DE1965281A1 - Neues proteolytisches Enzym und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents
Neues proteolytisches Enzym und Verfahren zu seiner HerstellungInfo
- Publication number
- DE1965281A1 DE1965281A1 DE19691965281 DE1965281A DE1965281A1 DE 1965281 A1 DE1965281 A1 DE 1965281A1 DE 19691965281 DE19691965281 DE 19691965281 DE 1965281 A DE1965281 A DE 1965281A DE 1965281 A1 DE1965281 A1 DE 1965281A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- proteolytic
- microorganisms
- activity
- enzyme
- proteolytic enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C14—SKINS; HIDES; PELTS; LEATHER
- C14C—CHEMICAL TREATMENT OF HIDES, SKINS OR LEATHER, e.g. TANNING, IMPREGNATING, FINISHING; APPARATUS THEREFOR; COMPOSITIONS FOR TANNING
- C14C1/00—Chemical treatment prior to tanning
- C14C1/06—Facilitating unhairing, e.g. by painting, by liming
- C14C1/065—Enzymatic unhairing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Description
E. M e r ο lc 23, Dezember 1969
Aktiengesellschaft
Darmstadt
Neues protoolytisches Enzym urld
Verfahren zu seiner Herstollung
Es ist bekannt, daß verschiedene Mikroorganismen proteolytische Enzyme bilden; eine Reihe solcher Mikroorganismen
werden in industriellem Maßstab zu dem Zweck gezüchtet, die produzierten proteolytischen Enzyme zu gewinnen.
Es ist ferner bekannt, daß proteolytische Enzyme hochmolekulare Eiweißkörper sind oder zumindest zu einem hohen
Prozentsatz aus solchen bestehen, und daß diese Enzyme aufgrund ihrer komplizierten chemischen Struktur gewöhnlich nur
unter genau definierten Bedingungen hinsichtlich des pH-Wertes, der Temperatur und gegebenenfalls Premdstoffzusätzen, zum
Beispiel Stabilisatoren und/oder Aktivatoren, beständig und proteolytisch wirksam sind. Für die industrielle Verwendung
sind naturgemäß solche proteolytischen Enzyme am wertvollsten, f bei denen die Grenzen, innerhalb derer sie beständig und wii*ksam
sind, möglichst weite Bereiche von pll-Vr'erten und Temperaturen
umfassen» Solche Enzyme sollten einerseits möglichst unabhängig von Aktivatoren sein, andererseits durch Fremdstoffzusätze
nicht inhibiert werden.
Es wurde nun gefunden, daß aus Kulturen von Mikroorganismen der Gattung ^rj.tir/u:hiu_M ein extrazelluläres proteolytischos
Enzyia gewonnen worden kann, das sich in Bezug auf die BefJ
iii<-,un/r,c>n, untur dciiuu oh stabil utui wirksun ist, vorteilhaft
109827/1335
von don bisher aus Mikroorganismen gewonnenen proteolytischen
Enzymen ι-terscheidot. Insbesondere besitzt es in wäßriger
Lösung in einem außergewöhnlich weiten pH—Bereich eine überraschende
Stabilität, ferner eine optimale proteolytische V/irkung bei Temperaturen, bei denen ein großer Teil der bisher
bekannten proteolytisohen Enzyme bereits in erheblichem Maße
deaktiviert wird. Die Gewinnung extrazellulärer proteolytischer Enzyme aus Tritirachium- Arten ist bisher noch nicht beschrieben
worden und ist sorait neu.
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein neues, von Mikroorganismen
der Gattung Tritirachium produziertes protoolytisches
Enzym, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es in wäßriger
Lösung in Gegenwart von Calciumionen in einem pll-üereich
von 3,5 bis 12,5 stabil und proteolytisch wirksam ist und
seine optimale proteolytische Wirksamkeit bei Temperaturen
von 65 - 700C entfaltet. V/eitere Charakteristilca des erfindungsgemäßen
proteolytischen Enzyms können der folgenden 13eschreibung
entnommen werden.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung
eines proteolytischen Enzyms,' das dadurch gekennzeichnet ist, daß Mikroorganismen der Gattung Tritlrachiua
unter aeroben Bedingungen in einem assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff enthaltenden Nährmedium bis zu
einer wesentlichen Anreicherung des proteolytischen Enzyms kultiviert werden und anschließend das proteolytische Enzym
aus diesen Kulturen in an sich bekannter Weise abgetrennt wird.
