DE19715586A1 - Dictyocaulus viviparus antigen for the diagnosis of lung worm infestation and for vaccination - Google Patents

Abstract

An immunogenic protein (DV17) from the lungworm Dictyocaulus viviparus having a protective effect is disclosed, as well as a process for isolating the same, a process for isolating the corresponding DNA sequence, the production of the protein by genetic engineering and the use of the protein in diagnostic kits and as vaccines.

Description

Die Erfindung betrifft ein Antigen aus den adulten Stadien des Lungenwurms Dictyocaulus viviparus (im folgenden auch D. viviparus oder Dictyocaulus genannt) des Rindes, mit dem man immundiagnostisch Lungenwurmbefall bei Rindern nachweisen kann. In einer Vakzine kann das Antigen Immunschutz gegen D. viviparus hervorrufen.The invention relates to an antigen from the adult stages of the lung worm Dictyocaulus viviparus (hereinafter also called D. viviparus or Dictyocaulus) of the cattle, with which immunodiagnostic lung worm infestation in cattle can demonstrate. In a vaccine, the antigen can provide immune protection against D. evoke viviparus.

Lungenwürmer haben insbesondere bei kleinen und großen Wiederkäuern eine große pathogene und wirtschaftliche Bedeutung. Dictyocaulus ist der einzige beim Rind Geschlechtsreife erlangende Lungenwurm. Er kommt weltweit dort vor, wo zumindest zeitweise gemäßigte Temperaturen von 15-20°C herrschen. Endemisch ist D. viviparus in Europa in den großen Flußauen, regenreichen Küstengebieten aber auch auf alpinen Almen verbreitet (R.J. Jörgensen (1980) Vet. Parasitol. 7, 153-167; H. Pfeiffer (1976) Wien. Tierärztl. Mschr. 63, 54-55). In den Niederlanden wurde z. B. bei über 77% der auf Weiden gehaltenen Kälbergruppen klinische Dictyokaulose festgestellt (J. Boch, R. Supperer (1992) Veterinärmedizinische Parasitologie. 4. Aufl., Parey, Berlin, S. 294-301).Lungworms have one especially in small and large ruminants great pathogenic and economic importance. Dictyocaulus is the only one at Bovine lungworm. It occurs wherever worldwide At least occasionally moderate temperatures of 15-20 ° C prevail. Endemic is D. viviparus in Europe in the large floodplains, rainy coastal areas but also widespread on alpine pastures (R.J. Jörgensen (1980) Vet. Parasitol. 7, 153-167; H. Pfeiffer (1976) Vienna. Veterinary Mschr. 63, 54-55). In the Netherlands z. B. Clinical in over 77% of calf groups kept on pastures Dictyocaulosis noted (J. Boch, R. Supperer (1992) Veterinary Parasitology. 4th ed., Parey, Berlin, pp. 294-301).

Die Aufnahme der dritten Larven mit dem Weidegras verursacht beim erstmals exponierten Kalb die Erkrankung (Dictyokaulose). Die Larven erreichen auf dem Blutweg die Alveolen der Lungen, die sie durchbrechen, um in die luftführenden Teile der Lunge zu gelangen. Dabei werden Läsionen erzeugt, die als Eintrittspforte für bakterielle Sekundärinfektionen dienen; die Vermehrung von Bakterien und anderer mikrobieller Erreger führt zu begrenzten oder generalisierten Lungenentzündungen mit allen möglichen Folgeerscheinungen wie Lungenödem und Herzversagen (T. Schnieder, A. Bellmer, F.-J. Kaup (1989) Wien. Tierärztl. Mschr. 76: 372-476). Die Atmung wird, auch durch die in den oberen Atmungswegen zu Obstruktionen führenden adulten Stadien, erheblich erschwert. Sichtbare Folgen der starken Beeinträchtigung des Allgemeinbefindens sind verminderte Gewichtszunahmen oder gar Gewichtsverluste verbunden mit Wachstumsverzögerungen. Bisweilen verschlimmern sich die klinischen Symptome dramatisch und führen rasch zum Tod.The uptake of the third larvae with the pasture grass caused the first time exposed calf to the disease (dictyocaulosis). The larvae reach on the The alveoli of the lungs pass through the alveoli to penetrate the air To get parts of the lungs. In doing so, lesions are created that act as an entry gate serve for secondary bacterial infections; the multiplication of bacteria and other microbial pathogens lead to limited or generalized Pneumonia with all possible sequelae such as pulmonary edema and heart failure (T. Schnieder, A. Bellmer, F.-J. Kaup (1989) Vienna. Tierärztl.  Mschr. 76: 372-476). Breathing is also done by those in the upper Breathing pathways leading to obstructions leading to adult stages, considerably more difficult. Visible consequences of the severe impairment of the general condition decreased weight gain or even weight loss associated with Growth retardation. Sometimes the clinical symptoms worsen dramatic and quickly lead to death.

