DE19653607A1 - Verfahren zur Diagnose und Therapie von Hodgkin-Lymphomen - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Diagnose und Therapie von Hodg­ kin-Lymphomen (Lymphogranulomatose), die auf der Expression des varianten Exons v10 des Gens CD44 als molekularem Target beruhen, Mittel für diese Verfahren sowie die Ver­ wendung dieser Mittel.

Das hochglykosylierte Zelloberflächenprotein CD44 ist an der Wechselwirkung zwi­ schen Zellen und der extrazellulären Matrix wie Migration und Aktivierung von Leukozyten bei Entzündung und Immunüberwachung, Vorläuferbildung von leukozytischen und mye­ loiden Zellen im Knochenmark als auch der Entwicklung lymphoider Organe und der Wech­ selwirkung von Zellen mit der extrazellulären Matrix beteiligt (Lesley et al., 1993, Günthert 1993, Pals et al., 1993, Mackay et al., 1994). Das menschliche CD44-Gen ist aus wenigstens 19 Exons zusammengesetzt, wovon wenigstens 12, die für die extrazelluläre Region kodieren, alternativ gespleißt werden (Screaton et al., 1992). Das CD44-Gen wird in einer Reihe von Normalgeweben und Karzinomen transkribiert (Fox et al., 1994). Während das Standard-CD44-Molekül (CD44s) ubiquitär exprimiert in epithelialen und mesenchymalen Geweben gefunden wird, werden die verschiedenen Isoformen, die durch alternatives RNA- Spleißen erzeugt werden, in einer sehr beschränkten Verteilung gefunden (Heider et al., 1993). Einige der varianten Isoformen sind an der Aktivierung von Lymphozyten betei­ ligt und treten in Assoziation mit Metastasenbildung auf (Mackay et al., 1994, Günthert et al., 1991, Rudy et al., 1993, Koopman et al., 1993). Obwohl eine direkte biologische Rolle der Expression von variantem CD44 bei der Metastasenbildung im Pankreaskarzinom der Ratte gezeigt wurde (Günthert et al., 1991, Seiter et al., 1993), ist seine Rolle in menschli­ chen Tumoren noch unbekannt.

Es wurden verschiedene Berichte publiziert, in denen gezeigt wurde, daß bestimmte alternativ gespleißte Formen von CD44 in menschlichen metastatischen Tumoren exprimiert wurden (Heider et al., 1993 und 1996, Fox et al., 1994, Friedrichs et al., 1995, Kaufmann et al., 1995, Salles et al., 1993, Stauder et al., 1995, Koopman et al., 1993, Tanabe et al., 1993). Studien der Expression von CD44 in Non-Hodgkin-Lymphomen (NHL) konzen­ trierten sich auf die Analyse des sogenannten Lymphozyten-homing Rezeptors CD44H oder CD44s (Horst et al., 1990a, Horst et al., 1990b, Jalkanen et al., 1991, Möller et al., 1992). Während einige Autoren (Horst et al., 1990a, Jalkanen et al., 1991, Picker et al., 1988, Pals et al., 1989, Fujiwara et al., 1993) eine Korrelation zwischen erhöhter CD44s-Expression und ungünstiger Prognose fanden, konnten andere (Terpe et al., 1994) diese Befunde nicht bestätigen. Kürzlich wurde eine Hochregulation von CD44v3 und CD44v6-Isoformen in NHL mit ungünstigem pathologischen Status gefunden (Koopman et al., 1993, Terpe et al., 1994, Salles et al., 1993, Stauder et al., 1995), wobei varianten-spezifische CD44-mAbs benutzt wurden (Mackay et al., 1994, Koopman et al., 1993, Fox et al., 1993).

Es sind verschiedene Ansätze bekannt geworden, die differentielle Expression varian­ ter Exons des CD44-Gens in Tumoren und Normalgeweben für diagnostische und thera­ peutische Verfahren nutzbar zu machen (WO 94/02633, WO 94/12631, WO 95/00658, WO 95/00851, EP 0531300).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Entwicklung von neuen Verfahren zur Diagnose und Therapie von Hodgkin-Lymphomen (Lymphogranulomatose) sowie die Be­ reitstellung von Mitteln für solche Verfahren.

Diese Aufgabe konnte mit der vorliegenden Erfindung gelöst werden. Sie betrifft Ver­ fahren zur Diagnose und Therapie von Hodgkin-Lymphomen (Lymphogranulomatose), die auf der Expression des varianten Exons v10 des CD44-Gens als molekularem Marker bzw. Target beruhen. Antikörpermoleküle mit entsprechender Spezifität eignen sich insbesondere als Vehikel, um Hodgkin-Lymphome in vivo selektiv zu erreichen.

Bevorzugt sind dabei Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß dabei ein Anti­ körpermolekül verwendet wird, das spezifisch an die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2 (siehe Sequenzprotokoll) bindet.

Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung sind die Verwendung solcher Antikör­ permoleküle bei den erfindungsgemäßen Verfahren sowie Mittel, um diese Verfahren auszu­ führen.