Zur Gewinnung dos erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms werdon Mikroorganismen der Gattung Tritirachium, insbesondere
der beim "Centraalbureau voor Schimmelcultures" in Uaarn,
Niederlande, hinterlegte Stamm Tritirachium albua LIMüF.l: in
103827/1335 bad
mm ,J —
eiiieu ivulturuediun gezüchtet. Dieser Stanua wurde aus ruit
Hornspäncu gedüngter Qartcnerde isoliert. Die Gattung
Tritirachium ist in Mycologia, Band 32 (Jahrgang 1940),
Seiten 23 - 30 beschrieben und charakterisiert.
Das Kulturmedium wird nach den für die Züchtung derartiger
Mikroorganismen allgemein bekannten Prinzipien ziisammengestellt«
Es enthält neben den üblichen mineralischen Nährsalzen eine oder mehrere Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff
organischen Ursprungs und eine oder mehrere Quellen von assimilierbarem Stickstoff, wofür sowohl organische als auch
anorganische Substanzen in Frage kommen. Geeignete Kohlenstoffquellen
sind insbesondere Kohlenhydrate und kohle- % "
hydrathaltige Rohprodukte wie z.B. Glukose, Saccharose, Stärke,
Getreideschrot, Weizenkleie, Malzextrakt«, Sojabohnenraehl
und Magermilchpulver. Der Kohlenhydratanteil kanu in weiten
Grenzen variiert werden; vorzugsweise werden N&hrmedien nit
einem Kohlenhydratgehalt von 0,1 bis 20 #, insbesondere von
0,2 bis 10 ',Ό verwendet. Man kann auch den Züchtungsprozess in
einem Medium mit einem niedrigen Kohlenhydratgehalt beginnen und im weiteren Verlauf nach und nach weitere Kohlenhydratinengen
zusetzen.
Als anorganische Stickstoffquellen werden vorzugsweise Nitrate,
wie z.B. Kaliumnitrat, Natriumnitrat und Calciumnitrat, oder
Ammoniumverbindungen wie beispielsweise Ammonlumchlorid,
Ammoniumacetat und Ammoniumnitrat eingesetzt· Geeignete organische Stickstoffquellen sind beispielsweise Harnstoff,
Peptone, Kasein, Albumin, Hefeextrakte, Sojabohnenaehl,
Erdnußmehl, Baumwollsamenmehl, Maisquellwasser und Magermilchpulver. Es können aber auch unlösliche Proteine wie
z.B. Keratine oder hitzedenaturierte Eiweiße verwendet werden. Eine Reihe der aufgezählten Nähroedienbestundteile
wie insbesondere MagemiiIchpulver, Sojabohnenmehl, llefeüxtrakte,
Maisqut-llwasser oder V/eizenkleie enthalten sowohl
109827/1335
assimilierbaren Kohlenstoff als auch assimilierbaren Stickstoff
in ausreichender Menge." Ebenso sind in diesen Produkten die für die Züchtung von Mikroorganismen notwendigen Spurenelemente gewöhnlich in genügender Menge enthalten.
Das Nährinediun wird vor Beginn des Anzuchtverfahrens auf einen
pll-Uert zwischen 4,5 und 8 eingestellt; vorzugsweise arbeitet
nan iia pH-Bereich zwischen 5,5 und 7,5. Durch den Abbau der
Kohlenhydrate tritt im Verlauf des Züchtungsprozesses gelegentlich
eine starke Säurebildung auf. Um eine absenkung des pll-Vcrtes unter den optimalen bereich zu verhindern,
können dem Nährmedium Puffersubstanzen, z.B. Phosphat puff ei-
oder Calciumkarbonat, zugesetzt werden. Ferner kann auch die
Verwendung einer automatischen pll-iiegeleinrichtung, die beim
Absinken des pII-Y/erts unter den gewünschten Bereich eine
Zugabe basisch reagierender Substanzen wie beispielsweise Alkalikarbonaten oder -hydrogenkarbonaten auslöst, zweckmäßig
sein.
Die Temperatur, bei der die Kultivierung durchgeführt wird, liegt zwischen 150G und 320G; vorzugsweise wird bei 2ö°G
bis 23 C gearbeitet. Vor Beginn des Zuclitprozesses wird das
Nährmedium in üblicher \feise sterilisiert.
Die Kultivierung der Mikroorganismen der Gattung Tritirachium
erfolgt unter aeroben Bedingungen. Bei der Verwendung von Fermentern erfolgt die Belüftung durch Einleiten von Luft
in die gerührte Submerskultur. Die Luftnenge entspricht dei*
bei bekannten Kultivierungsprozessen angewendeten. Gute Ausbeuten an dem erfindungsgemäßen proteolytischen Enzym wex*den
normalerweise bei einer Kultivierungsdauer von 2 bis 5 Tagen erhalten.
