Austragung von Nachkommentieren aus den Oozyten,
d) Genotypisierung und Selektion der in Stufe c) er haltenen Nachkommentiere mit der Maßgabe, daß Zellen der selektierten Säugetiere ein durch die konstitutiv aktive onkogene Mutante der Kinase-Domäne des c-Raf-2-Gens oder ein durch ein entsprechendes nor males Allel oder Derivat des A, B oder c-Raf-1-Gens codiertes Protein exprimieren.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der in Stufe a) verwendete Expressionsvektor einen Promoter für das Surfactant Protein C, vorzugsweise einen Promoter für das humane Surfactant Protein C enthält, wobei dieser Promotor in der fremden DNS mit der Maßgabe angeordnet ist, daß durch den Promotor die Transkription der Mu tante der Kinase-Domäne des c-Raf-1-Gens oder eines entsprechenden normalen Allels oder Derivats des A, B oder c-Raf-1-Gens kontrolliert wird und wobei der in Stufe a) verwendete Expressionsvektor optional zusätzlich DNS des SV40 Virus enthält.

12. Verwendung eines nicht-menschlichen Säugetiers nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur vorklinischen Untersuchung der Wirksamkeit von gegen Lungenkarzinome gerichteten Substanzen und/oder von gegen Lungenkarzi nome gerichteten Therapieverfahren.

13. Verwendung nach Anspruch 12 zur vorklinischen Un tersuchung der Wirksamkeit von Raf-Kinase hemmenden Substanzen.

14. Verwendung eines nicht-menschlichen Säugetiers nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Untersuchung der Pathogenese von Lungentumoren.

15. Zellgewebe, insbesondere Lungengewebe, aus einem transgenen nicht-menschlichen Säugetier nach einem der Ansprüche 1 bis 9, welches Zellgewebe eine erhöhte Wahrscheinlichkeit der Bildung von Tumoren, vorzugs weise Lungentumoren, aufweist.

16. Verfahren zur Herstellung von Zellgewebe, insbe sondere Lungengewebe, aus einem transgenen, nicht- menschlichen Säugetier, welches Zellgewebe eine erhöhte Wahrscheinlichkeit der Bildung von Tumoren, vorzugsweise Lungentumoren, aufweist, mit folgenden Verfahrensschritten:

a) Einbau der cDNA-Sequenz einer konstitutiv aktiven onkogenen Mutante der Kinase-Domäne des c-Raf-1-Gens oder eines entsprechenden normalen Allels oder Deri vats des A, B oder c-Raf-1-Gens in einen Expressionsvektor,
b) Einbringung des in Stufe a) erhaltenen Transgen- Vektors in Pronuclei von befruchteten Oozyten aus einem nicht-menschlichen Säugetier,
c) Implantation der in Stufe b) erhaltenen Oozyten in Ammentiere gleicher Spezies wie die Spenderspezies der Oozyten und Austragung von Nachkommentieren aus den Oozyten,
d) Genotypisierung und Selektion der in Stufe c) er haltenen Nachkommentiere mit der Maßgabe, daß Zellen der selektierten Säugetiere ein durch die konstitutiv aktive onkogene Mutante der Kinase-Domäne des Raf-1-Gens oder ein durch ein entsprechendes normales Allel oder Derivat des A, B oder c-Raf-1-Gens cod iertes Protein exprimieren.
e) Entnahme des Zellgewebes aus dem Säugetier und ggf. Kultivierung des entnommenen Zellgewebes.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der in Stufe a) verwendete Expressionsvektor einen Promoter für das Surfactant Protein C, vorzugsweise einen Promoter für das humane Surfactant Protein C enthält, wobei dieser Promotor in der fremden DNS mit der Maßgabe angeordnet ist, daß durch den Promotor die Transkription der Mutante der Kinase-Domäne des c-Raf-1-Gens oder eines entsprechenden normalen Allels oder Derivats des A, B oder c-Raf-1-Gens kontrolliert wird und wobei der in Stufe a) verwendete Expressionsvektor optional zusätzlich DNS des SV40 Virus enthält.

18. Verwendung eines Zellgewebes nach Anspruch 15 zur vorklinischen Untersuchung der Wirksamkeit von gegen Lungenkarzinome gerichteten Substanzen und/oder von gegen Lungenkarzinome gerichteten Therapieverfahren.

19. Verwendung nach Anspruch 18 zur vorklinischen Un tersuchung der Wirksamkeit von Raf-Kinase hemmenden Substanzen.

20. Verwendung eines Zellgewebes nach Anspruch 15 zur Untersuchung der Pathogenese von Lungentumoren.

21. Rekombinanter DNS Expressionsvektor enthaltend

A) die DNS-Sequenz einer konstitutiv aktiven onkogenen Mutante der Kinase-Domäne des c-Raf-1-Gens oder eines entsprechenden normalen Allels oder Derivates des A, B oder c-Raf-1-Gens,
B) eine Promoter-Domäne für das Surfactant Protein C mittels welcher die Transskription der durch die in A) definierte DNS-Sequenz steuerbar ist,
C) optional die DNS-Sequenz des SV40 Virus.

22. Rekombinanter DNS Expressionsvektor nach Anspruch 21, wobei die in A) definierte DNS Sequenz eine Se quenz gemäß der Fig. 1 oder eine daraus abgeleitete Sequenz ΔRaf (26-302) ist und/oder wobei die in B) definierte Promoter-Domäne eine Promoter-Domäne für das humane Surfactant Protein C ist.

23. Verwendung eines rekombinaten Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 21 oder 22 zur Herstellung eines transgenen nicht-menschlischen Säugetiers oder eines Zellgewebes aus einem solchen Säugetier.