DE19739360C2 - Verfahren zur Diagnose von frühen Krebsvorstufen der Leber und Niere - Google Patents
Verfahren zur Diagnose von frühen Krebsvorstufen der Leber und NiereInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Diagnose von frühen Krebsvor
stufen in der Leber und den Nieren, wobei in einer Leber- oder Nierengewebe
probe die Gegenwart des Insulin-Rezeptor-Substrats (IRS-1) in glykogenotischen
Foci (GSF) und/oder gemischtzelligen Foci (MCF) anhand der Bindung eines
spezifischen Reagenzes, beispielsweise eines Antikörpers, und der Sichtbarma
chung des gebildeten Komplexes nachgewiesen wird. Die vorliegende Erfindung
betrifft darüber hinaus die Verwendung des Verfahren zum Testen von Sub
stanzen, die im Verdacht stehen, Leber- und/oder Nierenkrebs erzeugen zu
können.
Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) zählt zu den häufigsten malignen Neoplas
men beim Menschen und verursacht jährlich weltweit mindestens 250.000 Tote.
Chronische Infektionen mit dem Hepatitis B- bzw. Hepatitis C-Virus, die Auf
nahme von Nahrungsmitteln, die Hepatokarzinogene enthalten, beispielsweise
das natürlich vorkommende Aflatoxin B1, sowie Alkoholmißbrauch werden als
die hauptsächlichen Risikofaktoren für das Entstehen von HCC angesehen.
Darüber hinaus wurde ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung eines hepatozel
lulären Adenoms bei Frauen beobachtet, die Empfängnisverhütungsmittel ein
nehmen, sowie sowohl bei Frauen als auch bei Männern, die mit anabolen
Steroidhormonen behandelt wurden. Zu den weiteren Stoffen, die in der mensch
lichen Umwelt auftreten und für die zumindest bei Nagern gezeigt werden
konnte, daß sie an der Entstehung von Leberkrebs beteiligt sind, gehören bei
spielsweise Nitrosamine, organische chlorierte Pestizide, polychlorierte Bipheny
le, Phthalate und Hypolipidämie bewirkende Medikamente.
Zur Diagnose von Krebsvorstufen der Leber bei Labortieren und neuerdings auch
beim Menschen wurden bisher konventionelle, beispielsweise mit Hämatoxylin
und Eosin gefärbte Gewebeschnitte hergestellt, daneben aber auch verschiedene
Markerenzyme, wie zum Beispiel die plazentare Form der Glutathion-S-Trans
ferase oder die Gamma-Glutamyltransferase, bestimmt. Die Karzinogenese wird
auch durch frühe Änderungen im Energiestoffwechsel begleitet, beispielsweise
durch die exzessive Glykogenspeicherung in herdförmigen präneoplastischen
Läsionen. Somit kann eine Diagnose auch mittels des histochemischen Nachwei
ses von Veränderungen des Glykogengehalts der Leberzellen durchgeführt
werden.
Ein entscheidender Nachteil der Diagnose unter Verwendung dieser Marker ist
jedoch, daß entweder keine Unterscheidung von frühen und späten Gewebsver
änderungen bei der Krebsentstehung möglich ist oder die Tumorvorstufen für
diagnostische Zwecke nicht deutlich genug vom umgebenden Gewebe abge
grenzt werden können. Letzteres trifft insbesondere auf die Glykogenbestim
mung zu, da Glykogen auch in unverändertem Gewebe in großen Mengen
vorkommt. Es ist somit mit dem im Stand der Technik beschriebenen diagnosti
schen Verfahren nicht möglich, frühe Krebsvorstufen zu erkennen, was eine
wesentliche Voraussetzung für eine möglichst frühzeitige und damit wirksame
Therapie ist.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit in der Bereitstellung eines
diagnostischen Verfahrens zur Diagnose von frühen Krebsvorstufen in der Leber
und den Nieren.
Die Lösung dieser Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentan
sprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.
Das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren erlaubt die Erkennung von frühen
Krebsvorstufen in der Leber und den Nieren und ist damit zur Krebsfrüherken
nung geeignet. Es basiert darauf, daß man in einer Gewebeprobe die Gegenwart
des Insulin-Rezeptor-Substrats (IRS-1) in glykogenotischen Foci (GSF) und/oder
gemischtzelligen Foci (MCF) anhand der Bindung an ein Reagenz nachweist.