Die Lungenwurmerkrankung der Rinder kann anhand der klinischen Symptomatik (G. Gräfner (1987) Monatsh. Vet. med. 42: 178-181) oder anhand der mit dem Kot ausgeschiedenen Larven diagnostiziert werden (J. Boch, R. Supperer (1992). Diese Möglichkeiten eignen sich vor allem für die Diagnose am Einzeltier, wenn eine starke Infektion vorliegt. Zu der modernen Massentierhaltung werden jedoch, basierend auf einer geeigneten Diagnostik, epidemiologische Voraussagen und Risikoeinschätzungen bezüglich des Ausbruchs einer Dictyokaulose in der fortgeschrittenen Weidesaison benötigt; d. h. in Surveys müssen viele, möglicherweise noch schwach infizierte Kälber mit einer sicheren, sensiblen Methode untersucht werden. Hierzu sind serologische Methoden geeignet (A. Bellmer, T. Schnieder, A.M. Tenter (1989) Proc. 13th Conf. Wrld Ass. Adv. Vet. Parasit., S. 33, Berlin, 07.-11.08.1989). In Dictyocaulus viviparus identifizierte, isoliert und teilweise rekombinant dargestellte Antigene werden zur Serodiagnostik genutzt. Für die Heilbehandlung der Dictyokaulose können gegen adulte und juvenile Stadien wirksame Medikamente eingesetzt werden (z. B. Levamisol®, (Pro) Benzimidazole, Netomin®, Ivermectin®). Diese Präparate sind hochwirksam und können somit durch akute Lungenwurmerkrankungen bedingte Ausfälle meist verhindern (H. Mehlhorn, D. Düwel, W. Raether (1993) Diagnose und Therapie der Parasitosen von Haus-, Nutz- und Heimtieren. 2. Aufl. Gustav Fischer Verlag, S. 223-227). Bei einer prophylaktischen/metaphylaktischen Behandlung lassen die Wirkstoffe aufgrund ihrer radikalen Wirksamkeit möglicherweise die Auseinandersetzung des Parasiten mit dem Immunsystem des Wirtes und somit die Ausbildung und Aufrechterhaltung einer belastbaren (Teil) Immunität nicht zu. Die Tiere sind dann einer Infektion im zweiten Weidejahr ungeschützt ausgesetzt (COBS, D.E., S.R. Pitt, J. Förster, M.T. Fox (1987) Res. Vet. Sci. 43: 273-275). Lungworm disease in cattle can be based on clinical symptoms (G. Graefner (1987) Monthly Vet. Med. 42: 178-181) or on the basis of the feces eliminated larvae are diagnosed (J. Boch, R. Supperer (1992). These Possibilities are particularly suitable for diagnosis on single animals, if one severe infection. However, modern factory farming, based on appropriate diagnostics, epidemiological predictions and Risk assessments regarding the outbreak of a dictyocaulosis in the advanced grazing season needed; d. H. in surveys, many possibly still weakly infected calves with a safe, sensitive Method to be examined. Serological methods are suitable for this (A. Bellmer, T. Schnieder, A.M. Tenter (1989) Proc. 13th Conf. Wrld Ass. Adv. Vet. Parasit., P. 33, Berlin, August 7-11, 1989). Identified in Dictyocaulus viviparus, isolated and partially recombinant antigens are used for serodiagnostics utilized. For the healing treatment of dictyocaulosis can be used against adult and juvenile stages of effective medication are used (e.g. Levamisol®, (Pro) Benzimidazole, Netomin®, Ivermectin®). These preparations are highly effective and can usually failures caused by acute lungworm diseases prevent (H. Mehlhorn, D. Düwel, W. Raether (1993) diagnosis and therapy of Parasitosis of pets, farm animals and pets. 2nd edition Gustav Fischer Verlag, S. 223-227). With prophylactic / metaphylactic treatment, the Active ingredients may be due to their radical effectiveness Controversy of the parasite with the host's immune system and thus the Training and maintenance of resilient (partial) immunity does not. The Animals are then exposed to infection in the second year of grazing (COBS, D.E., S.R. Pitt, J. Forster, M.T. Fox (1987) Res. Vet. Sci. 43: 273-275).  

Deshalb wird in letzter Zeit aus epidemiologischer Sicht immer häufiger eine Immunisierung der Kälber der ersten Weidesaison gefordert, entweder durch geringgradige subklinische Infektion oder durch Vakzinierung. Zur Zeit steht nur eine Lebendvakzine in Form röntgenattenuierter Larven zur Verfügung, die Grundimmunität hervorruft, die durch weitere natürliche Infektion aufrecht erhalten werden muß (Mehlhorn H., et al., (1993)). Bei ungenügender Nachimmunisierung über natürliche Infektion kommen gelegentlich bei plötzlicher, starker Exposition Durchbrüche mit Husten und Erkrankungen vor. Da die Vakzine selbst im Kühlschrank nur etwa 3 Wochen haltbar ist, muß sie sorgfältig aufbewahrt und rasch eingesetzt werden. Dieses Procedere verbietet einen "flächendeckenden" Einsatz; die Vakzine bleibt deshalb in erster Linie speziellen Endemiegebieten vorbehalten. Aufgrund der mangelnden Stabilität und Qualität ist die Entwicklung definierter Vakzinen (Subunitvakzine) erforderlich. Es stellte sich nun die Aufgabe, die aufgeführten Nachteile der derzeitigen Vakzinierungsmethode durch Bereitstellung eines neuen, vorteilhaften Impfstoffes zu beseitigen. Diese Aufgabe wurde durch die vorliegende Erfindung gelöst.Therefore, from an epidemiological point of view, one has become increasingly common lately Immunization of the calves of the first grazing season is required, either by minor subclinical infection or by vaccination. Currently only stands a live vaccine in the form of X-ray-attenuated larvae is available Basic immunity that is maintained by further natural infection must be (Mehlhorn H., et al., (1993)). In the event of insufficient post-immunization Occasionally come over natural infection with sudden, strong exposure Breakthroughs with cough and disease before. Since the vaccine itself Refrigerator is only stable for about 3 weeks, it must be kept carefully and can be used quickly. This procedure prohibits a "nationwide" Commitment; the vaccine therefore remains primarily in special endemic areas Reserved. Due to the lack of stability and quality, the development defined vaccines (subunit vaccines) required. The task now was the listed disadvantages of the current vaccination method Provision of a new, beneficial vaccine to eliminate. This task was solved by the present invention.