109827/1335
Die Bestimmung der Ausbeute an dem erfindungsgemäßen proteolytischon
Enzym erfolgt in Anlehnung an das von ANSON beschriebene Verfahren ^Journal of General Physiology, Band 22 (Jahrgang
1939), Seiten 79 bis 89/„ Bei der Charakterisierung des
orfindungsgemäiien pröteolytiachen Enzyms bedeutet in dieser
Beschreibung eine Aktivitätseiuheit (im Folgenden mit AE abgekürzt)
diejenige Menge proteolytisches Enzym, die denaturiertos
Hinderhäcioglobin bei einem angegebenen pH-Wert und einer
Temperatur von 35,5 C während 10 Minuten so weit abbaut, daß die mit 5 ^iger wässeriger Trichloressigsäurelösung nicht
fällbaren Abbauprodukte beim Versetzen mit Phenolreagenz die
—6
gleiche Farbe geben wie eine 10 molare Tyrosinlösung. Die ' im rolgendon angegebenen Aktivitäten wurden, ivenn nichts ™ anderes angegeben ist, bei einem pH-Wert von 7,5 bestimmt.
gleiche Farbe geben wie eine 10 molare Tyrosinlösung. Die ' im rolgendon angegebenen Aktivitäten wurden, ivenn nichts ™ anderes angegeben ist, bei einem pH-Wert von 7,5 bestimmt.
13ei dem in den vorhergehenden Abschnitten beschriebenen
Züchtungsverfahren wird das erfindungsgemäße proteolytische Enzym von den Mikroorganismen in die Kulturflüssigkeit abgegeben.
Die Aufzucht dos Mikroorganismus wird abgebrochen, wenn Proben zeigen, daß dae erfindungsgemäße Enzym in der Kulturflüssigkeit
wesentlich angereichert ist. Eine wirtschaftliche Gewinnung des erfindungsgemäßen Enzyms ist in der Hegel möglich,
wenn die Kulturflüssigkeit eine Aktivität von wenigstens etwa 150 AE pro Milliliter aufweist. Natürlich ist es günstiger,
wenn die Aktivität höher, etwa bei 200 bis 300 AE/eiI, liegt.
Für die Produktion des erfindungsgemäßen Enzyms im technischen Maßstab können durch Modifizierung des Züchtungsverfahrens
auch Aktivitäten von 400 bis 500 AE/inl Kulturflüssigkoit erreicht
werden.
Zur Isolierung des erfindungsgemäflen proteolytischen Enzyms
wird die Kulturflüssigkeit in an sich bekannter Veise aufgearbeitet.
Diese Aufarbeitung erfolgt zum Beispiel durch Abtrennen
des Myzels, vorzugsweise durch Abzontrifugieren odor
Abf iltriorcn, und Abtrennen der gobIMoton länzywe aus dom
v;a;ii»rigon KuI turf iltt\i t durch Sa Iz fraktionierung, zuu Ueiwpii'l
10 9 8 2 7/1 ) J 5 gAD
-G-
uit Ammonium« ^ xat, .Auiraoniuiachlorid oder Natriumchlorid, oder
durch Löe iigSEixitelfälluiig, zum Beispiel mit niederen aliphatischen
Alkoholen wie Methanol, Aethanol, Propanol oder Isopropanol,
mit Ketonen wie Aceton oder Butanon-(2), oder nit Polyäthylenglykol. Die weitere Aufarbeitung und Reinigung
erfolgt dann gewöhnlich durch Dialyse, Umfällung und/oder mit chromatographischen Methoden.
Das auf diese Veise isolierte erfindungsgomäße proteolytische
Enzym ist ein weißes, kristallines, wasserlösliches, chromatographisch
und elektrophoretisch einheitliches Material, das im pH-Bereich von 7 bis 12 eine proteolytische Aktivität von
240 - 270 AE/mg besitzt; diese Aktivität ist etwa doppelt so groß wie die von kristallisiertem Trypsin, dessen Aktivität
in dem beschriebenen Testverfahren zu 130 AE/mg bestimmt wurde.
Chemisch ist das erfindungsgemäße proteolytische Enzym dadurch charakterisiert, daß es ein basisches Protein mit einem isoelektrischen
Punkt bei etwa pH 9,5 und einem Molekulargewicht von 20000 - 30000 ist.
Die Elementaranalyse ergibt 41,4 5* Kohlenstoff, 7,1 '/β Wasserstoff,
13,3 5» Stickstoff und 1,5 # Schwefel. Die proteolytische
Aktivität zeigt keine Abhängigkeit von der Gegenwart oder Abwesenheit irgendwelcher Kationen und wird auch durch Zusätze
von Aethylendiamintetraessigsäure oder Jodacetat nicht inhibiert,
Dagegen wird die proteolytische Wirksamkeit durch einen Zusatz von Phenylmethylsulfofluorid vollständig gehemmt. Diese Befunde
deuten darauf hin, daß an dem protoolytisch aktiven Zentrum des erfindungsgemäßon Enzyms die Hydroxygruppe eines Serylrestes
beteiligt ist, während eventuell vorhandene Mercaptogruppen für die protoolytische Aktivität nicht von Bedeutung
sind.
