DE19719344A1 - Anordnung zur optischen Mikromanipulation, Analyse und Bearbeitung von Objekten - Google Patents

Anordnung zur optischen Mikromanipulation, Analyse und Bearbeitung von Objekten

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Description

Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur optischen Mikromanipulation, Analyse und Bearbeitung von Objekten im Nanometer- und Mikrometerbereich (10-9-10-3 m), mittels fokussierter Strahlung im Spektralbereich von 400 nm bis 1200 nm eines Lasers. Ein solcher Laser arbeitet entweder im kontinuierlich emittierenden (cw) Modus oder im gepulsten Modus mit ultrakurzen Laserpulsen im Nanosekunden-, Pikosekunden- oder Femtosekundenbereich. Die Anordnung ist geeignet, Objekte durch optische Mikromanipulation an einen bestimmten Ort zu transportieren, durch nichtlineare Fluoreszenzanregung eine Analyse sowie lokalisierte Laserbearbeitungen vorzunehmen, wobei die Bearbeitungsprodukte mittels optischer Mikromanipulation abtransportiert werden können.
Bisherige Anordnungen zur optischen Mikromanipulation beinhalten einen Laser im cw-Modus in Kombination mit einem Mikroskop. So wird für die optische Mikromanipulation von biologischen Objekten bevorzugt ein Laser im cw-Modus mit einer Emission im nahen infraroten (NIR) Spektralbereich eingesetzt. Geeignete Laser sind der Nd:YAG-Laser mit einer typischen Emission bei 1064 nm, der durchstimmbare cw-Ti:Saphir Laser mit einer typischen Emission im Bereich 700-1000 nm und der Diodenlaser mit einer typischen Emission im Bereich 670-1000 nm. Eine derartige Anordnung wird auch als Lichtfalle oder Laserpinzette bezeichnet. Anordnungen zur optischen Mikromanipulation sind bereits patentiert worden (US 4.887.721, US 4.893.886, US 5.212.382, US 5.308.976, US 5.363.190, US 5.512.745). Im US-PS 4.887.721 wird eine Zwei-Laser-Anordnung beschrieben, wobei ein Laser für die optische Mikromanipulation und ein zweiter für eine Analyse verwendet wird.
Nichtlineare Fluoreszenzanregungen sowie die Freisetzung von Stoffen, die von photolabilen chemischen Käfigen eingeschlossen sind ("caged compounds"), in biologischen Systemen werden im allgemeinen mit Femtosekundenpulsen eines modensynchronisierten MR-Lasers (typischerweise ein gepulster Ti:Saphir Laser) durchgeführt. Durch simultane Absorption von zwei langwelligen Photonen (Zweiphotonen-Anregung) können so sichtbare Fluoreszenzen induziert werden, die sonst nur mit kurzwelliger Strahlung, z. B. im ultravioletten (UV) Bereich, hätten angeregt werden können. Diese Verfahren zur nichtlinearen Fluoreszenzdiagnostik und Stoffreisetzung mittels Laserpulsen im Femtosekundenbereich und im roten/NIR-Spektralbereich sind ebenfalls patentiert (US 5.034.613, EP 500.717) und z. B. in der Zeitschrift Science 248 (1990) S. 73-76 beschrieben worden. Eine Schädigung oder Bearbeitung zelleigener Strukturen bzw. von Biomolekülen ist dabei nicht vorgesehen. Im Gegenteil, destruktive Wirkungen in der Zelle bzw. am Biomolekül sollen vermieden werden. Die typischerweise verwendete mittlere Leistung liegt im Bereich < 10 mW. Für eine optische Mikromanipulation sind diese Leistungen oftmals zu gering. Eine Erhöhung der mittleren Leistung der gepulsten Laserstrahlung würde jedoch destruktive Wirkungen induzieren [König et al. J. Microscopy 183 (1996) S. 197-204]. Daher werden z. B. keine Femtosekundenpulse für eine optische Mikromanipulation eingesetzt. In dem europaischen Patent EP 706.671 wird ein Scanning-Mikroskop zur Analyse basierend auf der Zweiphotonen-angeregten Fluoreszenz beschrieben, das cw- oder gepulste Laserstrahlung mit Pulslängen im Pikosekundenbereich oder längere Pulslängen nutzt.
