DE19719344A1 - Arrangement for optical micromanipulation, analysis and processing of objects - Google Patents

Arrangement for optical micromanipulation, analysis and processing of objects

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DE19719344A1 DE19719344A DE19719344A DE19719344A1 DE 19719344 A1 DE19719344 A1 DE 19719344A1 DE 19719344 A DE19719344 A DE 19719344A DE 19719344 A DE19719344 A DE 19719344A DE 19719344 A1 DE19719344 A1 DE 19719344A1
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Abstract

the arrangement has only one laser system (1) used in the continuously emitting mode or in the pulsed mode with ultra short laser pulses in the nano-, pico- or femto-second range to produce a focussed beam of variable intensity in the spectral range from 400 to 1200 nm. A switching device (2) for the laser system can consist of an intracavity switching element or of an extracavity switching element.

Description

Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur optischen Mikromanipulation, Analyse und Bearbeitung von Objekten im Nanometer- und Mikrometerbereich (10-9-10-3 m), mittels fokussierter Strahlung im Spektralbereich von 400 nm bis 1200 nm eines Lasers. Ein solcher Laser arbeitet entweder im kontinuierlich emittierenden (cw) Modus oder im gepulsten Modus mit ultrakurzen Laserpulsen im Nanosekunden-, Pikosekunden- oder Femtosekundenbereich. Die Anordnung ist geeignet, Objekte durch optische Mikromanipulation an einen bestimmten Ort zu transportieren, durch nichtlineare Fluoreszenzanregung eine Analyse sowie lokalisierte Laserbearbeitungen vorzunehmen, wobei die Bearbeitungsprodukte mittels optischer Mikromanipulation abtransportiert werden können.The invention relates to an arrangement for optical micromanipulation, analysis and processing of objects in the nanometer and micrometer range (10 -9 -10 -3 m) by means of focused radiation in the spectral range from 400 nm to 1200 nm of a laser. Such a laser works either in the continuously emitting (cw) mode or in the pulsed mode with ultra-short laser pulses in the nanosecond, picosecond or femtosecond range. The arrangement is suitable for transporting objects to a specific location by optical micromanipulation, analysis and localized laser processing by nonlinear fluorescence excitation, the processing products being able to be transported away by means of optical micromanipulation.

Bisherige Anordnungen zur optischen Mikromanipulation beinhalten einen Laser im cw-Modus in Kombination mit einem Mikroskop. So wird für die optische Mikromanipulation von biologischen Objekten bevorzugt ein Laser im cw-Modus mit einer Emission im nahen infraroten (NIR) Spektralbereich eingesetzt. Geeignete Laser sind der Nd:YAG-Laser mit einer typischen Emission bei 1064 nm, der durchstimmbare cw-Ti:Saphir Laser mit einer typischen Emission im Bereich 700-1000 nm und der Diodenlaser mit einer typischen Emission im Bereich 670-1000 nm. Eine derartige Anordnung wird auch als Lichtfalle oder Laserpinzette bezeichnet. Anordnungen zur optischen Mikromanipulation sind bereits patentiert worden (US 4.887.721, US 4.893.886, US 5.212.382, US 5.308.976, US 5.363.190, US 5.512.745). Im US-PS 4.887.721 wird eine Zwei-Laser-Anordnung beschrieben, wobei ein Laser für die optische Mikromanipulation und ein zweiter für eine Analyse verwendet wird.Previous arrangements for optical micromanipulation include one Laser in cw mode in combination with a microscope. So for the optical micromanipulation of biological objects prefers a laser in cw mode with emission in the near infrared (NIR) spectral range used. Suitable lasers are the Nd: YAG laser with a typical one Emission at 1064 nm, the tunable cw-Ti: sapphire laser with a typical emission in the range 700-1000 nm and the diode laser with a typical emission in the range 670-1000 nm. Such an arrangement is also called light trap or laser tweezers. Instructions for Optical micromanipulation has already been patented (US 4,887,721,  US 4,893,886, US 5,212,382, US 5,308,976, US 5,363,190, US 5,512,745). US Pat. No. 4,887,721 describes a two-laser arrangement, wherein one laser for optical micromanipulation and a second for one Analysis is used.