Die Erfindung betrifft ein neues, immunogenes, natives Protein, genannt DV 17, welches aus adulten Würmern von Dictyocaulus viviparus isoliert wurde. Seine Immunogenität begründet sich vor allem dadurch, daß es nach subcutaner Applikation im Rind eine Antikörperantwort induziert, die dem Tier Immunschutz verleiht. Ferner kann dieses Protein im ELISA zur retrospektiven Immundiagnose der Dictyokaulose im Rind verwendet werden. DV 17 ist durch folgende physikalische Eigenschaften charakterisiert. Das Protein ist beständig in allen verwendeten Puffern. Eine Verminderung der Immunreaktivität nach Tiefgefrierung (-85°C) des gereinigten Antigens konnte nicht festgestellt werden. Für Antigen DV 17 wurde unter Verwendung eines HPLC-Systems und einer Nucleosil C18-Säule (150 mm x 4.6 mm; 5 u) eine Retentionszeit von 14 min. gemessen (Gradientenelution bestehend aus Aqua dest 10.1% TFA (= 0% B) und Acetonitril 10.1% TFA (= 100% B)). DV 17 hat im SDS-Polyacrylamidgel (Phastgel 8-25%) ein geschätztes Molekulargewicht von ca. 16500 dalton. Der isoelektrische Punkt von DV 17 liegt im Bereich von 5.3-5.9. Letztlich wurden nach Proteolyse mit Endopeptidase Lys C folgende Teilaminosäuresequenzen ermittelt:
The invention relates to a new, immunogenic, native protein, called DV 17, which was isolated from adult worms of Dictyocaulus viviparus. Its immunogenicity is mainly due to the fact that, after subcutaneous application, it induces an antibody response in cattle, which gives the animal immune protection. This protein can also be used in the ELISA for retrospective immunodiagnosis of dictyocaulosis in cattle. DV 17 is characterized by the following physical properties. The protein is stable in all buffers used. A reduction in the immunoreactivity after freezing (-85 ° C) of the purified antigen could not be determined. A retention time of 14 min was determined for antigen DV 17 using an HPLC system and a Nucleosil C18 column (150 mm × 4.6 mm; 5 u). measured (gradient elution consisting of aqua dest 10.1% TFA (= 0% B) and acetonitrile 10.1% TFA (= 100% B)). DV 17 has an estimated molecular weight of approx. 16500 daltons in SDS polyacrylamide gel (Phastgel 8-25%). The isoelectric point of DV 17 is in the range of 5.3-5.9. Ultimately, the following partial amino acid sequences were determined after proteolysis with endopeptidase Lys C:

Als biologische Eigenschaft ist die Entwicklungshemmung von Dictyocaulus viviparus im Rind nach Vakzination herausragend.Dictyocaulus inhibits development as a biological property viviparus in cattle outstanding after vaccination.

Die Erfindung hat daher zum Gegenstand ein immunogenes Protein mit protektiver Wirkung, welches aus adulten Würmern des Lungenwurms Dictyocaulus viviparus isoliert wird und welches bevorzugt ein Molekulargewicht von 15000-18000 Da, einen isoelektrischen Punkt zwischen 5.3-5.9 und Aminosäureteilsequenzen gemäß Tabelle 1 aufweist.The invention therefore relates to an immunogenic protein with a protective Effect resulting from adult worms of the lung worm Dictyocaulus viviparus is isolated and which preferably has a molecular weight of 15000-18000 Da, an isoelectric point between 5.3-5.9 and partial amino acid sequences according to Table 1 has.

Ein vorzugsweiser Gegenstand der Erfindung ist ein Protein, welches ein Molekulargewicht von 16500 ± 1500 Da und/oder einen isoelektrischen Punkt von 5.6 hat.A preferred subject of the invention is a protein, which a Molecular weight of 16500 ± 1500 Da and / or an isoelectric point of 5.6 has.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung eines Proteins bei dem die Isolierung mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Extraktionsmethoden und chromatographischen Methoden durchgeführt wird.Another object of the invention is a method for isolating a Protein in which the isolation with the help of those skilled in the art Extraction methods and chromatographic methods is carried out.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine DNA, kodierend für ein Protein wie oben beschrieben, vorzugsweise eine DNA, die eine DNA-Sequenz gemäß Tabelle 1 enthält.Another object of the invention is a DNA coding for a protein such as described above, preferably a DNA that has a DNA sequence according to the table 1 contains.

Ferner ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Isolierung der genannten DNA, bei welchem
The invention further relates to a method for isolating said DNA, in which

• a) degenerierte Oligonukleotide, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Tabelle 1 oder Teile davon hergestellt werden, a) degenerate oligonucleotides containing a DNA sequence according to the table 1 or parts thereof are manufactured,  
• b) die gemäß a) hergestellten Oligonukleotide radioaktiv oder nicht-radioaktiv markiert werden undb) the oligonucleotides produced according to a) radioactive or non-radioactive be marked and
• c) aus einer cDNA-Bank, hergestellt aus Dictyocaulus viviparus, cDNA-Klone isoliert werden, die mit den nach b) hergestellten Hybridisierungs-proben unter stringenten Bedingungen hybridisieren.c) from a cDNA library, made from Dictyocaulus viviparus, cDNA clones are isolated with the hybridization samples prepared according to b) hybridize under stringent conditions.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung der genannten DNA, bei welchem
Another object of the invention is a method for isolating said DNA, in which

• a) PCR-Primer, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Tabelle 1 oder Teile davon oder enthaltend eine Oligo-dT-Sequenz hergestellt werden,a) PCR primer containing a DNA sequence according to Table 1 or parts thereof or containing an oligo-dT sequence,
• b) mit den so erzeugten PCR-Primeren aus einer cDNA-Bank, hergestellt aus Dictyocaulus viviparus, PCR-Fragmente generiert werden,b) with the PCR primers generated in this way from a cDNA bank, prepared from Dictyocaulus viviparus, PCR fragments are generated
• c) welche kloniert und nach gängigen Methoden analysiert werden undc) which are cloned and analyzed according to common methods and
• d) zur Vervollständigung der cDNA-Sequenz durch Hybridisierungsverfahren wie oben beschrieben an Stelle der degenerierten Oligonukleotide verwendet werden.d) to complete the cDNA sequence by hybridization methods used in place of the degenerate oligonucleotides as described above will.

Das zuletzt beschriebene Verfahren kann auch so abgewandelt werden, daß für die PCR-Reaktion als Matrize RNA benutzt wird, die in einem zusätzlichen Schritt zunächst revers transkribiert und der so entstandene cDNA-Erststrang zur PCR verwendet wird.The method described last can also be modified so that for PCR reaction is used as the RNA template in an additional step first reverse transcribed and the resulting cDNA first strand for PCR is used.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein rekombinantes Protein, enthaltend Aminosäureteilsequenzen gemäß Tabelle 1, welches vorzugsweise durch Expression einer wie oben beschrieben erhaltenen cDNA in Prokaryonten oder Eukaryonten und Aufreinigung nach dem Fachmann bekannten Methoden erhältlich ist. Another object of the invention is a recombinant protein containing Amino acid partial sequences according to Table 1, which is preferably by Expression of a cDNA obtained as described above in prokaryotes or Eukaryotes and purification can be obtained by methods known to those skilled in the art is.  