1 0 9 Il 2 ** ' 1315 ß*D original
Das infrarotspektrun des erfindungsgeiaäßen proteolytisehen
linzyus (Figur i in der Anlage) zeigt signifikante Absorptionsbanden
bei 3300,2970, 1645, 1537, 1514, 1452, 14.05, 1238 und
10Ü0 cm .
Das Ültraviolott-Absorptionsspektrum (Figur 2 in der Anlage)
weist ein Absorptionsmaximum bei 36200 cm" mit,einer Extinktion
von E* rJm = 8,75 auf.
Das eriindungsgeraäße proteolytische Enzym besitzt eine selektive
proteolytische Wirksamkeit gegenüber denaturierten Proteinen wie z.B. denaturiertem Hämoglobin, Casein, Albumin, Fibrinogen
und Spezialgelatine. Native Proteine werden nicht oder nur unvollkommen gespalten.
Das erfindungsgemäße proteolytlsohe Enzym weist sowohl in
festem als auch in gelöstem Zustand eine überraschend hohe Stabilität auf. In festem Zustand kann das Produkt bei 4-40C
mindestens 2 Jahre gelagert werden, ohne daß ein Aktivitätsverlust auftritt· In wässriger Lö&ung in Gegenwart sehr geringer
Mengen von Calciumionen (0,001 - 0,005 Mol/l) ist das erfindungsgemäße
Enzym in dem extrem weiten pll-üereich von 3,5
bis 12,5 stabil und proteolytiech wirksam; die Abhängigkeit der proteolytisehen Aktivität vom pH-Wert ist in Tabelle I
zusammengestellt. Die angegebenen relativen Aktivitäten sind darin für das erfindungsgemfiße proteolytitfche Enzym sowie "
für drei bekannte, aus Mikroorganismen der Gattungen Fusarltm,
Streptomyces und Bacillus gewonnene Enzyme in Prozent der maximalen Aktivität angegeben·
109827/133 5 BA0 original
196528Ί
Tabelle I: Itelative Aktivitäten verschiedener proteolytischer
Enzyme in Abhängigkeit vom pll-U'ert
pII-V.rert | 3,2 | 4 | 5 | 5,5 | 0 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 12,5 |
rel.proteolyt.Aktivi tät des erfindungsge- aäßen Tritirachium- |
4 | 15 | 55 | 68 | 82 | 93 | 96 | 100 | 100 | 100 | 90 | 18 |
Cnzyins (Jl) | - | - | - | - | 23 | 44 | 59 | 73 | 87 | 100 | 58 | 6 |
rel.proteolyt.Aktivi tät eines Fusarium- |
- | — | - | 38 | 51 | 75 | 100 | 57 | 43 | - | - | |
Snzyms («β) | - | 15 | 40 | 50 | 70 | 92 | 96 | 100 | 96 | 85 | 77 | - |
rel.proteolyt.Aktivi tät eines Streptomyces-Enzyms |
||||||||||||
(i'O | ||||||||||||
rel.proteolyt.Aktivi tät eines Bacillus- |
||||||||||||
Enzyms (#) |
Tabelle I zeigt deutlich, daß das erfindungsgomäßo Enzym eine
sehr gute proteolytische Wirksamkeit in einen wesentlich
breiteren pII-Bereich besitzt als die bekannten Enzyme aus
Fusariua-, Streptomyoes- und Bacillus-Arten.
breiteren pII-Bereich besitzt als die bekannten Enzyme aus
Fusariua-, Streptomyoes- und Bacillus-Arten.
Wässrige Lösungen des erfindungsgemäßen Enzyms, die 0,001 bis
0,005 Mol/l Calciumionen enthalten, sind in pH-Bereich der
maximalen proteolytischen Aktivität über für derartige Enzyme überraschend lange Zeiträume stabil. So :j.st an einer 0,15 ',ii
Lösung des erfindungsgemäßen' Enzyms in einem auf pH 8 eingestellten und an Calciumionen 0,001 molaren Borat-Pufferlösung (0,02 molar) auch nach 40-tagiger Aufbewahrung bei 250C noch
kein Aktivitätsverlust feststellbar. Die Aktivität dieser Ver suchslösung ist auch noch 15-tägiger Lagerung bei 40°C noch
unverändert.
maximalen proteolytischen Aktivität über für derartige Enzyme überraschend lange Zeiträume stabil. So :j.st an einer 0,15 ',ii
Lösung des erfindungsgemäßen' Enzyms in einem auf pH 8 eingestellten und an Calciumionen 0,001 molaren Borat-Pufferlösung (0,02 molar) auch nach 40-tagiger Aufbewahrung bei 250C noch
kein Aktivitätsverlust feststellbar. Die Aktivität dieser Ver suchslösung ist auch noch 15-tägiger Lagerung bei 40°C noch
unverändert.