Die Bearbeitung intrazellulärer Strukturen mittels Licht ist bereits von Tschachotin 1912 durchgeführt worden. Er bearbeitete einzelne Zellorganellen mittels fokussierter Strahlung einer konventionellen UV-Quelle (Lampe). Wesentlich bessere Fokussierungen konnten mit der Konstruktion des Lasers erreicht werden. So wurden z. B. 1965 durch Amy und Storb [Science 150 (1965) S. 756-757] und 1969 durch Berns et al. [Nature 221(1969) S. 74-75] über die Laser-induzierte Zerstörung einzelner Mitochondrien und Chromosomen berichtet. 1981 wurde in Science 213 (1981) S. 505-513 Laser-erzeugte Läsionen in Chromosomen, Organellen und Nervenzellen mittels eines Farbstoff-Lasers im Nanosekundenbereich und eines Nd:YAG-Lasers im Pikosekundenbereich vorgestellt. Diese Läsionen ermöglichten Rückschlüsse über die Funktionsweise der zellulären Areale. Im EP 182.320 wurde ein Verfahren zur Anbringung von Schnitten an biologischem Material mittels eines Eximer-Laser gepumpten Farbstofflasers vorgestellt, bei dem Beugungserscheinungen zur Herstellung von Schnitten genutzt werden. Im EP 52.409 werden ein Verfahren zur Fusion biologischer Zellen mittels gepulstem Laserstrahl der Pulsenergie 0,1-100 µJ beschrieben und Ausführungsbeispiele mittels gepulstem UV-Laser angegeben.
Die optische Mikromanipulation als auch die Laserbearbeitung kleiner Strukturen mittels einer Anordnung ist mehrfach beschrieben worden. Nachteil dieser Anordnung ist die Verwendung von zwei unterschiedlichen Lasern. So wird in den Publikationen Labor 2000 (1989) S. 36 und Nature 368 (1994) S. 667 von einem Lasermikroskop mit einem cw Nd:YAG Laser für die optische Mikromanipulation und einem weiteren 337 nm-Stickstoff-Laser für den mikrochirurgischen Einsatz berichtet. Im EP 679.325 wird eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Handhabung, Bearbeitung und Beobachtung mittels zweier Laser mit Emissionen in einem unterschiedlichen Spektralbereich beschrieben. Im US 5.393.957 sind eine Anordnung für eine Mikrobearbeitung mit einem Laser und eine optische Manipulation mit einem weiteren Laser, insbesondere von Mikrokapseln, beschrieben. Eine Zwei- Laser-Anordnung zur Mikromanipulation und zum Auslösen von Photoreaktionen ist im US 5.308.976 veröffentlicht.
Nachteil dieser Anordnungen ist der hohe Aufwand in der Verwendung unterschiedlicher Laser für die Bearbeitung und die optische Mikromanipulation. Neben komplizierten unterschiedlichen Strahlführungssystemen und getrennten Bedienelementen für die Anwendungen, werden darüber hinaus im allgemeinen Laser unterschiedlicher Emissionswellenlänge eingesetzt. Dies hat den weiteren Nachteil unterschiedlicher Strahlverläufe im Mikroskop infolge chromatischer Abberation und der Verwendung aufwendiger dichroitischer Optiken.
Es ist Aufgabe der Erfindung, bei einer Anordnung zur Bearbeitung, Analyse und optischen Mikromanipulation von Objekten im Nanometer- und Mikrometerbereich mittels fokussierter Laserstrahlung den Aufwand zur Erzeugung der Laserstrahlung sowie den Aufwand für den optischen Strahlengang wesentlich zu verringern.
Erfindungsgemäß wird zur Bearbeitung, Analyse und optischen Mikromanipulation nur ein einziges Lasersystem eingesetzt, dessen fokussierte und in der Intensität variierbare Strahlung im Spektralbereich 400 nm bis 1200 nm wahlweise in den kontinuierlich emittierenden (cw) Modus oder in den gepulsten Modus mit ultrakurzen Laserpulsen im Nano-, Piko- oder Femtosekundenbereich umgeschaltet wird. Je nach Anwendung der Laserstrahlung (Bearbeitung, Analyse bzw. optischen Mikro­ manipulation) wird das Lasersystem unter Beibehaltung des Strahlengangs im Mikroskop entweder in den cw-Modus oder in den Pulsbetrieb umgeschaltet.