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein immunchemisches Verfahren unter Verwendung des oben beschriebenen Proteins von D. viviparus, mit welchem die Menge an DV 17 spezifischen Antikörpern im Blut von Rindern bestimmt wird, indem man mit DV 17 beschichtete ELISA-Platten mit zu untersuchendem Rinderserum inkubiert und gegebenenfalls gebildete DV 17/Antikörper-komplexe durch Peroxidase-konjugierte, polyklonale Antikörper und eine entsprechende, dem Fachmann bekannte Farbreaktion nachweist.The invention also relates to an immunochemical process under Use of the D. viviparus protein described above, with which the Amount of DV 17 specific antibodies in the blood of cattle is determined by one coated with DV 17 ELISA plates with bovine serum to be examined incubated and any DV 17 / antibody complexes formed Peroxidase-conjugated polyclonal antibodies and a corresponding one, the Color reaction known to those skilled in the art.

Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des oben beschriebenen Proteins von D. viviparus als Vakzine, verbunden mit einem Carrier oder Adjuvans und ggf. Hilfsstoffen zur Immunisierung von Rindern gegen Dictyokaulose.Another object of the invention is to use the one described above Proteins from D. viviparus as a vaccine linked to a carrier or adjuvant and possibly auxiliary substances for immunizing cattle against dictyocaulosis.

Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist ein Diagnostik-Kit, enthaltend das oben beschriebene Protein von D. viviparus.Another object of the invention is a diagnostic kit containing the above protein described by D. viviparus.

Schließlich ist ein Gegenstand der Erfindung eine Vakzine, enthaltend das oben beschriebene Protein von D. viviparus sowie einen Carrier, ein Adjuvans sowie ggf. Hilfsstoffe.Finally, an object of the invention is a vaccine containing the above described protein from D. viviparus as well as a carrier, an adjuvant and possibly Auxiliaries.

Die Erfindung wird nun anhand von Beispielen näher erläutert, ohne darauf beschränkt zu sein. Die Tabelle ist wie folgt beschrieben:The invention will now be explained in more detail by means of examples, without being based on it to be limited. The table is described as follows:

Tabelle 1: Teilaminosäuresequenzen des isolierten DV 17-Proteins aus Dictyocaulus viviparus und die daraus ableitbare degenerierte Nukleotidsequenz. Abkürzungen:
N=A, G, C, T; Y=T, C; H=A, C, T; R=A, G; M=A, CTable 1: Partial amino acid sequences of the isolated DV 17 protein from Dictyocaulus viviparus and the derived degenerate nucleotide sequence. Abbreviations:
N = A, G, C, T; Y = T, C; H = A, C, T; R = A, G; M = A, C

Für die Identifizierung von Protein DV 17 wurden Normalseren und Infektionsseren von Rindern verwendet, die mit gastrointestinalen Nematoden wie Ostertagia ostertagi und Cooperia oncophora sowie dem Lungenwurm Dictyocaulus viviparus infiziert waren. For the identification of protein DV 17, normal sera and infection sera were used used by cattle with gastrointestinal nematodes such as Ostertagia ostertagi and Cooperia oncophora and the lungworm Dictyocaulus viviparus were infected.  

Chromatographisch aufgetrennte Proteinfraktionen gewonnen aus homogenisierten, adulten Lungenwürmern wurden mit Hilfe der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese weiter aufgetrennt und auf Immobilon P-Membranen immobilisiert (Semidry- Blotting). Das lungenwurmspezifische Protein DV 17 wurde anschließend mit den spezifischen Infektionsseren detektiert und mittels Umkehrphasen-HPLC-Säule weiter aufgereinigt. Die Reinheit der Proteinfraktion wurde in silber-gefärbten SDS- Polyacrylamidgelen (Phastgele) überprüft. Mittels BCA-Proteinassay wurde die Proteinkonzentration in elektrophoretisch reinen DV 17-Fraktionen bestimmt und bei -85°C tiefgefroren. Helminthennaive Rinder wurden 2 mal mit jeweils einer definierten Menge von gereinigtem DV 17 vakziniert. Die Rinder wurden 1 Woche nach der zweiten Vakzination mit L3-Larven von Dictyocaulus viviparus belastet (Challenge). Nicht vakzinierte Tiere dienten als Kontrolle. 4 Wochen nach dem Challenge wurden die Rinder geschlachtet, in der Lunge die Anzahl adulter Würmer bestimmt und die Länge der männlichen und weiblichen Würmer gemessen. Als Maß für den Immunschutz wurde die Reduktion der Anzahl adulter Würmer im Vergleich zur nicht vakzinierten Kontrolle definiert.Chromatographically separated protein fractions obtained from homogenized Adult lung worms were diagnosed using SDS polyacrylamide gel electrophoresis further separated and immobilized on Immobilon P membranes (Semidry- Blotting). The lung worm-specific protein DV 17 was then treated with the specific infection sera were detected and by means of reverse phase HPLC column further cleaned up. The purity of the protein fraction was determined in silver-colored SDS Polyacrylamide gels (phast gels) checked. The BCA protein assay was used Protein concentration in electrophoretically pure DV 17 fractions determined and at -85 ° C frozen. Helminthennaive cattle were 2 times with one each defined amount of purified DV 17 vaccinated. The cattle were 1 week old after the second vaccination with L3 larvae from Dictyocaulus viviparus (Challenge). Animals that were not vaccinated served as controls. 4 weeks after Challenge the cattle were slaughtered, in the lungs the number of adult worms determined and the length of the male and female worms measured. As The measure of immune protection was the reduction in the number of adult worms in the Comparison to the non-vaccinated control defined.

"Stringente Bedingungen" in Zusammenhang mit DNA-Hybridisierung bedeutet in der vorliegenden Anmeldung 6xSSC, 68°C."Stringent conditions" in connection with DNA hybridization means in of the present application 6xSSC, 68 ° C.

Die PCR-Bedingungen sind nach jedem Fachmann bekannten Methoden in Vorversuchen zu bestimmen.The PCR conditions are according to any method known to those skilled in the art To determine preliminary tests.