Nichtlineare Fluoreszenzanregungen sowie die Freisetzung von Stoffen, die von photolabilen chemischen Käfigen eingeschlossen sind ("caged compounds"), in biologischen Systemen werden im allgemeinen mit Femtosekundenpulsen eines modensynchronisierten MR-Lasers (typischerweise ein gepulster Ti:Saphir Laser) durchgeführt. Durch simultane Absorption von zwei langwelligen Photonen (Zweiphotonen-Anregung) können so sichtbare Fluoreszenzen induziert werden, die sonst nur mit kurzwelliger Strahlung, z. B. im ultravioletten (UV) Bereich, hätten angeregt werden können. Diese Verfahren zur nichtlinearen Fluoreszenzdiagnostik und Stoffreisetzung mittels Laserpulsen im Femtosekundenbereich und im roten/NIR-Spektralbereich sind ebenfalls patentiert (US 5.034.613, EP 500.717) und z. B. in der Zeitschrift Science 248 (1990) S. 73-76 beschrieben worden. Eine Schädigung oder Bearbeitung zelleigener Strukturen bzw. von Biomolekülen ist dabei nicht vorgesehen. Im Gegenteil, destruktive Wirkungen in der Zelle bzw. am Biomolekül sollen vermieden werden. Die typischerweise verwendete mittlere Leistung liegt im Bereich < 10 mW. Für eine optische Mikromanipulation sind diese Leistungen oftmals zu gering. Eine Erhöhung der mittleren Leistung der gepulsten Laserstrahlung würde jedoch destruktive Wirkungen induzieren [König et al. J. Microscopy 183 (1996) S. 197-204]. Daher werden z. B. keine Femtosekundenpulse für eine optische Mikromanipulation eingesetzt. In dem europaischen Patent EP 706.671 wird ein Scanning-Mikroskop zur Analyse basierend auf der Zweiphotonen-angeregten Fluoreszenz beschrieben, das cw- oder gepulste Laserstrahlung mit Pulslängen im Pikosekundenbereich oder längere Pulslängen nutzt.Nonlinear fluorescence excitations as well as the release of substances that enclosed by photolabile chemical cages ("caged compounds "), in biological systems are generally associated with Femtosecond pulses from a mode-locked MR laser (typically a pulsed Ti: sapphire laser). Through simultaneous Absorption of two long-wave photons (two-photon excitation) visible fluorescence can be induced, which otherwise only with short-wave radiation, e.g. B. in the ultraviolet (UV) range, would have stimulated can be. These methods for nonlinear fluorescence diagnostics and substance release by means of laser pulses in the femtosecond range and in red / NIR spectral range are also patented (US 5.034.613, EP 500.717) and z. B. in Science 248 (1990) pp. 73-76 have been described. Damage to or processing of cells Structures or biomolecules are not provided. On the contrary, destructive effects in the cell or on the biomolecule should be avoided will. The average power typically used is in the range < 10 mW. These services are often used for optical micromanipulation too low. An increase in the average power of the pulsed However, laser radiation would induce destructive effects [König et al. J. Microscopy 183 (1996) pp. 197-204]. Therefore z. B. none Femtosecond pulses used for optical micromanipulation. By doing European patent EP 706.671 uses a scanning microscope for analysis based on the two-photon excited fluorescence  cw or pulsed laser radiation with pulse lengths in the picosecond range or uses longer pulse lengths.

Die Bearbeitung intrazellulärer Strukturen mittels Licht ist bereits von Tschachotin 1912 durchgeführt worden. Er bearbeitete einzelne Zellorganellen mittels fokussierter Strahlung einer konventionellen UV-Quelle (Lampe). Wesentlich bessere Fokussierungen konnten mit der Konstruktion des Lasers erreicht werden. So wurden z. B. 1965 durch Amy und Storb [Science 150 (1965) S. 756-757] und 1969 durch Berns et al. [Nature 221(1969) S. 74-75] über die Laser-induzierte Zerstörung einzelner Mitochondrien und Chromosomen berichtet. 1981 wurde in Science 213 (1981) S. 505-513 Laser-erzeugte Läsionen in Chromosomen, Organellen und Nervenzellen mittels eines Farbstoff-Lasers im Nanosekundenbereich und eines Nd:YAG-Lasers im Pikosekundenbereich vorgestellt. Diese Läsionen ermöglichten Rückschlüsse über die Funktionsweise der zellulären Areale. Im EP 182.320 wurde ein Verfahren zur Anbringung von Schnitten an biologischem Material mittels eines Eximer-Laser gepumpten Farbstofflasers vorgestellt, bei dem Beugungserscheinungen zur Herstellung von Schnitten genutzt werden. Im EP 52.409 werden ein Verfahren zur Fusion biologischer Zellen mittels gepulstem Laserstrahl der Pulsenergie 0,1-100 µJ beschrieben und Ausführungsbeispiele mittels gepulstem UV-Laser angegeben.The processing of intracellular structures using light is already off Tschachotin in 1912. He edited individual ones Cellular organelles using a conventional radiation UV source (lamp). With the Construction of the laser can be achieved. So z. B. 1965 by Amy and Storb [Science 150 (1965) pp. 756-757] and 1969 by Berns et al. [Nature 221 (1969) pp. 74-75] on the laser-induced destruction of individuals Mitochondria and chromosomes have been reported. 1981 was published in Science 213 (1981) pp. 505-513 Laser-generated lesions in chromosomes, organelles and nerve cells using a dye laser in the nanosecond range and an Nd: YAG laser in the picosecond range. This Lesions made it possible to draw conclusions about the functioning of the cellular Areas. EP 182.320 describes a method for making cuts of biological material pumped using an Eximer laser Dye laser presented in which diffraction phenomena to manufacture used by cuts. EP 52.409 describes a method for Fusion of biological cells using a pulsed laser beam of pulse energy 0.1-100 µJ described and embodiments using pulsed UV laser specified.