Das Schaltelement dient dabei der Unterbrechung der Modensynchronisation (Modenkopplung) im gepulsten Lasersystem und der Transformation in ein Lasersystem im cw-Modus bzw. die Überführung eines Lasersystems im cw-Modus in ein gepulstes System mit ultrakurzen Pulsen. Im cw-Modus operieren die einzelnen longitudinalen Moden des Lasersystems unabhängig, während bei einem Lasersystem im Puls-Modus die einzelnen Moden durch eine feste Phasenkopplung "synchronisiert" vorliegen.
Das Schaltelement kann die relativ geringe spektrale Bandbreite der cw-Laserstrahlung (typischerweise kleiner oder gleich 1 nm) im Vergleich zur Femtosekundenstrahlung (z. B. spektrale Bandbreite eines 50 fs Pulses ≈ 20 nm) für seine Wirkungsweise ausnutzen. So kann das Schaltelement z. B. ein intracavity wellenlängenselektives Element darstellen, z. B. ein Etalon, Lyot-Filter, Absorptions- oder Interferenzfilter, ein AOTF ("acousto­ optical tunable filter"), eine absorbierende Flüssigkeit oder Gas, ein schaltbares Flüssigkeitskristallfilter, eine Prismen- oder Gitteranordnung oder eine mechanische Vorrichtung (z. B. Blende, Schlitz) zur räumlichen Abtrennung bzw. Hinzufügen von Spektralanteilen (z. B. durch Veränderung der Schlitzbreite).
Das Schaltelement kann auch auf dem Prinzip der Störung bzw. Wiederherstellung der Modensynchronisation basieren. So kann ein die Amplitude oder die Frequenz modulierendes intracavity Element (z. B. Chopper; akustooptischer Modulator bei zwei verschiedenen Frequenzen, wobei eine Frequenz entsprechend der Pulsfolgefrequenz/Resonatorlänge gewählt wurde), ein die Resonatorlänge veränderndes Element oder ein mechanisches Element (z. B. ein Schlitz) zur Beeinflussung unterschiedlicher Verluste von cw- und gepulster Strahlung im Resonator, z. B. unter Ausnutzung der Strahl-Selbstfokussierung auf der Basis des optischen Kerr-Effektes, verwendet werden. Als Schaltelement kann auch ein extracavity- Element verwendet werden, welches über einen Feedback-Mechanismus mit dem Resonator gezielt die Modensynchronisation bei Einbringen in den Strahlengang aufheben bzw. bei Entfernen wieder herstellen kann. Solch eine Beeinflussung der Modensynchronisation kann im einfachsten Fall durch das geeignete Einbringen/Entfernen eines planen Glasplättchens in den extracavity-Strahlengang realisiert werden, wobei der feedback- Mechanismus durch die geeignete Reflexion des Strahls am Glasplättchen gegeben ist. Eine Beeinflussung der Modensynchronisation kann auch durch geeignete Modulation des Pumplasers erfolgen.
Die Strahlung eines modensynchronisierten Lasersystems mit ultrakurzen Pulsen kann auch cw-Anteile enthalten, die unter anderem von der Leistung des Pumplasers abhängen. Die Modensynchronisation eines Lasersystems kann somit bei bestimmten Pumplaser-Leistungen verhindert werden. Insofern kann das Schaltelement auch eine Variation der Pumplaserleistung bewirken.
Das Schaltelement kann für die Realisierung des Schaltvorgangs dabei mechanisch in den Strahlengang eingefügt oder herausgenommen werden oder ein elektrooptisches Schaltelement darstellen.
Für die Umschaltung vom cw-Modus in den gepulsten Modus kann das schnelle Erreichen des stabilen modensynchronisierten Zustandes durch eine geeignete Modulation mit einer durch die Pulsfolgefrequenz bzw. durch die Resonatorlänge bestimmten Frequenz, z. B. mit einem akusto-optischen Modulator oder mittels mechanischer Schwingungen, erfolgen.