Die Karzinogenese in Leber und Niere ist dadurch gekennzeichnet, daß zuerst
präneoplastische Foci (glykogenotische Foci, GSF; gemischtzellige Foci, MCF;
basophile Foci, BCF) entstehen, aus denen sich dann schließlich das hepatozel
luläre Karzinom (HCC) oder Nierenzellkarzinom (NCC) entwickelt. Bei der Um
wandlung von GSF zu HCC bzw. NCC kommt es, wie schon vorstehend ange
deutet, in der Leber zu enzymatischen Veränderungen, wobei Glukose bevorzugt
über den Pentosephosphatzyklus und Glykolyse metabolisiert wird. Dabei nimmt
dann das ursprünglich im Überschuß gespeicherte Glykogen allmählich ab,
andererseits kommt es zu einer Zunahme der basophilen Ribosomen und der
Zellvermehrung. Über die Zwischenstufe der MCF entsteht schließlich der
basophile neoplastische Phänotyp. Durch verschiedene Untersuchungen wurde
nachgewiesen, daß in den GSF das Stoffwechselmuster der Antwort der Hepa
tozyten auf Insulin entspricht. Tatsächlich wurde bei diabetischen Ratten be
obachtet, daß nach Transplantation von Inselzellen in die Leber, die unter diesen
Bedingungen Insulin im Übermaß sezernierten, hepatozelluläre Neoplasmen
entstehen. Insulin ist ein pleiotropes Hormon, das sich in Hepatozyten auf den
Stoffwechsel sowie die Mitose auswirkt. Dies erfolgt durch eine Signaltransduk
tionskaskade, bei der IRS-1 das intrazelluläre Substrat der Insulinrezeptortyrosin
kinase darstellt. Die Überexpression von IRS-1 in HCC oder NCC konnte nach
gewiesen werden. Darüber hinaus wurde auch gezeigt, daß es bei Überexpres
sion von IRS-1 in Leberzellinien zur Transformation der Zellen kommt. Bisher
wurde jedoch die Expression von IRS-1 in frühen Stadien der Leber- und Nieren
zellkrebsentstehung nicht untersucht.
In der vorliegenden Anmeldung wurde überraschenderweise festgestellt, daß in
den frühen, glykogenspeichernden Krebsvorstufen (GSF, MCF) IRS-1 stark über
exprimiert wird, während es im normalen Leber- und Nierengewebe nur in sehr
geringen, histochemisch nicht nachweisbaren Mengen vorkommt. Während der
Untersuchungen, die zu der vorliegenden Erfindung führten, wurde in Ratten die
Expression von IRS-1 in mehr als 400 präneoplastischen Foci von veränderten
Hepatozyten (FAH) und in 12 hepatozellulären Karzinomen (HCC; induziert mit
N-Nitrosomorpholin, NNM) mittels Westernblots und über immunhistochemi
schen Nachweis untersucht. Mittels Westernblots konnte IRS-1 in der Leber von
NNM behandelten und unbehandelten Ratten nachgewiesen werden. IRS-1 war
jedoch in normalem Leberparenchym immunhistologisch nicht nachweisbar. Im
Gegensatz dazu ergab der immunhistochemische Nachweis, daß IRS-1 beson
ders in den GSF und MCF, die auch exzessiv Glykogen gespeichert hatten,
überexprimiert wurde. Somit ist eindeutig, daß die Überexpression von IRS-1 in
GSF und MCF zu einer präneoplastischen Glykogenose führt und ein frühes
Ereignis bei der Karzinogenese darstellt. Während der Progression der frühzeitig
auftretenden GSF zu MCF, BCF und HCC bzw. NCC wird dann die Expression
von IRS-1 wieder herunterreguliert. Dabei wird der präneoplastische insulinomi
metische Phänotyp allmählich in den malignen neoplastischen Phänotyp umge
wandelt. Diese im Tiermodell gewonnenen Erkenntnisse decken sich auch mit
den bisherigen Untersuchungen am Menschen, so daß die obigen Ergebnisse voll
übertragbar sind. Somit kann die Überexpression von IRS-1 als ein spezifischer
Marker für frühe Krebsvorstufen in der Leber und den Nieren verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit Verfahren zur Diagnose von frühen
Krebsvorstufen in der Leber und Nieren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
man eine Leber- oder Nierengewebeprobe bzw. daraus gewonnene Nukleinsäu
ren mit einem für das Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS-1) spezifischen Reagenz in
Berührung bringt und die Gegenwart von IRS-1 in glykogenetischen Foci (GSF)
und/oder gemischtzelligen Foci (MCF) anhand der spezifischen Bindung an das
Reagenz nachweist.
Die für das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren verwendbaren Nachweisver
fahren sind dem Fachmann bekannt und umfassen immunhistochemische Nach
weisverfahren (z. B. die APAAP-Methode) oder den Nachweis von IRS-1 mittels
geeigneter Nukleinsäure-Sonden, da die Gegenwart von überexprimiertem IRS-1
mit einer stark erhöhten Konzentration der entsprechenden RNA korreliert ist.