Die optische Mikromanipulation als auch die Laserbearbeitung kleiner Strukturen mittels einer Anordnung ist mehrfach beschrieben worden. Nachteil dieser Anordnung ist die Verwendung von zwei unterschiedlichen Lasern. So wird in den Publikationen Labor 2000 (1989) S. 36 und Nature 368 (1994) S. 667 von einem Lasermikroskop mit einem cw Nd:YAG Laser für die optische Mikromanipulation und einem weiteren 337 nm-Stickstoff-Laser für den mikrochirurgischen Einsatz berichtet. Im EP 679.325 wird eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Handhabung, Bearbeitung und Beobachtung mittels zweier Laser mit Emissionen in einem unterschiedlichen Spektralbereich beschrieben. Im US 5.393.957 sind eine Anordnung für eine Mikrobearbeitung mit einem Laser und eine optische Manipulation mit einem weiteren Laser, insbesondere von Mikrokapseln, beschrieben. Eine Zwei- Laser-Anordnung zur Mikromanipulation und zum Auslösen von Photoreaktionen ist im US 5.308.976 veröffentlicht.The optical micromanipulation as well as the laser processing smaller Structures by means of an arrangement have been described several times. The disadvantage of this arrangement is the use of two different ones Lasers. The publications Labor 2000 (1989) p. 36 and Nature 368 (1994) p. 667 from a laser microscope with a cw Nd: YAG laser for optical micromanipulation and another 337 nm nitrogen laser reported for microsurgical use. In EP 679.325 a  Device and a method for handling, processing and Observation using two lasers with emissions in a different one Spectral range described. In US 5,393,957 an arrangement for a Micromachining with a laser and optical manipulation with a other lasers, in particular microcapsules. A two- Laser arrangement for micromanipulation and for triggering Photoreactions is published in US 5,308,976.

Nachteil dieser Anordnungen ist der hohe Aufwand in der Verwendung unterschiedlicher Laser für die Bearbeitung und die optische Mikromanipulation. Neben komplizierten unterschiedlichen Strahlführungssystemen und getrennten Bedienelementen für die Anwendungen, werden darüber hinaus im allgemeinen Laser unterschiedlicher Emissionswellenlänge eingesetzt. Dies hat den weiteren Nachteil unterschiedlicher Strahlverläufe im Mikroskop infolge chromatischer Abberation und der Verwendung aufwendiger dichroitischer Optiken.The disadvantage of these arrangements is the high expenditure in use different lasers for processing and optical Micromanipulation. In addition to complicated different Beam guidance systems and separate controls for the Applications, moreover, are generally lasers different emission wavelength used. This has the other Disadvantage of different beam paths in the microscope as a result chromatic aberration and the use of complex dichroic Optics.

Es ist Aufgabe der Erfindung, bei einer Anordnung zur Bearbeitung, Analyse und optischen Mikromanipulation von Objekten im Nanometer- und Mikrometerbereich mittels fokussierter Laserstrahlung den Aufwand zur Erzeugung der Laserstrahlung sowie den Aufwand für den optischen Strahlengang wesentlich zu verringern.It is an object of the invention in an arrangement for processing, analysis and optical micromanipulation of objects in the nanometer and Micrometer range by means of focused laser radiation Generation of the laser radiation and the effort for the optical Significantly reduce the beam path.