Die Nuklein- und Aminosäuresequenz des varianten Exons v10 des CD44-Gens ist bekannt (Screaton et al., 1992, Tölg et al., 1993). Diese Sequenzen finden sich im Se­ quenzprotokoll (SEQ ID NO. 1 und 2). Die Existenz degenerierter oder alleler Varianten ist für die Ausführung der Erfindung nicht von Bedeutung; solche Varianten sind daher ausdrücklich mit eingeschlossen.

Die Erfindung kann mit polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern ausgeführt werden, die für ein Epitop spezifisch sind, das vom Exon v10 kodiert wird. Die Herstellung von Antikörpern gegen bekannte Aminosäuresequenzen kann nach an sich bekannten Me­ thoden erfolgen (Catty, 1989). Beispielsweise kann ein Peptid dieser Sequenz synthetisch hergestellt und als Antigen in einem Immunisierungsprotokoll eingesetzt werden. Ein ande­ rer Weg ist die Herstellung eines Fusionsproteins, das die gewünschte Aminosäuresequenz enthält, indem eine Nukleinsäure (die synthetisch oder z. B. durch Polymerase-Kettenreak­ tion (PCR) aus einer geeigneten Probe hergestellt werden kann), die für diese Sequenz ko­ diert, in einen Expressionsvektor integriert und das Fusionsprotein in einem Wirtsorganis­ mus exprimiert wird. Das gegebenenfalls gereinigte Fusionsprotein kann dann als Antigen in einem Immunisierungsprotokoll eingesetzt und Insert-spezifische Antikörper oder, im Falle monoklonaler Antikörper, Hybridome, die insertspezifische Antikörper exprimieren, mit geeigneten Verfahren selektiert werden. Solche Verfahren sind Stand der Technik. Heider et al. (1993, 1996) und Koopman et al. (1993) beschreiben die Herstellung von Antikörpern gegen variante Epitope von CD44.

Für das erfindungsgemäße Verfahren können jedoch auch Antikörpermoleküle ver­ wendet werden, die von poly- oder monoklonalen Antikörpern abgeleitet sind, z. B. Fab- oder F(ab')₂-Fraginente von Immunglobulinen, rekombinant hergestellte single-chain-Anti­ körper (scFv), chimäre bzw. humanisierte Antikörper sowie andere Moleküle, die spezifisch an Epitope binden, die durch Exon v10 kodiert werden. Aus einem kompletten Im­ munglobulin können beispielsweise Fab- oder F(ab')₂-Fragmente oder andere Fragmente erzeugt werden (Kreitman et al., 1993). Der Fachmann ist ferner in der Lage, rekombinante v10-spezifische Antikörpermoleküle herzustellen. Entsprechende Verfahren sind Stand der Technik. Solche rekombinanten Antikörpermoleküle können z. B. humanisierte Antikörper (Shin et al., 1989; Güssow et Seemann, 1991), bispezifische Antikörper (Weiner et al., 1993; Goodwin, 1989), single-chain-Antikörper (scFv, Johnson et Bird, 1991), komplette oder fragmentarische Immunglobuline (Coloma et al., 1992; Nesbit et al., 1992; Barbas et al., 1992), oder durch chain shuffling erzeugte Antikörper (Winter et al., 1994) sein. Humanisierte Antikörper können beispielsweise durch CDR-gratting (EP 0239400) hergestellt werden. Auch Framework-Regionen können modifiziert werden (EP 0519596). Zur Humanisierung von Antikörpern können heute Methoden wie PCR (s. z. B. EP 0368684; EP 0438310; WO 9207075) oder Computer-modelling (s. z. B. WO 9222653) angewendet werden. Es können auch Fusionsproteine, beispielsweise single-chain-Antikör­ per/Toxin-Fusionsproteine (Chaudhary et al., 1990; Friedman et al., 1993) hergestellt und verwendet werden. Unter die Oberbegriffe "Antikörper" und "Antikörpermoleküle" sollen außer polyklonalen und monoklonalen Antikörpern alle in diesem Abschnitt diskutierten Verbindungen fallen, sowie weitere Verbindungen, die sich strukturell von Immunglobulinen ableiten lassen und mit an sich bekannten Methoden herstellbar sind.

Für diagnostische Verfahren können Antikörpermoleküle beispielsweise mit radioak­ tiven Isotopen wie ¹³¹I, ¹¹¹In, ^99mTc oder radioaktiven Verbindungen (Larson et al., 1991; Thomas et al., 1989; Srivastava, 1988), Enzymen wie Peroxidase oder alkalischer Phos­ phatase (Catty et Raykundalia, 1989), mit Fluoreszenzfarbstoffen (Johnson, 1989) oder Biotinmolekülen (Guesdon et al., 1979) verknüpft werden. Für therapeutische Anwendun­ gen können v10-spezifische Antikörpermoleküle mit Radioisotopen wie ⁹⁰Y, ¹¹¹In, ¹³¹I oder ¹⁸⁶Re (Quadri et al., 1993; Lenhard et al., 1985, Vriesendorp et al., 1991; Wilbur et al., 1989), Toxinen (Vitetta et al., 1991; Vitetta et Thorpe, 1991; Kreitman et al., 1993; Theuer et al., 1993), Zytostatika (Schrappe et al., 1992), Prodrugs (Wang et al., 1992; Senter et al., 1989) oder radioaktiven Verbindungen verknüpft werden. Der Antikörper kann ferner mit einem Zytokin oder einem anderen immunmodulatorischen Polypeptid verknüpft sein, z. B. mit Tumornekrosefaktor oder Interleukin-2.