Die für IRS-1 codierende cDNA wurde von Sun et al., Nature 352, S. 72-77
(1991) veröffentlicht und es ist für einen Fachmann in Kenntnis dieser Sequenz
kein Problem die geeigneten Sonden zum Nachweis der IRS-1 mRNA auszuwäh
len und zu konstruieren. Dafür kommt die dem Fachmann bekannte in-situ
Hybrisidierung, Northern Blot oder Dot Blot in Frage.
Desweiteren sind Nukleinsäuren, die für das Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS-1)
kodieren, in WO 92/13083 beschrieben. Diese Nukleinsäuren und das davon
abgeleitete Protein werden zur Diagnose von Insulin-verwandten Krankheiten
eingesetzt.
Die erfindungsgemäßen Nachweisverfahren umfassen die Entnahme einer Gewebeprobe der Leber,
die Herstellung von Gewebeschnitten, die Inkubation der Gewebeschnitte mit
einem für IRS-1 spezifischen Reagenz und die Sichtbarmachung der erhaltenen
spezifischen Komplexe in den Gewebeschnitten.
Die Entnahme der Gewebeprobe der Leber kann durch verschiedene, dem Fach
mann bekannte Verfahren erfolgen, beispielsweise mittels Feinnadelbiopsie oder
laparoskopischer Biopsie. Für die anschließende Behandlung mit dem für IRS-1
spezifischen Reagenz werden Gewebeschnitte nach üblichen Verfahren herge
stellt, beispielsweise mittels Gefrierschnitt. Im Anschluß daran werden die
präparierten Gewebeschnitte mit dem für IRS-1 spezifischen Reagenz behandelt.
Zu geeigneten Reagenzien für das erfindungsgemäße Verfahren zählen IRS-1
spezifische Antikörper sowie mit IRS-1 mRNA hybridisierende Nukleinsäure-
Sonden (DNA oder RNA).
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird
die Gewebeprobe mit einem polyklonalen Antikörper, einem monoklonalen
Antikörper oder einem Fragment davon, die IRS-1 erkennen können, als Reagenz
in Berührung gebracht und so dann bestimmt, ob der Antikörper oder das Frag
ment davon an die Gewebeprobe gebunden ist.
Verfahren zur Gewinnung solcher Antikörper sind dem Fachmann bekannt und
umfassen beispielsweise bezüglich der polyklonalen Antikörper die Verwendung
von IRS-1-Präparaten zur Immunisierung geeigneter Tiere und die Gewinnung
von Serum. Ein geeigneter polyklonaler Antikörper ist beispielsweise ein gegen
IRS-1 gerichteter Antikörper wie er von der Firma Upstate Biotechnology Inc.,
Lake Placid, NY, USA erhältlich ist.
Bevorzugt wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren ein monoklonaler Antikör
per oder ein Fragment davon eingesetzt. Verfahren zur Herstellung monoklonaler
Antikörper sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. Dazu werden beispielsweise
Zell-Hybride aus Antikörper produzierenden Zellen und Knochenmark-Tumorzellen
hergestellt und kloniert. Anschließend wird ein Klon selektioniert, der einen Anti
körper produziert, der für IRS-1 spezifisch ist. Dieser Antikörper wird dann
hergestellt. Beispiele von Zellen, die Antikörper produzieren, sind Milzzellen,
Lymphknotenzellen, B-Lymphozyten etc.. Beispiele von Tieren, die zu diesem
Zweck immunisiert werden können, sind Mäuse, Ratten, Pferde, Ziegen und
Kaninchen. Die Myelomzellen lassen sich aus Mäusen, Ratten, Menschen oder
anderen Quellen erhalten. Die Zellfusion kann man beispielsweise durch das
allgemein bekannte Verfahren von Köhler und Milstein durchführen. Die durch
Zellfusion erhaltenen Hybridome werden mittels IRS-1 nach dem Enzym-Antikör
per-Verfahren oder nach einem ähnlichen Verfahren abgesucht. Klone werden
beispielsweise mit dem Grenz-Verdünnungsverfahren erhalten. Die erhaltenen
Klone werden BALB/c-Mäusen intraperitoneal implantiert, nach 10 bis 14 Tagen
wird der Ascites der Maus entnommen, und der monoklonale Antikörper durch
bekannte Verfahren (beispielsweise Ammoniumsulfatfraktionierung, PEG-Fraktio
nierung, Ionenaustauschchromatographie, Gelchromatographie oder Affinitäts
chromatographie) gereinigt. Der gewonnene Antikörper kann direkt verwendet
werden oder es kann ein Fragment davon verwendet werden. In diesem Zu
sammenhang bedeutet der Begriff "Fragment" alle Teile des monoklonalen
Antikörpers (z. B. Fab-, Fv- oder "single chain Fv"-Fragmente), welche die gleiche
Epitopspezifität wie der vollständige Antikörper aufweisen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der genannte monoklonale
Antikörper ein aus einem Tier (z. B. Maus) stammender Antikörper, ein humani
sierter Antikörper oder ein menschlicher Antikörper oder ein Fragment davon.