Erfindungsgemäß wird zur Bearbeitung, Analyse und optischen Mikromanipulation nur ein einziges Lasersystem eingesetzt, dessen fokussierte und in der Intensität variierbare Strahlung im Spektralbereich 400 nm bis 1200 nm wahlweise in den kontinuierlich emittierenden (cw) Modus oder in den gepulsten Modus mit ultrakurzen Laserpulsen im Nano-, Piko- oder Femtosekundenbereich umgeschaltet wird. Je nach Anwendung der Laserstrahlung (Bearbeitung, Analyse bzw. optischen Mikro­ manipulation) wird das Lasersystem unter Beibehaltung des Strahlengangs im Mikroskop entweder in den cw-Modus oder in den Pulsbetrieb umgeschaltet.According to the invention for processing, analysis and optical Micromanipulation uses only a single laser system, the focused and variable radiation in the spectral range 400 nm to 1200 nm optionally in the continuously emitting (cw) Mode or in the pulsed mode with ultra-short laser pulses in nano,  Pico or femtosecond range is switched. Depending on the application laser radiation (processing, analysis or optical micro manipulation) the laser system while maintaining the beam path in the microscope either in cw mode or in pulse mode switched.

Das Schaltelement dient dabei der Unterbrechung der Modensynchronisation (Modenkopplung) im gepulsten Lasersystem und der Transformation in ein Lasersystem im cw-Modus bzw. die Überführung eines Lasersystems im cw-Modus in ein gepulstes System mit ultrakurzen Pulsen. Im cw-Modus operieren die einzelnen longitudinalen Moden des Lasersystems unabhängig, während bei einem Lasersystem im Puls-Modus die einzelnen Moden durch eine feste Phasenkopplung "synchronisiert" vorliegen.The switching element serves to interrupt the mode synchronization (Mode coupling) in the pulsed laser system and the transformation into one Laser system in cw mode or the transfer of a laser system in cw mode in a pulsed system with ultra-short pulses. In cw mode the individual longitudinal modes of the laser system operate independently, while in a laser system in pulse mode, the individual modes there is a fixed phase coupling "synchronized".

Das Schaltelement kann die relativ geringe spektrale Bandbreite der cw-Laserstrahlung (typischerweise kleiner oder gleich 1 nm) im Vergleich zur Femtosekundenstrahlung (z. B. spektrale Bandbreite eines 50 fs Pulses ≈ 20 nm) für seine Wirkungsweise ausnutzen. So kann das Schaltelement z. B. ein intracavity wellenlängenselektives Element darstellen, z. B. ein Etalon, Lyot-Filter, Absorptions- oder Interferenzfilter, ein AOTF ("acousto­ optical tunable filter"), eine absorbierende Flüssigkeit oder Gas, ein schaltbares Flüssigkeitskristallfilter, eine Prismen- oder Gitteranordnung oder eine mechanische Vorrichtung (z. B. Blende, Schlitz) zur räumlichen Abtrennung bzw. Hinzufügen von Spektralanteilen (z. B. durch Veränderung der Schlitzbreite).The switching element can use the relatively narrow spectral bandwidth cw laser radiation (typically less than or equal to 1 nm) compared to Femtosecond radiation (e.g. spectral bandwidth of a 50 fs pulse ≈ 20 nm) for its mode of action. So the switching element e.g. B. represent an intracavity wavelength selective element, e.g. B. a Etalon, Lyot filter, absorption or interference filter, an AOTF ("acousto optical tunable filter "), an absorbent liquid or gas switchable liquid crystal filter, a prism or grid arrangement or a mechanical device (e.g. aperture, slot) for spatial Separation or addition of spectral components (e.g. by changing the slot width).