Beispiel 1example 1 Herstellung von InfektionsserenProduction of infection sera

Helminthennaive Rinder im Alter von 6 Monaten wurden mit unterschiedlichen Dosen von dritten Larven verschiedener Nematodenspezies (Dictyocaulus viviparus, Ostertagia ostertagi, Cooperia oncophora) infiziert. Die Infektions-dosen betrugen in der Dictyocaulus-Gruppe 2500, 1250 und 500 Larven/Rind; je Dosis wurden 3 Tiere verwendet. Für die Ostertagia-Gruppe wurden Infektionsdosen von 70 000, 30 000 und 15 000 Larven/Rind gewählt. Neben einer nicht infizierten Gruppe (= Negativkontrolle) wurde zusätzlich eine gemischte Gruppe mitgeführt, in der jedes Rind mit 2 500 Dictyocaulus Larven, 10000 Ostertagia Larven und 10000 Cooperia Larven infiziert wurde. An den Tagen DO (= Tag der Infektion), D +21, D +40, D +56, D +70, D +84, D +98 und D +112 wurden von jedem Rind Serumproben gewonnen, die aliquotiert bei -25°C aufbewahrt wurden. Die Seren wurden zur Identifizierung des Dictyocaulusantigens DV 17 in elektrophoretisch, chromatographisch aufgetrennten Proteinfraktionen sowie zur Beurteilung der Spezifität verwendet.Helminthennaive cattle at 6 months of age were different Doses of third larvae of different nematode species (Dictyocaulus viviparus, Ostertagia ostertagi, Cooperia oncophora) infected. Infection doses were 2500, 1250 and 500 larvae / cattle in the Dictyocaulus group; per dose 3 animals were used. Infection doses of were used for the Ostertagia group 70,000, 30,000 and 15,000 larvae / cattle selected. In addition to an uninfected Group (= negative control), a mixed group was also carried in  each cattle with 2,500 Dictyocaulus larvae, 10,000 Ostertagia larvae and 10,000 Cooperia larvae was infected. On days DO (= day of infection), D +21, D +40, D +56, D +70, D +84, D +98 and D +112 were serum samples from each bovine obtained which were stored aliquoted at -25 ° C. The sera became Identification of the Dictyocaulus antigen DV 17 in electrophoretic, chromatographically separated protein fractions and for the assessment of the Specificity used.

Beispiel 2Example 2 Gewinnung adulter LungenwürmerObtaining adult lungworms

6 Monate alte, helminthennaive Rinder wurden mit jeweils 5000 dritten Larven von Dictyocaulus viviparus oral infiziert; am darauffolgenden Tag erhielten die Tiere die gleiche Infektionsdosis. 28 Tage nach der Infektion wurden die Rinder geschlachtet und nach der Sektion adulte Würmer aus den Lungen gesammelt. Die Würmer wurden anschließend 3× mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, gewogen und bei -85°C bis zur Aufarbeitung gelagert.6 month old, helminthennaive cattle were each with 5000 third larvae of Dictyocaulus viviparus infected orally; the animals received the following day same infection dose. The cattle were slaughtered 28 days after infection and after the section adult worms are collected from the lungs. The worms were then washed 3 × with phosphate-buffered saline, weighed and stored at -85 ° C until worked up.

Beispiel 3Example 3 Extraktion von DV 17 aus adulten LungenwürmernExtraction of DV 17 from adult lungworms

10 g gefrorene Wurmmasse wurde bei Raumtemperatur aufgetaut und anschließend mit 40 ml 0.025 M Tris-HCl-Lösung pH 7.4 + 2 mM Pefabloc® im Gewebehomogenisator homogenisiert. Zur Entfernung grober Gewebebestandteile wurde das Homogenat bei 3010 g und 4°C 15 min zentrifugiert und das Pellet verworfen. Der Überstand wurde bei 4°C für 20 min bei 39 800 g zentrifugiert und der Überstand unter den gleichen Bedingungen 10 min rezentrifugiert. Der klare Überstand wurde nach Filtration mit 1.2 µm-Filtern in 1 Liter phospatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) über Nacht bei 4°C dialysiert (cut off der Dialysemembran 8000). 10 g of frozen worm mass was thawed at room temperature and then with 40 ml 0.025 M Tris-HCl solution pH 7.4 + 2 mM Pefabloc® im Homogenized tissue homogenizer. For the removal of coarse tissue components the homogenate was centrifuged at 3010 g and 4 ° C. for 15 min and the pellet discarded. The supernatant was centrifuged at 4 ° C for 20 min at 39,800 g and the supernatant was recentrifuged under the same conditions for 10 min. The clear one After filtration, the supernatant was buffered with 1.2 μm filters in 1 liter of phosphate Saline (PBS) dialyzed overnight at 4 ° C (cut off the dialysis membrane 8000).  

Beispiel 4Example 4 Präparative GelfiltrationPreparative gel filtration

Der dialysierte Überstand wurde bei 39800 g 15 min zentrifugiert und der klare Oberstand im Pharmacia-FPLC-System mittels präparativer Gelfiltrationssäule (Säulentyp XK 16/60; Trennmedium: Superdex 75 prep grade, Säulenvolumen: 124 ml) aufgetrennt. Zur Elution wurde PBS pH 7.4 verwendet. Die Fraktionen mit den Retentionsvolumina 65-75 ml wurden gesammelt und mit Ultrafiltrationsmodulen (cut off 3000) aufkonzentriert. Mit einem amplifizierten Western Blot wurde Protein DV 17 nachgewiesen.The dialyzed supernatant was centrifuged at 39800 g for 15 min and the clear one Top in the Pharmacia FPLC system using a preparative gel filtration column (Column type XK 16/60; separation medium: Superdex 75 prep grade, column volume: 124 ml) separated. PBS pH 7.4 was used for elution. The groups with the Retention volumes 65-75 ml were collected and with ultrafiltration modules (cut off 3000) concentrated. Protein was amplified with an Western blot DV 17 proven.