Nach Behandlung des Gewebeschnitts mit dem Antikörper erfolgt eine Weiterbe
handlung zur Sichtbarmachung und Lokalisation der immunhistochemischen
Reaktion durch spezielle Reagenzien, die mit bestimmten Enzymen, Fluoreszenz
farbstoffen oder radioaktiven Verbindungen markiert sind. Die Auswertung der
spezifisch angefärbten Gewebeschnitte erfolgt bevorzugt visuell mittels mikro
skopischer Vergrößerung. Dabei sind GSF durch eine übermäßige Speicherung
von Glykogen gekennzeichnet, das am alkoholfixierten Gewebeschnitt durch
Behandlung mit dem Perjod-Schiff's Reagenz als rote Granula im Zytoplasma der
Leberzellen dargestellt ist. Die MCF zeichnen sich durch eine Mischung von
rotgefärbten Glykogenspeicherzellen und glykogenärmeren Zellen aus, die im
Extremfall kein Glykogen mehr enthalten und dann durch Gegenfärbung der
Schnitte mit basischen Farbstoffen, z. B. Toluidinblau oder Cuprolinblau, die im
Zytoplasma vor allem die Ribosomen anfärben, als blaue Zellen in Erscheinung
treten.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird als IRS-1 nachweisendes
Reagenz eine mit der IRS-1 mRNA hybridisierende Nukleinsäuren-Sonde einge
setzt. Der Nachweis erfolgt über die dem Fachmann bekannte in-situ Hybrisidie
rung, Northern Blot oder Dot Blot. Diese Verfahren sind dem Fachmann hinrei
chend bekannt und es ist ihm auch vertraut aus den Gewebeschnitten mRNA zu
gewinnen. In diesem Zusammenhang sei auf Maniatis, Fritsch & Sambrook,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989); DNA Cloning, Vol. I und II
(D. N. Glover eds., 1985) und Nucleic Acid Hybridisation (B. D. Hames & S. J.
Higgins eds., 1984) hingewiesen.
Die gebildeten Komplexe zwischen IRS-1 und Reagenz können dadurch sichtbar
gemacht werden, daß ein anders markiertes Reagenz oder andere Substrate
verwendet werden. Beispiele für geeignete Markierungen sind Enzyme (Per
oxidase, Galaktosidase), fluoreszierende (Fluoreszeinisothiocyanat, Rhodamin
isothiocyanat) oder radioaktive Verbindungen. Neben farbigen Substraten (Bro
mo-Chloro-Indolylphosphat/Nitroblau-Tetrazolium, Diaminobenzidin, Aminoethyl
carbazol) können alternativ auch lumineszierende Verbindungen (Dioxetane)
angewendet werden.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Verfahrens zur
Bestimmung von Substanzen, die Leber- und/oder Nierenkrebs induzieren kön
nen, wobei man sich die oben beschriebenen Beobachtungen zunutze macht,
d. h. die zu untersuchende Substanz wird einem Tier appliziert, nach einem
geeigneten Zeitraum wird eine Gewebeprobe entnommen, diese mit einem für
das Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS-1) spezifischen Reagenz in Berührung ge
bracht und die mögliche Gegenwart von IRS-1 in glykogenotischen Foci (GSF)
und/oder gemischtzelligen Foci (MCF) anhand der spezifischen Bindung an das
Reagenz nachgewiesen. Das Vorhandensein von IRS-1 in GSF und/oder MCF
läßt dann darauf schließen, daß die verabreichte Substanz hepato- bzw. nephro
karzinogen wirkt.
Dabei wird die zu untersuchende Substanz dem Tier, beispielsweise einer Maus,
einem Kaninchen oder einer Ratte, in geeigneter Weise und in geeigneten Kon
zentrationen appliziert. Bevorzugt wird eine Dosis von 10% der Dosis bei der
nach einmaliger Gabe 50% der Versuchstiere sterben (LD 50) appliziert, eventuell
nach Sensibilisierung der Leber durch einmalige Gabe eines bekannten Karzino
gens (z. B. Diethylnitrosamin). Nach einem Zeitraum von ca. 4 Wochen bis 4
Monaten werden Feinnadelbiopsien durchgeführt bzw. den getöteten Tieren
Gewebeproben entnommen und die Gewebeschnitte hinsichtlich der Expression
von IRS-1 in GSF und MCF untersucht. Dadurch sollte es im Vergleich zu den
bisher gebräuchlichen Testverfahren (Langzeitversuch über 2-3 Jahre mit Tumor
nachweis als Endpunkt) möglich sein, die Anzahl an Versuchstieren zu reduzie
ren und den Zeitraum zwischen Applikation des potentiellen Karzinogens und
Untersuchung der Versuchstiere zu verkürzen, da nicht bis zur Entstehung eines
HCC oder NCC gewartet werden muß.