Vorteilhaft können mit dem erfindungsgemäßen diagnostischen Verfahren Proben von Patienten, beispielsweise aus Biopsien, untersucht werden, bei denen der Verdacht auf Ho­ dgkin-Lymphom (Lymphogranulomatose) besteht oder die Diagnose bereits vorliegt, der Tumor aber genauer charakterisiert werden soll. Der Nachweis varianter CD44-Moleküle, die eine Aminosäuresequenz enthalten, die vom variablen Exon v10 kodiert wird, kann auf Proteinebene mittels Antikörpern oder auf Nukleinsäureebene mittels spezifischer Nuklein­ säuresonden oder Primern für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erfolgen. Die Erfin­ dung betrifft demzufolge auch Antikörpermoleküle und Nukleinsäuren, die als Sonden bzw. Primer für solche Verfahren geeignet sind, und die Verwendung solcher Antikörper und Nukleinsäuren zur Diagnose und Analyse von Hodgkin-Lymphomen. Beispielsweise können Gewebsschnitte immunhistochemisch mit Antikörpern mit an sich bekannten Methoden untersucht werden. Aus Gewebeproben gewonnene Extrakte oder Körperflüssigkeiten können ferner mit anderen immunologischen Methoden unter Verwendung von Antikörpern untersucht werden, beispielsweise in Western Blots, Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA, Catty et Raykundalia, 1989), Radioimmunoassays (RIA, Catty et Murphy, 1989) oder verwandten Immunoassays. Die Untersuchungen können qualitativ, semiquantitativ oder quantitativ erfolgen. Die Expression der CD44-Spleißvariante v10 bei der Hodgkin'schen Erkrankung ist assoziiert mit aggressivem Verhalten des Tumors und hohem Rezidivrisiko. Sie korreliert mit fortgeschrittenem Stadium und schlechter Prognose von NSHD (nodular sclerosis Hodgkin's disease).

Neben der in-vitro-Diagnostik eignen sich Antikörpermoleküle mit erfindungsgemä­ ßer Spezifität auch zur in-vivo-Diagnostik von Hodgkin-Lymphomen. Trägt das Antikör­ permolekül ein detektierbares Label, kann eine Detektion des Labels zu diagnostischen Zwecken, z. B. Visualisierung des Tumors in vivo (Imaging), oder beispielsweise zur radio­ unterstützten Chirurgie (radioguided surgery) erfolgen. Für die Verwendung von mit radio­ aktiven Isotopen konjugierten Antikörpern zur Immunszintigraphie (Imaging) beispielsweise gibt es eine Reihe von Protokollen, auf deren Grundlage der Fachmann die Erfindung aus­ führen kann (Siccardi et al., 1989; Keenan et al., 1987; Perkins et Pimm, 1992; Colcher et al., 1987; Thompson et al., 1984).

Durch Nachweis und/oder Quantifizierung der Expression des varianten CD44-Epi­ tops v10 erhobene Daten können so in die Diagnose und Prognose einfließen. Vorteilhaft kann dabei die Kombination mit anderen prognostischen Parametern sein, etwa mit dem Tumorgrad.

Antikörpermoleküle mit der erfindungsgemäßen Spezifität und ggf. verknüpft mit ei­ nem zytotoxischen Agens können vorteilhaft zur Therapie von Hodgkin-Lymphomen (Lymphogranulomatose) verwendet werden. Dabei kann die Applikation systemisch oder topisch erfolgen, beispielsweise durch intravenöse (als Bolus oder Dauerinfusion), intrape­ ritoneale, intramuskuläre, subkutane o.a. Injektion/Infusion. Protokolle für die Verabrei­ chung von konjugierten oder nichtkonjugerten Antikörpern (sei es als komplette Im­ munglobuline, Fragmente, rekombinante humanisierte Moleküle o. ä.) sind Stand der Technik (Mulshine et al., 1991; Larson et al., 1991; Vitetta et Thorpe, 1991; Vitetta et al., 1991; Breitz et al., 1992, 1995; Press et al., 1989; Weiner et al., 1989; Chatal et al., 1989; Sears et al., 1982).