Beispiel 5Example 5 Western Blot-AnalyseWestern blot analysis

Die aufkonzentrierte Superdex 75 prep grade-Fraktion wurde im Verhältnis 1 : 2 mit reduziertem SDS-Puffer gemischt; davon wurden jeweils 40 µl/Probenvertiefung auf ein SDS-Excelgel (Fa. Pharmacia) aufgetragen. Die Elektrophorese wurde in der Multiphor II-Kammer (Fa. Pharmacia) unter standardisierten Laufbedingungen (600 V, 50 mA, 30 W, Laufzeit: 90 min) durchgeführt. Die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine wurden mittels "Semidry-Blotting" (Tovey ER, Baldo BA. Electrophoresis. 8, 1987, 384-387) auf Immobilon P-Membranen transferiert (Transferbedingungen: 45 min, konstante Stromstärke 0.8 mA/cm²) und nach einer 24 stündigen Blockphase mit 3%igem Rinderserumalbumin in Tris gepufferter Kochsalzlösung (TBS) mit einem Dictyocaulus-spezifischem Immunserum (gewonnen am D +40, siehe Beispiel 1) in einer Verdünnung von 1 : 20 1 Stunde inkubiert. Als Negativ-kontrolle wurde Rindernormalserum (Verdünnung 1 : 20 verwendet). Nach 3 maligem Waschen mit TBS + 0.05% Tween 20 wurde die Blotfolie mit einem Biotin-markierten Ziege anti Rind IgG (H+L) Antikörper (1 : 500; Fa. Pierce) für 1 Stunde inkubiert. Nach 3- maligem Waschen (TBS + 0.05% Tween 20) erfolgte eine 1 stündige Inkubation mit dem Enzymkonjugat Biotin-Streptavidin-Alkalische Phosphatase (1 : 2500; Fa. Pierce). Die Substratentwicklung wurde mit dem Substratkit der Fa. Biorad durchgeführt. The concentrated Superdex 75 prep grade fraction was mixed in a 1: 2 ratio with reduced SDS buffer; 40 µl / well of each was applied to an SDS Excel gel (from Pharmacia). The electrophoresis was carried out in the Multiphor II chamber (from Pharmacia) under standardized running conditions (600 V, 50 mA, 30 W, running time: 90 min). The electrophoretically separated proteins were transferred to Immobilon P membranes by means of "semidry blotting" (Tovey ER, Baldo BA. Electrophoresis. 8, 1987, 384-387) (transfer conditions: 45 min, constant current strength 0.8 mA / cm ² ) and after a 24 hour block phase with 3% bovine serum albumin in Tris buffered saline (TBS) with a Dictyocaulus-specific immune serum (obtained on D +40, see Example 1) at a dilution of 1:20 for 1 hour. Bovine normal serum (dilution 1:20) was used as a negative control. After washing 3 times with TBS + 0.05% Tween 20, the blot film was incubated with a biotin-labeled goat anti-bovine IgG (H + L) antibody (1: 500; Pierce) for 1 hour. After washing three times (TBS + 0.05% Tween 20), the mixture was incubated for 1 hour with the enzyme conjugate biotin-streptavidin-alkaline phosphatase (1: 2500; Pierce). The substrate development was carried out using the Biorad substrate kit.

Beispiel 6Example 6 Umkehrphasen - HPLCReverse phases - HPLC

Nach der immunologischen Identifizierung von DV 17 in den präparativen Gelfiltrationsfraktionen wurde das Protein mittels HPLC weiter aufgereinigt. Zu diesem Zweck wurde eine Nucleosil C 18 5U-Säule der Firma Alltech verwendet (150 mm×4.6 mm). Das Protein wurde mit Hilfe eines linearen Puffergradienten eluiert (Puffer A: Reinstwasser +0.1% Trifluoressigsäure (TFA); Puffer B: Acetonitril + 0.1% TFA). 500 µl der in Beispiel 4 aufkonzentrierten Fraktion wurden mit Puffer A 1 : 2 verdünnt und dann in die Säule injiziert. Die Flußrate betrug 0.5 ml/min. Die Gradientenelution wurde 5 min nach Injektion gestartet und 10 min später beendet. Für DV 17 wurde eine Retentionszeit von 14 min gemessen.After the immunological identification of DV 17 in the preparative Gel filtration fractions, the protein was further purified by HPLC. To a Nucleosil C 18 5U column from Alltech was used for this purpose (150 mm × 4.6 mm). The protein was grown using a linear buffer gradient eluted (buffer A: ultrapure water + 0.1% trifluoroacetic acid (TFA); buffer B: acetonitrile + 0.1% TFA). 500 μl of the fraction concentrated in example 4 were mixed with buffer Diluted 1: 2 and then injected into the column. The flow rate was 0.5 ml / min. The Gradient elution was started 5 min after injection and ended 10 min later. A retention time of 14 min was measured for DV 17.

Beispiel 7Example 7 Reinheitsnachweis und MolekulargewichtsbestimmungPurity detection and molecular weight determination

Die mittels HPLC aufgereinigte Fraktion mit einer Retentionszeit von 14 min wurde mit einem SDS-Polyacrylamidgel (Phast SDS-Gel 8-25%) im Phastsystem (Fa. Pharmacia) unter standardisierten Bedingungen analysiert. Als Molekulargewichtsmarker wurde der "Silver Stain SDS-PAGE Standards, low range"-Kit der Fa. Biorad verwendet. DV 17 wurde nach der Elektrophorese mittels Silberfärbung sichtbar gemacht (Silverstain Kit, Fa. Pharmacia). Die Molekulargewichtsbestimmung wurde mit einem Videodensitometer (Molecular analyst, Fa. Biorad) mittels Auswertungsprogramm "Profile analyst II" durchgeführt. Für DV 17 wurde ein Molekulargewicht von 16 500 ± 1500 dalton berechnet.The fraction purified by HPLC with a retention time of 14 min with an SDS polyacrylamide gel (Phast SDS gel 8-25%) in the phast system (Fa. Pharmacia) analyzed under standardized conditions. As Molecular weight marker was the "Silver Stain SDS-PAGE Standards, low range "kit from Biorad. DV 17 was used after the electrophoresis Silver staining made visible (Silverstain Kit, Pharmacia). The Molecular weight was determined using a video densitometer (Molecular analyst, from Biorad) using the "Profile analyst II" evaluation program. A molecular weight of 16 500 ± 1500 daltons was calculated for DV 17.

Beispiel 8Example 8 Bestimmung des isoelektrischen PunktesDetermination of the isoelectric point

Gemäß Beispiel 6 isoliertes DV 17 wurde mit Reinstwasser verdünnt und auf vorgefertigte Fokussiergele (IEF Phastgele pH 3-10 Fa. Pharmacia) aufge-tragen. Die Fokussierung im Phastsystem erfolgte unter standardisierten Bedingungen. Zwecks Bestimmung des isoelektrischen Punktes von DV 17 wurden Markerproteine mit definiertem, isoelektrischem Punkt (pH 3.5-9.3 Fa. Pharmacia) mitgeführt. Es ergab sich ein isoelektrischer Punkt von 5.3-5.9.DV 17 isolated according to Example 6 was diluted with ultrapure water and opened Prefabricated focusing gels (IEF Phastgels pH 3-10 from Pharmacia) are applied. The focus in the phast system was carried out under standardized conditions. Marker proteins were used to determine the isoelectric point of DV 17  carried with a defined, isoelectric point (pH 3.5-9.3 from Pharmacia). It there was an isoelectric point of 5.3-5.9.