Das Schaltelement kann auch auf dem Prinzip der Störung bzw. Wiederherstellung der Modensynchronisation basieren. So kann ein die Amplitude oder die Frequenz modulierendes intracavity Element (z. B. Chopper; akustooptischer Modulator bei zwei verschiedenen Frequenzen, wobei eine Frequenz entsprechend der Pulsfolgefrequenz/Resonatorlänge gewählt wurde), ein die Resonatorlänge veränderndes Element oder ein mechanisches Element (z. B. ein Schlitz) zur Beeinflussung unterschiedlicher Verluste von cw- und gepulster Strahlung im Resonator, z. B. unter Ausnutzung der Strahl-Selbstfokussierung auf der Basis des optischen Kerr-Effektes, verwendet werden. Als Schaltelement kann auch ein extracavity- Element verwendet werden, welches über einen Feedback-Mechanismus mit dem Resonator gezielt die Modensynchronisation bei Einbringen in den Strahlengang aufheben bzw. bei Entfernen wieder herstellen kann. Solch eine Beeinflussung der Modensynchronisation kann im einfachsten Fall durch das geeignete Einbringen/Entfernen eines planen Glasplättchens in den extracavity-Strahlengang realisiert werden, wobei der feedback- Mechanismus durch die geeignete Reflexion des Strahls am Glasplättchen gegeben ist. Eine Beeinflussung der Modensynchronisation kann auch durch geeignete Modulation des Pumplasers erfolgen.The switching element can also be based on the principle of the fault or Restore mode synchronization based. So one can Amplitude or frequency modulating intracavity element (e.g. Chopper; acousto-optical modulator at two different frequencies, where a frequency corresponding to the pulse repetition frequency / resonator length  ), an element that changes the resonator length or a mechanical element (e.g. a slot) to influence different Losses of cw and pulsed radiation in the resonator, e.g. More colorful Exploitation of beam self-focusing on the basis of the optical Kerr effect. An extracavity- Element that is used with a feedback mechanism the resonator specifically the mode synchronization when introduced into the Can cancel the beam path or restore it when removed. Such a In the simplest case, the mode synchronization can be influenced by the Appropriate insertion / removal of a flat glass plate in the extracavity beam path can be realized, the feedback Mechanism through the appropriate reflection of the beam on the glass plate given is. The mode synchronization can also be influenced by suitable modulation of the pump laser.

Die Strahlung eines modensynchronisierten Lasersystems mit ultrakurzen Pulsen kann auch cw-Anteile enthalten, die unter anderem von der Leistung des Pumplasers abhängen. Die Modensynchronisation eines Lasersystems kann somit bei bestimmten Pumplaser-Leistungen verhindert werden. Insofern kann das Schaltelement auch eine Variation der Pumplaserleistung bewirken.The radiation of a mode-locked laser system with ultra-short Pulses can also contain cw shares, which depend on performance, among other things depend on the pump laser. The mode synchronization of a laser system can thus be prevented with certain pump laser outputs. In this respect, the switching element can also vary the pump laser power cause.

Das Schaltelement kann für die Realisierung des Schaltvorgangs dabei mechanisch in den Strahlengang eingefügt oder herausgenommen werden oder ein elektrooptisches Schaltelement darstellen.The switching element can be used to implement the switching process mechanically inserted or removed in the beam path or represent an electro-optical switching element.

Für die Umschaltung vom cw-Modus in den gepulsten Modus kann das schnelle Erreichen des stabilen modensynchronisierten Zustandes durch eine geeignete Modulation mit einer durch die Pulsfolgefrequenz bzw. durch die Resonatorlänge bestimmten Frequenz, z. B. mit einem akusto-optischen Modulator oder mittels mechanischer Schwingungen, erfolgen.This can be used to switch from cw mode to pulsed mode rapid reaching of the stable mode-synchronized state by a suitable modulation with a by the pulse repetition frequency or by the Resonator length certain frequency, z. B. with an acousto-optical Modulator or by means of mechanical vibrations.

Die Erfindung soll nachstehend anhand von drei Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.The invention is intended to be described in the following on the basis of three exemplary embodiments are explained in more detail.

In der Zeichnung ist eine Prinzipanordnung mit einem schaltbaren intracavity-doppelbrechenden Flüssigkeitskristallfilter als Schaltelement dargestellt.In the drawing is a basic arrangement with a switchable intracavity birefringent liquid crystal filter as a switching element shown.