109827/1335
ORIGINAL
~ 9 —
Stärker alkalische Losungen des erf in dungs gemäß en Enzyias zeigen
xu'ur bei längerer Lagerung einen Aktivitätsverlust, der aber
\veitaus geringer ist als der von Lösungen anderer bekannter ünzyiae unter gleichen Bedingungen* Tabelle II enthält eine Zusammenstellung
der Stabilitätsdaten von Lösungen des erfindungsgcuüßen
Enzyms bei verschiedenen pH-Werten und Temperaturen.
Tabelle II: Stabilität von Lösungen des erfindungsgeinäßen
Enzyms.
pll-Uert der Lösung | 8 | 10 | ii |
luftaktivität nach 3ü Tagen bei 25°C (in Ji) |
100 | 80 | 85 |
ilestaktivität nach 15 Tagen bei 400C (in tf) |
100 | 45 | 40 |
Restaktivität nach 4 Stunden bei 53°C (in 5ί) |
75 | 60 | 40 |
Restaktivität nach 1 Tag bei 330C (in ?») |
60 | 20 | 10 |
Auch Losungen des erlindungsgonäßen Enzyms mit pll-Vorten im
sauren JJereich weisen eine sehr gute" Stabilität auf. So ist
bei einem pH-Wert ron ö,ö (liurbiturat-Pufferlösung) die
protoolytisoho Aktivität nach 21-tägiger Aufbewahrung bei
2ö 0 noch unverändert; nach 21-täglg«r Lagerung bei 400C
beträft die Reataktivität nor>.h"TO c/o. Losungen ait einem
109827/1335
pll-Vert von 4,6 (Acetat-Pufferlösung) weisen nach 21 Tagen
bei 25°: bzw. 40°U liestalctivitäten von 80 'S bzw. G5 <i auf.
Selbst im stark sauren Bereich bei pH 3 (Glycin-Pufferlösung) findet man nach 21 Tagen bei 2o°C noch eine Ilestaktivität voa
70 </„
Wie allgemein bekannt ist, nimmt die Stabilität von Losungen
proteolytischer Enzyme mit steigender Temperatur ab. Andererseits nimmt die Aktivität von proteolytischen Enzymen mit
steigenden Temperaturen zu, da auch enzymatisehe Reaktionen
durch Temperaturerhöhung beschleunigt werden· Diese beiden entgegengesetzten Tendenzen bewirken, daß jedes Enzym ein
Temperaturoptimum aufweist, dessen Lage natürlich von der Dauer der Testreaktion abhängt. Bei den industriell verwendeten
proteolytischen Enzymen wird es gewöhnlich in der 10 Minuten dauernden Testreaktion nach Anson bestimmt. Die
Lage dieses Temperatüroptimums kann ebenfalls als Maß für
die Stabilität eines Enzyms dienen. In Tabelle III sind die Temperaturoptima für einige bekannte proteolytische Enzyme
aus Mikroorganismen dem des erfindungsgemäßen Enzyms gegenübergestellt.
Tabelle III: Temperaturoptima verschiedener proteolytischer Enzyme aus Mikroorganismen.
Proteolytisches Enzym | Temperatüroptimum |
aus | (10 Minuten) in 0C |
Tritirachiu» album Limber | 65 -* 70 |
Streptomyces naraensis | 40 |
Streptomyces grisous | 40 - 60 |
Fusarium sp. ■ | 50 |
Bacillus subtilis | 55 |
Bacillus alcalophilus | 60 |
109827/13 15
-li-
Aus dieser Tabelle geht hervor, daß das Tenperaturoptinium
des eriiudungsgoEiäßen proteolytischen Enzyms höher liegt als
die Teraperaturopticia bekannter proteolytiseher Enzyme aus
anderen Mikroorganismen· Bei 65°C beträgt die proteolytische Aktivität des erfindungsgeniäßen Enzyms etwa 1200 AE/mg.