Beispiel 9Example 9 AminosäuresequenzanalyseAmino acid sequence analysis

Gemäß Beispiel 6 isoliertes DV 17 (40 µg) wurde mit Hilfe von Endopeptidase Lys C gespalten und die resultierenden Peptide mit einer C 18-Reserve Phase HPLC aufgereinigt. 7 Peptide wurden N-terminal ansequenziert. Es wurden folgende Teilaminosäuresequenzen identifiziert:
DV 17 isolated according to Example 6 (40 μg) was cleaved using endopeptidase Lys C and the resulting peptides were purified using a C 18 reserve phase HPLC. 7 peptides were sequenced at the N-terminal. The following partial amino acid sequences were identified:

Beispiel 10Example 10 Nachweis eines protektiven Effekts von DV 17Evidence of a protective effect of DV 17

5 Monate alte, helminthennaive Bullenkälber (Stallaufzucht, koproskopischer Nachweis negativ) wurden mit jeweils 50 µg gereinigtem, nativem DV 17 subcutan vakziniert. 4 Wochen später erfolgte eine Boostervakzination mit 45 µg Antigen/ Rind. Die Tiere wurden 1 Woche nach der 2. Vakzination mit jeweils 2×1000 L3- Larven von Dictyocaulus viviparus belastet (= Challenge). Nicht vakzinierte Tiere dienten als Kontrolle. 35 Tage nach dem Challenge wurden die Tiere geschlachtet und in der Lunge die Anzahl adulter Würmer bestimmt; gleichzeitig wurde die Länge intakter männlicher und weiblicher Würmer gemessen. In der vakzinierten Gruppe wurde eine um 80% reduzierte Anzahl adulter Würmer gefunden. Adulte Würmer aus der vakzinierten Gruppe waren im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant kleiner (Reduktion 33%). 5 month old, helminthennaive bull calves (stable rearing, coproscopic Detection negative) were subcutaneously with 50 µg of purified, native DV 17 vaccinated. 4 weeks later there was a booster vaccination with 45 µg antigen / Beef. The animals were treated with 2 × 1000 L3- 1 week after the 2nd vaccination. Larvae of Dictyocaulus viviparus contaminated (= challenge). Animals not vaccinated served as a control. The animals were slaughtered 35 days after the challenge and determines the number of adult worms in the lungs; at the same time the length intact male and female worms measured. In the vaccinated group a number of adult worms reduced by 80% was found. Adult worms from the vaccinated group were significant compared to the control group smaller (33% reduction).  

Beispiel 11Example 11 ELISA zum serologischen Nachweis einer DictyokauloseELISA for the serological detection of dictyocaulosis

ELISA-Platten (Maxisorb der Fa. Nunc) wurden mit einer Konzentration von 5 µg DV 17/ml PBS beschichtet; das Reaktionsvolumen betrug 100 µl pro Vertiefung. Nach einer Inkubation von 1 Stunde bei 37°C wurden die Platten 3 mal im ELISA washer gewaschen, das Waschvolumen pro Vertiefung betrug 200 µl. Als Waschlösung wurde Reinstwasser +0.1% Tween 20 verwendet. Unspezifische Bindungsstellen wurden durch Inkubation (3 Stunden bei Raumtemparatur) mit einem proteolytischem Gemisch von Gelatine (Fa. Boehringer Mannheim) blockiert. Die Inkubation erfolgte auf einem Mikrotiterplatten-Schüttler bei einer Schüttelfrequenz von 300 rpm. Nach 3-maligem Waschen wurden die Vertiefungen mit einer 1 : 200-Verdünnung spezifischer Infektions- und Kontrollseren beschickt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Als Nachweisantikörper wurde nach 3-maligem Waschen Peroxidase-konjugierte, polyklonale Kaninchenantikörper gegen bovines IgG (Fc-Fragment spezifisch; Fa. Dianova) in einer Verdünnung von 1 : 10 000 verwendet; die Inkubation dauerte 30 min. Die Platten wurden anschließend 4 mal gewaschen und dann mit Substratlösung inkubiert (Zusammensetzung: 5 ml 10-fach konzentrierter ABTS-Puffer + 45 ml Reinstwasser + 1 Tablette ABTS (≘ 50 mg ABTS). Die Substratentwicklung erfolgte bei Raumtemperatur und wurde im ELISA-Reader alle 10 min bei 414 nm überwacht. Dictyocaulus-spezifische Antikörper waren im ELISA frühestens 28 Tage nach einer Lungenwurminfektion nachweisbar.ELISA plates (Maxisorb from Nunc) were used with a concentration of 5 µg DV 17 / ml PBS coated; the reaction volume was 100 µl per well. After After incubation for 1 hour at 37 ° C., the plates were 3 times in an ELISA washer washed, the washing volume per well was 200 ul. As Wash solution, ultrapure water + 0.1% Tween 20 was used. Nonspecific Binding sites were identified by incubation (3 hours at room temperature) a proteolytic mixture of gelatin (Boehringer Mannheim) blocked. The incubation was carried out on a microtiter plate shaker at one Shaking frequency of 300 rpm. After washing 3 times, the Wells with a 1: 200 dilution of specific infection and control sera loaded and incubated for 1 hour at room temperature. As a detection antibody was peroxidase-conjugated, polyclonal after 3 washes Rabbit antibodies against bovine IgG (Fc fragment specific; Dianova) in dilution of 1: 10,000 used; the incubation lasted 30 min. The Plates were then washed 4 times and then with substrate solution incubated (composition: 5 ml 10-fold ABTS buffer + 45 ml Ultrapure water + 1 tablet ABTS (≘ 50 mg ABTS). The substrate development took place at room temperature and was in the ELISA reader every 10 min at 414 nm supervised. Dictyocaulus-specific antibodies were at the earliest 28 days in the ELISA detectable after a lung worm infection.