Von den Erfindern wurde überraschenderweise herausgefunden, daß auch in der
Niere lange Zeit vor Ausbildung von Nierenzellkarzinomen glykogenotische Herde
auftreten. Sie lassen sich im Prinzip wie die präneoplastischen Herde der Leber
erfassen. Der Nachweis einer IRS-1 Überexpression kann damit auch zur Früh
erkennung der Nierenkrebsentstehung eingesetzt werden. Dies gilt für Labortiere
ebenso wie für den Menschen.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Kit zur Durchführung der oben
diskutierten Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein für IRS-1
spezifisches Reagenz, wie vorstehend definiert, enthält. In einer bevorzugten
Ausführungsform enthält das Kit ebenfalls IRS-1, beispielsweise zur Durch
führung einer Kontrollreaktion. Das Kit enthält außerdem noch weitere Reagen
zien, die üblicherweise in immunhistochemischen Verfahren verwendet werden,
wie Puffer, Träger, Marker usw.
Es kann davon ausgegangen werden, daß die Überexpression des IRS-1 nicht
nur eine Begleiterscheinung bei der Entstehung des Leberkrebses ist, sondern
auch damit ursächlich in Zusammenhang steht. Somit würde es die Repression
der Überexpression an IRS-1 oder die Reduzierung der Menge an überexprimier
tem IRS-1 bzw. dessen Inaktivierung erlauben, bereits in einem sehr frühen
Stadium der Krebsentstehung therapeutische Maßnahmen zu ergreifen.
Die Erfindung wird weiter anhand der Figuren beschrieben, welche zeigen:
Spuren A - D, Westernblot-Analyse zum Nachweis des 165 kD IRS-1 in Homo
genaten von unbehandeltem (Spur B) und mit N-Nitrosomorpholin-behandeltem
(Spuren C + D) Rattenlebergewebe. Aliquots (10 µg) von zellulärem Gesamt
protein wurden einer SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen unterworfen
und mit polyklonalem anti-IRS-1-Antikörper (Fa. Upstate Biotechnology, Lake
Placid, NY, USA) inkubiert. Der gebundene Antikörper wurde mit Ziegen-anti-
Kaninchen-IgG, welches mit alkalischer Phosphatase markiert war, nachgewie
sen; Spur A, 3T3-Zellen (positive Kontrolle); Spur B, unbehandelte Rattenleber;
Spur C, präneoplastische Rattenleber; Spur D, hepatozelluläres Karzinom; links,
Molekulargewichtsmarker.
Die Korrelation von Glykogengehalt (bestimmt durch die PAS-Reaktion, A, E, G,
I, K) und der Expression von IRS-1 (nachgewiesen in situ mit polyclonalem anti-
IRS1-Antikörper (Kaninchen), B, F, H, J, L) wurden untersucht. Die Spezifität der
Immunreaktion (APAAP-Verfahren) wurde durch Substitution (C) und Kontrolle
der Flüssigkeitsadsorption (D) in seriellen Gefrierschnitten von präneoplastischen
(A-H) und neoplastischen (I-L) hepatozellulären Läsionen, die in Ratten mit N-
Nitrosomorpholin induziert wurden, bestätigt. A, präneoplastische Glykogenoti
sche Foci [], die eine deutliche positive Immunreaktion für IRS-1 zeigen, wäh
rend in dem umgebenden Gewebe die Reaktion negativ ist (B, mit Cuprolin-Blau
gegengefärbt), bei Substitution (C) und bei den Kontrollen der Flüssigkeitsad
sorption, (D); E, gemischte Zell-Foci [], die sich aus glykogenotischen und
glykogenarmen Zellen zusammensetzen, die eine Immunreaktion für IRS-1 zeigen
(F); G, glykogenarme, basophile Zell-Foci [*] innerhalb eines glykogenotischen
Focus [], die mit einer positiven Immunreaktion für 1RS-1 in glykogenotischen
[], jedoch einer negativen Reaktion in einer glykogenarmen [*] Zellpopulation
assoziiert sind; I, Teil eines glykogenarmen, basophilen hepatozellulären Karzi
noms in Nachbarschaft zu MCF [], assoziiert mit einer negativen Immunreak
tion für IRS-1 (J), allerdings jedoch einer schwachen Immunreaktion in der
präneoplastischen Zellpopulation []; K, Teil eines hepatozellulären Karzinoms,
das relativ große Mengen an Glykogen enthält und das einige deutliche glykoge
notische (klare) Zellen einschließt [], wobei sich eine Immunreaktion für IRS-1
zeigt, vor allem in glykogenotischen Zellen [].