Aufgrund der beschriebenen guten Stabilitäts- und ^ktivitätseigenschaften
läßt sich das erfindungsgemäße proteolytische
Enzym in allen Bereichen einsetzen, für die proteolytische Enzyme allgemein verwendet werden· Insbesondere kann es für
Wasch- und Reinigungsmittel oder Fleckenentferner, ferner als Enthaarungsmittel in der Gerberei, aber auch in der Lebens»
raittelindustrie zur Herstellung von Proteinhydrolysaten sowie in der Serologie zum Nachweis von inkompletten Antikörpern
verwendet werden. Besonders vorteilhaft für die Verwendung in der Lebensmittelindustrie und in der Serologie ist es, daß
das erfindungsgemäße Enzym in fester bzw« gelöster Form eine so ausgezeichnete Stabilität besitzt, daß zur Stabilisierung
wäßriger Lösungen im Gegensatz zu denen anderer Enzympräparate geringste, physiologisch unbedenkliche Mengen-Caleiumionen
völlig ausreichend sind· Als Y/asch- und Ileinigungsmittelzusatz
sowie als Enthaarungsmittel kann außer dem reinen erfindungsgemäßen
Enzym auch das aus dem Kulturfiltrat von Tritiraohiua-Arten
analog dem folgenden Beispiel. 4 isolierte Ilohenzym, das eine proteolytisohe Aktivität von 160 bis 230 AE/mg aufweist,
mit Erfolg verwendet werden. *
Iu einem sterilen 1000 al-Erlenmeyerkolben werden 200 al im
' Autoklaven bei 1200C 30 Minuten sterilisiertes Nähraedium, bestehend aus (alle Prozentangaben sind Gewichtsprozent)
109827M33S öad original
1 ι,Ό Pepton aus Casein
1 ι/Ό Glukose
0,28 ι,Ό Küliumdihydrogcuphosphat
0,07 c/e Dilcaliuiahydrogenphosphat
0,05 1Jo Magnesiumsulfat-heptahydrat
0,01 i» Calciuiachlorid-dihydrat
ad 100 c/e destilliertes Wasser
mit einer Submerskultur von Tritirachium album LBIBEIl beimpft
und Q Tage auf einer Schüttelaaschine mit 100 Ausschlägen
pro Minute bei 280G geschüttelt. Nach 3,4,5 und 6 Togen werden
Proben entnommen und der pll-Wert und die proteolytische Aktivität
bestimmt·
Zeit (Tage) | 0 | 3 | 4 | 5 | 6 |
pH-Wert der | |||||
Kulturflüssig | 5,9 | 7,3 | 7,7 | 7,8 | 7,9 |
keit | |||||
Proteolytische | |||||
Aktivität | 0 | 76,8 | 129,6 | 179,2 | 201,6 |
(in ΛΕ pro ml Kulturflüssig keit) |
Entsprechende Werte wurden auch bei Verwendung eines wie
folgt zusammengesetzten Ntthrmediums erhalten:
2 <i 0,25 «ί 0,28 $·
0,07 f. 0,05 # 0,01 #
ad 100
Magerailchpulver
Natriumchlorid
Kaliumdihydrogenphosphat
Dikaliumhydrogenphoephat c/* Magnesiumsulf a t-heptahydrat
# Calciumchlorid-dihydrat
cl* destilliertes Vasser.
109827/1335
KultivLoruiur, dos Milcrooi'gauisnius
IKaS Anzuchtverfahren wird vflo in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt,
jedoch enthält das Niihrmodiura i ^j Ovalbunin anstelle
des Cusoin-Peptons. In den nach 3, 4, ΰ und 6 Tagen entnommenen Proben worden die folgenden pll·-1·/orte und Aktivitäten
gefunden:
Zeit (Tage) | 0 | 3 | 4 | 5 | 6 |
pH-Wert der | |||||
Kulturflüsöig- | 5,8 | 5,3 | 7,1 | 7,3 | 7,8 |
keit | |||||
Proteolytische | |||||
Aktivität | 0 | 4,8 | S3,2 | 217,6 | 211,2 |
(in AE pro ml Kulturflüssig- keit) |
DeispieI 3
Kultivierung des Mikroorganismus
In einem Kleiniermentor iTerden unter sterilen Bedingungen
10 1 der in Beispiel 1 beschriebenen Nährlösung mit einer Subwerskultur von fritlrachium album LBDJEIl beimptt. Die
Kultur wächst bei 28°ü unter Durchleiten von 5 1 Luft pro
Hinute und Rühren mit 430 Umdrehungen pro Minute» In den
nach verschiedenen Zeiten entnommenen Proben werden die folgonderi pH-Werte und Aktivitäten gefundan:
109827/1335
Zeit !Stunden) | ü | 24 | 48 | 60 | 73 |
pll-'/ert der Kulturflüs3ig- koit |
5,9 | 4,0 | 7,1 | 7,6 | 7,8 |
Proteolytische Aktivität (in AE pro ml Kulturflüssig keit) |
0 | 2,8 | 84 | 134 | 217 |
In einem analogen Ansatz war der pH-Wert nach 90 Stunden 7,4; die proteolytischo Aktivität betrug 290 AE pro al Kulturflüssigkeit·
Abtrennung; dos Itohenzyms.