Ein cw-Argonionen-Laser gepumpter, gepulster modensynchronisierter Titan:Saphir Laser 1 mit einer Ausgangs-Pulsfolgefrequenz von 80 MHz, einer Ausgangs-Pulsdauer von 100 fs, einer mittleren Ausgangsleistung von 1,5 W und einer Wellenlänge von 800 nm dient als Anregungsquelle für die nichtlineare Fluoreszenzanalyse und die Bearbeitung von Partikeln im Mikrometerbereich. Ein Schaltelement in Form eines im µs-Bereich schaltbaren intracavity-doppelbrechenden Flüssigkeitskristallfilters 2 erlaubt den schnellen Wechsel in den cw-Modus für die optische Mikromanipulation. Die Ausgangsstrahlung des Lasers 1 wird über einen 1 : 4 Strahlaufweiter 3 und einen Strahlabschwächer 4 in den externen Port eines inversen Laser- Scanning-Mikroskops 5 eingekoppelt sowie mit einem Objektiv 6 hoher numerischer Apertur (100×, NA = 1.3, Öl-Immersion) auf eine Probe 7 nahezu beugungsbegrenzt fokussiert. Die zu analysierenden und zu bearbeitenden Probenareale werden mit einem fluoreszierenden Farbstoff mit hohem molekularen Zweiphotonenabsorptionskoeffizienten im NIR-Bereich markiert. Zunächst wird mit dem cw-Laserstrahl von 100 mW Leistung (Flüssigkeitskristallfilter "an") die Probe 7 durch eine Videokamera 8 kontrolliert (als Beleuchtungsquelle dient eine Halogenlampe 9) und mittels optischer Mikromanipulation an den gewünschten Ort transportiert. Anschließend wird der Laser 1 in den Femtosekunden-Modus geschaltet (Flüssigkeits-kristallfilter "aus"), wobei mittels einer elektrischen Steuerung 10 simultan der Laserstrahl auf eine mittlere Leistung von 2 mW an der Probe 7 abgeschwächt wird. Mittels Zweiphotonen-Fluoreszenzanregung wird im Scanning-Mode das zu bearbeitende Probenareal zunächst mit einem abgeschwächten Laserstrahl und den Mikroskop-internen Fluoreszenz­ detektor 11 analysiert. Anschließend wird der Laserstrahl mittels einer Scanningeinheit 12 und einem motorisierten Probentisch 13 auf das zu bearbeitende Areal der Probe 7 für eine Punkt-Bestrahlung (Scanning-Spiegel fixiert) eingestellt. Die Bestrahlungsdauer wird mit der Mikroskop-eigenen Software festgelegt. Die Bearbeitung erfolgt mit dem ungeschwächten Laserstrahl hoher Pulsleistung. Nach dem erneuten Wechsel in den cw-Modus (Flüssigkeitskristallfilter "an") werden die Bearbeitungsprodukte mittels optischer Mikromanipulation abtransportiert.A cw argon ion laser pumped, pulsed mode-synchronized titanium: Sapphire Laser 1 with an output pulse repetition frequency of 80 MHz, an output pulse duration of 100 fs, an average output power of 1.5 W and a wavelength of 800 nm serves as an excitation source for the non-linear fluorescence analysis and the processing of particles in the micrometer range. A switching element in the form of an intracavity birefringent liquid crystal filter 2 which can be switched in the microsecond range enables the rapid changeover to the cw mode for optical micromanipulation. The output radiation of the laser 1 is coupled into the external port of an inverse laser scanning microscope 5 via a 1: 4 beam expander 3 and a beam attenuator 4 and with a lens 6 having a high numerical aperture (100 ×, NA = 1.3, oil immersion) focused on a sample 7 almost diffraction limited. The sample areas to be analyzed and processed are marked with a fluorescent dye with a high molecular two-photon absorption coefficient in the NIR range. First, with the cw laser beam of 100 mW power (liquid crystal filter "on"), the sample 7 is checked by a video camera 8 (a halogen lamp 9 is used as the illumination source) and transported to the desired location by means of optical micromanipulation. The laser 1 is then switched to the femtosecond mode (liquid crystal filter "off"), the laser beam being simultaneously attenuated to an average power of 2 mW on the sample 7 by means of an electrical control 10 . By means of two-photon fluorescence excitation, the sample area to be processed is first analyzed in the scanning mode with an attenuated laser beam and the microscope-internal fluorescence detector 11 . The laser beam is then adjusted by means of a scanning unit 12 and a motorized sample table 13 to the area of the sample 7 to be processed for a point irradiation (scanning mirror fixed). The irradiation time is determined with the microscope's own software. The processing takes place with the unattenuated laser beam with high pulse power. After changing back to the cw mode (liquid crystal filter "on"), the processing products are removed by means of optical micromanipulation.