Die Erfindung soll nachstehend anhand von drei Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
In der Zeichnung ist eine Prinzipanordnung mit einem schaltbaren intracavity-doppelbrechenden Flüssigkeitskristallfilter als Schaltelement dargestellt.
Ein cw-Argonionen-Laser gepumpter, gepulster modensynchronisierter Titan:Saphir Laser 1 mit einer Ausgangs-Pulsfolgefrequenz von 80 MHz, einer Ausgangs-Pulsdauer von 100 fs, einer mittleren Ausgangsleistung von 1,5 W und einer Wellenlänge von 800 nm dient als Anregungsquelle für die nichtlineare Fluoreszenzanalyse und die Bearbeitung von Partikeln im Mikrometerbereich. Ein Schaltelement in Form eines im µs-Bereich schaltbaren intracavity-doppelbrechenden Flüssigkeitskristallfilters 2 erlaubt den schnellen Wechsel in den cw-Modus für die optische Mikromanipulation. Die Ausgangsstrahlung des Lasers 1 wird über einen 1 : 4 Strahlaufweiter 3 und einen Strahlabschwächer 4 in den externen Port eines inversen Laser- Scanning-Mikroskops 5 eingekoppelt sowie mit einem Objektiv 6 hoher numerischer Apertur (100×, NA = 1.3, Öl-Immersion) auf eine Probe 7 nahezu beugungsbegrenzt fokussiert. Die zu analysierenden und zu bearbeitenden Probenareale werden mit einem fluoreszierenden Farbstoff mit hohem molekularen Zweiphotonenabsorptionskoeffizienten im NIR-Bereich markiert. Zunächst wird mit dem cw-Laserstrahl von 100 mW Leistung (Flüssigkeitskristallfilter "an") die Probe 7 durch eine Videokamera 8 kontrolliert (als Beleuchtungsquelle dient eine Halogenlampe 9) und mittels optischer Mikromanipulation an den gewünschten Ort transportiert. Anschließend wird der Laser 1 in den Femtosekunden-Modus geschaltet (Flüssigkeits-kristallfilter "aus"), wobei mittels einer elektrischen Steuerung 10 simultan der Laserstrahl auf eine mittlere Leistung von 2 mW an der Probe 7 abgeschwächt wird. Mittels Zweiphotonen-Fluoreszenzanregung wird im Scanning-Mode das zu bearbeitende Probenareal zunächst mit einem abgeschwächten Laserstrahl und den Mikroskop-internen Fluoreszenz­ detektor 11 analysiert. Anschließend wird der Laserstrahl mittels einer Scanningeinheit 12 und einem motorisierten Probentisch 13 auf das zu bearbeitende Areal der Probe 7 für eine Punkt-Bestrahlung (Scanning-Spiegel fixiert) eingestellt. Die Bestrahlungsdauer wird mit der Mikroskop-eigenen Software festgelegt. Die Bearbeitung erfolgt mit dem ungeschwächten Laserstrahl hoher Pulsleistung. Nach dem erneuten Wechsel in den cw-Modus (Flüssigkeitskristallfilter "an") werden die Bearbeitungsprodukte mittels optischer Mikromanipulation abtransportiert.
Als zweites Ausführungsbeispiel ist prinzipiell der gleiche in der Zeichnung dargestellte Prinzipaufbau vorgesehen, mit dem Unterschied, daß der Ti:Saphir Laser 1 bereits intern einen nicht dargestellten akustooptischen Modulator (AOM) einer Betriebsfrequenz f1 entsprechend der Pulsfolgefrequenz bzw. entsprechend der Resonatorlänge des Lasers 1 für die Realisierung der Modensynchronisation enthält. Dieser AOM dient als Schaltelement derart, daß durch Wechsel auf eine zweite Betriebsfrequenz f2 die Modensynchronisation gestört wird. Eine Umschaltung auf die Betriebsfrequenz f1 bewirkt wiederum den Laserbetrieb im gepulsten Modus. Das Schaltelement Flüssigkeitskristallfilter 2 vom ersten Ausführungs­ beispiel in der Zeichnung entfällt.