Eine bevorzugte Ausführungsform einer therapeutischen Anwendung besteht darin, ein humanisiertes v10-spezifisches Immunglobulin oder ein F(ab')₂-Fragment davon mit ⁹⁰Y (Quadri et al., 1993; Vriesendorp et al., 1995), ¹³¹I (Juweid et al., 1995; Press et al., 1995; Thomas et al., in: Catty 1985, S. 230-239) ¹⁸⁶Re (Breitz et al., 1992, 1995) oder einem anderen geeigneten Radioisotop zu verknüpfen und zur Radioimmunotherapie von Hodg­ kin-Lymphomen einzusetzen. Beispielsweise kann ein solches Antikörpermolekül mit ⁹⁰Y unter Verwendung eines chelatbildenden Linkers wie ITCB-DTPA (Isothiocyanatobenzyl- Diethylentriaminpentaacteat) verknüpft werden, wobei eine spezifische Aktivität von 5-20 mCi/mg, vorzugsweise 10 mCi/mg erreicht werden sollte. Dieses Agens kann dann einem Patienten mit antigen-positivem Tumor in einer Dosierung von 0.1 bis 1 mCi/kg Körper­ gewicht, vorzugsweise 0.3 bis 0.5 mCi/kg Körpergewicht, besonders bevorzugt 0.4 mCi/kg, verabreicht werden. Bei einer zu verabreichenden Gesamtproteinmenge von 2 bis 5 mg kann dies in Form einer schnellen intravenösen Bolusinjektion geschehen. Bei monoklonalen Antikörpern kann es notwendig sein, das Agens vor der Verabreichung mit einem Über­ schuß (z. B. dem zehnfachen molaren Überschuß) des nichtradioaktiven Antikörpers zu vermischen; in diesem Fall erfolgt die Verabreichung besser in Form einer intravenösen In­ fusion z. B. über 15 Minuten. Die Anwendung kann wiederholt werden. Die Therapie kann durch Knochenmarkstransplantation unterstützt werden.

Abbildungen

Fig. 1 A. Einzelne HRS(Hodgkin und Reed-Sternberg)-Zelle eines Patienten ohne Rezidiv, die mit mAb VFF16 (CD44v10) reagiert. Pfeilspitzen zeigen auf nicht-reaktive HRS-Zellen. B. <50% der HRS-Zellen von Patienten mit Rezidiv zeigen Reaktivität. (ABC, x 400).

Fig. 2 CD44v10-Expression in HRS-Zellen in verschiedenen Patientengruppen. Es ist zu beachten, daß Patienten mit schlechtem klinischen Verlauf, d. h. Rezidiv oder Knochen­ marksbeteiligung ausschließlich mehr als 10% positive HRS-Zellen zeigen, während Patien­ ten ohne Rezidiv weniger als 10% positive HRS-Zellen haben. Der Unterschied zwischen diesen beiden Gruppen ist statistisch hochsignifikant.

Fig. 3 RT-PCR-Analyse unter Verwendung von CD44v10-spezifischen Primern (rechte Hälfte): Das Haupttranskript von etwa 470 bp in allen Proben und ein schwächeres Trans­ kript von 660 bp in den Proben 2, 3 und 4 belegen CD44v10-enthaltende Isoformen in allen 5 Fällen. Eine dominierende Bande von 440 bp bei Verwendung von Primern, die für die 5'- und 3'-konstante Region spezifisch sind, zeigt die Standardform von CD44 an (linke Hälfte).

Beispiele Beispiel 1 Herstellung v10-spezifischer Antikörper

Die gesamte variante Region des HPKII-Typs von CD44v (Hofmann et al., 1991) wurde aus menschlicher Keratinozyten-cDNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Die beiden PCR-Primer 5'-CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3', Positionen 25-52, und 5'-TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3', Positionen 1013-984 der LCLC97-varianten Region, wie von Hofmann et al. beschrieben, enthielten eine EcoRI-Erkennungsstelle, die benutzt wurde, um das PCR-Produkt direkt in den Vektor pGEX-2T (Smith et al., 1988) zu klonieren. Das resultierende Konstrukt (pGEX CD44v HPKII, v3-v10) kodiert für ein Fusionsprotein von ∼70 kD, bestehend aus Glutathion-S- transferase von Schistosoma japonicum und den Exons v3-v10 von humanem CD44 (Heider et al., 1993). Das Fusionsprotein wurde in E. coli exprimiert und anschließend über Glutathion-Agarose affinitätsgereinigt (Smith et al., 1988).

Weibliche Balb/c Mäuse wurden intraperitoneal mit dem affinitätsgereinigten Fusi­ onsprotein nach folgendem Schema immunisiert:

• 1. Immunisierung: 90 µg Fusionsprotein in komplettem Freund'schen Adjuvans
• 2. und 3. Immunisierung: 50 µg Fusionsprotein in inkomplettem Freund'schen Adjuvans.

Die Immunisierungen erfolgten im Abstand von jeweils 4 Wochen. 14 Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Tiere noch an drei aufeinanderfolgenden Tagen mit je­ weils 10 µg Fusionsprotein in PBS immunisiert. Am darauffolgenden Tag wurden Milzzel­ len eines Tieres mit hohem Antikörpertiter mit P3.X63-Ag8.653-Mausmyelomzellen mit Hilfe von Polyethylenglykol 4000 fusioniert. Die Hybridomzellen wurden dann in Mikroti­ terplatten in HAT-Medium selektioniert (Köhler et Milstein, 1975; Kearney et al., 1979).