Vergrößerung bei Fig. 1 und 2: 64x; Der Balken entspricht 100 µm; hv, kleine
Lebervene
PAS, Periodsäure-Schiff'sche Reaktion; APAAP, Alkalische Phosphatase-anti-
Alkalische Phosphatase
Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung
Präneoplastsiche hepatozelluläre Läsio
nen wurden in erwachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten durch eine
begrenzte Exposition gegenüber oral verabreichtem NNM (Stop-Modell; 12 mg
NNM pro kg Körpergewicht) über einen Zeitraum von 7 Wochen induziert. Das
Gewebe von NNM behandelten bzw. unbehandelten Ratten wurde 15 und 20
Wochen nach Absetzen von NNM entnommen. HCC wurden durch orale Ver
abreichung derselben Dosis an NNM über einen Zeitraum von 10 Wochen oder
einer geringeren Dosis (1 mg/kg Körpergewicht pro Tag) über einen Zeitraum
von bis zu 73 Wochen erzeugt. Lebergewebe wurde bei -150°C schockgefroren
und bei -80°C aufbewahrt. Serielle Gefrierschnitte (6 µm) wurden mit Haematox
ylin und Eosin gefärbt oder mit PAS-T (Periodsäure-Schiff'sche Reaktion,
Gegenfärbung mit Toluidinblau) zum Nachweis von Glykogen behandelt.
Gefriergetrocknetes Lebergewebe wurde in Puffer lysiert, der 0,05 M TBS (Tris
gepufferte Kochsalzlösung), pH-Wert 7,4, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1
mM PMSF, 1 mM EGTA, 1 µg/ml Aprotinin, 1 µg/ml Leupeptin, 1 µg/ml Pep
statin, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 2,5% SDS und 5% 2-Mercaptoäthanol ent
hielt. Zur Entfernung von Zelltrümmern wurde bei 4°C zweimal jeweils 10 min.
bei 15000 g zentrifugiert. Danach wurde 5 min. gekocht und eine PAGE unter
reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Gradientengelen (4-15%)
durchgeführt. Die Proteinauftrennung und die Überführung auf eine Nitrozel
lulose-Membran (Hybond C°, 0,45 µ , Amersham Int., Little Chaltfont, England)
wurden mittels des "PhastSystem" von Pharmacia (Uppsala, Schweden) durch
geführt. Im Anschluß daran wurde die Membran 20 min. mit fettfreier Trocken
milch (3%) in PBS behandelt, 30 min. bei Raumtemperatur und zusätzlich 24
Stunden bei 4°C mit 3 µg/ml polyclonalem anti-IRS-1-Kaninchen-Antikörper
(Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY, USA) inkubiert, worauf die Inkuba
tion mit 1,2 µg/ml mit alkalischer Phosphatase markiertem Ziegen-anti-Kanin
chen-IgG erfolgte (90 min., RT; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.,
West Grove, PA, USA). Nach Behandlung mit 0,05% Twen-20 in PBS (15 min.)
wurden Banden im Gel mit Nitroblau-Tetrazoliumchlorid und 5-Brom-4-Chlor-3-
Indolylphosphat (Bachem Biochemica, Heidelberg, Deutschland) sichtbarge
macht. Für Positivkontrollen wurde ein 3T3-Zellysat (Upstate Biotechnology Inc.,
Lake Placid, NY, USA) verwendet (Fig. 1, Spur A).
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. Es zeigte sich, daß der verwendete
Antikörper spezifisch an ein Protein mit etwa 165 kD gebunden war (Fig. 1,
Spuren A - D). Dieses Molekulargewicht ist im Bereich von 165-180 kD, der dem
Molekulargewicht von IRS-1 entspricht, das von verschiedenen Gruppen für IRS-
1 aus verschiedenen Geweben bestimmt wurde. IRS-1 konnte deutlich sowohl
in unbehandelten (Spur B), als auch in mit NNM behandelten Rattenlebern nach
gewiesen werden (Spuren C und D). In der präneoplastischen Leber (Spur C),
die viele FAH enthielt, die weniger als 5% der Parenchym-Fraktion besiedelten
oder im HCC (Spur D) war eine Tendenz zu einer erhöhten Menge an IRS-1 im
Vergleich zu der unbehandelten Kontrolle zu beobachten.
Gefrierschnitte (6 µm) wurden auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträgern
(Sigma Diagnostics, St. Louis, MO, USA) befestigt, in 100% Methanol (15 min.,
-20°C) fixiert, mit Ziegenserum, 1 : 30 in TBS, abgeblockt und zuerst 30 min. bei
RT, dann zusätzlich 24 Stunden bei 4°C mit 10 µg/ml anti-IRS-1-Antikörper
inkubiert. Nach jedem der nachstehen beschriebenen Schritte wurden die Ge
frierschnitte mit 0,05 M Tris-Puffer (pH-Wert 7,4) zweimal jeweils 3 min. ge
spült. Anschließend wurden 18 ug/ml Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (Jackson
ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA) und danach ein 1 : 10
verdünnter Kaninchen-APAAP-Komplex (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,
USA) in zwei Zyklen dazugegeben. Nach Waschen mit destilliertem Wasser über
einen Zeitraum von 5 min. wurden die Gefrierschnitte mit Neufuchsin gefärbt.