8,1 1 ICulturfiltrat mit einer proteolytischen Aktivität von
121 AE/ml werden mit 2,02 g CaCl2 · 2 HgO und soviel festem
Trie-hydroxymethyl-aminomethan versetzt, daß der pli-Y/ort 8,0
betragt, und unter vermindertem Druck bei 25 - 28°C auf 940 ml
eingeengt. Das Konzentrat wird durch Zentrifugieren geklärt
und der Rückstand mit 200 ml einer auf pH 8,0 eingestellten, 0,1 molaren Pufferlösung (Tris-hydroxyiaethyl-aminoniothan/Salzsäuro),
die außerdem 0,002 molar an Calciumchlorid ist, ausgewaschen· Das mit dor Waschlösung vereinigte geklärte Konzentrat,
das noch 90 l/o der im eingesetzten ICulturfiltrat vor—
handonen proteolytisehen Aktivität enthält, wird boi 5°ü uit
614 g Ammoniumsulfat versetzt und Über Nacht bei dieser
Temperatur stehengelassen. Del· dubei erhaltene Niederschlag
109827/1335
v/ird durch Dekantieren und Zentrifugieren abgetrennt und
in 200 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird filtriert und über
Nacht gegen strömendes entsalztes Y/asser dialysiert. Das Dialysat· wird zur Entfärbung axt ECTEOIA-Cellulose behandelt
und die erhaltene klare Enzymlösung gefriergetrocknet« Ausbeute 3,0 g Hohenzym mit einer proteolytischen Aktivität
von etwa 180 ΛΕ/mg. Dieses Uohenzym ist bei + 40C mindestens
2 Jahre ohne Aktivitätsverlust haltbar und kann für die meisten technischen Verwendungszwecke ohne weitere Aufreinigung
eingesetzt werden.
10 g des nach Deispiel 4 erhaltenen Rohenzyms werden in 95 ral
0,01 molarer Pufferlösung (Trie-hydroxymethyl-aminomethan/Salzsäure),
die 0.002 molar an Calciumchlorid ist, gelöst und mit
dieser Pufferlösung über eine schwach basische Ionenaustauschersäule
aus nit Diätliylaminoäthan modifiziertem Dextrangel chromatographiert. Als erste Komponente werden 3,4 g des
reinen erfindungsgeiaäßen proteolytischen Enzyms eluiert, das
durch Gefriertrocknung als weißes, kristallines Pulver erhalten wird und eine proteolytische Aktivität von 240 - 270 λ
ΛΕ/mg aufweist. Anschließend wird ein Nebenprodukt eluiert
(etwa 10 cjt des aufgetragenen Rohenzyms), das aus mindestens
3 Komponenten besteht und eine proteolytische Aktivität von
40 - 50 AE/rag besitzt.
109827A1335 BAD ORIGINAL
Claims (1)
- Proteolytisches Enzym, gewonnen aus Kulturen von Mikroorganismen der Gattung Tritirachiun und mit folgenden Eigenschaften:(a) Elementaranalysei etwa 41,4 c/o Kohlenstoff, 7,1 c/e Wasserstoff, 13,3 '/O Stickstoff und 1,5 # Schwefel.(b) Molekulargewicht: 20000 bis 30000.(c) Infrarotspektrum (vgl. Figur 1 in der Anlage) mit signifikanten Absorptjonsbanden bei 3300, 2970, 1645, 1537, 1514, 1452, 1405, 1238 und 1060 cm"1.(d) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (vgl. Figur 2 in der Anlage) mit einem Absorptionsmaximum bei -36 200 cm" mit einer Extinktion E. '* =8,75.(e) Isoelektrischer Punkt bei einem pH von etwa 9,5.(f) Proteolytische Aktivität im pH-Bereich von 3,5 bis 12,5.(g) Stabilität in gepufferter wässriger Lösung im pH-Bereich von 8 bis 11 in Gegenwart von 1 - 5 · 10~ Mol/l Calciumionen bei 25 C über mindestens 30 Tage.(h) Temperaturoptimum dor proteolytischcn Aktivität bei pH 8 bei 65 - 700C.Verfahren zur Herstellung eines proteolytisehen Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Gattung Tritirachiuia in einem assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff enthaltenen Nährmedium kultiviert und anschließend das proteolytische Enzym in an sich bekannter Weise abtrennt.3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Tritirachiun album LBIBEIl verwendet.4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen bei Temperaturen zwischen 15°C und 32°C, vorzugsweise zwischen 250C und 280C, kultiviert.109827/1335BAD ORIGINAL5. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch ^kennzeichnet, daß ti die Mikroorganismen in einen Näliraediuu nit einen pll-Vert zwischen 5 und 8 kultiviert.109827/1335 8AO ORISlNAuLeerseite