Die Bestimmung des Antikörpertiters im Serum bzw. das Screening der Hybridom­ überstände wurde mit Hilfe eines ELISAs durchgeführt. Bei diesem Test wurden zunächst Mikrotiterplatten mit Fusionsprotein (GST-CD44v3-10) oder nur mit Glutathion-S-Transfe­ rase beschichtet. Anschließend wurde mit seriellen Verdünnungen von Serumproben bzw. Hybridomüberständen inkubiert und die spezifischen Antikörper mit Peroxidase-konjugier­ ten Antikörpern gegen Maus-Immunglobulin nachgewiesen. Hybridome, die nur mit Glutathion-S-transferase reagierten, wurden verworfen. Die verbleibenden Antikörper wur­ den zunächst in einem ELISA mit domänenspezifischen Fusionsproteinen (Exon v3, Exon v5 + v6, Exon v6 + v7, Exon v8 - v10, Exon v10) charakterisiert (Koopman et al., 1993). Ihre immunhistochemische Reaktivität wurde an menschlichen Hautschnitten getestet.

Antikörper aus der Überständen der Hybridomaklone VFF-14 und VFF-16 binden nur an Fusionsproteine, die eine Domäne enthalten die durch das Exon v10 kodiert wird.

Beispiel 2 Immunhistochemische Untersuchung von Gewebeproben Gewebe und Patienten

37 Paraffin-eingebettete Lymphknotenproben von 29 Patienten mit NSHD (nodular sclero­ sis Hodgkin's disease; gemäß Rye-Klassifizierung) wurden aus der Sammlung der Abteilung für Pathologie, Universitätsschule für Medizin, Graz, Österreich, erhalten und in drei Grup­ pen eingeteilt; Gruppe 1: 11 Patienten mit vorbehandelter NSHD vor Behandlung (5 Pati­ enten im Stadium I, 6 im Stadium II), die für mehr als 6 Jahre Rezidiv-frei waren; Gruppe 2: 9 Patienten mit vorbehandelter NSHD vor Behandlung (4 im Stadium I, 5 im Stadium II) zeigten einen Rückfall der Krankheit in einem bis drei Jahren. Von 7 dieser 9 Patienten wurden zwei bis drei follow-up Lymphknotenschnitte von NSHD-Rezidiven ebenfalls in diese Studie eingeschlossen; Gruppe 3: 9 Patienten mit Knochenmarksbeteiligung zum Zeit­ punkt der ursprünglichen Diagnose (Stadium IV).

Immunhistochemie

Die Lymphknotenproben wurden mit den folgenden mAbs gefärbt: CD44 standard (s) erkannt durch den mAb SFF2; CD44v5 detektiert durch den mAb VFF8; CD44v6 detektiert durch die mAbs VFF7 und VFF18; CD44v10 detektiert durch die mAbs VFF14 und VFF16. MAb SFF2 erkennt ein Epitop, das allen CD44-Isoformen gemein ist. MAbs VFF7 und VFF18 erkennen verschiedene, aber überlappende Epitope, die durch das Exon v6 ko­ diert werden. MAb VFF8 ist spezifisch für Exon v5. MAbs VFF14 und VFF16 reagieren mit einem Epitop, das durch Exon v10 kodiert wird.

Die Immunhistochemie wurde an mit Mikrowellen behandelten Schnitten ausgeführt (Gerdes et al., 1992), wobei die Avidin-Biotin-Komplex (ABC)-Peroxidase-Methode ver­ wendet wurde (Güesdon et al., 1979). Paraffin-Schnitte wurden in Xylol entwachst, rehy­ driert, und die endogene Peroxidase mit H₂O₂ in Methanol blockiert. Die Objektträger wur­ den in einem Glasständer plaziert und in 500 ml 0.01 M Citratpuffer (2.1 g Zitronensäure in 1 l deionisiertem Wasser, pH mit 2 N NaOH auf 6.0 eingestellt) benetzt. Die Mikrowellen­ behandlung erfolgte für 35 Minuten bei maximaler Leistung (600 W) in einem Mikrowellen­ ofen (BioRad). Nach 9 Minuten Mikrowellenbehandlung wurde der verdampfte Puffer mit deionisiertem Wasser aufgefüllt. Nach der Mikrowellenbestrahlung wurde die Lösung für 20 Minuten gekühlt. Danach wurden die Objektträger in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gespült und durch Diaminobenzidin (DAB)-Entwicklung immungefärbt.

Zum Vergleich wurden 10 gefrorene Lymphknotenproben (3 von Patienten der Grup­ pe 1, 2 von Gruppe 2 und 5 erst kürzlich gesammelte Fälle) ebenfalls mit den mAbs VFF14 (v10) und VFF16 (v10) inkubiert, wobei die alkalische Phosphatase-anti-alkalische-Phos­ phatase (APAAP)-Methode verwendet wurde (Cordell et al., 1984).

Zu Kontrollzwecken wurden Schnitte von normaler humaner Epidermis, die dafür be­ kannt ist, die jeweiligen Antigene zu enthalten, getestet (positiv-Kontrollen). Ersatz des Primärantikörpers durch Normalserum ergab immer negative Ergebnisse (negativ-Kontrol­ len).

Für weitere Kontrollzwecke wurden immunhistochemische Färbungen für CD44v10 und CD44v6-Expression jeweils zweimal wiederholt. Um die Befunde zu bestätigen, wur­ den die Fälle zusätzlich in einem anderen Laboratorium inkubiert, wobei die APAAP-Me­ thode verwendet wurde (Cordell et al., 1984).