Das Abblocken der endogenen alkalischen Phosphatase erfolgte durch Zugabe
von 1,73 mM Levamisol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Einige der
Gefrierschnitte wurden mit 1% Cuprolin-Blau (BDH Chemicals Ltd., Poole,
England) gegengefärbt. Schließlich wurden die Gefrierschnitte mit Glycerin-
Gelatine bedeckt. Zum Nachweis der Spezifität der Immunfärbung wurde der
primäre Antikörper in seriellen Gefrierschnitten gegen Affinitäts-gereinigtes IgG
(10 µg/ml) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA)
ausgetauscht. Zusätzlich zu dieser Substitutionskontrolle wurde in den Gefrier
schnitten eine Flüssigkeitsadsorptionskontrolle nach Vorinkubation des anti-IRS-
1-Antikörpers mit dem enstprechenden immunisierenden Peptid (Ratten-IRS-1-
Peptid, Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY, USA) über einen Zeitraum
von 3 Stunden bei RT und bei einem Mengenverhältnis von 1 : 10 g/g durch
geführt. Beide Kontrollen erwiesen sich als negativ.
Die Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen sind in Fig. 2
dargestellt. Wie in (A) zu sehen ist, kann IRS-1 in normalem Leberparenchym
immunhistochemisch nicht nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis läßt sich
dadurch erklären, daß in normalen Hepatozyten nur eine sehr geringe Menge an
IRS-1 enthalten ist. Im Gegensatz dazu zeigt jedoch die Mehrzahl der präneopla
stischen FAH eine mehr oder weniger starke Immunreaktion bezüglich IRS-1. Die
Immunreaktion ist auf das Zytoplasma beschränkt, wobei sich gelegentlich eine
auffallende perinucleäre Lokalisation zeigt. Insgesamt wurden über 400 FAH
untersucht und entsprechend den veröffentlichten Kriterien in die Klassen GSF,
MCF und BCF eingeteilt. Die IRS-1-Expression war besonders deutlich in den
früh auftretenden GSF (Fig. 2A + B). Von den 93 untersuchten GSF waren 96%
positiv bezüglich IRS-1. In den sich etwas später entwickelnden MCF war IRS-1
immunhistochemisch ebenfalls eindeutig nachweisbar (Fig. 2E + F). 97% der
beobachteten MCF waren ebenfalls positiv, allerdings war die Expression von
IRS-1 nicht ganz so stark im Vergleich zu den GSF. Die Stärke der Immunreak
tion bezüglich IRS-1 war eng mit der Anzahl der Glykogen-speichernden Zellen
innerhalb der FAH korreliert. Die Immunreaktion nahm mit dem zunehmenden
Ersatz der glykogenotischen durch Glykogen-arme basophile Zellen ab, was ein
Anzeichen dafür ist, daß eine grundsätzliche Verschiebung des Metabolismus
beim Übergang von frühen zu späten FAH stattfindet. Dies ist in Übereinstim
mung mit früheren Beobachtungen. FAH, die ausschließlich aus basophilen
Zellen bestanden, werden kaum beobachtet, jedoch waren von den 6 aufgefun
denen BCF alle negativ bezüglich IRS-1 (Fig. 2G + H). Dies trifft ebenfalls auf die
Mehrheit der 12 untersuchten HCC zu, in denen Glykogen-arme basophile Zellen
vorherrschten (Fig. 2I + J). Lediglich in 3 HCC konnte eine schwache Anfärbung
für IRS-1 beobachtet werden, die Immunreaktion war jedoch auf hochdifferen
zierte Zell-Subpopulationen beschränkt, die immer noch etwas Glykogen enthiel
ten (Fig. 2K + L).