Als zweites Ausführungsbeispiel ist prinzipiell der gleiche in der Zeichnung dargestellte Prinzipaufbau vorgesehen, mit dem Unterschied, daß der Ti:Saphir Laser 1 bereits intern einen nicht dargestellten akustooptischen Modulator (AOM) einer Betriebsfrequenz f1 entsprechend der Pulsfolgefrequenz bzw. entsprechend der Resonatorlänge des Lasers 1 für die Realisierung der Modensynchronisation enthält. Dieser AOM dient als Schaltelement derart, daß durch Wechsel auf eine zweite Betriebsfrequenz f2 die Modensynchronisation gestört wird. Eine Umschaltung auf die Betriebsfrequenz f1 bewirkt wiederum den Laserbetrieb im gepulsten Modus. Das Schaltelement Flüssigkeitskristallfilter 2 vom ersten Ausführungs­ beispiel in der Zeichnung entfällt.In principle, the same basic structure shown in the drawing is provided as the second exemplary embodiment, with the difference that the Ti: sapphire laser 1 already internally has an acousto-optical modulator (AOM), not shown, of an operating frequency f 1 corresponding to the pulse repetition frequency or the resonator length of the laser 1 contains for the implementation of mode synchronization. This AOM serves as a switching element such that the mode synchronization is disturbed by changing to a second operating frequency f 2 . Switching to the operating frequency f 1 in turn causes laser operation in the pulsed mode. The switching element liquid crystal filter 2 from the first embodiment example in the drawing is omitted.

Als drittes Ausführungsbeispiel ist prinzipiell wiederum der in der Zeichnung dargestellte Prinzipaufbau des ersten Ausführungsbeispiels vorgesehen, mit dem Unterschied, daß als Schaltelement ein nicht gezeigtes mechanisch in den intracavity-Strahlengang ein- und ausführbares Absorptionsfilter vorgesehen ist. Auch hier entfällt das in der Zeichnung dargestellte Flüssigkeitskristallfilter 2 vom ersten Ausführungsbeispiel. As a third exemplary embodiment, the basic structure of the first exemplary embodiment shown in the drawing is again provided, with the difference that an absorption filter (not shown) that can be mechanically inserted and executed in the intracavity beam path is provided as the switching element. Here too, the liquid crystal filter 2 from the first exemplary embodiment shown in the drawing is omitted.

BezugszeichenlisteReference list

11

Laser
laser

22nd

Flüssigkeitskristallfilter
Liquid crystal filter

33rd

Strahlaufweiter
Beam expander

44th

Strahlabschwächer
Beam attenuator

55

Laser-Scanning-Mikroskop
Laser scanning microscope

66

Objektiv
lens

77

Probe
sample

88th

Videokamera
Video camera

99

Halogenlampe
Halogen lamp

1010th

elektrische Steuerung
electrical control

1111

Fluoreszenzdetektor
Fluorescence detector

1212th

Scanningeinheit
Scanning unit

1313

Probentisch
f1 Rehearsal table
f 1

, f2 , f 2

Betriebsfrequenz
Operating frequency

Claims (17)