Der Prozentsatz von HRS-(Hodgkin- und Reed-Sternberg-)-Zellen, der mit den Anti­ körpern gefärbt wurde, wurde als 0%, weniger als 10%, 10-50%, und über 50% klassifi­ ziert. Es wurde darauf geachtet, daß die immunreaktiven HRS-Zellen eindeutig Tumorzellen waren (z. B. anhand der Anwesenheit charakteristischer Kerndetails), besonders in den Fällen, wo weniger als 10% der HRS-Zellen die jeweiligen Antigene exprimierten. Alle Fälle wurden getrennt von 2 der Erfinder begutachtet. Die Verteilung der Färbung, z. B. an der Membran, im Zytoplasma oder beides, wurde ebenso aufgezeichnet wie die Immunre­ aktivität in Zellen, die keine HRS-Zellen waren.

Statistische Analyse

CD44-Expressionsmuster wurden analysiert, indem die Pearson-chi-square-Kalkula­ tion und der Mantel-Haenszel-Test für lineare Assoziation verwendet wurde, wobei das Programm SPSS for Windows verwendet wurde. P-Werte, die gleich oder geringer waren als 0.05, wurden als signifikant betrachtet.

Ergebnisse der immunhistochemischen Färbungen

Tabelle 1 zeigt eine Übersicht der Ergebnisse, die mit gegen CD44s, CD44v5, v6 und v10 gerichteten Antikörpern in HRS-Zellen erhalten wurden. Der Hauptteil der antigenen Reaktivität der HRS-Zellen war in allen Fällen auf der Zelloberfläche. Eine variable Anzahl von HRS-Zellen ergab zytoplasmatische und/oder punktähnliche perinukleäre Reaktivität mit oder ohne Oberflächenfärbung, die wahrscheinlich die Reaktivität von CD44-Molekülen im Golgiapparat oder im endoplasmatischen Retikulum wiedergeben.

CD44v10-Erpression korreliert mit fortgeschrittenem Stadium und schlechter Prognose von NSHD. CD44s-, CD44v5- (detektiert durch mAb VFF8) und CD44v6-Expression (detektiert durch mAb VFF18) in HRS-Zellen wurde in der Mehrzahl der Fälle gefunden, wobei allerdings eine große Variabilität in der Zahl der gefärbten Zellen beobachtet wurde (Tabelle 1). CD44v6-Expression (detektiert durch mAb VFF7) wurde nur in wenigen Fällen gefunden, und wenn vorhanden, dann war sie auf eine Minderheit von HRS-Zellen be­ schränkt (Tabelle 1). In Patienten ohne Rezidiv wurde CD44v10-Expression (detektiert durch die mAbs VFF14 und VFF16) nur in sehr wenigen Fällen gefunden, und der Anteil reaktiver HRS-Zellen war <10% (Fig. 1A und 2). Im Gegensatz dazu wurde in allen Fällen von Patienten mit Rezidiv oder anfänglicher Knochenmarksbeteiligung CD44v10-Expres­ sion gesehen. In den meisten dieser Fälle bestand eine deutliche Überexpression von CD44v10 mit <50% reaktiven HRS-Zellen (Fig. 1B und 2). Diese Überexpression von CD44v10 wurde auch in den untersuchten Lymphknotenschnitten von Rezidiven gefunden (Tabelle 2).

Gefrorene Lymphknotenschnitte von 3 Patienten ohne Rezidiv und von 2 Patienten mit Rezidiv ergaben identische Ergebnisse wie Paraffinschnitte. Beide für Exon v10 spezifi­ sche Antikörper (VFF14 und VFF16) zeigten identische Resultate in der Reaktion entweder auf der Oberfläche und/oder im Zytoplasma der HRS-Zellen.

Unter Verwendung von Fishers exaktem Test ergaben die Unterschiede der CD44- Isoform-Expression zwischen Patientengruppen mit nicht-aggressiver und aggressiver NSHD die folgenden p-Werte: CD44s (p=0.3625), CD44v5 (p=0.2415), CD44v6 (nachgewiesen mit mAb VFF7) (p=0.2903), CD44v6 (nachgewiesen durch mAb VFF18) (p=0.1836), CD44v10 (nachgewiesen durch mAbs VFF14 und VFF16) (p=0.001). Dies zeigt, daß die unterschiedlichen Expressionsmuster von CD44v10 (nachgewiesen durch mAbs VFF14 und VFF16) innerhalb dieser NSHD-Gruppen statistisch hochsignifikant wa­ ren. Die Expression der CD44-Spleißvariante v10 bei der Hodgkin'schen Erkrankung ist as­ soziiert mit aggressivem Verhalten des Tumors und hohem Rezidivrisiko. Sie korreliert mit fortgeschrittenem Stadium und schlechter Prognose von NSHD.