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19691965281 DE1965281C3 (de) | 1969-12-29 | Proteolytisches Enzym und Verfahren zu seiner Herstellung | |
NL7015726A NL7015726A (de) | 1969-12-29 | 1970-10-27 | |
FR7046263A FR2074169A5 (en) | 1969-12-29 | 1970-12-22 | Proteolytic enzyme prodn |
BE760902A BE760902A (fr) | 1969-12-29 | 1970-12-28 | Nouvel enzyme proteolytique et son procede de |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19691965281 DE1965281C3 (de) | 1969-12-29 | Proteolytisches Enzym und Verfahren zu seiner Herstellung |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE1965281A1 true DE1965281A1 (de) | 1971-07-01 |
DE1965281B2 DE1965281B2 (de) | 1977-07-07 |
DE1965281C3 DE1965281C3 (de) | 1978-02-23 |
Family
ID=
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002072634A2 (de) * | 2001-02-09 | 2002-09-19 | Roche Diagnostics Gmbh | Rekombinante proteinase k |
WO2005097986A1 (en) | 2004-04-02 | 2005-10-20 | Roche Diagnosticss Gmbh | Highly purified proteinase k |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002072634A2 (de) * | 2001-02-09 | 2002-09-19 | Roche Diagnostics Gmbh | Rekombinante proteinase k |
WO2002072634A3 (de) * | 2001-02-09 | 2003-03-13 | Roche Diagnostics Gmbh | Rekombinante proteinase k |
WO2005097986A1 (en) | 2004-04-02 | 2005-10-20 | Roche Diagnosticss Gmbh | Highly purified proteinase k |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE1965281B2 (de) | 1977-07-07 |
NL7015726A (de) | 1971-07-01 |
BE760902A (fr) | 1971-06-28 |
FR2074169A5 (en) | 1971-10-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE2453111A1 (de) | Verfahren zur herstellung von neuen enzymen | |
DE2026092A1 (de) | Alkalische Protease und Verfahren zu deren Herstellung | |
EP0144017A1 (de) | Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Poly-D(-)-3-hydroxybuttersäure | |
DE69120946T2 (de) | Co-hydrolytsches verfahren zur herstellung von extrakten aus hefe und nicht-hefe proteinen | |
DE69116192T2 (de) | Für die Polysaccharidhydrolyse aus einem lignozellulosehaltigen Substrat geeignete Enzymzusammensetzung, ihre Herstellung und Verwendung | |
DE2167078C2 (en) | Amylase prepn - for prodn of maltose from starch | |
DE2527068A1 (de) | Verfahren zur herstellung von cholesterinesterase | |
DE2444990A1 (de) | Verfahren zur herabsetzung des nucleinsaeuregehalts von proteinhaltigen materialien | |
DE1642625C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von Isoamylase durch Fernmentation | |
DE2003652C3 (de) | Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von CelluJase | |
DE3147947C2 (de) | Verfahren zur Herstellung halbsynthetischer Enzyme | |
DE68915568T2 (de) | Verfahren zur Gewinnung der Protease von Endothia parasitica. | |
DE1965281A1 (de) | Neues proteolytisches Enzym und Verfahren zu seiner Herstellung | |
DE1965281C3 (de) | Proteolytisches Enzym und Verfahren zu seiner Herstellung | |
DE1692783A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von 5-Nucleotide enthaltenden Wuerzstoffgemischen | |
DE3823462C2 (de) | ||
DE1517732C3 (de) | Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung hochaktiver Protease | |
DE2524580A1 (de) | Verfahren zur gewinnung von lipolytischem enzym | |
DE2631047C3 (de) | Verfahren zum Herstellen von biologischen Proteinen Mikroorganismen der Art Prototheca | |
DE2843567C2 (de) | Herstellung von Hefe auf Äthanol | |
DE3505353C2 (de) | Verfahren zur Herstellung von L-Serin | |
DE1767183A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von mikrobiellem Labferment | |
DE1952012C3 (de) | Biotechnisches Verfahren zur Herstellung alkalischer Protease | |
DE3785449T2 (de) | Enzymatisches verfahren zur behandlung von xanthangummis zur verbesserung der filtrierbarkeit ihrer waesserigen loesungen. | |
DE2154031C3 (de) | Neues proteolytisches Enzym und seine Herstellung |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) |