1. Anordnung zur optischen Mikromanipulation, Analyse und Bearbeitung von Objekten im Nanometer- und Mikrometerbereich mit einem Lasersystem, dadurch gekennzeichnet, daß nur ein einziges Lasersystem (1) eingesetzt wird und daß Mittel (2) vorgesehen sind, welche das Lasersystem (1) mit seiner fokussierten und in der Intensität variierbaren Strahlung im Spektralbereich 400 nm bis 1200 nm je nach Verwendung der Laserstrahlung wahlweise in den kontinuierlich emittierenden (cw) Modus oder in den gepulsten Modus mit ultrakurzen Laserpulsen im Nano-, Piko- oder Femtosekundenbereich umschalten.1. Arrangement for optical micromanipulation, analysis and processing of objects in the nanometer and micrometer range with a laser system, characterized in that only a single laser system ( 1 ) is used and that means ( 2 ) are provided which the laser system ( 1 ) with switch its focused and variable-intensity radiation in the spectral range 400 nm to 1200 nm depending on the use of the laser radiation either in the continuously emitting (cw) mode or in the pulsed mode with ultra-short laser pulses in the nano, pico or femtosecond range. 2. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel durch ein intracavity Schaltelement realisiert werden.2. Arrangement according to claim 1, characterized in that the means can be realized by an intracavity switching element. 3. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel durch ein extracavity Schaltelement realisiert werden.3. Arrangement according to claim 1, characterized in that the means can be realized by an extracavity switching element. 4. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel aus einem Schaltelement zur Änderung der spektralen Bandbreite des Lasersystems (1) bestehen.4. Arrangement according to claim 1, characterized in that the means consist of a switching element for changing the spectral bandwidth of the laser system ( 1 ). 5. Anordnung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Schaltelement zur Änderung der spektralen Bandbreite des Lasersystems (1) auf an sich bekannten doppelbrechenden Flüssigkeitsfiltern (2) beruht. 5. Arrangement according to claim 4, characterized in that the switching element for changing the spectral bandwidth of the laser system ( 1 ) is based on known birefringent liquid filters ( 2 ). 6. Anordnung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Schaltelement zur Änderung der spektralen Bandbreite des Lasersystems (1) auf an sich bekannten Interferenz- bzw. Absorptionsfiltern beruht.6. Arrangement according to claim 4, characterized in that the switching element for changing the spectral bandwidth of the laser system ( 1 ) is based on known interference or absorption filters. 7. Anordnung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Schaltelement zur Änderung der spektralen Bandbreite des Lasersystems (1) auf an sich bekannten absorbierenden Flüssigkeiten oder Gasen beruht.7. Arrangement according to claim 4, characterized in that the switching element for changing the spectral bandwidth of the laser system ( 1 ) is based on absorbing liquids or gases known per se. 8. Anordnung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Schaltelement zur Änderung der spektralen Bandbreite des Lasersystems (1) auf an sich bekannten optischen Filtern, z. B. Lyotfiltern, auf interferometrischen Anordnungen, auf AOTF-Elementen ("acousto-optical tunable filter") bzw. auf Prismen- und Gitteranordnungen beruht.8. Arrangement according to claim 4, characterized in that the switching element for changing the spectral bandwidth of the laser system ( 1 ) on optical filters known per se, for. B. Lyot filters, based on interferometric arrangements, on AOTF elements ("acousto-optical tunable filter") or on prism and grating arrangements. 9. Anordnung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Schaltelement zur Änderung der spektralen Bandbreite des Lasersystems (1) auf an sich bekannten mechanischen Anordnungen zur räumlichen Beeinflussung von Spektralanteilen, wie z. B. Lochblenden und Spalte, beruht.9. Arrangement according to claim 4, characterized in that the switching element for changing the spectral bandwidth of the laser system ( 1 ) on known mechanical arrangements for spatially influencing spectral components, such as. B. pinhole and column based. 10. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel aus einem Schaltelement zur Beeinflussung der Modensynchronisation bestehen.10. The arrangement according to claim 1, characterized in that the means a switching element to influence the mode synchronization. 11. Anordnung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Schaltelement zur Beeinflussung der Modensynchronisation auf Elementen zur Variation der Resonatorlänge beruht. 11. The arrangement according to claim 10, characterized in that the Switching element for influencing mode synchronization on elements to vary the resonator length.   12. Anordnung nach Ansprüchen 3 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Schaltelement zur Beeinflussung der Modensynchronisation aus einem extracavity-Element mit Rückkopplungsmechanismus besteht.12. Arrangement according to claims 3 and 10, characterized in that the Switching element for influencing mode synchronization from one extracavity element with a feedback mechanism. 13. Anordnung nach Ansprüchen 2 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Schaltelement zur Beeinflussung der Modensynchronisation aus einem intracavity Modulator, z. B. aus einem akustooptischen Modulator, besteht.13. Arrangement according to claims 2 and 10, characterized in that the Switching element for influencing mode synchronization from one intracavity modulator, e.g. B. consists of an acousto-optical modulator. 14. Anordnung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Schaltelement zur Beeinflussung der Modensynchronisation aus einem Modulator für den Pumplaser des Lasersystems (1) besteht.14. Arrangement according to claim 10, characterized in that the switching element for influencing the mode synchronization consists of a modulator for the pump laser of the laser system ( 1 ). 15. Anordnung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel aus an sich bekannten Elementen zur Veränderung der Pumplaserleistung des Lasersystems (1) bestehen.15. The arrangement according to claim 1, characterized in that the means consist of known elements for changing the pump laser power of the laser system ( 1 ). 16. Anordnung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel aus einem elektrooptischen Schalter bestehen.16. The arrangement according to claim 1, characterized in that the means an electro-optical switch. 17. Anordnung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zum Zweck ihrer Einführung und Entfernung in den bzw. aus dem Strahlengang des Lasersystems (1) bewegbar angeordnet sind.17. The arrangement according to claim 1, characterized in that the means for the purpose of their introduction and removal in or out of the beam path of the laser system ( 1 ) are arranged movably.
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