Im Gegensatz zu früheren immunhistochemischen Studien der CD44-Expression im Zusammenhang mit prognostischer Relevanz in Neoplasien verschiedenen histogenetischen Ursprungs, die ausschließlich an Gefrierschnitten ausgeführt wurden (Koopman et al., 1993, Terpe et al., 1994, Ristamäki et al., 1994, 1995, Stauder et al., 1994, Heider et al., 1993, Horst et al., 1990a, b, Heider et al., 1996, Kaufmann et al., 1995, Mulder et al. 1994), könn­ te mit der vorliegenden Erfindung demonstriert werden, daß CD44-mAbs auch an Paraffin­ eingebettetem Material angewendet werden können, wenn Mikrowellenbehandlung benutzt wird. Dieses Verfahren erfordert konstante Fixierung und Mikrowellenbehandlung, um re­ produzierbare Ergebnisse zu ergeben. Für die Validierung der Immunreaktivität, die mit Paraffin-eingebettetem Material erhalten wurde, wurde die immunhistochemische Analyse parallel an gefrorenen Proben durchgeführt, und es wurden identische Ergebnisse erhalten. Zusätzlich wurden die Ergebnisse der CD44v10-Expression durch RT-PCR bestätigt. Für die CD44v6-Expression konnte eine Korrelation mit schlechter Prognose in NHL (Koopman et al., 1993, Salles et al., 1993, Terpe et al., 1994, Ristamäki et al., 1994, Stauder et al., 1994), Brustkrebs (Kaufmann et al., 1995) und Kolonkarzinomen (Heider et al, 1993) gezeigt werden. In den von uns untersuchten Fällen von NSHD jedoch waren nur einige wenige Fälle CD44v6-positiv, und wir konnten keine Korrelation mit der Prognose feststel­ len, wobei wir zwei verschiedene Antikörper gegen CD44v6 benutzten. Weil diese beiden verwendeten mAbs gegen v6 verschiedene Epitope der Exon v6-kodierten Aminosäurese­ quenz erkennen, kann dieser Mangel an detektierbarem CD44v6 in den meisten Fällen (siehe Tabelle 1) nicht durch Modifikation oder Maskierung von Epitopen erklärt werden. Im Gegensatz zur häufigen Expression von CD44v5 in gastrischen Adenokarzinomen (Heider et al., 1993) waren die Daten betreffend CD44v5-Expression innerhalb der drei Gruppen von NSHD nicht statistisch signifikant.

Exon v10 ist - zusätzlich zu den Exons v3 und v6 - ein variantes Exon, das in Lym­ phozyten konstitutiv exprimiert wird (Stauder et al., 1994). Bis jetzt wurde CD44v10-Ex­ pression in NHLs noch nicht systematisch analysiert, und dieses Exon wurde nur selten in Karzinomen detektiert (Heider et al., 1996). Die vorliegende Erfindung demonstriert am Beispiel zweier verschiedener Antikörper gegen CD44v10 (VFF14 und VFF16) eine sta­ tistisch signifikante Hochregulierung der CD44v10-Expression in HRS-Zellen von NSHD mit schlechter Prognose (Gruppen 2 und 3). Dabei zeigten beide Exon v10-spezifische An­ tikörper identische Ergebnisse sowohl auf der Oberfläche als auch (und/oder) im Zytoplasma der HRS-Zellen. Der Nachweis der CD44v10-Expression mit 2 verschiedenen mAbs ist wichtig, da beispielweise bei Mammakarzinom divergierende Daten von verschie­ denen Autoren erhalten wurden, die verschiedene mAbs der gleichen Exon-Spezifität ver­ wendeten (Friedrichs et al., 1995, Kaufmann et al., 1995). Zur weiteren Bestätigung unserer überraschenden Ergebnisse wurden alle Fälle in einem anderen Laboratorium unabhängig immunogefärbt (wobei eine andere Färbungsmethode verwendet wurde), mit identischen Ergebnissen.

Die Ergebnisse für die CD44v10-Expression in HRS-Zellen von NSHD sind die ersten Daten, die eine Korrelation der CD44v10-Expression mit Stadium und Prognose der Krankheit zeigen. Die erfindungsgemäßen Verfahren geben dem Arzt somit wertvolle dia­ gnostische und prognostische Informationen zur Erkrankung am Hodgkin-Lymphom. Dar­ über hinaus ist CD44v10 ein geeignetes molekulares Target für therapeutische Interventio­ nen bei dieser Erkrankung.

Reaktivität von HRS-Zellen

Reaktivität von HRS-Zellen

Reaktivität (%) von CD44v10 (VFF14 und VFF16) und CD44v6 (VFF18) in HRS-Zellen von Patienten der Gruppe 2 (Rezidiv)

Reaktivität (%) von CD44v10 (VFF14 und VFF16) und CD44v6 (VFF18) in HRS-Zellen von Patienten der Gruppe 2 (Rezidiv)

Beispiel 3 Anwendung von v10-spezifischer RT-PCR zu diagnostischen Zwecken Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Fünf Fälle erlaubten die Isolierung von mRNA und wurden zusätzlich durch reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) analysiert.