Tabelle 1Table 1

Claims (16)

1. Immunogenes Protein DV 17 mit protektiver Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein aus adulten Würmern des Lungenwurms Dictyocaulus viviparus isoliert wird.1. Immunogenic protein DV 17 with a protective effect, characterized in that the protein is isolated from adult worms of the lung worm Dictyocaulus viviparus. 2. Protein, gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Protein ein Molekulargewicht von 15 000-18000 dalton, einen isoelektrischen Punkt zwischen 5.3 und 5.9 und Aminosäureteilsequenzen gemäß Tabelle 1 aufweist.2. Protein according to claim 1, characterized in that said Protein a molecular weight of 15,000-18,000 daltons, one isoelectric point between 5.3 and 5.9 and partial amino acid sequences according to Table 1. 3. Protein, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Protein ein Molekulargewicht von 16 500 ± 1500 dalton hat.3. Protein, according to one of claims 1 to 2, characterized in that said protein has a molecular weight of 16,500 ± 1,500 daltons. 4. Protein, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Protein einen isoelektrischen Punkt von 5.6 hat.4. Protein, according to any one of claims 1 to 3, characterized in that said protein has an isoelectric point of 5.6. 5. Verfahren zur Isolierung eines Proteins, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung mit Hilfe von Extraktionsmethoden und chromatographischen Methoden durchgeführt wird.5. A method for isolating a protein according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the insulation with the help of Extraction methods and chromatographic methods is carried out. 6. DNA, kodierend für ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.6. DNA coding for a protein according to one of claims 1 to 4. 7. DNA, gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine DNA- Sequenz gemäß Tabelle 1 enthält.7. DNA, according to claim 6, characterized in that it is a DNA Contains sequence according to Table 1. 8. Verfahren zur Isolierung einer DNA gemäß Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß

• a) degenerierte Oligonukleotide, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Tabelle 1 oder Teile davon hergestellt werden
• b) die hergestellten Oligonukleotide radioaktiv oder nicht-radioaktiv markiert werden und
• c) aus einer cDNA-Bank, hergestellt aus Dictyocaulus viviparus, cDNA- Klone isoliert, die mit den nach b) hergestellten Hybridisierungs-proben unter stringenten Bedingungen hybridisieren.

8. A method for isolating a DNA according to claim 6 or 7, characterized in that

• a) degenerate oligonucleotides containing a DNA sequence according to Table 1 or parts thereof are prepared
• b) the oligonucleotides produced are radioactive or non-radioactive labeled and
• c) isolated from a cDNA bank, produced from Dictyocaulus viviparus, cDNA clones which hybridize with the hybridization samples prepared according to b) under stringent conditions.

9. Verfahren zur Isolierung einer DNA gemäß Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß

• a) PCR-Primer, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Tabelle 1 oder Teile davon oder enthaltend eine Oligo-dT-Sequenz, hergestellt werden,
• b) mit den so erzeugten PCR-Primeren aus einer cDNA-Bank, hergestellt aus Dictyocaulus viviparus, PCR-Fragmente generiert werden,
• c) welche kloniert und nach gängigen Methoden analysiert werden und
• d) zur Vervollständigung der cDNA-Sequenz durch Hybridisierungs­ verfahren gemäß Anspruch 8 an Stelle der degenerierten Oligonukleotide verwendet werden.

9. A method for isolating a DNA according to claim 6 or 7, characterized in that

• a) PCR primers containing a DNA sequence according to Table 1 or parts thereof or containing an oligo-dT sequence are prepared,
• b) PCR fragments generated in this way from a cDNA bank, produced from Dictyocaulus viviparus, PCR fragments,
• c) which are cloned and analyzed according to common methods and
• d) to complete the cDNA sequence by hybridization methods according to claim 8 are used in place of the degenerate oligonucleotides.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß für die PCR- Reaktion als Matrize RNA benutzt wird, die in einem zusätzlichen Schritt zunächst revers transkribiert und der so entstandene Erststrang zur PCR verwendet wird.10. The method according to claim 9, characterized in that for the PCR Reaction as an RNA template is used in an additional step first reverse transcribed and the resulting first strand for PCR is used. 11. Rekombinantes Protein, enthaltend Aminosäureteilsequenzen gemäß Tabelle 1.11. Recombinant protein containing partial amino acid sequences according to the table 1. 12. Rekombinantes Protein, erhältlich durch Expression einer nach einem der Ansprüche 8 bis 10 erhaltenen cDNA in Prokaryonten oder Eukaryonten und Aufreinigung. 12. Recombinant protein, obtainable by expression of one of the Claims 8 to 10 obtained cDNA in prokaryotes or eukaryotes and Purification.   13. Immunphemisches Verfahren zur Bestimmung der Menge von DV 17 spezifischen Antikörpern im Blut von Rindern unter Verwendung eines Proteins, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß mit DV 17 beschichtete ELISA-Platten mit zu untersuchendem Rinderserum inkubiert werden und gegebenenfalls gebildete DV 17/Antikörperkomplexe mit Peroxidase-konjugierten, polyklonalen Antikörpern und einer Farbreaktion nachgewiesen werden.13. Immunophemic method for determining the amount of DV 17 specific antibodies in the blood of cattle using a Protein according to one of claims 1 to 4, 11 or 12, characterized characterized in that coated with DV 17 ELISA plates with examining bovine serum and possibly formed DV 17 / antibody complexes with peroxidase-conjugated, polyclonal Antibodies and a color reaction can be detected. 14. Verwendung eines Proteins, gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, 11 oder 12 als Vakzine verbunden mit einem Carrier oder Adjuvans und ggf. Hilfsstoffen zur Immunisierung von Rindern gegen Dictyokaulose.14. Use of a protein according to one or more of claims 1 to 4, 11 or 12 as a vaccine combined with a carrier or adjuvant and if necessary, auxiliaries for immunizing cattle against dictyocaulosis. 15. Diagnostik-Kit enthaltend ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1-4, 11 oder 12.15. Diagnostic kit containing a protein according to any one of claims 1-4, 11 or 12. 16. Vakzine, enthaltend ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1-4, 11 oder 12 sowie einen Carrier, ein Adjuvans sowie ggf. Hilfsstoffe.16. Vaccine containing a protein according to any one of claims 1-4, 11 or 12 as well as a carrier, an adjuvant and possibly auxiliary substances.