Als drittes Ausführungsbeispiel ist prinzipiell wiederum der in der Zeichnung dargestellte Prinzipaufbau des ersten Ausführungsbeispiels vorgesehen, mit dem Unterschied, daß als Schaltelement ein nicht gezeigtes mechanisch in den intracavity-Strahlengang ein- und ausführbares Absorptionsfilter vorgesehen ist. Auch hier entfällt das in der Zeichnung dargestellte Flüssigkeitskristallfilter 2 vom ersten Ausführungsbeispiel.
Bezugszeichenliste
1
Laser
2
Flüssigkeitskristallfilter
3
Strahlaufweiter
4
Strahlabschwächer
5
Laser-Scanning-Mikroskop
6
Objektiv
7
Probe
8
Videokamera
9
Halogenlampe
10
elektrische Steuerung
11
Fluoreszenzdetektor
12
Scanningeinheit
13
Probentisch
f1
, f2
Betriebsfrequenz

Claims (17)

1. Anordnung zur optischen Mikromanipulation, Analyse und Bearbeitung von Objekten im Nanometer- und Mikrometerbereich mit einem Lasersystem, dadurch gekennzeichnet, daß nur ein einziges Lasersystem (1) eingesetzt wird und daß Mittel (2) vorgesehen sind, welche das Lasersystem (1) mit seiner fokussierten und in der Intensität variierbaren Strahlung im Spektralbereich 400 nm bis 1200 nm je nach Verwendung der Laserstrahlung wahlweise in den kontinuierlich emittierenden (cw) Modus oder in den gepulsten Modus mit ultrakurzen Laserpulsen im Nano-, Piko- oder Femtosekundenbereich umschalten.
2. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel durch ein intracavity Schaltelement realisiert werden.
3. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel durch ein extracavity Schaltelement realisiert werden.
4. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel aus einem Schaltelement zur Änderung der spektralen Bandbreite des Lasersystems (1) bestehen.
5. Anordnung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Schaltelement zur Änderung der spektralen Bandbreite des Lasersystems (1) auf an sich bekannten doppelbrechenden Flüssigkeitsfiltern (2) beruht.
6. Anordnung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Schaltelement zur Änderung der spektralen Bandbreite des Lasersystems (1) auf an sich bekannten Interferenz- bzw. Absorptionsfiltern beruht.
7. Anordnung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Schaltelement zur Änderung der spektralen Bandbreite des Lasersystems (1) auf an sich bekannten absorbierenden Flüssigkeiten oder Gasen beruht.
8. Anordnung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Schaltelement zur Änderung der spektralen Bandbreite des Lasersystems (1) auf an sich bekannten optischen Filtern, z. B. Lyotfiltern, auf interferometrischen Anordnungen, auf AOTF-Elementen ("acousto-optical tunable filter") bzw. auf Prismen- und Gitteranordnungen beruht.
9. Anordnung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Schaltelement zur Änderung der spektralen Bandbreite des Lasersystems (1) auf an sich bekannten mechanischen Anordnungen zur räumlichen Beeinflussung von Spektralanteilen, wie z. B. Lochblenden und Spalte, beruht.
10. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel aus einem Schaltelement zur Beeinflussung der Modensynchronisation bestehen.
11. Anordnung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Schaltelement zur Beeinflussung der Modensynchronisation auf Elementen zur Variation der Resonatorlänge beruht.
12. Anordnung nach Ansprüchen 3 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Schaltelement zur Beeinflussung der Modensynchronisation aus einem extracavity-Element mit Rückkopplungsmechanismus besteht.
13. Anordnung nach Ansprüchen 2 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Schaltelement zur Beeinflussung der Modensynchronisation aus einem intracavity Modulator, z. B. aus einem akustooptischen Modulator, besteht.
14. Anordnung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Schaltelement zur Beeinflussung der Modensynchronisation aus einem Modulator für den Pumplaser des Lasersystems (1) besteht.
15. Anordnung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel aus an sich bekannten Elementen zur Veränderung der Pumplaserleistung des Lasersystems (1) bestehen.
16. Anordnung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel aus einem elektrooptischen Schalter bestehen.
17. Anordnung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zum Zweck ihrer Einführung und Entfernung in den bzw. aus dem Strahlengang des Lasersystems (1) bewegbar angeordnet sind.
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