Es wurde 1 µg Gesamt-RNA isoliert und revers transkribiert, wie in der Literatur be­ schrieben (Günthert et al., 1991). 5 µl Erststrang-cDNA wurde mit Taq-Polymerase (Promega, Madison, USA) in einem Volumen von 50 µl amplifiziert, wobei die Pufferbe­ dingungen verwendet wurden, die vom Hersteller empfohlen wurden. Die Primer-Konzen­ tration betrug 0.2 mM. Um die Qualität und Häufigkeit der cDNA-Synthese zu testen, wurde eine GAPDH-PCR mit Oligonukleotiden, die homolog zu den Positionen 8-29 und 362-339 der publizierten GAPDH-cDNA-Sequenz (Allen et al., 1987) waren, durchge­ führt. Einer Vorinkubation für 5 min bei 95°C folgten 25 Amplifikationsrunden (30 sec bei 95°C, 1.5 min bei 62°C) und ein Extensionszyklus von 7 min bei 72°C. Danach wurden 10 µl der Reaktion auf einem 2%igen Agarosegel analysiert und das Amplifikationsprodukt unter UV-Licht visualisiert, nachdem das Gel mit Ethidiumbromid gefärbt worden war. Für die Amplifizierung von CD44v10-enthaltenden cDNAs wurden Primer verwendet, die ho­ molog zum 3'-Ende des Exons v10 (Positionen 986-1013, Hofmann et al., 1991) und zur 5'- konstanten Region von CD44 (Positionen 513-540, Stamenkovic et al., 1989) waren. Zur Amplifikation CD44-Standard-enthaltender Isoformen wurde statt des CD44v10-spezifi­ schen Primers ein 3'-konstanter-CD44-Primer (Positionen 934-958, Stamenkovic et al., 1989) verwendet. Nach 40 Amplifikationszyklen (94°C für 30 sec, 62°C für 1.5 min) wurden 10 µl des Reaktionsgemisches wie oben analysiert. Zu Kontrollzwecken wurde statt RNA entweder destilliertes Wasser (Negativkontrolle) oder ein CD44v3-v10 enthaltendes Plasmid (Positivkontrolle, Heider et al., 1996) benutzt.

In den 5 Fällen, in denen eine RNA-Isolierung möglich war, bestätigte die RT-PCR- Analyse die Expression CD44v10 enthaltender CD44-Isoformen (da es sich um erst kürzlich erhaltene Proben handelt, ist der weitere Krankheitsverlauf bei diesen Patienten noch nicht bekannt). Die amplifizierten Fragmente entsprechen CD44-Transkripten, die den konstanten Anteil von CD44 in Kombination mit dem varianten Exon v10 (460 bp-Bande) bzw. varian­ tem Exon v10 plus weiteren varianten Exons (660 bp-Bande) aufweisen (Fig. 3, rechte Hälfte). Zu Kontrollzwecken wurden parallel cDNAs mit Primern amplifiziert, die spezifisch für die 5'- und 3'-konstante Region von CD44 waren (Fig. 3, linke Hälfte), wobei eine do­ minierende Bande von 440 bp erhalten wurde, die die Standardform von CD44 anzeigt. Die molekulargenetischen Ergebnisse korrelierten mit den immunhistochemischen Befunden, wo in allen 5 Fällen ein hoher Anteil der HRS-Zellen (die weniger als 10% der Gesamtzellzahl in einer Probe ausmachen) CD44v10 exprimierten und die Mehrheit der Zellen (HRS plus Nicht-Tumorzellen) mit dem anti-CD44s-Antikörper reagierten.

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Claims (10)

1. Verfahren zur Diagnose oder Therapie von Hodgkin-Lymphomen (Lymphogranu­ lomatose), dadurch gekennzeichnet, daß dieses Verfahren auf der Expression des variablen Exons v10 des Gens CD44 als molekularem Marker beruht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es auf der Bindung eines Antikörpermoleküls an ein Epitop, das von dem variablen Exon v10 des Gens CD44 kodiert wird, beruht.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß dabei ein Antikörpermo­ lekül verwendet wird, das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 erkennt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörpermolekül ein monoklonaler Antikörper, ein Fab- oder F(ab')₂-Fragment eines Immunglobulins, ein rekombinant hergestellter Antikörper, ein rekombinant hergestellter chimärer, humanisierter Antikörper oder single-chain-Antikörper (scFv) ist.

5. Verwendung eines Antikörpermoleküls, das für ein Epitop spezifisch ist, das von dem varianten Exon v10 des CD44-Gens kodiert wird, in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.

6. Verwendung eines Antikörpermoleküls, das für ein Epitop innerhalb der Amino- Säuresequenz spezifisch ist, die durch das variable Exon v10 des CD44-Gens kodiert wird, zur Therapie von Hodgkin-Lymphomen (Lymphogranulomatose).

7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörpermo­ lekül an die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 bindet.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörpermolekül ein monoklonaler Antikörper, ein Fab- oder F(ab')₂-Fragment eines Immunglobulins, ein rekombinant hergestellter Antikörper, ein rekombinant hergestellter chimärer bzw. humanisierter Antikörper oder single-chain-Antikörper (scFv) ist.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörpermolekül mit einem radioaktiven Isotop, einer radioaktiven Verbindung, einem Enzym, einem Toxin, einem Zytostatikum, einem Prodrug, einem Zytokin oder einem anderen immunmodulatorischen Polypeptid verknüpft ist.

10. Verwendung eines Antikörpermoleküls, das für ein Epitop innerhalb der Amino­ säuresequenz spezifisch ist, die durch das variable Exon v10 des CD44-Gens kodiert wird, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Diagnose und/oder Therapie von Hodgkin-Lymphomen (Lymphogranulomatose).