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Überexpression von IRS-1 ein frühes Ereignis
bei der Karzinogenese der Leber darstellt, das mit der Akkumulation von Glyko
gen in GSF und MCF eng korreliert ist. Diese Korrelation betrifft nicht nur die
gesteigerte Expression von IRS-1 in glykogenotischen Zellen des Typs GSF und
MCF, sondern auch die praktisch zeitgleich damit einhergehende Reduktion
sowohl der IRS-1-Überexpression und der Glykogenakkumulation während des
Auftretens von entdifferenzierten basophilen Zellen in MCF, BCF und hepatozel
lulären Neoplasmen. Es kann ausgeschlossen werden, daß der starke Zusam
menhang zwischen IRS-1-Expression und der Glykogenakkumulation durch eine
unspezifische Bindung des Antikörpers an das Glykogenmolekül bedingt ist, und
zwar anhand der nachstehenden Beobachtungen. Obwohl beträchtliche Mengen
an Glykogen auch in den extrafocalen Hepatozyten von NNM behandelten Tieren
(Fig. 2A) und im Parenchym von unbehandelten Kontrolltieren gespeichert wur
den, war die Immunraktion für IRS-1 in diesen Bereichen des Parenchyms
grundsätzlich negativ (Fig. 2B). Darüber hinaus wurde Glykogen während der
einzelnen Schritte der immunhistochemischen Verarbeitung ausgewaschen, vor
allem während der hohen Anzahl an Waschschritten. Dies konnte dadurch
verifiziert werden, daß in denselben Gefrierschnitten sowohl eine Immunreaktion
als auch die PAS-Reaktion durchgeführt wurden. Bei der Durchführung der PAS-
Reaktion nach der Immunreaktion enthielten die Schnitte einschließlich der IRS-
1-positiven Foci kein Glykogen mehr. Diese Ergebnisse zeigen, daß der Phänotyp
der frühen Phase der Entstehung des Leberkrebses, d. h. die präneoplastische
Glykogenose in der Leber, durch eine Überexpression von IRS-1 bedingt ist.
Claims (13)
1. Verfahren zur Diagnose von frühen Krebsvorstufen in Leber und/oder
Niere, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Leber- oder Nierengewebe
probe oder daraus gewonnene Nukleinsäuren mit einem für das Insulin-
Rezeptor-Substrat (IRS-1) spezifischen Reagenz in Berührung bringt und
die Gegenwart von IRS-1 in glykogenotischen Foci (GSF) und/oder ge
mischtzelligen Foci (MCF) nachweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das IRS-1 spezifische Reagenz zum
Nachweis von IRS-1 in einer Gewebeprobe ein Antikörper oder Fragment
davon ist und man die Gewebeprobe mit dem Antikörper oder einem
Fragment davon in Berührung bringt und sodann bestimmt, ob der Anti
körper oder das Fragment davon an die Gewebeprobe gebunden ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper ein monoklona
ler Antikörper oder ein Fragment davon ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Antikörper ein Mausantikörper, ein
humanisierter Antikörper oder ein menschlicher Antikörper ist, oder ein
Fragment davon.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Reagenz mit
Enzymen, fluoreszierenden Verbindungen, lumineszierenden Verbindun
gen, ferromagnetischen Sonden oder radioaktiven Verbindungen markiert
ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reagenz zum Nachweis von IRS-1
eine mit einer für IRS-1 codierenden Nukleinsäure hybridisierende Nu
kleinsäure ist.
7. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, daß es ein wie in einem der Ansprüche 1 bis 6
definiertes Reagenz enthält und andere Puffer, Lösungen, Vorrichtungen
oder Träger, die üblicherweise in immunologischen oder molekularbiologi
schen Nachweisverfahren verwendet werden.
8. Verfahren zur Bestimmung von hepato- oder nephrokarzinogenen Substan
zen, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Substanz
einem Tier appliziert, nach einem geeigneten Zeitraum eine Gewebeprobe
entnimmt, diese oder daraus gewonnene Nukleinsäuren mit einem für das
Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS-1) spezifischen Reagenz in Berührung bringt
und die mögliche Gegenwart von IRS-1 in glykogenotischen Foci (GSF)
und/oder gemischtzelligen Foci (MCF) nachweist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das IRS-1 spezifische Reagenz zum
Nachweis von IRS-1 in einer Gewebeprobe ein Antikörper oder Fragment
davon ist und man die Gewebeprobe mit dem Antikörper oder einem
Fragment davon in Berührung bringt und sodann bestimmt, ob der Anti
körper oder das Fragment davon an die Gewebeprobe gebunden sind.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei der Antikörper ein monoklona
ler Antikörper oder ein Fragment davon ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Antikörper ein Mausantikörper,
ein humanisierter Antikörper oder ein menschlicher Antikörper ist, oder ein
Fragment davon.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei das Reagenz mit
Enzymen, fluoreszierenden Verbindungen, lumineszierenden Verbindun
gen, ferromagnetischen Sonden oder radioaktiven Verbindungen markiert
ist.
13. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Reagenz eine mit einer für IRS-1
codierenden Nukleinsäure hybridisierende Nukleinsäure ist.
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WO1992013083A1 (en) * | 1991-01-18 | 1992-08-06 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Nucleic acid encoding insulin receptor substrate-1 (irs-1), irs-1 protein, diseases, therapy associated with the metabolism of irs-1 |
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SUN, X.J., (u.a.), in: Nature, 1991, Bd. 352, S. 73-77 * |
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